本发明涉及一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用，属于酶工程领域。
背景技术：
果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。
目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种碱性果胶酶的突变体，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO,2所示。
本发明的第三个目的是提供获得所述碱性果胶酶突变体的方法，是将SEQ ID NO.3所示碱性果胶酶氨基酸序列中的自组装双亲短肽AEAEAKAKAEAEAKAK突变为AELEAKLKAELEAKLK。
在本发明的一种实施方式中，所述AELEAKLKAELEAKLK以PT-linker为连接肽与SEQ ID NO.3所示碱性果胶酶N端连接，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的碱性果胶酶突变体。
本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主、pET-22b(+)为载体，表达所述碱性果胶酶突变体。
本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将编码所述碱性果胶酶突变体的基因与载体连接，表达至大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-22b(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产碱性果胶酶包涵体的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至TB培养基中，30～37℃培养10～36h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至TB培养基中，37℃培养10～36h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以3～5％(v/v)的接种量进行接种。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以3％(v/v)的接种量进行接种于TB培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种至含有2％的葡萄糖的LB培养基中，37℃培养10～12h，再以3％v/v的接种量转接至TB培养基中。
在本发明的一种实施方式中，当菌体浓度OD600＝0.55～0.65时加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导培养24～72h。
在本发明的一种实施方式中，当菌体浓度OD600＝0.55～0.65时加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导培养48h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将基因工程菌在LB培养基中培养10～12h，获得种子液；将种子液按体积比3％的接种量接入发酵培养基TB中，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
本发明还要求保护编码所述突变体，以及表达该突变体的基因工程菌在食品、纺织或造纸方面的应用。
有益效果：碱性果胶酶作为重要的工业催化酶，整个过程中反应条件温度较高，且存在一定的底物抑制。利用基因工程手段对碱性果胶酶N端氨基酸进行改造得到了一株可以制备碱性果胶酶活性包涵体的重组大肠杆菌，本发明制备的胞内活性包涵体,酶活可达36.87±3.51U/mL，相同条件下对照菌株胞内活性包涵体酶活仅为1.39±0.003U/mL(统一菌浓为5OD)。该碱性果胶酶活性包涵体易于分离及重复利用，性质稳定，在60℃下保温50min后仍然具有70％以上的的酶活，且在45℃催化反应条件下重复利用五次仍具有80％以上酶活，具有重要的工业价值。
附图说明
图1为碱性果胶酶及碱性果胶酶突变体的包涵体酶活。
具体实施方式：
培养基：
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L。
发酵培养基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH2PO4 2.32g/L、K2HPO416.43g/L。碱性果胶酶酶活测定：
采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
热稳定性测定：
将稀释好的酶液分装并置于60℃金属浴中，每隔3min取样进行酶活测定，测定残余酶活。
实施例1：突变菌株的获得
(1)根据原有成功异源表达的融合蛋白质粒PGL-S1为模板，其序列为SEQ ID NO.2所示。分别设计了(P1/P2)引物：
P1：5’-CATGCAGAACTAGAAGCGAAACTCAAAGCGGAGCTGGAAGCTAAGCTTAAAGGTGGT-3’
P2：5’-TAATTTACCCGCACCCGCTTGATTTATGAC-3’
PCR扩增体系：模板6ng，上下游引物各1.5μL，PrimeSTAR premix聚合酶25μL，灭菌ddH2O 22μL。PCR反应条件：98℃预变性，2min，一个循环；98℃变性，10s，56℃退火，5s，72℃延伸，1min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。
二轮PCR利用大引物PCR扩增法(megaprimer PCR)，以原有异源表达PGL-S1的质粒为模板50ng，上一轮获得的DNA片段为模板250ng，PrimeSTAR premix聚合酶25μL，灭菌ddH2O加入至体系总体积为50μL。PCR反应条件：98℃预变性，2min，一个循环；98℃变性，10s，56℃退火，5s，72℃延伸，6min 30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。
(2)质粒的转化。取预先制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置15min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证正确后(PGL-AL)接种于种子培养基发酵培养。
实施例2：突变株的验证
种子培养：将重组菌E.coli BL21(DE3)从甘油管中取适量接种于含100μg·mL-1氨苄青霉素，2％葡萄糖的LB培养基中，装液量为20mL/250mL。37℃，200r·min-1摇床上振荡培养10h。
摇瓶发酵：将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入发酵培养基TB(100μg·mL-1氨苄青霉素)中，装液量为20mL/250mL，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
实施例3：重组大肠杆菌产碱性果胶酶活性包涵体及酶活测定
将重组菌发酵液8000r/min离心20min，将获得的菌体用pH 7.5的20mM甘氨酸-NAOH缓冲液洗涤两次，然后利用超声细胞破碎仪对重组大肠杆菌进行细胞破碎，离心取沉淀并利用相同的缓冲液悬浮起来即得到所需的碱性果胶酶活性包涵体。
通过对重组大肠杆菌进行细胞破碎之后(统一控制菌浓为5OD)，分别对胞内可溶和胞内不溶部分(活性包涵体部分)进行酶活测定，PGL-AL不溶部分酶活为36.87±3.51U/mL，野生型PGL为1.39±0.003U/mL，出发菌株PGL-S1为3.67±0.023U/mL，且在60℃下纯酶半衰期最长为20min(前期构建突变体)，而活性包涵体在60℃下保温50min后仍然具有70％以上的的酶活。
实施例4
本发明还尝试采用其它自组装双亲短肽通过PT-linker与碱性果胶酶N端连接，包括氨基酸序列为SEQ ID NO.4～8的双亲短肽，分别表示为S1v1，S1v2，S1v3，S1v4，和S1v5。
表1自组装双亲短肽序列表
采用实施例1-3相同策略构建重组大肠杆菌，并对碱性果胶酶包涵体酶活进行测定，结果如图1所示，出发菌株PGL-S1胞内包涵体酶活为3.56±0.15U/mL，PGL-AL胞内活性包涵体活性最高，为36.87±3.51U/mL，与对照(未连接双亲短肽的PGL)相比，提高了26倍。S1v1和S1v2，包涵体酶活分别为4.02±0.08和24.01±0.76U/mL，其余S1v3，S1v4和S1v5，胞内活性包涵体部分酶活分别为0.172±0.0018,0.122±0.0023和0.098±0.002U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种碱性果胶酶活性包涵体的制备及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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Glu Leu Glu Ala Lys Leu Lys Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro
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Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Ala Met Asp Ala Asp Leu Gly His
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Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr
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Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Leu Asn Val Tyr Thr Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met Asn Val Asp Asp Asn
100 105 110
Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu
115 120 125
Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu
130 135 140
Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln
145 150 155 160
Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile Val Gly
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Ser Gly Thr Asn Ala Lys Val Val Gly Gly Asn Phe Gln Ile Lys Ser
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Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr
195 200 205
Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser
210 215 220
Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr His Ile Trp Ile Asp
225 230 235 240
His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys
245 250 255
Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly Gln Thr Asp Ala Ser
260 265 270
Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn Tyr Tyr His Asp His
275 280 285
Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp
290 295 300
Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val
305 310 315 320
Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val His Val Tyr Asn Asn
325 330 335
Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Phe Ser Tyr Ala
340 345 350
Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala Gln Asn Asn Val Ile
355 360 365
Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile Ser Val Phe Ser Gly
370 375 380
Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ile
385 390 395 400
Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser Val Gly Trp Thr Pro
405 410 415
Ser Leu His Gly Ser Ile Asp Ala Ser Ala Asn Val Lys Ser Asn Val
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Ile Asn Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn
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<212> DNA
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