铅暴露工人岗前入职筛选微小RNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物技术学领域，涉及血清/血浆微小rna(microrna，简称mirna)的应用，公开了一种用于铅暴露工人岗前入职筛选的血清/血浆mirna及其应用。

背景技术：

铅因其在环境中不可降解而普遍存在，可通过消化道、呼吸道等途径进入机体影响神经、消化、造血等多个系统的功能，造成机体损害。铅所致的神经发育毒性无阈值，有研究报道即使血铅水平低于100μg/l仍然存在神经发育毒性(akesson,aetal2005)。因此，寻找铅中毒易感者标志物有助于及早发现铅中毒易感人群。在既往研究中，多种mirnas被证实出现了差异性表达，并参与了铅中毒的过程中。

随着经济的发展，铅引发的职业健康问题也引起了相关政府部门的密切关注。国家职业安全与健康研究所(niosh)的一份报告估计，美国有大约300多万工人在工作时可能接触铅。2014年，中国疾病控制中心报告了224起慢性铅中毒职业病例，血铅浓度超过600μg/dl(blls)。工业铅中毒的主要暴露源包括电池循环，铅汽油工业，轴承臂工作，管道制造，造船，颜料和印刷。此外，靠近铅相关工业厂房的农田也容易受到污水污染，特别是在下游地区。

有毒金属通常与人体中表观遗传学的修饰密切相关，包括dna甲基化，组蛋白乙酰化和mirna失调。这些表观遗传变化也可能通过其特殊机制影响基因的表达。作为表观遗传学的一个重要组成部分。微小rna(microrna，mirna)是一类长约20～25个核苷酸的非编码rna，它参与细胞的靶mrna的3’端非翻译区序列完全或部分互补结合，导致靶mrna降解或转录后翻译抑制，从而调控靶基因的表达。

研究发现，血清/血浆mirna非常稳定，反复冻融、酸碱环境、煮沸、长期保存等均不会造成血清/血浆mirna的损失，而且mirna在外周血中的表达同样具有组织的相关性和特异性。循环mirna检测损伤性小、灵敏度高、可重复性好、费用低，已有很多关于血清/血浆mirna用于肿瘤早期检测和预后生物标志物的(avila-morenoetal.2011；quetal.2011；cortezetal.2012)，但其作为铅暴露工人入职筛选还是首创。在这项研究中，我们通过调查铅耐受型工人血清/血浆及年龄性别匹配的铅易感型工人血清/血浆中筛选出差异表达的mirnas，然后找出血清/血浆中共同上调或下调的mirnas，作为铅暴露工人岗前筛查血清/血浆mirna标志物，为铅暴露工人岗前入职筛选提供依据。

技术实现要素：

本发明目的，首次将铅耐受型工人血清/血浆与年龄性别等匹配的铅易感型工人血清/血浆筛选出差异表达的mirnas，然后找出血清/血浆中相对上调(明显增加)或下调(明显降低)的mirnas，再通过与入职前铅耐受型工人和铅易感型工人血清/血浆中mirnas做对比，找出入职前相同差异改变的mirna，作为筛选出铅暴露工人岗前筛查血清/血浆mirna标志物，为铅暴露工人岗前入职筛选提供依据。

本发明技术方案：铅暴露工人岗前入职筛选微小rna标志物，即检测铅暴露工人的血清/血浆微小rna标志物，所述生物标志物为：mir-520c-3p、mir-211、mir-148a、mir-572。

其中mir-211序列uucccuuugucauccuucgccu。

所述铅暴露工人岗前入职筛选微小rna标志物在制备检测的试剂盒中应用。

试剂盒通过检测铅耐受者的mir-211含量，并与铅易感者水平相比较来进行铅暴露工人岗前筛查。mir-211pcr扩增法rt引物及扩增引物或seqidno:3所示的mir-211探针法检测引物；其中在于所述试剂盒中mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端扩增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端扩增引物：tggtgtcgtggagtc。

其中铅耐受者血清/血浆中mir-520c-3p、mir-211、mir-148a含量明显增高，是铅易感型工人血清/血浆中的含量的2-3倍、铅耐受者血清/血浆中mir-572明显降低，是铅易感型工人血清/血浆中的含量的0.3-0.5倍。

所述的应用通过检测铅耐受组的mir-211含量，并与铅易感组水平相比较进行筛选。

有益效果：本发明首次将铅耐受型工人血清/血浆与年龄性别等匹配的铅易感型工人血清/血浆筛选出差异表达的mirnas，然后找出血清/血浆中相对上调或下调的mirnas，再通过与入职前铅耐受型工人和铅易感型工人血清/血浆中mirnas做对比，找出入职前相同差异改变的mirna，作为筛选出铅暴露工人岗前筛查血清/血浆mirna标志物，为铅暴露工人岗前入职筛选提供依据。作为筛选出铅暴露工人岗前筛查血清/血浆mirna标志物，操作简单，灵敏度高，适用于大规模易感人群筛查。

附图说明

图1中a、b、c、d分别对应hsa-mir-520c-3p、hsa-mir-211、hsa-mir-148a和hsa-mir-572四个mirnas在226例铅暴露工人血清/血浆中的表达水平；

图2入职前铅耐受型(图2中左)和铅易感型(图2中右)工人血清/血浆中mir-211的表达水平。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：

样本的筛选

血清/血浆样本的收集：每位铅暴露工人提供5ml新鲜血液，离心后收集上层血清/血浆，充分摇匀后置于冰盒带回实验室。采用pe900t型原子吸收光谱仪及配套试剂测定血铅值，206d型zpp测定仪测定锌原卟啉值。

不同铅酸蓄电池企业，相同工种中随机整群抽取1130名职工，匹配性别、年龄及环境铅暴露水平后筛选出血铅浓度最高的10％人群共113例为铅耐受组，血铅≥400μg/l，筛选出血铅浓度最低的10％人群共113例为铅易感组，血铅≤400μg/l。

所有工人都经过资深医生的诊断，使用统一的健康状况调查表，以面对面的方式铅暴露工人进行现场流行病学调查。调查内容包括一般人口学特征、学历、暴露时间、工龄等相关信息。所有调查人员均经过统一培训。

表1.总体铅暴露工人基本信息

表2.筛选样本基本信息

铅暴露人群血清/血浆特异mirna表达谱初筛

(1)选取10例在性别、年龄、工龄、暴露时间匹配的铅耐受型工人血清/血浆，同时选取10例性别、年龄、工龄、暴露时间匹配均匹配的铅易感工人血清/血浆，铅耐受型和铅易感型的基本信息见表3a和表3b。

表3a.五例提供血清/血浆铅耐受型工人的基本信息

表3b.五例提供血清/血浆铅易感型工人的基本信息

(2)采用qiangen试剂盒从铅暴露工人血清/血浆中提取总rna。

(3)通过taqman低密度芯片(taqmanlowdensityarray，tlda)筛选候选mirnas。

mirna表达谱分析及验证

对比分析铅耐受组和铅易感组的血清/血浆芯片mirna表达谱结果，以血清/血浆△△ct大于2为标准，筛选出血清/血浆芯片结果mirnas共4个，分别为mir-520c-3p,mir-211,mir-148a和mir-572，其中在血铅浓度高的耐受组mir-520c-3p,mir-211,mir-148a表达均下调。然而，mir-572的表达上调。在此基础上，采用113例铅耐受组与113例铅易感组血清/血浆样本对该4个mirnas进行验证。

血清/血浆mirna表达量的检测方法

本方法采用taqmanprobe-basedqrt-pcr检测血清/血浆中mirna的表达量。

(1)rna的提取

血清/血浆rna采用lsreagent试剂提取，提取方法参照lsreagent说明书流程进行。

(2)逆转录

采用taqmanmirna逆转录试剂盒和mirna特异性茎环结构(stem-loop)逆转录引物进行mirna逆转录反应，具体操作参照abi公司推荐的程序，其中部分进行调整，反应体系包括3μl5×的逆转录引物(同时加入5个逆转录引物，每次包含内参的逆转录引物)、1.5μl10×的逆转录缓冲液、0.15μl100mmol/l的dntp和dttp混合物、1μl逆转录酶(50u/μl)、0.19μl的rna抑制剂，共5.84μl，每个反应体系中加入9.16μlrna，总反应体系为15μl。该方法的反应条件为：16℃反应30min，42℃反应30min分钟，最后85℃孵育5min。

(3)实时荧光定量pcr

采用taqman探针法进行实时荧光定量pcr，具体操作参照abi公司推荐的程序，其中部分进行调整，反应体系包括：0.25μl20×mirna检测探针、2.5μl2×mastermix、1.25μl双蒸水、1μl稀释后的cdna，共5μl，每个mirna检测实施4平行，以cel-mir-238为内参。使用abiprism7900荧光定量pcr仪检测，其反应条件：95℃反应10min、95℃反应15sec、60℃反应1min，40个循环。逆转录和实时荧光定量pcr过程所需探针由abi公司合成，相应mirna的id号见后文提供。

分析铅耐受组和铅易感组血清/血浆中的mirna表达水平

实时荧光定量pcr技术是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，ct值系指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。目的mirna起始拷贝数越多，则ct值越小，反之则越大。在目的mirna与内参扩增效率相同的情况下可以直接得到目的mirna相对于内参的定量△ct＝ct目的-ct内参，倍数＝△ct耐受/△ct易感。使用sds2.4软件分析tlda芯片数据，采用sas10.0软件做进一步的统计分析。

表4四种mirnas在铅暴露工人血清/血浆中的表达

筛选铅暴露工人岗前入职的生物标志物

通过入职前检查的血液样本，这些工人血铅浓度低于50μg/dl，且没有接触任何铅暴露的工作史。mir-211表达量在铅易感组和铅耐受组工人间差异存在明显的统计学意义(p＝0.009)，见图2。这些结果表明，mir-211可能是一个铅暴露敏感指标，且始终贯穿不同时期的慢性铅暴露生物标志物。

所述试剂盒中含有seqidno:2所示的mir-211的rt引物、seqidno:3所示的mir-211的f端引物。

seqidno:1：mir-211：uucccuuugucauccuucgccu

seqidno:2：pcr扩增法：

mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端扩增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端扩增引物：tggtgtcgtggagtc

内参u6引物：u6-f：ctcgcttcggcagcac

u6-r：aacgcttcacgaatttgc

seqidno:3：探针法检测：

内参cel-39:000200

mir-211:000514

每个id的产品同时包括逆转探针和pcr探针。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

seqidno:1：mir-211：uucccuuugucauccuucgccu

seqidno:2：pcr扩增法：

mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端扩增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端扩增引物：tggtgtcgtggagtc

内参u6引物：u6-f：ctcgcttcggcagcac

u6-r：aacgcttcacgaatttgc

seqidno:3：探针法检测：

内参cel-39:000200

mir-211:000514