一种检测缺血性脑卒中的生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种检测缺血性脑卒中的生物标志物及其应用。
背景技术：
：脑卒中又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)。是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性脑卒中又称脑梗死，中医称之为中风。本病系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。缺血性脑卒中依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部脑梗死的60％，因而通常所说的‘脑梗死’实际上指的是脑血栓形成。缺血性脑卒中病因：由于缺血性脑卒中的主要分类——脑血栓形成的病因基础主要为动脉粥样硬化，因而产生动脉粥样硬化的因素是发生脑梗死最常见的病因。由于动脉粥样硬化好发于大血管的分叉处和弯曲处，故脑血栓形成的好发部位为颈动脉的起始部和虹吸部、大脑中动脉起始部、椎动脉及基底动脉中下段等。当这些部位的血管内膜上的斑块破裂后，血小板和纤维素等血液中有形成分随后黏附、聚集、沉积形成血栓，而血栓脱落形成栓子可阻塞远端动脉导致缺血性脑卒中。近期在全球范围内进行的INTERSTROKE研究结果显示：脑梗死风险中的90％可归咎于10个简单的危险因素，它们依次是高血压病、吸烟、腰臀比过大、饮食不当、缺乏体育锻炼、糖尿病、过量饮酒、过度的精神压力及抑郁、有基础心脏疾病和高脂血症。脑卒中是我国继心血管疾病、恶性肿瘤疾病之后的第三大致死性疾病，每年发病率为150/10万，死亡率为120/10万。脑卒中分为缺血卒中和出血性卒中。其中，临床上缺血性卒中更为常见，约占全部脑卒中的70％。约有50％～75％的脑卒中与高血压有关，高血压史使脑卒中的风险增加2.5倍以上。如果应用更严格的高血压定义——血压＞160/90mmHg，这种风险因素的相关性会增加。缺血性脑卒中的病死率约为10％，致残率可达50％以上。存活者的复发率高达40％，缺血性脑卒中复发可严重削弱患者的日常生活和社会功能，而且可明显增加死亡率。目前，识别引起脑卒中的原因是主要根据头颅CT扫描，核磁共振成像技术和动脉造影。但CT、MRI扫描并不是完全可信的方法，因为在诊断早期CT对缺血性脑卒中只有16％的灵敏度，而对于出血性脑卒中却有89％的灵敏度。20％缺血性脑卒中并不能够被MRI扫描技术探测到。且影像诊断技术并不存在于所有诊疗中心中，这些都阻碍了脑卒中的快速诊断和药物的及时应用。生物标志物是药物研发过程中的有效工具，它提供了药物性能及疾病进程的相关信息，反映了具体的药物治疗效果。糖尿病及免疫性疾病等多种疾病都已经根据生物标志物进行治疗。然而，在脑血管病中生物标志物仍相对缺乏。因此，探索缺血性脑卒中的生物标志物有着重要的意义。由于传统诊断不足，找到诊断脑卒中的新颖的生物标志成为了一种迫切的需求。针对辨认生物学标志物用iTRAQ和高分辨率的质谱来进行相对定量是一项很有前途的技术。识别体液中的缺血性脑卒中生物学标志物对于影像学诊断具有辅助性作用。技术实现要素：为了实现脑卒中的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种角蛋白，I型细胞骨架蛋白9(Keratin，typeIcytoskeletal9(KRT9))蛋白在作为缺血性脑卒中生物标志物中的应用。为实现上述目的，本发明首先提供了一种检测缺血性脑卒中的生物标志物，所述生物标志物包括KRT9蛋白或其活性片段；编码所述KRT9蛋白的mRNA；编码所述KRT9蛋白的基因。本发明的第二方面提供了所述生物标志物在诊断缺血性脑卒中和/或评估罹患缺血性脑卒中风险的产品中的应用。本发明的第三方面提供了所述生物标志物在评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后产品中的应用。优选的，所述产品包括芯片或试剂盒。优选的，所述KRT9蛋白在缺血性脑卒中生物样品中表达上调。优选的，所述检测包括基因水平的检测和蛋白水平的检测。如，所述基因水平的检测包括real-timePCR法、Northernblot、Southernblot、基因芯片、原位杂交或RNA酶保护实验等。所述蛋白水平的检测包括免疫检测、Westernblot或蛋白芯片等。为了简化实验程序，所述蛋白水平的检测还包括蛋白检测试剂盒，如ELISA检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、化学发光试剂盒、免疫荧光试剂盒等。所述试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，说明书一般包括公司标志及名称、试剂盒名称、试剂盒组成、保质期、使用领域、使用方法等项目，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。优选的，所述免疫方法为ELISA法检测和/或胶体金检测。所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒包括：包被KRT9单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。本发明的第四方面提供了所述生物标志物在筛选预防或治疗脑卒中的药物的应用。优选的，所述KRT9蛋白在缺血性脑卒中生物样品中表达上调。优选的，所述的样品为血液，如血清、血浆或全血。本发明的第五方面提供了能够抑制血液中KRT9蛋白表达的物质在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用。本发明的第六方面提供了用于检测脑卒中发生的系统，该系统包括检测KRT9蛋白或其活性片段的物质。优选的，所述系统包括数据处理装置，所述数据处理装置内设采集比较模块a和处理模块b，所述采集比较模块a的功能为：采集并比较待测者与对照者的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量；所述处理模块b的功能为根据比较的结果按照如下方法确定待测者是否为脑卒中患者：若所述待测者的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量显著高于所述对照组的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量，则所述待测者为或候选为脑卒中患者；反之，则所述待测者不为或候选不为脑卒中患者；所述对照者为健康人。优选地，处理模块b中判断上调的标准是待测者的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量比对照者至少提高30％。优选地，处理模块b中判断上调的标准是待测者的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量比对照者至少提高60％。优选地，处理模块b中判断上调的标准是待测者的组织样本中所述KRT9蛋白或其活性片段的表达量比对照者至少提高90％。本发明的有益效果如下：本发明公开了一种与脑卒中相关的蛋白KRT9，并进一步证实该KRT9蛋白或其活性片段在脑卒中组织中表达上调。利用该蛋白检测脑卒中不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1本发明实施例2中的色谱图；图2本发明实施例3中的KRT9表达量标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法。本发明的发明人对6例脑卒中样本及6例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行筛选，挑选出候选蛋白KRT9，现有研究中并没有KRT9蛋白和脑卒中相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了KRT9蛋白在缺血性脑卒中组织中表达上调，其相关产品可用于诊断、治疗缺血性脑卒中。本发明的KRT9蛋白是在本发明之前的已知蛋白，其基本信息如下：NCBIReferenceSequence：NP_000217.2。本发明还采用ELISA检测试剂盒检测上述蛋白在缺血性脑卒中和正常人群中的表达，并验证了该蛋白为缺血性脑卒中中表达上调。本发明应用iTRAQ联合质谱的方法鉴定急性缺血性脑卒中患者血清中导致内皮功能紊乱的蛋白标志物。同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术由ABSCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ试剂包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。(1)报告部分有八种：113-121(无120)，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。(2)肽反应部分：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。(3)平衡部分：保证被标记的同一肽段的质荷比相同。与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术服务优势：(1)灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；(2)分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；(3)高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；(4)结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；(5)自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。本发明的了KRT9基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-PhasePeptideSynthesis，WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。本文使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过脑卒中分期确定与脑卒中不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一蛋白相比，所述基因在从患脑卒中或通过脑卒中分期确定的脑卒中已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平升高。根据本发明，“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达升高，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明生物标志物对应的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接变体时，表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定，例如包括使用SYBR绿、TaqMan和分子信标技术的定量实时RTPCR。本文使用的“对照”指未显示任何OA症状并且未诊断为脑卒中或OA的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响OA的药物，并且未诊断为患有任何其他疾病。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自样本组织的RNA，其中RNA分离自样本组织，所述样本组织分离自组织移除时未诊断为OA并且未显示任何OA症状的个体。本发明的生物学样品血在本发明的一个方面中，根据本领域熟知的方法从受试者中获得血样。可以使用本领域技术人员已知的技术(特别是已知的采血方法)从受试者的任何身体部位(如指、手、腕、臂、腿、足、踝、胃和颈)取血。在一个具体的实施方案中，从受试者获得静脉血并根据本发明方法使用。可以使用真空管、注射器或蝶形针取血。采血量将取决于采血部位、本发明方法需要的量和受试者的舒适度而变化。如在多个具体的实施方案中，从受试者收集0.001mL、0.005mL、0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL或更多血。将血保存在K3/EDTA管中。在一个方面中，根据本领域熟知的采血方法从正常个体或者从诊断为患脑卒中或怀疑患脑卒中的个体取全血。全血包括可直接使用的血，并包括已经根据本领域熟知的方法(例如优选在300-800×g温和离心5-10分钟)除去血清或血浆并且已经从剩余血样中分离了RNA或mRNA的血。在一个具体的实施方案中，将得自受试者的全血(即未分级血)与裂解缓冲液(如裂解缓冲液(1L)：0.6gEDTA；1.0gKHCO2，8.2gNH4Cl，用NaOH调整至到pH7.4)混合，离心样品并保留细胞沉淀，根据本领域熟知的方法提取RNA或mRNA(“裂解血”)(参阅如Sambrook等)。优选使用全血，因为它避免了昂贵耗时的分离血中细胞类型的步骤(Kimoto，1998，Mol.Gen.Genet258：233-239；ChellyJ等，1989，Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：2617-2621；ChellyJ等，1988，Nature333：858-860)。在本发明的一些实施方案中，将收集自受试者的全血进行分级(即分离成组分)。在本发明的一个具体实施方案中，使用本领域已知技术从收集自受试者的全血分离血细胞。例如，可以对收集自受试者的血进行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心。这种离心将红细胞(血红细胞)与各种类型的有核细胞和血浆分离开。具体地，Ficoll-Hypaque梯度离心可用于分离外周血白细胞(PBL)，它们可根据本发明方法使用。其他全血分离方法按照本领域技术人员所熟知的方法进行操作。在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的生物学样品保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-80℃)保存。在一些实施方案中，作为保存样品的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。实施例1样本的收集取2015年06月到2015年12月期间在解放军火箭军总医院就诊缺血性脑卒中患者，病例组共收集6例，对照来源于同时期来解放军火箭军总医院体检但各项指标均正常的健康志愿者，共收集6例，具体信息如表1所示。获取所有研究对象的肘正中静脉血，5ml，4度冰箱静置1h，离心1500rpm、10min，取上清，离心1500rpm、10min，取上清，分装保存于-80度冰箱。表1样本信息实施例2iTRAQ实验筛选差异蛋白一、所用仪器和试剂涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901)恒温孵浴器(上海浦东荣丰科学仪器有限公司，型号：HH.S4)真空冷冻干燥机(Thermo，型号：SPD2010-230)RIGOLL-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)，流动相A：98％ddH2O，2％乙腈(pH10)；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O(pH10)高效液相色谱仪：(ThermoScienticEASY-nLC1000System(NanoHPLC))，流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸质谱系统(Thermo，型号：Q-Exactive)Blue白蛋白IgG去除试剂盒(Sigma-Aldrich，货号：PROTBA-1KT)DTT(Bio-Rad，货号：161-0611，美国)碘乙酰胺(Bio-Rad，货号：163-2109，美国)试剂盒中的DissolutionBuffer(ABSciex，PN：4381664)胰酶(Promega，货号：V5111，美国)10K超滤管(milipore，PN：UFC5010BK)8标试剂盒(ABSciex，PN：4390812，PN：4381664)Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2μg))色谱柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，(Agela，货号：DC952505-0)乙腈(Merck，货号：100030，德国)氨水(Sigma-Aldrich，货号：17837，美国)二、iTRAQ定量实验流程2.1样本蛋白处理2.11、平衡柱子1)缓慢颠倒培养液，涡旋混匀培养液；2)取0.4ml培养液到柱子中，保证培养液是混匀的；3)将柱子放入2ml收集管中，以10000rpm(8000g)的速度离心5-10s；4)加0.4ml平衡缓冲液到柱子中，以10000rpm(8000g)的速度离心5-10s，将2ml收集管中的缓冲液倒掉，并将柱子再次放到原来的2ml离心管中；5)再加0.4ml平衡缓冲液到柱子中，以10000rpm(8000g)的速度离心20-40s，将2ml收集管中的缓冲液倒掉，并将柱子放到一个新的2ml离心管中。2.12、去除血清中的白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)1)加25-100ul血清样本到处理过的柱子中，并在室温下孵育5-10min；2)离心柱子和收集管，10000-12000rpm(8000-12000g)*60s；3)再将收集管中的洗出液加入到柱子中，室温下孵育5-10min；这一步去除了超过5％的白蛋白；4)在同一个收集管中离心柱子10000-12000rpm(8000-12000g)*60s；5)经过两次洗脱留在收集管中的血清与第六步清洗步骤的液体混合；6)洗脱柱子中残余未绑定蛋白：柱子中加入100ul平衡缓冲液，离心；10000-12000rpm(8000-12000g)*60s，将第4、6两步骤收集管中得到的液体混合；7)去除白蛋白和IgG的血清可在-20℃长期贮存。2.2Bradford法蛋白定量采用Bradford法[MarionM.Bradford.AnalyticalBiochemistry，1976，72：248-254]测定样本提取的蛋白浓度。得到各样品蛋白浓度(见表2)表2蛋白样品浓度2.3蛋白酶解(FilterAidedSamplePreparation，FASP)1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；2)加入终浓度25mMDTT，60度反应1小时；3)加入终浓度50mM碘乙酰胺，室温10分钟；4)将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液；5)加入iTRAQ试剂盒中的DissolutionBuffer100μl，12,000转离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次；6)更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg(与蛋白质量比1∶50)，体积50μl，37摄氏度反应过夜；7)次日，12,000转离心20分钟，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；8)在超滤管中加入50μlDissolutionBuffer，12,000转再次离心20分钟，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品。2.4iTRAQ标记1)从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将试剂离心至管底；2)向每管试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；2)取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中；4)将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2小时；5)加入100μl水终止反应；6)为了检测标记效率及定量准确性，从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF(ABSCIEX4800Plus)鉴定，确认标记反应良好；7)混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；8)真空冷冻离心干燥；9)抽干后的样品冷冻保存待用；10)酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析。2.5高pH条件下的反相色谱分离1)混合标记后的样品用100μl流动相A溶解，14000g离心20min，取上清待用；2)使用400μg酶解好的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，检测系统情况；3)取100μl准备好的样本上样；4)流速0.7ml/min，分离梯度如表3所示，色谱图如图1所示。表3反相色谱分离梯度2.6纳升级反相色谱-QExactive进行蛋白质分析1)将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；2)12,000转离心10分钟，吸取上清上样；3)上样体积10μl，采取夹心法上样；4)LoadingPump流速350nl/min，15分钟；5)分离流速300nl/min，分离梯度如表4所示。表4纳升级反相色谱分离梯度三、质谱数据分析和结果数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在本次实验中选择的数据库来自UniProt(http://www.uniprot.org/)，数据库本版为：UniProt_Susscrofa_201510.fasta。iTRAQ的质谱分析是由ThermoQ-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件*.RAW采用Thermo公司的配套商用软件ProteomeDiscoverer1.4处理。本次iTRAQ实验共鉴定到272个总蛋白，其分析到差异蛋白14个。为了更好的理解差异蛋白的功能，我们对差异蛋白进行了GeneOnlogy和信号通路分析，并对差异蛋白进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异蛋白KRT9，该蛋白在缺血性脑卒中样本中表达上调。实施例3大样本验证差异蛋白KRT9的表达1、取样取2014年01月到2015年12月期间在解放军火箭军总医院就诊缺血性脑卒中患者，病例组共收集20例，分别标号为A1-A20，对照来源于同时期来解放军火箭军总医院体检但各项指标均正常的健康志愿者，共收集10例，分别标号为B1-B10。获取所有研究对象的肘正中静脉血，5ml，4度冰箱静置1h，离心1500rpm、10min，取上清，离心1500rpm、10min，取上清，分装保存于-80度冰箱。2、实验过程实验选用人角蛋白，I型细胞骨架蛋白9(KRT9)ELISA试剂盒(购买自厦门慧嘉生物科技有限公司)该人角蛋白，I型细胞骨架蛋白9(KRT9)ELISA检测试剂盒操作步骤如下：(1)标准品的稀释：临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300pg/ml，150pg/ml，75pg/ml，37.5pg/ml，18.5pg/ml，9pg/ml，4.5pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。(2)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。(3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃，60分钟。(4)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡l-2分钟，350μl/每孔，甩干。(5)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液)100μl，37℃，60分钟。(6)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。(7)依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。(8)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。(9)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。3结果获得7个标准品的OD值，如表5所示，制作的标准曲线如图2所示。实验得到了20个样本的OD值，根据标准曲线，计算样品中KRT9的浓度，其结果如表6所示。其中，样品的OD值为三个副孔去背景后的OD均值。统计学分析表6中数据，可知20个样本的浓度值在70-90pg/ml之间，对照样本的浓度均值为54.904pg/ml，上述差异具有统计学意义(P＜0.05)，上述结果表明，KRT9蛋白在缺血性脑卒中样本中表达水平升高，提高在30％以上。表57个标准品的OD值标准品1234567浓度(pg/m1)4.5918.537.575150300OD值0.0810.1170.2200.3150.4330.5290.715表6样品和对照的OD值和浓度值实施例4ELISA评价脑卒中的治疗效果样本选用实施例1中的6例缺血性脑卒中病人，KRT9蛋白的ELISA操作同实施例3，治疗前检测血清中KRT9蛋白水平，跟踪随访这6位患者，疗程结束后再检测血清中KRT9蛋白水平，对比血清中KRT9蛋白含量变化，具体KRT9蛋白的表达水平参见表7。从表7中KRT9含量变化与治疗效果的比较可以看出，临床治疗效果越显著的患者，其血清中KRT9蛋白水平升高的越多；临床治疗效果不明显的患者，其血清中KRT9蛋白水平无明显变化。该结果表明，检测血清中KRT9蛋白水平可对缺血性脑卒中治疗效果进行评估，即KRT9蛋白在评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后产品中有应用前景。表7临床检测缺血性脑卒中治疗前后KRT9水平虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3