本发明属于基因工程及脑血管医学技术领域。更具体地，涉及一种与抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中相关的SNP标志物及其应用。
背景技术：
缺血性脑卒中，又被称为脑梗塞或脑梗死（中医则称之为中风），是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化。在我国，随着社会发展及居民生活方式和饮食习惯的不断改变，脑卒中已经成为目前我国人口死亡原因第二位的疾病，严重威胁居民健康。
目前根据循证医学的证据，在积极干预高血压、糖尿病、高胆固醇血病、脑血管狭隘等缺血性脑卒中的危险因素的同时，抗血小板聚集治疗是有效防治脑梗死的基石，可显著降低中风的复发率和死亡率。而氯吡格雷是继阿司匹林之后一个重要的噻吩并吡啶类抗血小板药物，对动脉粥样硬化相关心脑血管疾病（如心肌梗塞、中风或血管性死亡等）具有良好的防治作用。氯吡格雷作为前体药物，必须通过CPY450酶代谢，生成能抑制血小板聚集的活性代谢物。氯吡格雷的活性代谢产物选择性的抑制二磷酸腺苷（ADP）与其血小板P2Y12受体的结合及继发的ADP介导的糖蛋白GPIIb/IIIa复合物的活化，因此抑制血小板聚集。通过阻断释放的ADP诱导的血小板活化聚集途径也可抑制除ADP以外的其他激动剂诱导的血小板聚集，达到良好的治疗效果。
尽管服用氯吡格雷可以使大部分缺血性脑卒中患者获得良好收益，但是近年来越多越多的研究发现，不同患者对其具有不同的药物反应性。其中，据报道，约有4～30%患者服用氯吡格雷后未能达到充分抑制血小板聚集的作用，却引发一系列不良后果，这种现象被称为氯吡格雷抵抗。如何克服氯吡格雷抵抗成为广大临床医生和研究者热切关注的问题。众多遗传因素，如代谢酶、转运体、核受体基因多态性被认为与其具有紧密关联。单核苷酸多态性（SNP）被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性。因此如果患者在一些重要的相关调控基因上具有不同的SNP型，则会导致不同患者对氯吡格雷的治疗具有不同的反应性，因此相关SNP可能是氯吡格雷抵抗的关键因素。通过筛查氯吡格雷作用的相关的SNP谱，可以用来筛选氯吡格雷防治的受益人群。如果能够通过相关的SNP组合确定哪些缺血性脑卒中患者适合服用氯吡格雷，哪些患者不适合氯吡格雷治疗，就能够在发病初期确定最佳的用药方案，减少药物滥用，达到良好的治疗效果。然而，目前临床上仍然缺少相关SNP用于指导合理用药，是临床上急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种与抗血小板药氯吡格雷防治缺血性脑卒中相关的SNP位点，可用于采用抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中患者的临床用药指导，预防药物抵抗，增强治疗效果。具体是通过分离和研究服用抗血小板药物氯吡格雷的缺血性脑卒中患者的外周血DNA中的SNP，寻找与氯吡格雷反应性差异高度相关的位点，并研制出可临床或人群应用的氯吡格雷防治缺血性脑卒中的相关试剂盒，为缺血性脑卒中的防治药物选择提供指导。
本发明的目的是提供一种与抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中相关的SNP标志物。
本发明另一目的是提供上述标志物的特异性扩增引物和特异性延伸引物。
本发明的再一目的是提供上述标志物及其特异性扩增引物与特异性延伸引物在制备抗血小板药物氯吡格雷防治缺血性脑卒中的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的再一目的是提供用于缺血性脑卒中防治用药指导的辅助诊断试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种与抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中相关的SNP标志物，所述SNP标志物为 rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的组合，其序列依次分别如SEQ ID NO.1～5所示。上述SNP标志物的特异性扩增引物为：
rs6686001特异性扩增引物的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7示；
rs2302429特异性扩增引物的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
rs2242480特异性扩增引物的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
rs4244285特异性扩增引物的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
rs2046934特异性扩增引物的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
上述SNP标志物的特异性延伸引物为：
rs6686001的特异性延伸引物序列如SEQ ID NO.8所示；
rs2302429的特异性延伸引物序列如SEQ ID NO.11所示；
rs2242480的特异性延伸引物序列如SEQ ID NO.14所示；
rs4244285的特异性延伸引物序列如SEQ ID NO.17所示；
rs2046934的特异性延伸引物序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明筛选的上述SNP位点，与抗血小板药氯吡格雷防治缺血性脑卒中相关，可用于采用抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中患者的临床用药指导，预防药物抵抗，增强治疗效果。具体是通过分离和研究服用抗血小板药物氯吡格雷的缺血性脑卒中患者的外周血DNA中的SNP，寻找与氯吡格雷反应性差异高度相关的位点，并研制出可临床或人群应用的氯吡格雷防治缺血性脑卒中的相关试剂盒，为缺血性脑卒中的防治药物选择提供指导。
因此，以下所述应用在都应在本发明的保护范围之内：
所述SNP标志物在制备与抗血小板药物氯吡格雷防治缺血性脑卒中相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
所述特异性扩增引物和/或所述特异性延伸引物在制备与抗血小板药物氯吡格雷防治缺血性脑卒中相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
所述SNP标志物及其特异性扩增引物和/或特异性延伸引物在制备指导治疗缺血性脑卒的用药方案的制剂或试剂盒方面的应用。
一种与氯吡格雷防治缺血性脑卒中相关的辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有检测外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的组分。该试剂盒用于检测定外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的SNP标志物组合。
进一步地，所述组分包括权利要求2所述特异性扩增引物和/或权利要求3所述特异性延伸引物。
更进一步，优选地，所述组分还包括基因检测所需的试剂。
优选地，所述基因检测所需的试剂包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水、标准品和/或对照品等。
本发明人以标准操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，采用光比浊法检测ADP诱导的血小板聚集率来判定患者是否发生氯吡格雷抵抗，采用Sequenom MassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。具体地，本发明解决问题的技术方案包括：
（1）建立统一标准的标本库和数据库以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
（2）基因型检测：选择缺血性脑卒中患者将其分为氯吡格雷抵抗组和氯吡格雷非抵抗组，在与氯吡格雷相关通路范围内找出与防治缺血性脑卒中相关的阳性SNP位点。
（3）氯吡格雷防治缺血性脑卒中的辅助诊断试剂盒的研制：将脑卒中患者根据是否发生氯吡格雷抵抗进行分层，根据检测出的氯吡格雷相关SNP基因型分布频率，找出层间具有显著差异的SNP，开发辅助诊断试剂盒。
本发明选择了313例缺血性脑卒中患者，其中抵抗组106例，非抵抗组207例。将这两组人群经进行检测后获得相关结果。
根据Sequenom MassARRAY的检测，本发明人检测并比较得到了在氯吡格雷抵抗组和非抵抗组之间基因型分布频率在测层间存在明显差异的SNP包括rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934。
单因素和多因素回归分析结果均表明，这5个SNP与缺血性脑卒中患者的氯吡格雷抵抗现象存在着显著关联。
进一步分析这5个SNP的组合用于氯吡格雷治疗缺血性脑卒中辅助诊断的效果，发现其组合能够很好的区分氯吡格雷抵抗和氯吡格雷有效的缺血性脑卒中人群。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于氯吡格雷防治缺血性脑卒中的辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血DNA标本中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检测试剂。
具体而言，这5个SNP的组合，或者这5个SNP的特异性引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于氯吡格雷治疗缺血性脑卒中的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的自身状况，采取更具个性化的防治方案提供支持。
另外，本发明还提供了一种抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中患者的临床用药指导方法，是对每个SNP的基因型进行评分，以野生纯合型=“0”，其它=“1”，根据如下公式计算危险分值：
危险分值=（0.749 × rs6686001评分）+（0.810 × rs2302429评分）-（0.543 × rs2242480评分）+（0.671 × rs4244285评分）-（0.714 × rs2046934评分）；
根据危险分值来评估受试者是否适合服用氯吡格雷进行缺血性脑卒中的防治；cutoff值为0.2275，危险分值小于0.2275为氯吡格雷抵抗的低风险人群，可以服用氯吡格雷防治缺血性脑卒中；而危险分值大于0.2275为氯吡格雷抵抗的高风险人群，不宜服用氯吡格雷防治缺血性脑卒中。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的标志物序列改变作为氯吡格雷治疗缺血性卒中的辅助判断的标志物的优越性在于：
（1）SNP标志物是一种新型基因生物标志物，稳定、微创、易于检测，在疾病初期就可检出结果，可以有效提高疾病诊断及治疗相关的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为缺血性脑卒中患者的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
（2）采用科学系统的评价体系，本发明人应用Sequenom MassARRAY基因分型方法以获取疾病候选基因相关的SNP组合，以上方法保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用。
（3）本发明获得的与缺血性脑卒中患者的氯吡格雷抵抗现象相关的SNP标志物和特异性引物，并进行了相关辅助诊断试剂盒的研制。根据检测情况，与临床的氯吡格雷抵抗现象关联分析，综合考虑了每个SNP与氯吡格雷抵抗的正、负关联情况和联系强度，通过危险分值来评估受试者是否适合服用氯吡格雷进行结缺血性卒中的预防和治疗，对于具有高抵抗风险的患者采取替代药物（如替格瑞洛，阿司匹林等），指导临床用药，提高药物疗效。
附图说明
图1是缺血性脑卒中患者发生氯吡格雷抵抗的ROC曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 研究样本的选择收集和样品资料的整理
1、样本选择
（1）年龄 40～80岁，性别不限；
（2）符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准，并经CT或MRI证实；
（3）以75mg/天（含首次以300mg负荷剂量服用）口服氯吡格雷5天以上 （含5天）。
2、发明人共选择了313例符合标准的样本进行单个Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品，并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2 样品的血小板聚集率的检测——氯吡格雷抵抗的判定
1、采用光比浊法进行血小板聚集试验。取EDTA抗凝全血（1：9）2.7 ml，以800rpm离心5min，提取富含血小板血浆，再以3000rpm离心15min，提取贫血小板血浆，血小板计数为10～20×109/L，用PPP 调整 PRP至200～300×109/L，以PPP作空白对照，37℃预热3min，以10μM ADP为诱导剂，光比浊法测定患者的血小板聚集率。
2、测定缺血性脑卒中患者服服用氯吡格雷前（day0）和服用氯 吡格雷后（day5）血小板聚集率。若服药后血小板抑制率小于 10% 或 服用后血聚值 >50%，则认为发生氯吡格雷抵抗；按照此标准将纳入患者分为氯吡格雷抵抗组和非抵抗组。
3、通过临床检测患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率的变化，得出有106例病人存在氯吡格雷抵抗现象，207例病人不抵抗。
实施例3外周血DNA中SNP标志物的分型扫描
在上述符合条件的313例缺血性脑卒中患者（其中抵抗组106例，非抵抗组207例）经Sequenom MassARRAY分型检测获得相关结果。具体步骤为：
1、酚-氯仿法提取外周血基因组DNA
（1）取 EDTA 抗凝全血 100 μl，加无菌双蒸水 200 μl 混匀；
（2）加入 6 M 碘化钠 200 μl，混匀；
（3）加入氯仿/异戊醇（24：1，v/v）400 μl，反复混匀，静置 10 min； 12000 rpm 离心 10 min，吸取上层清液置另一离心管；
（4）向上清液加入异丙醇 300 μl 混匀，静置 3 min，12000 rpm 离心 10 min， 弃上清；
（5）加入预冷的 70% 乙醇 500 μl，静置 3 min，12000 rpm 离心 3 min，弃 去乙醇；
（6）重复步骤（5）一次，倒置片刻；
（7）样品放入真空干燥器至完全干燥后，加入TE缓冲液 40 μl 重悬 DNA， 待 DNA 充分溶解后，进行纯度和浓度的测定，以- 20℃条件保存。
通常能得到50～100ng/μl DNA，纯度(紫外260D与280D比值)在1.6～2.0。
2、DNA 浓度及纯度测定
（1）取样品20 μl，加超纯水至600 μl，充分混匀，用紫外分光光度计测定波长分 别为260 nm、280 nm、320 nm 时的OD值，计算DNA的浓度和纯度。
（2）DNA浓度(μg/ml)= (OD260－OD320)×50μg/ml×稀释倍数（稀释30倍）
（3）DNA 纯度= (OD260－OD320) / (OD280－OD320)
标准 DNA 纯度比值为1.8；比值>1.9，表明有RNA污染；比值< 1.6，表 明有蛋白质等污染，可用氯仿/异戊醇再次抽提纯化。本次所用DNA全部合格。
实施例4 SNP的Sequenom MassARRAY基因分型：
1、取受试者样本，设计特异性引物，PCR反应和SNP测定，检测并比较氯吡格雷抵抗组和非抵抗组的缺血性脑卒中患者不同基因型的分布差异。
具体方法如下：
（1）引物设计：
登录 Sequenom 网站，利用在线 Assay Design Suite 设计 Sequenom IPLEX 引（https://seqpws1.sequenom.com/AssayDesignerSuite.html#design:new = Genotyping）
（2）PCR 反应体系:
DNA阵列质谱基因分型PCR体系为7 µL，其中包括DNA 2 µL，去离子水3.3 µL，10×PCR Buffer with 20 mM MgCl2 0.5 µL，25 mM MgCl2 0.4 µL，25 mM dNTP Mix 0.1 µL，1 µM Primer Mix 0.5 µL，5 U/µL PCR Enzyme 0.2 µL。
（3）PCR反应条件如表1：
表1 PCR反应条件
（4）SAP反应体系：SAP反应体系为9 µL，其中包括7 µL PCR产物，去离子水1.53 µL，SAP buffer 0.17 µL，SAP enzyme 0.3 µL。
（5）SAP反应条件如表2：
表2 SAP反应条件
（6）延伸反应体系延伸反应体系为11 µL，其中包括9 µL SAP产物，去离子水0.619 µL，iPLEX buffer 0.2 µL，iPLEX termination mix 0.2 µL，Extension primer mix 0.94 µL，iPLEX enzyme 0.041 µL。
（7）延伸反应条件如表3：
表3 延伸反应条件
（8）芯片点样及数据获取：用15mg CLEAN 树脂为样本除盐后，应用MassARRAY RS1000 将反应液转移到96-pad Spectro CHIP上，使用MassARRAY Typer工作站进行打谱操作，通过Typer 4软件获取数据及图谱。
2、数据处理和分析：
利用logistic回归模型比较在氯吡格雷抵抵抗组和非抵抗组中目标基因频率的分布差异，筛选出存在显著性差异的5个阳性关联SNP。具体5个SNP标志物及其扩增引物序列见表4和表5。
表4 5个SNP标志物序列
表5 SNP标志物的扩增引物序列
注：F：Fowward Primer，上游引物序列；R：Reverse Primer，下游引物序列；E：Extended Primer，延伸引物序列。
实施例5 利用危险度评分方法分析SNP与氯吡格雷抵抗的关系
1、根据上述结果，本发明人通过对抵抗组和非抵抗组样品进行基因型分布频率的比较，最终选择出5个阳性关联的，以单个回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而分析这些对服用抗血小板药物氯吡格雷发生抵抗的情况进行诊断。对5个标志物的联合分析发现，这5个SNP以70.9%的AUC将适合服用氯吡格雷和不适合服用氯吡格雷的脑卒中患者分开（如图1所示）。
2、因此，本发明人证明了采用rs6686001， rs2302429， rs2242480， rs4244285， rs2046934的组合能够很好地区分适合服用氯吡格雷和不适合服用氯吡格雷的人群。
也就是说，这5个SNP的组合区分出的适合服用氯吡格雷的人群适合用这类药物进行预防或者治疗，区分出的不适合服用氯吡格雷的人群则建议更换其他抗血小板药物（如替格瑞洛，阿司匹林等）进行防治。
实施例6
运用卡方检验用于分类变量或者t检验用于连续性变量比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析模型进行关联分析。
为了进一步研究这5个SNP构成的综合指征用于评价辅助诊断的效果，我们构建了一个数学模型，综合考虑每个SNP与氯吡格雷抵抗发生的联系强度。具体来说，我们对每个SNP的基因型进行评分，以野生纯合型=“0”，其它=“1”，以单个SNP分析时的logistic回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。
危险分值的计算方法如下：
危险分值=（0.749 × rs6686001评分）+（0.810 × rs2302429评分）-（0.543 × rs2242480评分）+（0.671 × rs4244285评分）-（0.714 × rs2046934评分）。
获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于关联研究的313例样本中。根据危险分值来评估受试者是否适合服用氯吡格雷进行缺血性脑卒中的防治，cutoff值为0.2275，并据此估算风险，评估危险分值为小于0.2275为氯吡格雷抵抗的低风险人群，可以服用氯吡格雷防治中风。而危险分值大于0.2275为氯吡格雷抵抗的高风险人群，建议换用其它药物治疗。
表6 病例组与对照组关联分析结果
统计学分析均通过专门的统计学分析软件（SPSS 21.0）完成工。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
实施例7吡格雷防治缺血性脑卒中相关的辅助诊断试剂盒的制作
1、试剂盒的制作和操作流程是基于Sequenom MassARRAY基因分型技术。
Sequenom MassARRAY对候选基因通路上单个检测后，在是否发生氯吡格雷抵抗这一因素下，确定缺血性脑卒中患者基因型分布频率层间具有显著差异的，以此作为氯吡格雷防治缺血性脑卒中辅助诊断的指标。最后筛选出的与非氯吡格雷防治缺血性脑卒中辅助诊断相关的SNP（rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934）组成相应试剂盒。
试剂盒含有一批SNP特异性引物包括下列引物的引物序列（rs6686001的引物序列为SEQ ID NO.1-3，rs2302429的引物序列为SEQ ID NO.4-6，rs2242480的引物序列为SEQ ID NO.7-9，rs4244285的引物序列为SEQ ID NO.10-12，rs2046934的引物序列为SEQ ID NO.13-15）。
试剂盒还可以含有相应技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，以及用于确定基因型的标准品和空白对照等。
2、此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱指导缺血性脑卒中患者中氯吡格雷的使用，不仅稳定，检测方便，且精确，可以辅助提高药物治疗的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学，广州中大南沙科技创新产业园有限公司
<120> 一种与抗血小板药物氯吡格雷治疗缺血性脑卒中相关的SNP标志物及其应用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
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