一种便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪的制作方法

本实用新型涉及基因检测领域，尤其涉及一种便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪。

背景技术：

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的体外等温扩增特异性核酸片段技术。此技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。因为其克服了传统的聚合酶链式反应（PCR反应）需通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，可以在15-60分钟扩增出10⁹-10¹⁰倍靶序列拷贝，具有更高的灵敏度、特异性和扩增效率。LAMP在病原微生物的快速检测、遗传病检测、单核苷酸多态性分型等领域显示出巨大的应用潜力。目前LAMP已应用于肿瘤突变基因、结核分枝杆菌及病毒的快速检测。

LAMP产物检测方法包括琼脂糖电泳检测，焦磷酸镁浊度检测，荧光定量检测和荧光目测。LAMP产物琼脂糖电泳检测的结果为连续梯状电泳条带，但由于需要开盖检测，容易造成污染。荧光定量检测存在较为繁琐且需特殊仪器设备、成本高的特点。焦磷酸镁浊度检测是相对简便检测方法，但仍需实时浊度检测仪，从而限制了其广泛应用。荧光目测法是目前最简便、快速的方法，选择钙黄绿素作为荧光指示剂，反应前加入LAMP反应体系，一步反应后无需开盖，可直接裸眼准确判断反应结果，适用于即时检测（Point of care testing, POCT）。POCT主要是指在实验室以外的现场（包括患者床旁、急诊科室、医师诊所、家庭内）实施的快速检测。就LAMP技术本身而言，并不能实现LAMP反应的POCT。

微流控芯片（Microchip）是一种可集成化，微型化和便携化的技术平台。此技术在微米尺度的空间上进行流体控制，可将临床实验室的功能集成在几平方厘米的芯片上。其具备规模集成，样品处理时间短，检测灵敏度高和成本低的特点，为LAMP反应的POCT提供了广阔的应用平台。LAMP结合微流控芯片（Microchip）则可摆脱对精良仪器设备及精确温度的的依赖，可望实现对LAMP反应的POCT。

目前，许多研究将LAMP技术与微流控芯片结合实现了对病原体核酸及肿瘤基因突变的简单、快速检测。但上述研究仍需水浴锅、热板等插电的辅助设备提供恒温，受固定的检测场所限制，达不到POCT的要求。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪，以实现LAMP反应的即时检测。

为实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一方面，本实用新型提供一种便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪，包括箱盖及箱体，所述箱体内设置微流控芯片、温控装置和可视化检测系统；所述温控装置包括温度控制器及加热金属块，所述微流控芯片放置于所述加热金属块上，所述微流控芯片和所述加热金属块周围设置透明挡板，所述透明挡板上设置可拆卸的盖板，所述可视化检测系统设置于所述盖板上，所述可视化检测系统包括微型摄像机和微型紫外荧光灯。

优选的，所述微流控芯片包括检测槽道、独立对照槽道、阳性对照槽道、阴性对照槽道以及阴性独立对照槽道，所述检测槽道、阳性对照槽道和阴性对照槽道通过相应的流体控制通道连接至样品及试剂反应液入口，所述流体控制通道的旁侧设置引物包被入口，所述样品及试剂反应液入口位于所述微流控芯片的中央，所有槽道的端部均设置废液出口，所述独立对照槽道及所述阴性独立对照槽道均设置独立的对照反应液入口。

优选的，所述温度控制器为单片机控制，包括温度控制部分、温度显示部分、温度测量部分、蜂鸣报警器以及显示面板，所述温度控制部分包括时间程序控制，所述显示面板包括温度显示窗口和电压显示窗口，所述蜂鸣报警器为低压报警。

优选的，所述低压报警的压力值为≤20.5V。

优选的，所述时间程序控制的步骤为加热温度至恒定值，恒温反应1小时后，自动开启微型紫外灯和微型摄像机。

优选的，所述温度控制器的控制温度为63℃。

优选的，所述流体控制通道的形状为逶迤微通道。

优选的，所述检测槽道和所述独立对照槽道的数量均为5个。

优选的，所述箱盖与所述箱体通过位于侧面的锁片连接，箱盖的中央位置设置把手。

优选的，所述微型摄像机和微型紫外荧光灯位于微流控芯片的正上方。

优选的，所述微型摄像机通过WIFI与图像显示设备连接。

优选的，所述图像显示设备包括电脑，手机，相机。

优选的，所述可视化检测仪的电源为锂电池，所述锂电池为可充电的。

第二方面，本实用新型提供了微流控芯片的制作方法及其应用，所述制作方法包括以下步骤：

步骤一、采用软光刻技术加工阳模；

步骤二、在步骤一所述的阳模上浇注PDMS并固化；

步骤三、将步骤二处理后的阳模与玻璃片进行键合。

所述微流控芯片的应用包括骨髓增殖性肿瘤多位点基因突变检测、其他肿瘤多位点基因突变及病原体核酸检测。

第三方面，本实用新型提供了便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、从引物包被入口注入引物，制成功能化的微流控芯片；

步骤二、检测槽道、阳性对照槽道和阴性对照槽道从样品及试剂反应液入口注入反应液，然后从样品及试剂反应液入口注入矿物油，最后封堵微流控芯片的样品及试剂反应液入口、废液出口；

步骤三、各独立对照槽道通过相应的对照反应液入口分别加入对照反应液，然后封堵相应的对照反应液入口及废液出口；

步骤四、将上述步骤处理后的微流控芯片放置在加热金属块上，由温控装置加热，并恒温反应1小时；

步骤五、开启微型紫外荧光灯，用微型摄像机拍摄检测结果并传送至图像显示设备。

优选的，所述步骤一所述的微流控芯片的功能化采用蒸发法。

优选的，所述步骤二和所述步骤三中的引物、矿物油及反应液的注入均采用移液器。

优选的，所述步骤二和所述步骤三中的样品及试剂反应液入口、对照反应液入口、废液出口均采用环氧胶封堵。

优选的，所述步骤四中的恒温反应的温度为63℃。

最后，本实用新型还涉及便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪的应用，其涵盖微流控芯片等温扩增所涉及的全部应用领域，包括转基因产品安全的检测、病毒的检测、常见致病菌的检测、细菌耐药基因的检测及肿瘤的检测。

与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：本实用新型基于微流控芯片技术，结合LAMP技术，利用荧光目测法，将反应、检测及结果集成于一个便携式设备，摆脱了固定场所及固定检测设备的限制，也不依赖于精确的温度控制，其实现了LAMP反应的现场、快速、自动化检测，并可将检测结果快速传输至用户手中，有效节约了用户的时间，完成了LAMP反应的即时检测。

附图说明

图1是本实用新型所述的便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪的立体图；

图2是如图1所示的便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪在关闭状态下的立体图；

图3是位于如图1所示的微流控芯片的示意图；

图4是位于如图1所示的温控装置的结构图；

图中的附图标记为：

1、箱盖；2、箱体；3、锁片；4、把手；5、微流控芯片；6、温度控制器；7、加热金属块；8、透明挡板；9、盖板；10、温度显示窗口；11、电压显示窗口；12、微型摄像机；13、微型紫外荧光灯；

21~25、检测槽道；26、样品及试剂反应液入口；27、对照反应液入口；28、引物包被入口；29、废液出口；30、流体控制通道；P1~P5、独立对照槽道；P、阳性对照槽道；N、阴性对照槽道；N*：阴性独立对照槽道。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本实用新型的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本实用新型的技术方案，而不能以此来限制本实用新型的保护范围。

如图1和图2所示，本实用新型所述的便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪，包括箱盖1及箱体2，所述箱盖1与所述箱体2通过位于侧面的锁片3连接，所述箱体2内设置微流控芯片5、温控装置和可视化检测系统；所述温控装置包括温度控制6及加热金属块7，所述微流控芯片5放置于所述加热金属块7上，所述微流控芯片5和所述加热金属块7周围设置透明挡8，所述透明挡板8上设置可拆卸的盖板9，所述可视化检测系统设置于所述盖板9上，所述可视化检测系统包括微型摄像机12和微型紫外荧光灯13。

如图3所示，所述微流控芯片5包括检测槽道21~25、独立对照槽道P1~P5、阳性对照槽道P、阴性对照槽道N以及阴性独立对照槽道N*，所述检测槽道21~25、阳性对照槽道P和阴性对照槽道N通过相应的流体控制通道30连接至样品及试剂反应液入口26，所述流体控制通道30的旁侧设置引物包被入口28，所述样品及试剂反应液入口26位于所述微流控芯片5的中央，所有槽道的端部均设置废液出口29，所述独立对照槽道P1~P5及所述阴性独立对照槽道N*均设置独立的对照反应液入口27。

如图4所示，所述温控装置为单片机控制，包括温度控制部分、温度显示部分、温度测量部分、蜂鸣报警器以及显示面板，所述温度控制部分包括时间程序控制，所述时间程序控制的步骤为加热温度至恒定值，恒温反应1小时后，自动开启微型紫外灯和微型摄像机，所述显示面板包括温度显示窗口10和电压显示窗口11，所述蜂鸣报警器为低压报警。所述单片机连接温度测量部分电路、继电器驱动电路、显示电路及蜂鸣器报警电路，所述继电器驱动电路连接加热金属块。

本实用新型还提供一种便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、从引物包被入口28注入LAMP引物，制成功能化的微流控芯片5；

步骤二、检测槽道21~25、阳性对照槽道P和阴性对照槽道N通过样品及试剂反应液入口26注入反应液，然后从样品及试剂反应液入口26注入矿物油，最后封堵微流控芯片的样品及试剂反应液入口26、废液出口29；

步骤三、各独立对照槽道P1~P5、N*通过相应的对照反应液入口27分别加入对照反应液，然后封堵相应的对照反应液入口27及废液出口29；

步骤四、将上述步骤处理后的微流控芯片5放置在加热金属块7上，由温控装置加热，并恒温反应1小时；

步骤五、开启微型紫外荧光灯13，用微型摄像机12拍摄检测结果并传送至图像显示设备。

实施例一

步骤一、制作微流控芯片5

采用软光刻技术加工SU-8阳模，模塑法制作微流控芯片5，在阳模上浇注PDMS，固化后与玻璃片进行键合。

其中，此芯片5的LAMP反应区具有5个检测槽道21~25及相应的独立对照槽道P1~P5，每个槽道容积约7 µL，其尺寸为10 mm(L)×2.4 mm(W) ×0.3 mm(H)。每个检测槽道21~25连接流体控制通道30的逶迤微通道，其尺寸为29.5 mm(L)×0.1-0.2 mm(W) ×0.05-0.3 mm(H)；同时设置阳性对照槽道P、阴性对照槽道N和阴性独立对照槽道N*，作为反应体系的质量控制。在微流控芯片5的使用过程中采用液体矿物油进行流体控制。

步骤二、加工便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪

所述可视化检测仪的尺寸为12 cm(L)×10cm(W) ×8 cm(H)，具有便携性。采用锂电池供电，温控装置由单片机控制。本实用新型中的温度传感器选用美国Dallas公司生产的单总线数字式集成温度传感器。

温控装置的技术性能：工作温度0 –40℃；湿度≤90%，无腐蚀性气体，控制温度50- 100℃；控制精度：≤±0.3；一次连续工作时间3小时左右。

步骤三、基于微流控芯片的LAMP反应的可视化检测仪的检测过程

本实施例以骨髓增殖性肿瘤多位点基因突变的检测为例。

各槽道对应的引物及反应液如下：

利用软件确定DNA序列上6个不同的区域，针对突变位点，分别设计LAMP反应的引物外(F3，B3)，内引物（FIP，BIP）及环引物（LF，LB）。微流控芯片5个检测槽道21~25分别对应检测5种基因位点，如下：

JAK2 V617F野生型引物：617 F3-W，617 B3-W，617 FIP-W及617 BIP-W；

JAK2 V617F突变型引物：617 F3-M，617 B3-M，617 FIP-M及617 BIP-M；

MPL W515K突变型引物：515 F3-K， 515 B3-K，515 FIP-K，515 BIP-K和515 LF-K：

MPL W515L突变型引物：515 F3-L，515 B3-L，515 FIP-L，515 BIP-L和515 LF-L；

MPL W515野生型引物：515 F3-W，551 B3-W，515 FIP-W，515 BIP-W和515 LF-W；

使用去离子双蒸水溶解引物及探针至如下工作浓度：F3（5 µM）、B3（5 µM）、FIP（40 µM）、BIP（40 µM）、LF（40 µM）。

所述检测槽道21~25的反应液类型为25 µL 10 ×反应缓冲液，4 µL DNA，2 µL钙黄绿素，2 µL Bst DNA 聚合酶，17 µL去离子双蒸水。

所述独立对照槽道P1~P5的反应液类型为3 µL 10×反应缓冲液，0.5 µL DNA，0.25 µL Bst DNA 聚合酶，0.25 µL 钙黄绿素，1 µL引物和1.5 µL去离子双蒸水；

所述阳性对照槽道P的引物为Loopamp®DNA 扩增试剂盒中阳性对照DNA（0.5 µL）和引物DNA（1 µL），反应液类型与检测槽道一致。

所述阴性对照槽道N不包被引物，反应液类型与检测槽道1~5一致。

所述阴性独立对照槽道N*用双蒸水代替模板DNA，反应液类型为：3 µL 10 ×反应缓冲液，0.25 µL Bst DNA 聚合酶，0.25 µL 钙黄绿素，1 µL引物溶液DNA, 和2 µL去离子双蒸水。

所述可视化检测仪的检测步骤如下：

使用前，将上述的不同引物对通过蒸发法包被于相应的检测槽道21~25/N/P内，制成功能化芯片，由于引物具有特异性，LAMP反应后即可对不同的基因突变进行检测；

采用移液器将50 µL LAMP反应液从样品及试剂反应液入口26加到微流控芯片5，然后再将4 µL矿物油从样品及试剂反应液入口29加入，最后用环氧胶封堵微流控芯片5的样品及试剂反应液入口26、废液出口29。

各对照槽道P1~P5/N*分别加入6.5 µL LAMP反应液，用上述同样方法封堵对照反应液入口27和废液出口29。

将微流控芯片5放置于加热金属块7上，通过温控装置将温度加热至63℃，恒温反应1小时，然后自动开启微型紫外荧光灯13，在紫外光照射下（365 nm），反应阳性结果显示裸眼可见的绿色荧光，即检测结构为骨髓增殖性肿瘤患者MPL W515K 突变。微型摄像机12拍摄检测结果并将其传送至智能手机。用户即可在手机浏览器中第一时间查看检验进程，报告的完整图片和结论等信息。

实施例二

所述微流控芯片5的应用包括骨髓增殖性肿瘤多位点基因突变检测、其他肿瘤多位点基因突变及病原体核酸检测。

实施例三

所述可视化检测仪的应用涵盖微流控芯片等温扩增所涉及的全部应用领域，包括转基因产品安全的检测、病毒的检测、常见致病菌的检测、细菌耐药基因的检测及肿瘤的检测。

实施例四

应用此便携式可视化检测仪并结合LAMP技术，可实现肺炎链球菌，肺炎支原体，肺炎衣原体和腺病毒的快速同步检测。

具体实施步骤与检测肿瘤基因突变一致，不同之处仅在于针对不同的病原体设计特异LAMP引物，并在检测前将多种引物包被于微流控芯片的检测槽道，制成可应用于多种呼吸道病原体检测的功能化芯片。

通过上述实施例可知，本实用新型所述的便携式微流控芯片LAMP可视化检测仪，将反应、检测及结果集成于一个便携式设备，摆脱了固定场所及固定检测设备的限制，也不依赖于精确的温度控制，其实现LAMP反应的现场、快速、自动化检测，并可将检测结果快速传输至用户手中，有效节约了用户的时间，完成了LAMP反应的即时检测。

以上对本实用新型的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本实用新型并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本实用新型的范畴之中。因此，在不脱离本实用新型的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本实用新型的范围内。