本发明涉及生物分子学及医学领域，具体涉及利用与股骨头坏死相关的microRNA作为分子标记物在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用。
背景技术：
：股骨头坏死因其主要病理系股骨头血运受阻，遭受破坏而引起的头部骨质缺血，故多称为股骨头缺血性坏死或股骨头无菌性坏死。股骨头缺血性坏死(avascularnecrosisofthefemoralhead,ANFH)是骨科常见病，多发病，早期诊断困难，治疗效果欠佳。长期大剂量应用激素致股骨头缺血性坏死，现已成为临床常见的药源性疾病。据国内报道，小剂量长期应用糖皮质激素致股骨头坏死的发病率为20％，大剂量短期应用的发病率为40％左右。股骨头坏死病理机制复杂，其特征是因血液循环障碍导致股骨头缺血坏死，由于机体对坏死区具有自然修复能力，当新生骨细胞随新生血管向坏死区生长并形成新骨的同时，坏死骨小梁将被逐步吸收。在此过程中骨的力学性能明显减弱，正常负重即可致股骨头塌陷，关节间隙变窄，最后导致骨关节炎，使病人髋关节功能障碍而致残致瘫。股骨头髓腔内骨髓脂肪化是激素性股骨头坏死(SteroidinducedAvascularNecrosisofFemoralHead,SANFH)早期的重要病理改变。近年来研究证明，激素可引起骨髓基质细胞大量分化成脂肪细胞，造成髓内脂肪细胞堆积，引起骨内压增高，使股骨头内微循环障碍而引起大量骨细胞缺血坏死。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞。骨的发育随年龄发生着动态的变化，其中由成骨细胞引导的骨形成和由破骨细胞引导的骨吸收构成了骨重建的动态平衡。当成骨细胞分化异常时，就会导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、股骨头坏死等。MicroRNA(miRNAs)是一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区(3’TTR)，从而抑制翻译或降解靶基因。MicroRNA在进化过程中高度保守，在生物体内分布广泛，并参与许多复杂的生物学过程，如胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、骨形成等。有研究表明：miRNAs通过调控成骨分化相关基因表达在骨形成中起关键作用，如miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化、miR-494通过调节Runx2的表达抑制成骨细胞分化等。早期的诊断和治疗是治疗SANFH的关键。随着生物信息学的不断发展，越来越多的和SANFH相关的基因见诸报道，证实了多种基因在ANFH的发生发展中的作用，为SANFH的早期诊断和治疗提供了理论依据。因此本领域迫切需要开展与激素性股骨头坏死相关联的特异性miRNA作为早期诊断的标记物的研究，以便提供新的有效的预防和治疗靶点。技术实现要素：为了实现糖皮质激素引起的股骨头坏死的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的与糖皮质激素引起的股骨头坏死相关的miRNAs。本发明的目的还在于提供该股骨头坏死相关miRNAs在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用。为实现上述目的，本发明首先提供一种检测糖皮质激素引起的股骨头坏死的分子标记物，所述分子标记物为miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p中的一个或多个miRNAs。本发明进一步研究发现所述的分子标记物在糖皮质激素引起的股骨头坏死患者生物学样品中表达上调。进一步地，本发明提供了所述的分子标记物在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用。优选的，所述糖皮质激素包括：地塞米松、倍他米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、由安西龙、氢化可的松和可的松。进一步地，本发明提供了一种治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死的药物，其特征在于，所述的药物包含miR-16-5p抑制剂。优选的，所述miR-16-5p抑制剂是miR-16-5p的反义寡核苷酸或拮抗剂，所述的miR-16-5p的反义寡核苷酸序列为SEQIDNO.4。优选的，所述的药物能够抑制骨髓间充质干细胞的凋亡。进一步地，本发明提供了一种诊断糖皮质激素引起的股骨头坏死的试剂，所述试剂盒包括用于检测miR-16-5p的表达水平的试剂。优选的，所述的试剂包括特异性扩增miR-16-5p的引物或探针。优选的，所述的引物序列包括正向引物序列如SEQIDNO.1所示和反向引物为通用引物。本发明的有益效果如下：本发明公开了与糖皮质激素引起的股骨头坏死相关的分子标记物，并进一步证实所述分子标记物在糖皮质激素引起的股骨头坏死患者生物学样本中表达上调。利用这些分子标记物检测糖皮质激素引起的股骨头坏死不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1miR-16-5p在不同浓度地塞米松刺激的MSCs中表达情况。图2miR-16-5p抑制剂对MSCs细胞凋亡的影响。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。本发明的发明人对25例股骨头坏死患者样本及22例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行差异性表达miRNA的筛选，再进行GO功能富集合和信号通路分析，挑选了差异表达上调的miRNAs：miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p。现有研究中并没有上述miRNAs和股骨头坏死相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，采用RT-PCR方法检测上述miRNAs在不同浓度地塞米松刺激的MSCs中的表达，并验证了上述miRNAs在高浓度地塞米松刺激的MSCs中表达上调。此外还验证了miR-16-5p可以引起细胞凋亡，其相关制剂可用于治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死。本文使用的“股骨头坏死”未做说明时，一般特指激素性股骨头缺血性坏死。本文使用的“糖皮质激素”是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，目前也可由化学方法人工合成。糖皮质激素可用于一般的抗生素或消炎药所不及的病症，如SARS、败血症等，具有调节糖、脂肪、蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抗炎作用。代表性的糖皮质激素例子包括(但并不限于):地塞米松、倍他米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、由安西龙、氢化可的松和可的松。一类与使用糖皮质激素药物相关的常见副作用是会导致不利的骨病，其中包括(但并不限于):骨质疏松、骨髓脂肪化、股骨头坏死。本文使用的“地塞米松”是一种人工合成的肾上腺皮质激素，其衍生物有氢化可地松、泼尼松等，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，广泛应用于各科治疗多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘，及皮肤科、眼科疾病。地塞米松的药理作用主要包括:抗炎作用和免疫抑制作用。抗炎作用表现在，减轻和防止组织对炎症的反应，抑制巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放，减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。其免疫抑制作用表现在:防止或抑制细胞介导的免疫反应，延迟性的过敏反应，减少T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞的数目，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合能力，抑制白介素的合成与释放，降低T淋巴细胞向淋巴母细胞转化，并经原发免疫反应的扩展；可降低免疫复合物通过基底膜，并能减少补体成份及免疫球蛋白的浓度。临床发现，长期使用地塞米松(Dex)会导致严重的股骨头坏死。本文使用的“骨髓间充质干细胞”以及“BMSCs”含义相同，可以互换使用。骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓中的间充质干细胞，具有定向或多向分化的潜能。成骨细胞与脂肪细胞都来源于骨髓间充质干细胞(BMSCs)，而且二者的分化存在一种竞争性的平衡，因而股骨头坏死病人骨髓中出现大量的脂肪提示BMSCs转向脂肪细胞分化而成骨分化受到抑制。BMSCs具有强大的自我增殖能力和分化多潜能性，可通过调节向成骨方向分化。BMSCs的分化方向受到转录因子的严格调控，Runx2是启动成骨细胞分化的关键转录因子。本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。本发明的药物的剂量可随给药模式和待治疗的疾病程度等而变化，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。优选的本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。本文使用的“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨、滑膜组织等样品。用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如椎间盘、关节突、脊髓、椎旁肌或血样)或细胞样品(如成骨细胞、软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多股骨头坏死症状的受试者、临床诊断为患有股骨头坏死的受试者、易患股骨头坏死的受试者(如有股骨头坏死家族史的受试者、有股骨头坏死遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感股骨头坏死或提高患股骨头坏死可能性的受试者)、怀疑患有股骨头坏死的受试者、正接受股骨头坏死治疗的受试者、患有股骨头坏死和非接受股骨头坏死治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无股骨头坏死的受试者(即正常)、已治愈股骨头坏死的受试者、正在控制其股骨头坏死的受试者和未诊断为股骨头坏死的受试者。本文使用的“对照”指未显示任何股骨头坏死症状(包括创伤性性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死)并且未诊断为股骨头坏死的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响股骨头坏死的药物。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自样本组织的RNA，其中RNA分离自样本组织，所述样本组织分离自组织移除时未诊断为股骨头坏死并且未显示任何股骨头坏死症状的个体。在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的生物学样品保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-80℃)保存。实施例1高通量测序筛选差异表达基因1、取样收集25例行全髋关节置换手术的股骨头坏死患者骨髓组织样本，取样来源于2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的患者，所有患者均确诊为由长期或大剂量应用糖皮质激素致股骨头缺血性坏死。对照来源于同时期骨科住院的髋关节粉碎性骨折患者的髋关节处骨髓组织样本，共收集22例。采集所有研究对象的样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。2、对组织样本进行总RNA提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按ImL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。4、高通量测序测序平台为IllTmina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.Tk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRdTplication含量，kmer的freqTency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达miRNAs:miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p，所述miRNAs在股骨头坏死患者组织样本中表达上调。实施例2RT-PCR检测不同浓度地塞米松处理的细胞has-miR-16表达情况1、取样收集3例行全髋关节置换手术的患者骨髓样本，取样来源于2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的髋关节骨性关节炎患者。采集所有研究对象的样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。2、骨髓间充质干细胞的分离与培养(1)使用无菌骨髓穿刺针和注射器来提取股骨侧骨的骨髓组织。(2)将提取的骨髓组织移入含有培养基和肝素抗凝剂(4000T/ml)的试管中，用等体积的PBS进行稀释。静置30s，弃去沉淀后加入等量的1.077μg/ml淋巴细胞分离液，以778xg离心20分钟，在白色中间层收集单核细胞。(3)单核细胞用10mlD-Hanks液洗涤，280xg离心6分钟后收集。加入含58％的DMEM的DMEM/F12培养液、40％MCDB-201、2％胎牛血清、10ng/mlEGF、10ng/mlPDGF、1X胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、1X亚油酸-牛血清白蛋白、50μMβ-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素培养，细胞密度为2x106/ml。(4)每2天更换一次培养液，当细胞汇合成片且贴壁率达到70-80％后，加0.25％胰蛋白酶和0.01％的EDTA制成细胞悬液，然后按照1:3的比例进行传代培养。(5)培养至第三代时，将MSCs以2×104/cm2接种于25CM2(T25)培养瓶内。当它们达到70％-80％的汇合率时，加入成骨诱导培养液：含10％胎牛血清、10nm的地塞米松，0.2mM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠的H-DMEM培养基。地塞米松的浓度分别采用10-7mol/L和10-9mol/L两种浓度分组进行培养，每2天更换一次培养液。3、RT-PCR检测于成骨诱导后6天，采用RT-PCR检测两组不同浓度地塞米松刺激处理后的MSCs中has-miR-16的表达情况。3.1总RNA提取同实施例1的方法进行RNA提取。3.2逆转录使用OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit(Takara，CodeNo.D350A)进行逆转录，实验操作按产品说明书进行，采用20μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。3.3Real-TimePCR使用SYBRPrimeSciptmiRNART-PCRKit(Takara，CodeNo.RR716)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。反应体系如表1所示。表1miRNA的RT-PCR反应体系组分加入量SYBRPremixExTaqII(2×)10μLPCRForwardPrimer(10μM)0.5μLTni-miRqPCRPrimer(10μM)0.5μLROXReferenceDyeII(50×)2μL模板(cDNA溶液)2μLdH2O至20μLmiRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应。扩增miR-16-5p正向引物序列如SEQIDNO.1所示，以snRNAT6作为内参，其上游引物为SEQIDNO.2所示，下游引物为SEQIDNO.3所示。扩增程序：95℃30s；40x(95℃5s，60℃34s)。3.4实验结果用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-△△Ct×100％，比较has-miR-16在10-7mol/L地塞米松刺激的MSCs中和10-9mol/L地塞米松刺激的MSCs中的表达水平。结果显示：miR-16-5p在10-7mol/L地塞米松刺激的MSCs中表达上调，如图1所示。实施例3抑制miR-16-5p表达1、细胞来源实施例2培养的骨髓间充质干细胞。2、设计合成针对miR-16-5p的反义寡核苷酸(anti-miR-16-5p)根据miR-16-5p的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成miR-16-5p的反义寡核苷酸序列和随机对照序列，miR-16-5p的反义寡核苷酸序列为SEQIDNO.4。3、转染采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的细胞接种到6孔板中，细胞计数约5×104，常规培养至转染当天，细胞融合度为50-60％时进行试验。将80nManti-miR-16-5p加入到100TLDMEM培养基中，轻柔混匀；另用100TLDMEM培养基稀释2TLLipofectaminTM2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育5min；混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，使他们充分混合。其中，非特异性序列作为阴性对照(anti-NC)，同期设有空白对照组。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。4、anti-miR-16-5p对于骨髓间充质干细胞miR-16-5p表达的作用：细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例2。Real-timePCR结果显示，阴性对照组对骨髓间充质干细胞中miR-16-5p表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的anti-miR-16-5p组对骨髓间充质干细胞中miR-16-5p表达起到一定抑制作用抑制率为54％。实施例4miR-16-5p抑制剂对骨髓间充质干细胞凋亡的影响按照实施例3的方法对骨髓间充质干细胞进行anti-miR-16-5p和anti-NC的转染。细胞转染48h后，将细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×105细胞；按照AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒(购自Invitrogen公司)的操作说明进行细胞处理。加入500μL的BindingBTffer(凯基，南京)悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-FITC(凯基，南京)混匀后，加入5μLPropidiTmIodide(凯基，南京)，混匀；室温、避光、反应5-15min后进行流式细胞仪的检测。统计细胞凋亡率，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。结果如图2所示，与转染anti-NC细胞组相比，转染anti-miR-16-5p的细胞凋亡率降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>边焱焱<120>MicroRNA在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用<130>P16ghs125<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tagcagcacgtaaatattggcg22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2gtgctcgcttcggcagcacatat23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3aaaatatggaacgcttcacgaa22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4atcgtcgtgcatttataaccgc22当前第1页1 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