本发明涉及一种多腔室基因分析反应装置，属于生物技术和机械电子交叉领域。
背景技术：
：基因的多重荧光分析从上世纪90年代开始在分子生物学领域应用，典型的是荧光聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，也称为实时荧光PCR技术，它基于荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET）原理，在PCR扩增过程中加入荧光基团或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后对未知基因模板进行定量或定性分析的方法，进行荧光PCR的荧光PCR仪主要部件包括产生温度梯度的热力学结构、进行荧光激发的激发光源、对发射光进行检测的检测系统以及数据获取分析软件工作站。市场上的主要荧光PCR仪品牌型号包括美国Lifetechnologies公司7500型、7300型、StepOnePlus、Viia7型荧光PCR仪，罗氏公司LightCycler480型、LightCycler96型荧光PCR仪，BioRad公司CFX96型荧光PCR仪，以及安捷伦Stratagene公司Mx3000P型、Mx3005P型荧光PCR仪。这些荧光PCR仪在分子生物学基础研究的基因含量、单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）或者基因突变测定，临床检验中病原微生物或者致病基因定性、定量检测，食品卫生检疫中的食品安全检测，以及一些生物类恐怖袭击检测领域等，都有广泛的应用。上述市场主流荧光PCR仪，通用反应管耗材是0.1或0.2ml容量的单个反应管、八联管或者96孔板，用于盛放含有PCR组分和基因模板的反应液并用于扩增荧光信号检测，但在单个反应管中由于仪器荧光检测波长的限制，通常在520±15nm（FAM荧光报告基团、SYBRGreen染料）、558±12nm（VIC、HEX、JOE荧光报告基团）、587±10nm（NED、Cy3荧光报告基团）、623±14nm（ROX、TexasRed荧光报告基团）以及682±14nm（Cy5荧光报告基团）这5个波长检测分别检测1个基因（在没有采用扩增产物熔解曲线分析条件下），因此最多最能分析5个基因；如果该样本有更多的基因需要分析，则需要额外增加反应管，增加人工操作并降低一次检测的样本数量，这极大地限制了荧光PCR在更高通量基因分析中的应用。技术实现要素：本发明的目的是克服上述现有技术不足，提供一种结构简单、易于操作、节能环保的多腔室基因分析反应装置，可以实现10～50个基因的高通量分析，适合在分子生物学基础研究、临床分子诊断、食品安全基因检测以及生物恐怖袭击类基因检测领域应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种多腔室基因分析反应装置，其特征在于，该反应装置包含主管a、支管b、腔室c和封堵物质d结构，1个主管a连接2～10个支管b的一端，每一支管b的另一端连接反应腔室c，支管b和腔室c之间装配有封堵物质d，每个腔室内含核酸扩增反应组分，用于核酸扩增反应和基因分析。所述基因分析反应装置中的主管a、支管b、腔室c，为聚丙烯材料制备或者经过蚀刻的微流控玻璃芯片，均为中空，可以容纳液体或固体。所述基因分析反应装置中的腔室c，在进行核酸扩增反应和基因分析时，不同基因采用不同荧光波长分析，这些波长为520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm中的1～5个。所述基因分析反应装置中的封堵物质d，为一种可计量微型阀门，能使定量体积液体通过管腔，或者将支管b和腔室c封闭隔断。所述基因分析反应装置腔室中的核酸扩增反应组分，含有有引物、荧光探针、脱氧核糖核苷三磷酸或者核糖核苷三磷酸、核酸聚合酶、核酸酶以及辅助酶作用的金属离子，为液体状态或玻璃化固体状态；特别地，核酸扩增反应组分含有引物、荧光探针、脱氧核糖核苷三磷酸（即dNTPs，包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP）、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）以及镁离子。所述基因分析反应装置的核酸扩增反应，是指PCR反应，或者转录介导扩增技术（Transcription-MediatedAmplification，TMA）、链替代扩增（StrandDisplacementAmplification，SDA）、连接酶链式反应（LigaseChainReaction，LCR）和依赖核酸序列的扩增（Nucleic-AcidSequenceBasedAmplification，NASBA）、环介导等温扩增(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)、支链核酸信号放大系统（BranchedDNA，bDNA）、滚环扩增（RollingCircleAmplification，RCA）这些核酸扩增方法。所述基因分析反应装置使用时，当基因核酸模板在外界压力或电场作用下从主管分别经支管流到各个反应腔室中与核酸扩增反应组分混合，然后封堵物质将腔室封闭，整个装置放在具有荧光分析功能的热循环仪上反应，每个腔室中的基因核酸模板在热循环或等温扩增过程中进行实时荧光分析，能实现5个基因的定性或定量检测。装置连接2个反应腔室最多可以分析10个基因，连接10个腔室最多可以分析50个基因。所用基因核酸模板来源于动物、植物、微生物、人工合成制备或扩增获得的DNA或者RNA。有益效果本发明根据上述设计的技术方案，在基因分析中使用设计的多腔室基因分析反应装置，所具有的技术优点和产生的有益效果如下：（1）高通量基因分析：传统荧光PCR仪单个反应管囿于波长限制，一次检测只能分析5个基因，而本发明反应装置最多能分析50个基因，大大提高了荧光PCR的基因分析工作效率。（2）节能环保：本发明反应装置体积小、结构简单，在相同基因分析数量上，和传统荧光PCR比较具有轻便的特点，大大降低了试剂和耗材的消耗，达到节能环保的目的。（3）适合即时检验（Point-of-caretesting，POCT）检测：本发明装置结合样本核酸提取步骤，可以一步实现从样本到检测结果的全部过程，不仅操作简单，而且报告结果时间短，适合POCT检测。附图说明附图1为多腔室基因分析反应装置示意图，展示了主管a、支管b，腔室c、封闭物质d的连接顺序，其中支管b，腔室c、封闭物质d的数目最少分别有2个、最多有10个，即分别有一个反应装置有2～10个反应腔室。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1：多腔室基因分析反应装置的制备和应用（1）多腔室基因分析反应装置的制备按照说明书附图中主管a、支管b，腔室c、封闭物质d的连接顺序设计模具，并采用聚丙烯材料制备带有2个腔室的基因分析反应装置。在2个腔室中分别装入核酸扩增引物探针，dNTPs、逆转录酶、核酸聚合酶、UNG酶以及镁离子，制备的2腔室基因分析反应装置用于血清样本乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）的基因分型检测。HBV基因分型引物探针采用文献（JClinMicrobiol.2010Apr;48(4):1105–1111）表1中的As、Bps、Cps、D引物探针序列（4对HBV基因型引物、4条HBV基因型探针），但探针序列5’端依次分别采用FAM、JOE、Cy3、ROX荧光基团标记、3’端采用BHQ淬灭基团标记，分别基于HBVS抗原基因检测我国常见的HBV基因型A、B、C、D。HCV基因分型引物探针采用文献（JClinVirol.2005Oct;34(2):108-14）中的基因亚型引物探针（4对HCV基因型引物、4条HCV基因型探针），但针对HCV1-4基因型的探针Gt1probe～Gt4probe序列5’端依次分别采用FAM、JOE、Cy3、ROX荧光基团标记、3’端采用BHQ淬灭基团标记，基于HCV基因组5’端非编码区序列检测HCV1、2、3、4基因亚型。同时，采用本申请人申请的发明专利（201310742857.6，一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒）中采用的GAPDH基因引物探针作为内参照引物探针，探针序列5’端Cy5荧光基团标记、3’端采用BHQ淬灭基团标记。将上述设计使用的HBV基因分型的12条引物探针、HCV基因分析型的12条引物探针、以及3条内参照引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。在上述2个腔室的基因分析反应装置中，首先在2个腔室分别加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8条浓度各10mMHBV基因型引物0.9ul、2条10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4条浓度各10mMHBV基因型探针各0.6ul、10mMGAPDH基因探针0.3ul。第2个腔室加入SuperScript®III逆转录酶3U，8条浓度各10mMHCV基因型引物各0.9ul、2条10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4条浓度各10mMHCV基因型探针各0.6ul、10mMGAPDH基因探针0.3ul。上述装置放入台式冻干机（Alpha1-4LSC型，德国Christ公司）冻干，此时核酸扩增反应混合物为无水玻璃化固体状态，将反应装置置于4℃保存。（2）多腔室基因分析反应装置的在血清HBV/HCV基因分型中应用采集经临床核酸定量检测确定为病毒性肝炎的患者血清5例，采用本申请人发明专利（ZL201010621890.X，一种用于生物样品中核酸提取纯化的细胞裂解试剂）中病毒DNA/RNA磁珠结合共提取方法，每例样本提取获得核酸100ul，立即进行检测。取上述制备保存的2个腔室的基因分析反应装置，平衡到室温，在主管a加入上述提取的100ul核酸模板，在外界压力作用下，液体模板分别流入2个腔室各30ul时，相应的微型阀关闭，腔室中固体反应组分被核酸模板液体溶解，反应体系为30ul。将反应装置转入带荧光分析功能的热循环仪扩增检测，反应程序为50℃10min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循环扩增40次，并在每次循环的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五个波长（对应520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）荧光信号。反应结束后按照软件分析，以有明显扩增、呈现S型扩增曲线的结果判断为阳性。5例样本检测结果如表1所示，上述制备的基因分析反应装置对临床病毒性肝炎患者样本能完整地在一次检测中完成HBV、HCV基因分型结果的测定，和目前常规使用的荧光PCR方法比较，具有操作简便、检测快速的优点。表1本发明基因分析反应装置对血清HBV/HCV基因分析结果结果血清1血清2血清3血清4血清5HBV基因型C型B型A型C型D型HCV基因型3型1型4型2型1型内参照阳性阳性阳性阳性阳性实施例2：多腔室基因分析反应装置的制备和应用（1）多腔室基因分析反应装置的制备按照说明书附图中主管a、支管b，腔室c、封闭物质d的连接顺序设计模具，并采用玻璃硅材料和微机电系统（MEMS，Micro-Electro-MechanicalSystem）技术，在硅片上刻蚀加工制备了带有2个腔室的微流控芯片基因分析反应装置。在2个腔室中分别装入核酸扩增引物探针，dNTPs、逆转录酶、TaqDNA聚合酶、UNG酶以及镁离子，制备的2腔室基因分析反应装置用于泌尿生殖道样本常见性传播疾病病原体（沙眼衣原体，淋球菌，解脲支原体，生殖支原体，人乳头瘤病毒6、11、16、18型）的核酸检测检测。沙眼衣原体（CT）、淋球菌（NG）、解脲支原体（UU）、生殖支原体（Mg）核酸检测引物探针采用文献（IntJMolEpidemiolGenet.2013Sep12;4(3):167-74）表1中的引物探针序列（CT-Plasmid-FP/CT-Plasmid-RP/CT-Plasmid-Probe、NG-FP/NG-RP/NG-Probe、UP-UU-FP/UP-UU-RP/UU-Probe、MG-FP/MG-RP/MG-Probe，共4对引物、4条探针），但探针序列5’端依次分别采用FAM、JOE、Cy3、ROX荧光基团标记、3’端采用BHQ淬灭基团标记，不同波长分别检测临床常见的CT、NG、UU、Mg病原体。HPV6/11两个亚型，16/18两个亚型引物探针分别采用本申请人申请的发明专利（201511007550.7，一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒；201110448224.5，人乳头瘤病毒（HPV）16,18型多通道荧光PCR检测方法与试剂盒）引物探针，其中6/11两个亚型共用1对引物，6型探针序列5’端标记FAM荧光基团、11型探针序列5’端标记改为JOE荧光基团，16/18两个亚型各有1对引物及探针，16型探针序列5’端标记改为Cy3荧光基团，18型探针序列5’端标记改为ROX荧光基团，HPV6/11/16/18检测4条探针的3’端均采用BHQ淬灭基团标记。同时，采用本申请人申请的发明专利（201310742857.6，一种含内参照的高灵敏Epstein-Barr病毒荧光定量PCR试剂盒）中采用的GAPDH基因引物探针作为内参照引物探针，探针序列5’端Cy5荧光基团标记、3’端采用BHQ淬灭基团标记。将上述设计使用的CT、NG、UU、Mg核酸检测的12条引物探针、HPV6/11/16/18型检测10条引物探针、以及3条内参照引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。在上述2个腔室的微流控芯片基因分析反应装置中，首先在2个腔室分别加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8条浓度各10mMCT、NG、UU、Mg引物各0.9ul、2条10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4条浓度各10mMCT、NG、UU、Mg探针各0.6ul、10mMGAPDH基因探针0.3ul，加入去离子水补足体积到26ul，用微型阀门密封腔室。第2个腔室加入6条浓度各10mMHPV6/11/16/18基因型引物各0.9ul、2条10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4条浓度各10mMHPV6/11/16/18基因型探针各0.6ul、10mMGAPDH基因探针0.3ul，加入去离子水补足体积到26ul，用微型阀门密封腔室。上述微流控芯片基因分析反应装置置于-20℃保存。（2）多腔室基因分析反应装置的在泌尿生殖道分泌物病原体检测中应用收集临床性病门诊患者泌尿生殖道分泌物漂洗液样本10例，取漂洗液样本200ul，13000rpm离心10min后弃上清，在沉淀中加入50ul含有20mMNaOH、1%吐温20的核酸裂解液，漩涡混匀后100℃保温10min，13000rpm离心2min，每例样本吸取上清获得核酸提取物约50ul，立即进行检测。取上述制备保存的2个腔室的基因分析反应装置，平衡到室温，在主管a加入上述提取的50ul核酸模板，在外界压力作用下，液体模板分别流入2个腔室各4ul时，相应的微型阀关闭。将反应装置转入带荧光分析功能的热循环仪扩增检测，反应程序为50℃2min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循环扩增40次，并在每次循环的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五个波长（对应520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）荧光信号。反应结束后按照软件分析，以有明显扩增、呈现S型扩增曲线的结果判断为阳性。10例样本检测结果如表2所示，上述制备的基因分析反应装置对临床性病门诊患者泌尿生殖道样本中常见的8种性传播疾病病原体（沙眼衣原体，淋球菌，解脲支原体，生殖支原体，人乳头瘤病毒6、11、16、18型）一次检测获得信息，和目前常规使用的荧光PCR方法比较，具有体积微小、操作简便快速、报告结果时间短的优势。表2本发明基因分析反应装置对泌尿生殖道分泌物病原体基因分析结果样本病原体内参照样本病原体内参照分泌物1CT，UU，HPV6阳性分泌物6CT，UU，HPV6阳性分泌物2NG，HPV6/11阳性分泌物7HPV6/11/16/18阳性分泌物3UU，Mg，HPV6/11阳性分泌物8CT，HPV16阳性分泌物4HPV16/18阳性分泌物9UU，HPV6/11阳性分泌物5CT，NG，HPV11阳性分泌物10NG，Mg，HPV18阳性当前第1页1 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