止血材料的制作方法

本发明涉及止血材料(诸如伤口敷料)以及形成此类材料的方法。本发明还涉及将肽缀合至基底的方法。

氧化纤维素织物是已长期用于医学应用的生物可降解和可吸收的织物。其有利的特性包括高可吸收性、抗细菌和抗病毒特性以及无毒和抗粘附作用。

由于所述织物引起或加速其所施加的部位处的血液凝固的能力，氧化纤维素可用作止血材料。商业上可用的氧化纤维素织物的实例是(由ethiconinc.制造)。

然而，氧化纤维素织物具有若干缺点，包括差的止血特性、低生物可降解性和可灭活酸敏感性蛋白质(诸如凝血酶、白蛋白和球蛋白)的低ph。

改性氧化纤维素并改进其特性的努力主要聚焦于中和所述材料的酸性。例如，欧洲专利ep0659440b1描述了使用钙或钙与钠或钾的组合处理氧化纤维素。然而，需要进一步改进氧化纤维素的止血特性。

spot合成是在纤维素膜上进行的固相肽合成的已建立方法，并且常用于制备肽阵列(hilpert,k.、winklerd.f.h、hancock,r.e.w.(2007)cellulose-boundpeptidearrays:preparationandapplications,biotechnologyandgeneticengineeringreviews,24:1,31-106)。纤维素是具有游离羟基的多糖。为了制成适用于合成肽的纤维素，必需将官能性从羟基改变成反应性更大的氨基。最简单和常用的纤维素膜的衍生化是使用fmocβ-丙氨酸或fmoc-gly和n,n’-二异丙基碳化二亚胺进行的酯化。

然而，氧化纤维素的结构与纤维素的不同之处在于氧化纤维素基底在其表面上具有羧基。

氧化纤维素不适用于肽(尤其是具有游离n-端的肽)的常规spot合成。这是因为在氨基酸的氨基与氧化纤维素的羧基之间发生反应。

spot合成的另一个缺点是在所有偶合阶段由于重复的固相结合羧基活化而引起的增加的差向异构化风险。

本申请人已设计一种将肽缀合至基底(诸如氧化纤维素)的更有效方法并且出乎意料地发现如果将纤维蛋白原结合肽共价连接至氧化纤维素基底，则止血特性得到适当的改进。

在广义上，本发明涉及肽(诸如纤维蛋白原结合肽)到基底的共价固定以及将此类肽共价固定至基底的方法。

本发明的方法涉及提供包含肽和第一反应基团的部分；提供具有第二反应基团的基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将肽共价连接至基底。

此方法与常规spot合成相反，其中肽在羧基至氨基方向中合成同时c-端固定至基底。换言之，spot肽合成在基底上发生。常规spot合成可适用于在纤维素基底上制成肽阵列，但是其对于将肽连接至基底(诸如伤口敷料)可能是不实际且不经济的。例如，首先合成肽之后将所述肽缀合至所述基底可使得更容易表征和控制材料的纯度。

本发明的方法包括对spot合成的修改，其适用于spot合成可能不适用的具有羧基的基底，诸如氧化纤维素。具有羧基的其他基底的实例包括淀粉、糖原、右旋糖酐、半纤维素、果胶、透明质酸、脱乙酰壳多糖、明胶、胶原以及丝。

根据本发明，提供一种将肽共价固定至基底的方法，其包括：提供下述部分，其中每个部分包含肽和羧基反应基团形式的第一反应基团(或部分反应基团)；提供包含羧基形式的第二反应基团(或基底反应基团)的基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将所述肽共价固定至所述基底。

在优选的实施方案中，所述基底是或者包括基于纤维素的基底，诸如氧化纤维素，最优选地是再生氧化纤维素。

所述部分优选地包含纤维蛋白原结合肽。

优选地，所述方法涉及将多个肽共价固定至所述基底。

根据本发明，提供一种制成止血材料或药剂的方法，其包括将多个纤维蛋白原结合肽共价固定至氧化纤维素基底。

在一些实施方案中，所述方法包括：提供包含纤维蛋白原结合肽和羧基反应基团形式的第一反应基团的部分；提供包含羧基形式的第二反应基团的氧化纤维素基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将所述肽共价固定至所述基底。

优选地，所述第一反应基团是氨基，使得第一反应基团与第二反应基团的反应形成酰胺键。

在一个优选的实施方案中，所述肽通过所述肽的c端共价固定至基底。

根据本发明，提供一种将肽共价固定至基底的方法，其包括：提供包含肽和通过肽的c端连接的羧基反应基团形式的第一反应基团的部分；提供包含羧基形式的第二反应基团的基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将每个肽共价固定至所述基底，使得所述肽通过其c端共价固定至所述基底。

所述部分可以包含非肽部分或接头。所述非肽部分可以提供第一反应基团。所述部分的非肽部分可以在所述肽的c端处连接至α-羰基。在非肽部分未提供第一反应基团的情况下，所述肽可能不能另外与所述基底上的第二反应基团反应。非肽部分可因此充当衔接子。当第一反应基团与第二反应基团反应时，非肽部分可以形成在基底与肽之间的间隔物的至少一部分。

非肽部分可以通过酰胺键共价连接至肽。

所述部分可包含以下结构：

所述部分的非肽部分可以包含直链基团，适合地为具有式-(ch2)a-的直链基团，其中a是1-20，优选地是1-15、1-10、1-5或2-4。

在一个特别优选的实施方案中，所述部分包含以下结构：

其中a＝1-20，优选地1-15、1-10、1-5或2-4。

优选地，所述部分已通过固相肽合成，例如使用标准fmoc化学或boc化学来合成。本发明的方法可包括合成所述部分的步骤。有利的是，所述部分在其连接至基底之前合成，而非在基底上原位合成。

所述部分的肽上的反应基团可通过保护基团诸如t-boc或f-moc进行保护。精氨酸侧链可通过2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)基团或pmc进行保护。有利的是，所述部分的仅第一反应基团可与所述基底的第二反应基团反应。例如，所述肽的n端上的氨基或任何羧基反应性氨基酸侧链可防止与所述基底的第一反应基团反应。如果希望肽通过其c端缀合至基底并且希望肽的n端容易接近配体，则这是特别有利的。

在一些实施方案中，n端可能不需要保护，特别是在希望所述肽的n端氨基与基底的羧基反应，从而使得所述肽通过其n端结合至基底的情况下。

一旦所述肽共价固定至所述基底，就可对所述肽脱保护。

在其他实施方案中，所述肽可通过侧链，例如通过赖氨酸残基的侧链结合至所述基底。因此，第一反应基团可以是肽中的氨基酸的侧链。

在一些实施方案中，所述基底通过使基底的羧基与改性基团反应来改性(或活化)。改性基团可以引入间隔物，以使得第二反应基团呈现或定位在间隔物的末端。这可提高在缀合期间第二反应基团到所述部分的可接近性。

适合间隔物的实例包括肽间隔物。如本文所用，术语“肽间隔物”包括一个或多个氨基酸残基的间隔物。在一些实施方案中，肽间隔物的长度是1-5个或1-2个氨基酸残基。适合的肽间隔物的实例包括甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、β-丙氨酸、l-赖氨酸或ε-氨基己酸。

所述方法可包括通过使基底上的羧基与改性基团反应来改性基底。

优选地，每个改性基团具有为羧基反应基团的第一反应基团和为羧基的第二反应基团。优选地，改性基团的第一反应基团是氨基。氨基因此可与载体的羧基反应以形成酰胺键。因此，尽管第二反应基团在其改性之前可以是存在于基底上的相同官能团，但是间隔物的引入可使官能团以更易接近的构造呈现。

在改性之前，所述基底可包含以下结构：

改性基底可包含以下结构：

一旦改性基团与基底上的羧基反应，就可提供用于与所述部分的第一反应基团反应的羧基，这可导致酰胺键形成。

例如，如果改性基团包含两个甘氨酸残基，则改性基底可包含以下结构：

如果改性基团包含6-氨基己酸，则改性基底可包含以下结构：

根据本发明，提供一种将肽共价固定至基底的方法，其包括：提供包含肽和第一反应基团的部分；提供包含通过对基底的羧基进行改性来形成的第二反应基团的改性基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将所述肽共价固定至所述基底。

在一些实施方案中，所述方法包括：提供包含纤维蛋白原结合肽和第一反应基团的部分；提供包含通过对基底的羧基进行改性来形成的第二反应基团的改性氧化纤维素基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将所述肽共价固定至所述基底。

在一些实施方案中，第一反应基团是羧基，任选地是在肽的c端处的羧基。在其他实施方案中，第一反应基团可以通过肽的c端连接。

根据本发明，提供一种将肽共价固定至基底的方法，其包括：提供包含肽和第一反应基团的部分，其中所述第一反应基团是在肽的c端处的羧基，或者其中所述第一反应基团通过肽的c端连接；提供包含通过对基底的羧基进行改性来形成的第二反应基团的改性基底；以及使所述第一反应基团与所述第二反应基团反应以将每个肽共价固定至所述基底，使得所述肽通过其c端共价固定至所述基底。

第二反应基团可以是非羧基，优选地是羧基反应基团，最优选地是氨基。第二反应基团可以用于与所述部分的羧基，诸如在肽的c端处在肽的氨基酸残基的侧链上的羧基反应。

基底的羧基可通过使其与改性基团反应来改性(或活化)。所述方法因此可包括对所述基底进行改性。所述改性可导致间隔物引入，其中基底的第二反应基团定位在间隔物的末端。间隔物可以通过酰胺键共价连接至。

改性基底可包含以下结构：

间隔物可包含直链基团，适合地为具有式-(ch2)a-的直链基团，其中a是1-20，优选地是1-15、1-10、1-5或2-4。

改性基团可包含第一羧基反应基团和第二羧基反应基团，其中所述第一羧基反应基团和所述第二羧基反应基团优选地是氨基。

改性基团可包含以下结构：

h2n-(ch2)a-nh2

其中a＝1-20，优选地1-15、1-10或1-6。

改性基团可因此包含二胺分子，诸如乙二胺、1,6-己二胺或1,4-丁二胺。

例如，如果改性基团包含乙二胺，则改性基底可包含以下结构：

本发明提供一种共价结合至基底的肽，其可通过本发明的方法获得。

本发明提供一种用于改性(或活化)基底的方法，其包括使基底上的羧基与改性基团反应，其中所述改性基团包含第一反应基团，优选地是羧基反应基团，最优选地是氨基；以及第二反应基团，优选地是氨基反应基团，最优选地是羧基。

改性基团可包含肽。

在改性之前，所述基底可包含以下结构：

改性基底可描述为活化的或衍生化的。

本发明提供一种改性基底，优选地是一种改性的氧化纤维素基底，其包含以下结构：

其中x是氨基反应基团，优选地是羧基。

优选地，间隔物通过酰胺键连接。因此，所述基底可包含以下结构：

其中x是氨基反应基团，优选地是羧基。因此，改性基底可包含以下结构：

间隔物可包含如本文所述的肽间隔物。

本发明提供一种用于改性(或活化)基底的方法，其包括使基底上的羧基与改性基团反应，其中所述改性基团包含第一反应基团，优选地是羧基反应基团，最优选地是氨基；以及第二反应基团，优选地是羧基反应基团，最优选地是氨基。

每个改性基团可包含以下结构：

h2n-(ch2)a-nh2

其中a＝1-20，优选地1-15、1-10或1-6。

本发明提供一种改性基底，优选地是一种改性的氧化纤维素基底，其包含以下结构：

其中x是羧基反应基团，优选地是氨基。

优选地，间隔物通过酰胺键连接。因此，改性基底可包含以下结构：

其中x是羧基反应基团，优选地是氨基。因此，改性基底可包含以下结构：

间隔物可包含基团-(ch2)a-，其中a是1-20，优选地是1-15、1-10或1-6。

本发明提供一种改性基底，其可通过本发明的方法获得。

本发明还涉及一种材料，其包含共价结合至肽的基底。所述基底优选地包含羧基，并且所述肽可通过使包含所述肽的部分与所述基底上的羧基反应来结合至所述基底。

优选地，所述基底是或包括氧化纤维素。优选地，所述肽是纤维蛋白原结合肽。优选地，所述基底共价结合至多个肽。

根据本发明，提供一种止血材料(或止血剂)，其包含共价固定至多个纤维蛋白原结合肽的氧化纤维素基底。

优选地，所述肽通过所述基底的羰基固定至所述基底。例如，每个肽可通过使所述肽或包含所述肽的部分与基底上的羧基反应来固定至所述基底。所述肽可通过酰胺键连接至基底。

有利的是，使用基底上的羧基作为与肽的连接点可修改基底的酸性特性并且改进与蛋白质诸如凝血酶和纤维蛋白原的相互作用。

在优选的实施方案中，所述肽通过间隔物固定至基底。间隔物可增加对配体的可接近性。在纤维蛋白原结合肽的情况下，其可增加对纤维蛋白原的可接近性并改进止血活性。

所述材料可包含以下结构：

在优选的实施方案中，所述肽通过其c端固定至基底。所述肽的n端可因此是容易接近的并且可供用于与配体相互作用。所述肽可通过在c端处的主链α羰基连接至所述基底。

因此，所述材料可包含以下结构：

可替代地，所述肽可通过其n端结合至所述基底。所述材料可因此包含以下结构：

可替代地，所述肽可通过其氨基酸残基之一的侧链来结合。

优选地，间隔物通过酰胺键连接至所述肽。因此，所述材料可包含以下结构之一或二者：

优选地，间隔物通过酰胺键连接至所述基底。

在优选的实施方案中，间隔物包括肽间隔物。适合的肽间隔物的实例包括甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、β-丙氨酸、l-赖氨酸或ε-氨基己酸。在一些实施方案中，肽间隔物的长度是1-5个或1-2个氨基酸。

在一些实施方案中，间隔物包括非肽间隔物。这可能是肽间隔物的附加方案或替代方案。非肽间隔物可包含直链，优选地其中所述非肽间隔物包含基团-(ch2)a-，其中a是1-20，优选地是1-15、1-10、1-5或2-4。

在优选的实施方案中，所述材料包含以下结构之一或二者：

在一些实施方案中，所述基底是伤口敷料。伤口敷料材料优选地是非胶态多孔敷料材料。如本文所用的术语“非胶态多孔敷料材料”是指通常可适用于覆盖、罩住或保护伤口的任何非胶态多孔材料。此类材料的实例包括片、垫、海绵、泡沫、膜、纱布、网格、颗粒以及珠粒。非胶态多孔敷料材料包括适用于局部施用于伤口但不适用于注射到身体中的材料。具体地，颗粒或珠粒太大，不能穿过肺毛细血管床。至少大部分颗粒或珠粒具有大于6μm的最大尺寸。敷料材料优选地是氧化纤维素或者具有可用于缀合的羧基的任何其他敷料材料。伤口敷料可以是织物。

优选地，伤口敷料是无菌的。伤口敷料可以作为准备施用于伤口的无菌伤口敷料提供。伤口敷料可与说明书一起包装以将伤口敷料应用于伤口。

本发明可提供一种减少或控制出血的方法，其包括向伤口施用伤口敷料。

在一些实施方案中，所述基底是手术紧固件。术语“手术紧固件”是指用于机械连接组织的装置或试剂，其通过刺穿或刺穿组织来应用。手术紧固件的实例包括缝合线、钉和销。纤维蛋白原结合肽已所共价固定到的手术紧固件可以特别有利地用于促进在其应用期间形成的孔中的凝血。例如，其可防止或减少缝合线孔中的出血。手术紧固件可用于将材料(诸如伤口敷料)连接至患者。

本发明提供一种连接组织的方法，其包括将手术紧固件应用于患者。

优选地，共价固定至基底(或用于共价固定至基底)的肽(例如纤维蛋白原结合肽)的长度各自是4-60个，优选地4-30个，更优选地4-10个氨基酸残基。在其他实施方案中，每个肽的长度可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基。优选的是，每种肽的长度不长于60个氨基酸残基，更优选地其长度不长于30个氨基酸残基。

如本文所用的术语“肽”也并入肽类似物。若干种肽类似物是技术人员已知的。在纤维蛋白原结合肽的情况下，可以使用任何适合的类似物，只要纤维蛋白原能够结合至纤维蛋白原结合肽。

适合的纤维蛋白原结合肽的实例以及其可识别的方式提供于wo2005/035002、wo2007/015107和wo2008/065388。

优选地，每种纤维蛋白原结合肽是合成肽。

优选地，每种纤维蛋白原结合肽以10^-9至10^-6m之间的解离常数(kd)结合至纤维蛋白原，所述解离常数例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400nm或更大。约100nm的kd是优选的。解离常数可在平衡时测量。例如，已知浓度的放射性标记的纤维蛋白原可用微球体温育，纤维蛋白原结合部分已于所述微球体交联。通常，5μm肽与1gm微球体交联，或者15-40摩尔的肽与1gm的微球体交联。将肽连接的微球体稀释至0.5mg/ml，并且在具有浓度为0.05与0.5mg/ml之间的放射性标记的纤维蛋白原的ph7.4等渗缓冲液(例如，含有0.15mnacl的0.01mhepes缓冲液)中在20℃下孵育1h。微球体上结合至纤维蛋白原结合肽的纤维蛋白原可以通过离心作用与游离纤维蛋白原分离并且测量游离的和结合的纤维蛋白原的量。解离常数然后可通过scatchard分析通过将结合的纤维蛋白原的浓度针对结合纤维蛋白原:游离纤维蛋白原的浓度的比率作图来计算，其中曲线的斜率表示kd。

纤维蛋白原分子由通过二硫键连接在一起的三对不同的多肽链αα、ββ和γ组成。纤维蛋白原链被折叠成三个不同的结构区域，两个远端d区域连接至一个中心e区域。每个d区域含有分别位于γ和ββ区域的c端的聚合‘a’和‘b’孔。凝血酶催化短肽血纤维蛋白肽a(fpa)和b(fpb)分别从中心e区域中的纤维蛋白原的aα链和ββ链的氨基端去除，从而暴露出两个聚合位点：“突起a”，其具有氨基端序列gly-pro-arg-；以及“突起b”，其具有氨基端序列gly-his-arg-。一个血纤维蛋白单体的最新暴露的聚合突起物通过‘a-a’和‘b-b’突起孔相互作用与另一个血纤维蛋白单体的相应孔相互作用，从而使得血纤维蛋白单体组装成半交错的双链原纤维。

在本发明的优选实施方案中，每个纤维蛋白原结合肽包含序列gly-(pro,his)-arg-xaa(seqidno:1)，其中xaa是任何氨基酸并且pro/his意指脯氨酸或组氨酸存在于该位置处。优选地，此序列处于肽的氨基端。例如，所述肽可包含序列nh2-gly-(pro,his)-arg-xaa(seqidno:1)。所述肽可通过其羧基端连接至基底。

然而，在一些实施方案中，氨基酸序列可以是处于肽的羧基端。所述肽可通过其氨基端连接至基底。例如，优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于孔‘b’)的至少一个纤维蛋白原结合肽，诸如包含序列apfprpg(seqidno:2)的肽可通过其氨基端连接至载体或线(thread)。如果纤维蛋白原结合肽通过其氨基端连接，则所述肽的羧基端可包含酰胺基团。酰胺基团而非羧基(或带负电荷羧酸根离子)在所述肽的暴露的羧基端处的存在可有助于优化纤维蛋白原结合肽与纤维蛋白原的结合。

在本发明的一些实施方案中，纤维蛋白原结合肽中的至少一些包含氨基酸序列gly-pro-arg-xaa(seqidno:3)，其中xaa是任何氨基酸。优选地，xaa是除val之外的任何氨基酸，并且优选地是pro、sar或leu。

在一些实施方案中，纤维蛋白原结合肽中的至少一些包含氨基酸序列gly-his-arg-xaa(seqidno:4)，其中xaa是除pro之外的任何氨基酸。

根据本发明的一些实施方案，纤维蛋白原结合肽优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于纤维蛋白原的孔‘b’)。优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于孔‘b’)的适合的纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括：gpr-；gprp-(seqidno:5)；gprv-(seqidno:6)；gprpfpa-(seqidno:7)；gprvvaa-(seqidno:8)；gprpvver-(seqidno:9)；gprpaa-(seqidno:10)；gprppec-(seqidno:11)；gprpper-(seqidno:12)；gpspaa-(seqidno:13)。

根据一些实施方案，纤维蛋白原结合肽优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于纤维蛋白原的孔‘a’)。优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于孔‘a’)的纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括：ghr-、ghrp-(seqidno:14)、ghrpy-(seqidno:15)、ghrpl-(seqidno:16)、ghrpy酰胺-(seqidno:17)。

所述材料可包含具有不同序列的纤维蛋白原结合肽。例如，在一些实施方案中，所述材料可包含具有结合至纤维蛋白原的孔‘a’相对于孔‘b’的不同选择性的纤维蛋白原结合肽。

优选地，纤维蛋白原结合肽不包含纤维蛋白原。优选地，纤维蛋白原未固定至基底。优选地，所述材料不是通过将纤维蛋白原固定至基底来形成。

在一个优选的布置中，纤维蛋白原分子可以结合至少两个纤维蛋白原结合肽。因此，如果存在固定至基底的多个纤维蛋白原结合肽，则纤维蛋白原分子可以变成非共价交联的。因此，纤维蛋白原结合肽可包含可以同时结合至纤维蛋白原的两个不同区域的一个或多个序列。例如，纤维蛋白原包含两个端部结构域(d-结构域)，其各自可结合至纤维蛋白原结合肽。

在一个优选的实施方案中，所述材料可包含以下结构中的一个或多个：

本发明可提供一种控制出血的方法，其包括向伤口施用本发明的止血材料。

在一些实施方案中，基底(优选地是氧化纤维素基底)共价固定至多个纤维蛋白原结合肽，其中所述纤维蛋白原结合肽是已共价固定至所述基底的止血剂的一部分。

例如，所述止血剂可包含多个载体和固定至每个载体的多个纤维蛋白原结合肽。多个载体可因此共价固定至基底并且多个纤维蛋白原结合肽可固定至每个载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体是可溶性载体。例如，所述载体可溶于血浆中。所述载体应适用于施用于出血伤口部位。所述载体可包含聚合物，例如蛋白质、多糖或合成的生物相容性聚合物(诸如聚乙二醇)或其任何组合。白蛋白是优选的蛋白质载体。可溶性载体或止血剂可具有至少10mg/ml溶剂的溶解度，例如10-1000mg/ml、33-1000mg/ml或33-100mg/ml。

载体可包含允许纤维蛋白原结合肽连接的反应基团。例如，载体可在其表面上包含硫醇部分或胺部分。如果载体是蛋白质性的，则硫醇部分或胺部分可由氨基酸(例如半胱氨酸或赖氨酸)的侧链提供。可替代地，反应基团可添加到载体。如果载体由蛋白质诸如白蛋白形成，则这是特别有利的。例如，载体可以使用能够与载体上的伯胺基团反应的试剂(诸如2-亚氨基四氢噻吩(2-it))硫醇化。可替代地，胱胺可以在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)存在下偶合至载体上的羧基，接着还原性裂解所引入的二硫键。

在优选的实施方案中，所述纤维蛋白原结合肽通过间隔物共价固定至基底。优选的间隔物是非肽间隔物，例如包含亲水性聚合物诸如聚乙二醇(peg)。在一个优选的实施方案中，使各自包含通过peg间隔物连接至硫醇反应基团(例如，马来酰亚胺基团)的纤维蛋白原结合肽的多个肽缀合物与硫醇化载体(例如，使用如上所述的2-it或胱胺制备)反应。适合的非肽间隔物描述于wo2013/114132中。

止血剂可包含肽缀合物。适合的载体可因此包含一个或多个氨基酸残基，例如单个氨基酸残基，诸如赖氨酸氨基酸残基。包含含有一个或多个氨基酸残基的载体的缀合物的优点在于它们可容易使用固相肽合成方法制成。另外，它们可容易在未使用免疫原性试剂的情况下产生并且可耐受消毒辐射。

肽缀合物的每个纤维蛋白原结合肽可独立地在其羧基端(任选地通过接头)或其氨基端(任选地通过接头)连接至载体。

在一个实例中，肽缀合物可具有以下通式：

fbp-(接头)-x-(接头)-fbp

其中：

fbp是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地是非肽接头；

x是氨基酸，优选地是多官能氨基酸，最优选地是三官能氨基酸残基，诸如赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。

在一个优选的实施方案中，肽缀合物是树枝状体。树枝状体可包含分支核心和单独地共价连接至所述分支核心的多个纤维蛋白原结合肽。分支核心可包含一个或多个多官能氨基酸。每个多官能氨基酸或多个多官能氨基酸可具有共价连接至所述分支核心的一个或多个纤维蛋白原结合肽。

所述分支核心包含：i)两个至十个多官能性氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至分支核心的多官能氨基酸残基；ii)多个多官能氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至分支核心的至少两个相邻多官能氨基酸残基中的每一个；iii)多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至分支核心的多官能氨基酸残基中的至少一个；iv)多个多官能氨基酸残基，其中两个或更多个多官能氨基酸残基通过相邻多官能氨基酸残基的侧链共价连接；或者v)单个多官能氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽单独地共价连接至多官能氨基酸残基的每个官能团。

多官能氨基酸残基可包含三官能或四官能氨基酸残基或三官能和四官能氨基酸残基，或者单个多官能氨基酸残基是三官能或四官能氨基酸残基。

每个纤维蛋白原结合肽可具有不同的与分支核心的连接点，因此纤维蛋白原结合肽在本文中被认为“单独地共价连接”至分支核心。

分支核心包含任何适合的氨基酸序列。分支核心可包含多达十个多官能氨基酸残基，例如两个至十个或两个至六个多官能氨基酸残基。

分支核心可包含多个连续多官能氨基酸残基。分支核心可包含多达十个连续多官能氨基酸残基。

本文所用的术语“三官能氨基酸”是指具有为胺(-nh2)的第一官能团、为羧酸(-cooh)的第二官能团和第三官能团。本文所用的术语“四官能氨基酸”是指具有为胺(-nh2)的第一官能团、为羧酸(-cooh)的第二官能团、第三官能团以及第四官能团。第三官能团和第四官能团可以是能够与纤维蛋白原结合肽的羧基端反应或者与连接至纤维蛋白原结合肽的羧基端的接头的官能团反应的任何官能团。

多官能氨基酸可包含具有氨基、羧基和带有另一个官能团(由此提供三官能氨基酸)或另外两个官能团(由此四官能氨基酸的侧链的中心碳原子(α-或2-)。

所述多官能氨基酸残基或每个多官能氨基酸残基可以是蛋白原性或非蛋白原性多官能氨基酸或者天然或非天然多官能氨基酸残基。

蛋白原性三官能氨基酸包括具有氨基、羧基、侧链和α氢左旋构象的中心碳原子(α-或2-)。适合的三官能蛋白原性氨基酸的实例包括l-赖氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-天冬酰胺、l-谷氨酰胺以及l-半胱氨酸。

适合的三官能非蛋白原性氨基酸残基的实例包括d-赖氨酸、β-赖氨酸、l-鸟氨酸、d-鸟氨酸以及d-精氨酸残基。

用于本发明的肽树枝状体的适合的三官能氨基酸残基的实例包括：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺以及半胱氨酸残基，例如l-赖氨酸、d-赖氨酸、β-赖氨酸、l-鸟氨酸、d-鸟氨酸、l-精氨酸、d-精氨酸、l-天冬氨酸、d-天冬氨酸、l-谷氨酸、d-谷氨酸、l-天冬酰胺、d-天冬酰胺、l-谷氨酰胺、d-谷氨酰胺、l-半胱氨酸以及d-半胱氨酸残基。

适用于本发明的肽树枝状体中的适合的多官能非天然氨基酸的实例包括瓜氨酸、2,4-二氨基异丁酸、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸以及顺式-4-氨基-l-脯氨酸。多官能非天然氨基酸可获自sigma-aldrich。

在一些实施方案中，分支核心可包含均聚多官能氨基酸序列，例如聚赖氨酸、聚精氨酸或聚鸟氨酸序列，诸如分支核心包含两个至四个或两个至六个连续的赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸残基。在其他实施方案中，分支核心可包含不同的多官能氨基酸残基，例如一个或多个赖氨酸残基、一个或多个精氨酸残基和/或一个或多个鸟氨酸残基。

在其他实施方案中，分支核心可包含多个多官能氨基酸残基和一个或多个其他氨基酸残基。

在分支核心包含多个多官能氨基酸残基时，相邻多官能氨基酸残基可以通过氨基酸侧链连接、通过肽键连接在一起，或者一些相邻多官能氨基酸残基可以通过侧链连接连接在一起并且其他多官能氨基酸残基通过肽键连接在一起。

在其他实施方案中，分支核心可包含两个或更多个多官能氨基酸残基，并且至少一个纤维蛋白原结合肽单独地连接至每个或更多个多官能氨基酸残基中的每一个，并且两个或更多个纤维蛋白原结合肽单独地连接至分支核心的多官能氨基酸残基中的至少一个。

根据其他实施方案，两个纤维蛋白原结合肽单独地连接至分支核心的末端多官能氨基酸残基。

肽树枝状体的结构的实例包括肽树枝状体，其中：

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基；

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基和两个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基；

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽所连接的第三个三官能氨基酸残基；或者

·分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽所连接的第一个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第二个三官能氨基酸残基、一个纤维蛋白原结合肽所连接的第三个三官能氨基酸残基以及一个纤维蛋白原结合肽所连接的第四个三官能氨基酸残基。

肽树枝状体可包含以下通式(i)：

其中：

fbp是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地是非肽接头；

x是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸；

y是-fbp或-nh2；

当y是-fbp时z是–(接头)-fbp，或者当y是-nh2时z是-[-xn-(接头)-fbp]a-(接头)-fbp；

其中：

xn是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、l-鸟氨酸或精氨酸；并且

a是1-10，优选地是1-3。

例如，当y是nh2时，z是-[-xn-(接头)-fbp]a-(接头)-fbp，树枝状体的结构如下：

其中a是1：

或者，其中a是2：

或者，其中a是3：

可替代地，当y是-fbp时z是-[-xn-(接头)-fbp]a-(接头)-fbp；

其中：

xn是三官能氨基酸残基，优选地是赖氨酸、l-鸟氨酸或精氨酸；并且

a是1-10，优选地是1-3。

例如，当y是-fbp时，z是-[-xn-(接头)-fbp]a-(接头)-fbp并且a是1，树枝状体的结构如下：

肽树枝状体可包含以下通式(ii)：

其中：

fbp是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-nh(ch2)5co–；

y是-fbp或-nh2；

z是：

-r-(接头)-fbp，这是在y是-fbp时，或者

其中r是-(ch2)4nh-、-(ch2)3nh-或-(ch2)3nhcnhnh-。

因此，在一个实施方案中，z可以是：

其中r是-(ch2)4nh-、-(ch2)3nh-或-(ch2)3nhcnhnh-；其中a是1-3。

可替代地，a可以是4-10，或者其可以是1-10。

在另一实施方案中，z是：

其中r是-(ch2)4nh-、-(ch2)3nh-或-(ch2)3nhcnhnh-；

其中a是1-10，优选地是1-3。

例如，z是：

肽树枝状体可包含以下通式(iii)：

其中：

fbp是纤维蛋白原结合肽；

–(接头)-是任选的接头，优选地包含-nh(ch2)5co–；

y是-fbp或-nh2；

z是：

-(ch2)4nh-(接头)-fbp，这是在y是-fbp时；或者

因此，在一个实施方案中，z可以是：

其中a是1-3。

可替代地，a是4-10，或者其可以是1-10。

在另一实施方案中，z是：

其中a是1-10，优选地是1-3。

例如，z是：

一个或多个或每个纤维蛋白原结合肽可通过非肽接头共价连接。接头可以是不干扰纤维蛋白原与纤维蛋白原结合肽的结合的任何适合的接头。所述接头可包括柔性的直链接头，适合地是直链烷基。此类接头可以因此允许肽树突状体的纤维蛋白原结合肽彼此远离地延伸。例如，所述接头可包含–nh(ch2)nco–基团，其中n是任何数值，适合地是1-10，例如5。包含-nh(ch2)5co-基团的接头可通过使用ε‐氨基酸6‐氨基己酸(εahx)来形成。

肽缀合物(诸如肽树突状体)的特定优点在于它们可容易例如通过暴露于辐射(适合地为γ辐射)来消毒，而没有肽树突状体或组合物与纤维蛋白原聚合的能力的显著损失。

根据本发明，提供一种对止血材料进行消毒的方法，其包括使所述材料暴露于γ辐射，优选地多达30kgy，其中止血材料包含基底(优选地是氧化纤维素基底)和固定至基底的多个纤维蛋白原结合肽。优选地，通过肽缀合物诸如肽树突状体提供纤维蛋白原结合肽。

在理论上，每个载体的纤维蛋白原结合肽的数目不存在上限。然而，实际上，对于任何特定结构而言，可以对纤维蛋白原结合肽的数目进行改变和测试，以确定用于所需纤维蛋白原聚合特性，例如用于纤维蛋白原聚合的速度或通过与纤维蛋白原聚合产生的水凝胶的密度的最佳数目。最佳数目可能取决于许多因素，包括载体的性质和每个载体上用于连接纤维蛋白原结合肽的反应基团的数目。然而，优选的是，每个载体分子平均存在多达100个纤维蛋白原结合肽。优选地，每个载体分子平均存在至少三个、优选地至少五个纤维蛋白原结合肽。优选的范围是每个载体分子10-20个纤维蛋白原结合肽。肽缀合物(诸如肽树突状体)可包含总计每个树突状体多达二十个纤维蛋白原结合肽，例如每个树突状体多达十个纤维蛋白原结合肽或者每个树突状体多达五个纤维蛋白原结合肽。

每个载体可具有连接至所述载体的不同序列的纤维蛋白原结合肽。对于多个载体，第一种多个载体可具有与第二种多个载体相比不同的所连接的纤维蛋白原结合肽。

适用于固定至基底的止血剂可包含肽树突状体和含有两个或更多个纤维蛋白原结合肽的肽缀合物。肽缀合物可包含具有相同序列或不同序列的纤维蛋白原结合肽。例如，肽缀合物可包含优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于孔‘b’)的唯一纤维蛋白原结合肽、或者优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于孔‘a’)的唯一纤维蛋白原结合肽、或者优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于孔‘b’)的一个或多个纤维蛋白原结合肽和优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于孔‘a’)的一个或多个纤维蛋白原结合肽。在一些实施方案中，肽缀合物可以是肽树突状体。肽树突状体的纤维蛋白原结合肽可优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于纤维蛋白原的孔‘b’)，并且肽缀合物的纤维蛋白原结合肽可优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于纤维蛋白原的孔‘a’)。已发现此类组合物具有协同效应，因为它们能够比单独的肽树突状体或肽缀合物更快速地聚合纤维蛋白原。此协同效应的机制未得到充分的理解，但是在未受到理论约束的情况下，认为其可能发生，因为所述组合物提供更多‘a’和‘b’纤维蛋白原聚合位点。

可替代地，肽树突状体的纤维蛋白原结合肽可优选结合至纤维蛋白原的孔‘b’(相对于纤维蛋白原的孔‘a’)，并且肽缀合物的纤维蛋白原结合肽可优选结合至纤维蛋白原的孔‘a’(相对于纤维蛋白原的孔‘b’)。

现仅借助示例并参考附图来描述本发明的实施方案，在附图中：

图1示出用于合成本发明的止血敷料的方案；

图2示出用于监测保持结合在本发明的敷料上的完全去保护的纤维蛋白原肽的存在的kaiser测试(ninhydrin测试)的结果；

图3a示出用于对照敷料和本发明的止血敷料的样品；

图3b示出本发明的敷料与对照相比改进的凝血活性；

图4示出用于改性敷料的表面的反应方案；

图5示出用于合成本发明的止血敷料的反应方案；

图6示出用于监测保持结合在本发明的敷料上的完全去保护的纤维蛋白原肽的存在的kaiser测试(ninhydrin测试)的结果；

图7a示出用于对照敷料和本发明的止血敷料的样品；

图7b示出本发明的敷料与对照相比改进的凝血活性；

图7c示出放置在聚丙烯管上的本发明的止血材料和对照材料；

图7d示出本发明的止血材料对人类纤维蛋白原的聚合；

图7e示出在本发明的止血材料上的纤维蛋白原凝血；

图8示出用于改性敷料的表面的反应方案；

图9示出用于合成本发明的止血敷料的反应方案；

图10示出用于监测保持结合在本发明的敷料上的完全去保护的纤维蛋白原肽的存在的kaiser测试(ninhydrin测试)的结果；

图11示出用于改性敷料的表面的反应方案；

图12示出用于合成本发明的止血敷料的反应方案；

图13示出用于监测保持结合在本发明的敷料上的完全去保护的纤维蛋白原肽的存在的kaiser测试(ninhydrin测试)的结果；

图14示出肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力；

图15示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图16示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图17示出若干种不同的肽树突状体聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力。编号是指肽树突状体的身份；

图18示出通过使用不同肽树突状体聚合纤维蛋白原来形成的水凝胶的照片；

图19示出肽树突状体与肽缀合物的不同组合聚合不同浓度的纤维蛋白原的能力；并且

图20示出若干种不同的肽树突状体聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力。

实施例1-boc-gpr(pbf)pg-nh-ch2-ch2-nh2(boc-fbp-)在氧化再生纤维素织物上的一步偶合

boc-gpr(pbf)pg-nh-ch2-ch2-nh2(boc-fbp-)部分通过fmoc-化学由c端到n端专门地组装。在合成的最后合成点期间，完全保护所述部分(在arg上包含pbf保护基团)，除了c端上的游离氨基，并且所保护部分购自almacltd。

将可商购获得的由johnson&johnsonmedicallimited的ethiconinc.制成的surgicel*absorbablehemostat(氧化再生纤维素(orc))用作基底。surgicel中的羧酸含量从文献中采用(参见ep0659440)。50克surgicelnu-knit*织物具有20％羧酸含量(0.22摩尔的羧酸)。

将用于合成的orc织物用2x1ml二氯甲烷(dcm)预先洗涤(1min)并在33℃下干燥。在干燥之后，将orc织物-50mg(0.2mmol–的羧酸cooh)浸入在1ml二甲基甲酰胺(dmf)溶液中并且将其与o-苯并三唑-n,n,n’,n’-四甲基-脲-六氟-磷酸盐(hbtu；90mg，0.2mmol)、1-羟基-1h-苯并三唑(hobt；30mg，0.2mmol)混合，然后在室温下将敷料活化15min。然后添加n,n-二异丙基乙二胺(0.4mmol，0.075ml，d＝0.798)(或n,n-二异丙基乙胺dipea)并且将所得溶液再反应15min。在此之后，将dmf中所溶解的50mg0.05mmolboc-gpr(pbf)pg-nh-ch2-ch2-nh2添加到总计2ml的反应混合物中。将偶合反应在室温下进行5小时。用dmf(3x1ml)、甲醇(meoh)(3x1ml)和dmf(3x1ml)洗涤织物。重复boc-gpr(pbf)pg-nh-ch2-ch2-nh2偶合步骤并且在室温下孵育过夜，然后用dmf(2x1ml)、meoh(1x1ml)和dmf(2x1ml)洗涤。然后用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤orc织物。在偶合反应之后用95％tfa、2.5％tis、2.5％水(3ml)去除保护基团产生了gprpg-nh-ch2-ch2-nh-co-orc(“gprpg-orc”)。

图1汇总了反应方案和结构。图2示出监测保持结合在织物(orc对照(顶部)；gprpg-orc(底部))上的完全去保护的肽的存在的kaiser测试(ninhydrin测试)的结果。

实施例2–官能性测试

称量gprpg-fbp和orc(对照)的样品，用100μl人类血浆(alphalabs-plasmalot#a1162exp2015-03)处理并且在33℃下孵育1.5或3min。从血浆中取出测试的样品和对照并且然后称量以确定任何差值。将测试重复3次。表1中的结果显示，保持在gprpg-orc上的质量与对照样品相比显著更高，这指示纤维蛋白原结合肽当缀合至织物时保持活性。

表1

将orc(对照)和gprpg-orc(各自6mg)放置在称量瓶中(参见图3a–对照(左图)；gprpg-orc(右图))并且用100μl人类血浆进行处理，然后在33℃下孵育3min。将所得血块放置(倾斜)成90°角，并且观察到来自血块的任何溢流。orc(对照)释放流体，但gprpg-orc不会(参见图3b–对照(左图)；gprpg-orc(右图))。

实施例3–使用gly-gly间隔物制备表面改性的氧化纤维素织物

通过碱催化的hbtu/hobt酰胺键形成来实现将gly-gly间隔物引入到氧化纤维素织物中。将用于合成的织物用2x5ml二氯甲烷(dcm)预先洗涤(1min)并在33℃下干燥。在干燥之后，将织物285mg(1.25mmol–cooh浓度)浸入在5ml二甲基甲酰胺(dmf)溶液中并且将其与o-苯并三唑-n,n,n’,n’-四甲基-脲-六氟-磷酸盐(hbtu；597mg，1.156mmol)、1-羟基-1h-苯并三唑(hobt；217mg，1.56mmol)混合，然后在室温下将织物活化15min。然后添加n,n-二异丙基乙二胺(3.14mmol，0.505ml，d＝0.798)(或n,n-二异丙基乙胺dipea)并且将所得溶液再反应15min。在此之后，将二甲亚砜(dmso)中所溶解的24mg0.31mmolgly-oh添加到反应混合物中。

将偶合反应在室温下进行140min。用dmf(3x5ml)、甲醇(meoh)(3x5ml)和dmf(3x5ml)洗涤氧化纤维素织物。重复gly-oh偶合步骤并且在室温下孵育30min，然后用dmf(2x5ml)、meoh(1x5ml)和dmf(2x5ml)洗涤。

图4汇总了反应方案和结构。

实施例4-boc-fbp与gly-gly-官能化氧化纤维素织物的偶合

通过碱催化的合成方法实现boc-fbp与gly-gly-官能化织物的偶合。首先，将gly-gly-官能化织物浸入在dmf(5ml)中并且将其与hbtu(475mg，1.25mmol)、hobt(169mg，1.25mmol)混合。在室温下搅拌2min之后，添加n,n-二异丙基乙二胺(0.406ml，2.5mmol)(或dipea)并混合2min。将275mg(0.31mmol)boc-fbp肽溶解在dmf(200μl)中并且将此添加到反应混合物。将偶合反应在室温下进行过夜(17小时)。然后用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤敷料。在偶合反应之后用95％tfa、2.5％tis、2.5％水(3ml)去除保护基团产生了gprpg-nh-ch2-ch2-nh-co-g-g-orc(“gprpg-g-g-orc”)。

kaiser测试(ninhydrin测试)用于监测保持结合在织物(参见图6—orc对照(顶部)；gprpg-g-g-orc(底部))上的完全去保护的肽的存在。

kaiser测试显示与实施例1(没有gly-gly间隔物)相比更强烈的强阳性结果。

实施例5–官能性测试

对于gprpg-g-g-orc重复倾斜测试(在实施例2中描述)。将orc(对照)和gprpg-g-g-orc(各自8mg)各自放置在称量瓶中并且用100μl人类血浆处理，然后在33℃下孵育1.5min。将所得凝块放置(倾斜)成90°角。观察到凝块的强度。图7a和图7b示出与血浆形成比orc对照(左图)更强的gprpg-g-g-orc样品；(gprpg-g-g-orc(右图))。

称量gprpg-g-g-fbp和orc(对照)的样品，并且用150μl人类血浆(alphalabs-plasmalot#a1174exp2016-03)处理并且在33℃下孵育1.5min。从血浆中取出测试的样品和对照并且然后称量以确定是否可观察到任何差值。将测试重复四次。表2中的结果显示，保持在gprpg-g-g-orc上的质量与对照样品相比显著更高，这表明纤维蛋白原结合肽当缀合至再生氧化纤维素织物时保持活性。

表2

图7c示出放置在单独的聚丙烯管中的gprpg-g-g-orc(管标记的sc+(顶部))和orc(对照)(管标记的sc-(顶部))纤维。将150μl人类血浆溶液(alphalabs-plasmalot#a1162exp2016-03)添加到每个样品中并且将纤维在37℃下孵育1.5分钟。具有存在于图7d所示的sc+-中的凝块。

还进行对从聚乙烯管取出的线的视觉检查。图7e显示gprpg-g-g-orc纤维与人类纤维蛋白原形成凝块。从容器取出的gprpg-g-g-orc纤维比对照样品更厚。

实施例6–使用ε-ahx间隔物制备表面改性的氧化纤维素织物

通过碱催化的hbtu/hobt酰胺键形成来实现将6-氨基己酸(ε-ahx)间隔物引入到氧化纤维素织物中。所采用的合成方法与以上实施例3中所述的用于改性具有gly-gly间隔物的orc织物的方法基本上相同。

在预先洗涤和干燥步骤之后，将114mg织物浸入在2mldmf溶液中并且将其与o-苯并三唑-n,n,n’,n’-四甲基-脲-六氟-磷酸盐(hbtu；237mg，0.625mmol)、1-羟基-1h-苯并三唑(hobt；84mg，0.625mmol)混合，然后在室温下将织物活化15min。然后添加n,n-二异丙基乙二胺(1.25mmol，0.200ml，d＝0.798)(或dipea)并且将所得溶液再反应15min。在此之后，将二甲亚砜(dmso)中所溶解的16.4mg0.125mmolε-ahx-oh添加到反应混合物中。将偶合反应在室温下进行过夜。

用dmf(3x3ml)、甲醇(meoh)(3x3ml)和dmf(3x3ml)洗涤织物。

图8汇总了反应方案和结构。

实施例7–boc-fbp与ahx-官能化敷料的偶合

通过如实施例4所述的碱催化的合成方法实现boc-fbp与ahx-官能化织物的偶合。

图9示出反应方案和结构的汇总。

首先，将ahx-官能化敷料浸入在dmf(2ml)中并且将其与hbtu(190mg，0.5mmol)、hobt(67.4mg，0.5mmol)混合。在室温下搅拌2min之后，添加n,n-二异丙基乙二胺(0.180ml，1.1mmol)(或dipea)并混合2min。将110mg(0.125mmol)boc-fbp肽溶解在dmf(200μl)中并且将此添加到反应混合物。将偶合反应在室温下进行过夜(17小时)。然后用dmf(3x3ml)和dcm(3x3ml)洗涤敷料。在偶合反应之后用95％tfa、2.5％tis、2.5％水(3ml)去除保护基团产生了gprpg-nh-ch2-ch2-nh-co-ahx-orc(“gprpg-ahx-orc”)。

kaiser测试(ninhydrin测试)用于监测保持结合在纤维素(参见图10—gprpg-ahx-orc(左图)；gprpg-g-g-orc(右图))上的完全去保护的肽的存在。

实施例8–使用β-ala间隔物制备表面改性的氧化纤维素织物

通过碱催化的hbtu/hobt酰胺键形成来实现将β-丙氨酸(β-ala)间隔物引入到氧化纤维素织物中。所采用的合成方法与以上实施例3中所述的用于改性具有gly-gly间隔物的orc织物的方法基本上相同。

在预先洗涤和干燥步骤之后，将206mg织物浸入在5mldmf溶液中并且将其与o-苯并三唑-n,n,n’,n’-四甲基-脲-六氟-磷酸盐(hbtu；442mg，1.165mmol)、1-羟基-1h-苯并三唑(hobt；152mg，1.125mmol)混合，然后在室温下将织物活化15min。然后添加n,n′-二异丙基乙二胺(2.468mmol，0.319ml)(或n,n-二异丙基乙胺-diepa)并且将所得溶液再反应15min。在此之后，将二甲亚砜(dmso)中所溶解的20mg0.226mmolβ-ala-oh添加到反应混合物中。将偶合反应在室温下进行过夜。

用dmf(3x5ml)、甲醇(meoh)(3x5ml)和dmf(3x5ml)洗涤织物。

图11汇总了反应方案和结构。

实施例9–boc-fbp与β-ala-官能化敷料的偶合

通过如实施例4所述的碱催化的合成方法实现boc-fbp与β-ala-官能化织物的偶合。

图12示出反应方案和结构的汇总。

首先，将β-ala-官能化敷料浸入在dmf(5ml)中并且将其与hbtu(350mg，0.923mmol)、hobt(124mg，918mmol)混合。在室温下搅拌2min之后，添加n,n′-二异丙基乙二胺(0.247ml，1.911mmol)(或n,n-二异丙基乙胺diepa)并混合2min。将202mg(0.231mmol)boc-fbp肽溶解在dmf(400μl)中并且将此添加到反应混合物。将偶合反应在室温下进行过夜(17小时)。然后用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤敷料。在偶合反应之后用95％tfa、2.5％tis、2.5％水(3ml)去除保护基团产生了gprpg-nh-ch2-ch2-nh-co-ahx-orc(“gprpg-ahx-orc”)。

kaiser测试用于监测保持结合在纤维素上的完全去保护的肽的存在。参见图13从左图开始是surgicel对照(标记为orc-对照)、gprpg-β-ala-orc和gprpg-ahx-orc。

实施例10–官能性测试

称量gprpg-β-ala-fbp、gprpg-ahx-orc和orc(对照)的样品，并且用100μl人类血浆(alphalabs-plasmalot#a1174exp2016-03)处理并且在33℃下孵育1.5min。从血浆中取出测试的样品和对照并且然后称量以确定是否可观察到任何差值。将测试重复三次。表3中的结果显示，保持在gprpg-β-ala-orc、gprpg-ahx-orc上的质量与对照(surgicel)样品相比显著更高，这表明纤维蛋白原结合肽当缀合至再生氧化纤维素织物时保持活性。

表3

实施例11-肽树突状体和肽缀合物的合成

在rink酰胺mbha低负荷树脂(novabiochem，0.36mmol/g)通过标准fmoc肽合成使用fmoc保护的氨基酸(novabiochem)合成肽。

大体上，在整个合成中使用单次偶合循环并且采用hbtu活化化学(hbtu和pybop(来自agtcbioproducts)用作偶合剂)。然而，在一些位置处，偶合比预期更低效并且需要双倍偶合。

使用自动肽合成器和多达分支点的hbtu并且通过使用肽分支的pybop进行手动肽合成来组装肽。

对于自动合成，将三倍过量的氨基酸和hbtu用于每次偶合并且使用二甲基甲酰胺(dmf,sigma)中九倍过量的n,n-二异丙基乙胺(dipea,sigma)。

对于手动合成，将三倍过量的氨基酸和pybop用于每次偶合并且使用n-甲基吡咯烷酮(nmp，sigma)中九倍过量的dipea。

使用dmf中的20％哌啶(sigma)对生长的肽链去保护(fmoc基团去除)同样不能总是有效的并且需要双倍去保护。

使用fmoc-lys(fmoc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh或f-oh制成分支。

通过用含有三异丙基硅烷(tis,sigma)、水和苯甲醚(sigma)(1:1:1,5％)的95％tfa(sigma)处理树脂2-3小时来进行肽的最终去保护和所述肽从固体支持体中裂解。

裂解的肽沉积在冷乙醚(sigma)中，通过离心来成团并且冻干。将小球重新溶解在水(10-15ml)中，将其过滤，并且通过反相hplc使用c-18柱(phenomenex，流速为20ml/min)和含有0.1％tfa的乙腈/水梯度进行纯化。将所纯化的产物冻干并且通过esi-lc/ms和分析性hplc进行分析并且已证实是纯的(>95％)。质量结果全部与计算的值一致。

肽树突状体和肽缀合物

下文示出了使用以上所述的方法合成的肽树突状体和肽缀合物的结构。

在肽序列末端处的“nh2-”基团是指在序列的氨基端处的氨基。在肽序列末端处的“-am”基团是指在序列的羧基端处的酰胺基团。

肽缀合物编号：1：

肽缀合物编号2：

肽树突状体编号3：

肽树突状体编号4：

肽树突状体编号5：

肽树突状体编号8：

肽树突状体编号9：

肽树突状体编号10：

肽树突状体编号11：

肽树突状体编号12：

肽树突状体编号13：

实施例12–肽树突状体与纤维蛋白原的共聚合

树突状体编号12包含具有五个连续赖氨酸残基的分支核心。赖氨酸残基通过相邻赖氨酸残基的侧链共价连接。

评定肽树突状体编号12聚合纤维蛋白原的能力。将浓度范围为0.005-2mg/ml的30μl树突状体溶液添加到3mg/ml的100μl纯化的人类纤维蛋白原(血液中可见的纤维蛋白原水平)中。使用sigmaamelungkc4δ凝固分析仪分析纤维蛋白原的聚合。图14示出在树突状体浓度逐渐增加的情况下聚合(凝血)时间(以秒计)的图。

结果显示树突状体能够几乎立即与纤维蛋白原共聚，甚至在树突状体的非常低的浓度下也是如此。在树突状体浓度超过0.5mg/ml的情况下凝血时间的增加被认为通过与纤维蛋白原内游离的结合口袋的数目相比过量的纤维蛋白原结合肽来解释。在较高浓度下，树突状体的纤维蛋白原结合肽可以使纤维蛋白原结合口袋饱和，从而产生不能与纤维蛋白原工具的显著大量的过量树突状体分子。

实施例7–改变每个树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目对与纤维蛋白原共聚的速度的影响

此实施例研究了改变每个肽树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目对与纤维蛋白原共聚的速度的影响。

使用实施例11中所述的相同方法评定肽树突状体编号4、5、10、11和12与纤维蛋白原共聚的能力。每个树突状体的浓度在0.005-0.5mg/ml之间改变。图15示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，树突状体编号5(仅具有两个纤维蛋白原结合肽/树突状体)不能与纤维蛋白原共聚。由于纤维蛋白原结合肽的数目从三个增加到五个，在～0.125至～0.275mg/ml的树突状体浓度下，共聚的速度增加。在低于～0.125mg/ml树突状体的浓度下，树突状体编号10(具有三个纤维蛋白原结合肽/树突状体)产生比树突状体4(具有四个纤维蛋白原结合肽/树突状体)更快的凝血时间。在范围～0.02-0.5mg/ml内，树突状体编号12(具有五个纤维蛋白原结合肽/树突状体)产生几乎即时的凝血。在范围～0.05-0.3mg/ml内，树突状体编号11(具有四个纤维蛋白原结合肽/树突状体)也产生几乎即时的凝血。

可以得出结论，纤维蛋白原由本发明的树突状体聚合的速度通常随着每个树突状体的纤维蛋白原结合肽的数目增加而增加。

实施例13–纤维蛋白原结合肽取向和不同的纤维蛋白原结合肽序列对与纤维蛋白原共聚的速度的影响

为了评定纤维蛋白原结合肽的取向是否可影响肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，合成了包含连接至单个三官能氨基酸残基(赖氨酸)的三个纤维蛋白原结合肽的肽树突状体(称为“三分支”树突状体)，但是纤维蛋白原结合肽之一被取向成其氨基端连接至分支核心，并且在其羧基端酰胺化。还测试包含不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力。

肽树突状体编号3和10的纤维蛋白原结合肽各自具有序列gprpg(seqidno:18)。肽树突状体编号10的每种纤维蛋白原结合肽被取向成其羧基端连接至分支核心。肽树突状体编号3的纤维蛋白原结合肽之一被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

肽树突状体编号8的纤维蛋白原结合肽中的两种具有序列gprpg(seqidno:18)，并且第三纤维蛋白原结合肽具有序列apfprpg(seqidno:2)，其被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

肽树突状体编号9的纤维蛋白原结合肽中的两种具有序列gprpfpa(seqidno:7)，并且第三纤维蛋白原结合肽具有序列apfprpg(seqidno:12)，其被取向成其氨基端连接至分支核心。该肽的羧基端包含酰胺基团。

序列gprpg(seqidno:15)结合至纤维蛋白原的孔‘a’和孔‘b’，但是对孔‘a’有一些偏爱。序列gprpfpa(seqidno:7)以高偏好结合纤维蛋白原中的孔‘a’。序列pro-phe-pro使肽链的主链稳定并且增强突起-孔相互作用的亲和力(stabenfeld等,blood,2010,116:1352-1359)。

使用实施例11所述的相同方法评定树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.005-0.5mg/ml。图16示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，改变三分支树突状体的纤维蛋白原结合肽之一的取向，以使得所述肽被取向成其氨基端连接至分支核心(即，树突状体编号3)，从而减小树突状体与纤维蛋白原共聚的能力(比较树突状体编号的凝血时间树突状体编号10的凝血时间)。然而，在较高纤维蛋白原浓度下，树突状体编号3能够与纤维蛋白原共聚(数据未示出)。

具有被取向成其氨基端连接至分支核心的不同序列的纤维蛋白原结合肽的三分支树突状体能够与纤维蛋白原共聚(参见树突状体编号8的结果)。

三分支树突状体在与纤维蛋白原共聚合时也具有非常大的活性，其中纤维蛋白原结合肽包含优选结合至纤维蛋白原中的孔‘b’的序列(序列gprpfpa(seqidno:7))，其中这些肽被取向成其羧基端连接至分支核心，并且其他肽包含可逆序列(即序列apfprpg(seqidno:2)，其被取向成其氨基端连接至分支核心(树突状体编号9)。

实施例14-具有不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体与纤维蛋白原共聚的能力

gprpg(seqidno:18)和gprpfpa(seqidno:8)基序主要结合至纤维蛋白原上的‘a’孔。此实施例描述了对嵌合肽树突状体(即，具有连接至相同分支核心的不同纤维蛋白原结合肽序列的肽树突状体)与纤维蛋白原共聚的能力的评定。

肽树突状体编号13是包含具有序列gprpg-(seqidno:18)的两个纤维蛋白原结合肽(其对‘a’孔具有结合偏好)和具有序列ghrpy-(seqidno:15)的两个纤维蛋白原结合肽(其优选结合至‘b’孔)的嵌合四分支肽树突状体。非嵌合肽树突状体编号11和12分别是四臂树突状体和五臂树突状体。这些树突状体的每种纤维蛋白原结合肽具有序列gprpg-(seqidno:18)。树突状体编号11、12和13的每种纤维蛋白原结合肽在其羧基端连接至分支核心。

使用实施例11所述的相同方法评定树突状体与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.005-0.5mg/ml。图17示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，使用嵌合树突状体进行的凝血速度比在低于0.3mg/ml浓度的非嵌合树突状体更慢。然而，图18示出了使用不同树突状体获得的水凝胶的照片。凝胶使用所用的肽树突状体(11、12和13)的数目标记，并且“p”标记使用产物形成的水凝胶，其中若干种纤维蛋白原结合肽连接至可溶性人类血清白蛋白。通过嵌合树突状体形成的水凝胶与使用树突状体编号11和12形成的水凝胶更稠密并且含有更少流体(在3mg/ml纤维蛋白原下或在更高浓度的纤维蛋白原下)。因此，尽管使用嵌合树突状体的凝血时间更慢，但是使用此树突状体形成的水凝胶更稠密。

实施例15–肽树突状体和肽缀合物的混合物与纤维蛋白原共聚的能力

序列gprp(seqidno:5)的纤维蛋白原结合肽牢固并优选地结合至纤维蛋白原的孔‘a’(laudano等,1978pnas7s)。肽缀合物编号1包含具有此序列的两个纤维蛋白原结合肽，其各自连接至赖氨酸残基。第一肽在其羧基端通过接头连接至赖氨酸残基，并且第二肽在其氨基端通过接头连接至其赖氨酸残基。第二肽的羧基端包含酰胺基团。

序列ghrpy-(seqidno:15)的纤维蛋白原结合肽牢固并优选地结合至纤维蛋白原的孔‘b’(doolittle和pandi,biochemistry2006,45,2657-2667)。肽缀合物编号2包含具有此序列的第一纤维蛋白原结合肽，在其羧基端通过接头连接至赖氨酸。具有反向序列(yprhg(seqidno:19))的第二纤维蛋白原结合肽在其氨基端通过接头连接至赖氨酸残基。第二肽的羧基端包含酰胺基团。

接头允许肽彼此远离地延伸。

将肽缀合物编号1或2(2mg/ml)与肽树突状体编号3或4和纤维蛋白原混合，并且使用实施例11所述的相同方法评定所述混合物与纤维蛋白原共聚的能力，每种树突状体的浓度范围是0.025-0.5mg/ml。图15示出在各种不同的树突状体的浓度逐渐增加的情况下获得的凝血时间(以秒计)的图。

结果显示，出乎意料地，仅含有肽缀合物编号2(即具有b-突起肽)和树突状体肽的混合物是协同的和增加的活性，而含有肽缀合物编号1(a-突起肽)当添加到肽缀合物编号2或肽树突状体时是无活性的。

实施例16–肽树突状体聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力

测试若干种不同的肽树突状体(编号4、5、8、9、10、11、12、13)聚合人类血浆中的纤维蛋白原的能力。

将30μl各树突状体(在0.25mg/ml的浓度下)添加到37℃的100μl人类血浆中，并且使用sigmaamelungkc4δ凝固分析仪确定纤维蛋白原的聚合。

每种树突状体的凝血时间示出在图20中，并且显示肽树突状体10、11、4、12和13能够聚合人类血浆中的纤维蛋白原，其中树突状体编号12是特别有效的(具有小于一秒的凝血时间)。然而，肽树突状体编号5、8和9不能聚合人类血浆中的纤维蛋白原。

实施例12-消毒对即用型肽树突状体制剂的影响

此实施例描述了γ辐射对配制为具有水合性凝胶的即用型糊料的肽树突状体的止血活性的影响。

将2ml肽树突状体编号12或13的溶液与surgiflo止血基质(水合可流动明胶基质)混合以形成每种肽的糊料。通过用30kgy剂量的⁶⁰coγ射线对每种糊料进行消毒，并且然后保存在室温下。在保存两周和四周之后将消毒糊料的样品用于测试。

在保存之后，使用10mmhepes缓冲液从每种糊料中提取肽树突状体。将30μl每种提取物(具有约0.25mg/ml的肽浓度)添加到100μl3mg/ml人类纤维蛋白原，并且使用sigmaamelungkc4δ凝固分析仪确定在37℃下每种树突状体聚合纤维蛋白原的能力(‘凝血’活性)。还确定未辐射对照样品的聚合活性。结果汇总在以下表中。

结果显示，本发明的配制为具有水合明胶的即用型糊料的肽树突状体在通过辐射消毒之后保留聚合纤维蛋白原的能力。

序列表

<110>haemostatixlimited

<120>止血材料

<130>p/73051.wo01

<150>gb1508020.3

<151>2015-05-11

<160>19

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>4

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>pro或his

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸

<400>1

glyxaaargxaa

1

<210>2

<211>7

<212>prt

<213>智人

<400>2

alapropheproargprogly

15

<210>3

<211>4

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>任何氨基酸，优选地是除val之外的任何氨基酸，

优选地是pro、sar或leu

<400>3

glyproargxaa

1

<210>4

<211>4

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>除pro之外的任何氨基酸

<400>4

glyhisargxaa

1

<210>5

<211>4

<212>prt

<213>智人

<400>5

glyproargpro

1

<210>6

<211>4

<212>prt

<213>智人

<400>6

glyproargval

1

<210>7

<211>7

<212>prt

<213>智人

<400>7

glyproargpropheproala

15

<210>8

<211>7

<212>prt

<213>智人

<400>8

glyproargvalvalalaala

15

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>智人

<400>9

glyproargprovalvalgluarg

15

<210>10

<211>6

<212>prt

<213>智人

<400>10

glyproargproalaala

15

<210>11

<211>7

<212>prt

<213>智人

<400>11

glyproargproproglucys

15

<210>12

<211>7

<212>prt

<213>智人

<400>12

glyproargproprogluarg

15

<210>13

<211>6

<212>prt

<213>智人

<400>13

glyproserproalaala

15

<210>14

<211>4

<212>prt

<213>智人

<400>14

glyhisargpro

1

<210>15

<211>5

<212>prt

<213>智人

<400>15

glyhisargprotyr

15

<210>16

<211>5

<212>prt

<213>智人

<400>16

glyhisargproleu

15

<210>17

<211>5

<212>prt

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>羧基(carbox)端包含酰胺基团

<400>17

glyhisargprotyr

15

<210>18

<211>5

<212>prt

<213>智人

<400>18

glyproargprogly

15

<210>19

<211>5

<212>prt

<213>智人

<400>19

tyrproarghisgly

15