本发明涉及蛋白演变和蛋白活性领域。具体而言，本发明涉及从野生型蛋白产生在野生型正常生理条件下可逆或不可逆地失活的条件活性生物蛋白(conditionallyactivebiologicprotein)，特别是治疗性蛋白的方法。例如，演变的蛋白在体温下几乎无活性，但在较低温度下有活性。
背景技术：
有大量文献描述了演变蛋白，特别是例如酶的各种特性的潜力，以在不同条件下稳定工作。例如，酶已经演变为在较高温度下稳定，具有改变的活性。在高温活性增强的情况下，该增强中的大部分可归因于q10规则中普遍描述的较高的动力活性，对于酶来说评估为温度每增加10℃，其转换率增加一倍。此外，还存在使蛋白在正常工作条件下(例如该分子的野生型温度活性)变得不稳定的自然突变的例子。对于温度突变体，这些突变体可以在较低温度下具有活性，但通常较野生型分子具有降低水平的活性(通常也可将此描述为活性下降，该活性受q10或类似规则支配)。
人们期望获得有用的具有条件活性的分子，例如这些分子在野生型条件下几乎无活性，但在除野生型条件以外的其他条件下具有活性，其活性水平等于或高于在野生型条件下的活性水平，或在特定微环境中被激活或被失活，或经过一段时间后被激活或被失活。除了温度，其它能够使蛋白演变或优化的条件包括ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度(osmolality)、氧化应激和电解质浓度。其它在演变过程中能够被优化的目标特性包括耐化学性和耐蛋白水解性。
已公布了许多演变或改造分子的策略。然而，将蛋白改造或演变为在其野生型工作条件下变为失活或几乎失活(≤10％活性，特别是1％活性)，而在新的条件下与其野生型条件的活性相当或高于其野生型条件的活性，需要该失稳突变(destabilizingmutations)与不对抗该失稳效应(destabilizingeffect)的活性增强的突变共存。据预期，不稳定降低该蛋白的活性会比标准规则如q10所预测的影响大，因此，演变出在低温下有效工作，例如同时在它们的正常工作条件下是失活的蛋白的能力，可制备一类意想不到的新的蛋白，我们称之为条件活性生物蛋白。
在本申请中，根据作者和日期引用了各种出版物。为了更充分地描述本领域技术人员已知的这些公开物的日期和请求保护的权利要求中所描述的本领域状况，这些出版物以参阅的方式并入本申请。
技术实现要素：
本发明提供一种制备条件活性生物蛋白的方法，该方法包括：选择一种野生型生物蛋白，使用一种或多种演变技术演变编码该野生型生物蛋白的dna以产生突变dna，表达该突变dna以获得突变蛋白，在正常生理条件下和异常条件下对该突变蛋白和野生型蛋白进行测试，从那些突变蛋白中选择表现出以下两种特性的条件活性生物蛋白：(a)在正常生理条件下的测试中较野生型蛋白活性下降，以及(b)在异常条件下的测试中较野生型蛋白活性增强。在各个方面中，所述正常生理条件选自温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度中的一种或多种。在一个特定的方面，所述正常生理条件是温度，其中该条件活性生物蛋白在正常生理温度下是完全失活的，而在低于正常生理温度的异常温度下有活性。在其它方面，该条件活性生物蛋白在野生型正常生理条件下是可逆或不可逆失活的。在一个特定的方面，该蛋白在野生型正常生理条件下是可逆失活的。可选择地，条件活性生物蛋白选自那些在两种或两种以上不同生理条件下表现出活性可逆或不可逆变化的蛋白。
在一个实施方案中，所述野生型生物蛋白是酶。在某些方面，所述野生型生物蛋白选自下组：组织型纤溶酶原激活物、链激酶、尿激酶、肾素和透明质酸酶。
在另一个实施方案中，所述野生型生物蛋白选自降钙素基因相关肽(cgrp)、p物质(sp)、神经肽y(npy)、血管活性肠肽(vip)、血管加压素(vasopressin)和血管抑素。
在另一个实施方案中，所述生物蛋白是抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备条件活性生物反应调节剂的方法，所述方法包括：选择炎性反应介质；确定针对该介质的野生型抗体；演变该野生型抗体；有区别地筛选具有以下特性的突变体：在第一条件下相对于野生型抗体表现出降低的与介质的结合，并且在第二条件下表现出增强的与介质的结合亲和力，以确定改善型突变体(up-mutant)；重组改善型突变体的重链和轻链以产生重组的改善型突变体；以及在重组的改善型突变体中筛选具有以下特性的突变体：在第一条件下相对于野生型抗体显示出降低的与介质的结合，且在第二条件下显示出增强的与介质的结合亲和力，以确定有条件活性的生物反应调节剂。一方面，炎症反应介质选自il-6、il-6受体、tnf-α、il-23和il-12。另一方面，第一和第二条件选自ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含条件活性生物蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
附图说明
图1是显示实施例9中选择的条件活性抗体及其在ph6.0相对于ph7.4的选择性的图。
定义
为了便于理解本文提供的实例，将对一些频繁出现的方法和/或术语在本文中进行定义。
本文中使用的与测试量有关的术语“约”是指测试量的正常变化，其可由本领域熟练技术人员进行测量和实施与测量目的和测量仪器精度相称的关注等级(levelofcare)所预期。除非另有说明，“约”是指所给值+/-10％的变化。
本文所用的术语“活性”是指蛋白质可以进行的任何功能，包括催化反应和与配偶体结合。对于酶，活性可以是酶的酶活性。对于抗体，活性可以是抗体与其抗原之间的结合活性(即结合亲和力)。对于受体或配体，活性可以是受体与其配体之间的结合亲和力。
本文中使用的术语“试剂”是指一种化合物、化合物的混合物、空间定位化合物系列(例如，vlsips肽系列、多核苷酸系列和/或组合小分子系列)、生物大分子、噬菌体肽展示文库、噬菌体抗体(例如，scfv)展示文库、多核糖体肽展示文库或从生物材料，如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)的细胞或组织中获得的提取物。在下面描述的筛选试验中评价试剂的潜在酶活性。在下面描述的筛选试验中评价试剂作为条件活性生物治疗性酶的潜在活性。
限制位点中的“多义碱基要求(ambiguousbaserequirement)”是指不限定为最大范围的核苷酸碱基要求，即不限于特定的碱基(如，在非限制性实例中，特定的碱基选自a、c、g和t)，而可以是至少两种或两种以上碱基中的任一种。本领域以及本文中使用的普遍接受的缩写，代表以下碱基的多义，包括：r＝g或a；y＝c或t；m＝a或c；k＝g或t；s＝g或c；w＝a或t；h＝a或c或t；b＝g或t或c；v＝g或c或a；d＝g或a或t；n＝a或c或g或t。
本文中使用的术语“氨基酸”是指任何含有氨基(-nh2)和羧基(-cooh)的有机化合物；优选为游离基或聚合后作为肽键的一部分。本领域已知的“二十个自然编码的多肽-形成α-氨基酸”是指：丙氨酸(ala或a)、精氨酸(arg或r)、天冬酰胺(asn或n)、天冬氨酸(asp或d)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酸(glu或e)、谷氨酰胺(gln或q)、甘氨酸(gly或g)、组氨酸(his或h)、异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、赖氨酸(lys或k)、蛋氨酸(met或m)、苯丙氨酸(phe或f)、脯氨酸(pro或p)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、色氨酸(trp或w)、酪氨酸(tyr或y)和缬氨酸(val或v)。
术语“扩增”是指多核苷酸的拷贝数增加。
具有“嵌合特性”的分子为具有以下特性的分子：1)与第一参照分子部分同源且部分异源；2)同时与第二参照分子部分同源且部分异源；3)与此同时，不排除与一个或多个其他参照分子部分同源且部分异源的可能性。在非限制性实施方案中，嵌合分子可以通过组装部分分子序列的重配来制备。在非限制性方面，嵌合多聚核苷酸分子可以通过使用多个分子模板合成嵌合多核苷酸来制备，使得所得嵌合多核苷酸具有多个模板的特性。
本文中使用的术语“同源(cognate)”是指物种间的进化和功能相关的基因序列。例如，但不限于，在人类基因组中人cd4基因是小鼠3d4基因的同源基因，因为这两个基因的序列和结构表明，它们具有较高的同源性，两个基因都编码一种在通过mhcⅱ类限制抗原识别而传递t细胞激活信号中发挥作用的蛋白。
本文中使用的术语“比较窗口”是指至少20个连续核苷酸的概念片段(conceptualsegment)，其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较，且比较窗口中的部分多核苷酸序列可包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比20％或低于20％的添加或缺失(即，缺口)，使两条序列达到最适比对。用于比较窗口比对的最适比对序列可以按照史密斯局部同源性算法来进行(smithandwaterman,1981“生物序列的比较(comparisonofbiosequences)”，advapplmath,2:482-489；smithandwaterman,1981,“重叠基因和信息理论(overlappinggenesandinformationtheory)”，jtheorbiol,91:379-380；smithandwaterman,jmolbiol,“普通分子序列的确定(identificationofcommonmolecularsubsequences)”，1981,147:195-197；smith等人,1981，“比较的生物序列的排列(comparativebiosequencemetrics)”，jmolevol,18:38-46)，按照needleman同源性比对算法来进行(needleman和wunsch,1970，“两个蛋白氨基酸序列的相似性搜索的一般适用方法(ageneralmethodapplicabletothesearchforsimilaritiesintheaminoacidsequenceoftwoproteins)”jmolbiol,48(3):443-453)，按照pearson相似性搜索的方法来进行(pearsonandlipman,1988，“用于生物序列比较的改进工具(improvedtoolsforbiologicalsequencecomparison)”，procnatacadsciusa,85:2444-2448)，按照这些算法的计算机化运行来进行(gap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wis)，或通过检查，根据选择的各种方法产生最佳比对(即，在比较窗口中形成最高同源百分数)。
术语“条件活性生物蛋白(conditionallyactivebiologicprotein)”是指野生型蛋白的变体或突变体，其在一种或多种正常生理条件下较亲本野生型蛋白活性高或低。这种条件活性蛋白还在身体的选定区域表现出活性，和/或在异常或允许的生理条件下表现出增加的或下降的活性。正常生理条件是温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度，它们在个体的给药部位或在个体作用部位的组织或器官中被认为是在正常范围内的。异常条件是指偏离了正常可接受范围的条件。在一个方面，条件活性生物蛋白在野生型条件下几乎是无活性的，但在除野生型条件之外是有活性的，其活性与野生型条件的活性相同或高于野生型条件的活性。例如，在一个方面，演变的条件活性生物蛋白在体温下几乎无活性，但在较低温度下有活性。在另一方面，条件活性生物蛋白在野生型条件下是可逆或不可逆失活的。在另一方面，野生型蛋白是一种治疗性蛋白。在另一个方面，条件活性生物蛋白用作药物或治疗剂。在另一个方面，所述蛋白在高含氧血液，例如，在流经肺后或在肾脏中发现的较低ph环境中，或多或少有活性。
“保守氨基酸替换”是指具有相似侧链残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸：丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸替换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文中使用的术语“对应于”是指多核苷酸序列与全部或部分参考多核苷酸序列同源(即，是相同的、非严格演变相关的)，或多肽序列与参考多肽序列是相同的。相比之下，本文中使用的术语“互补”是指其互补序列与全部或部分参考核苷酸序列同源。例如，核苷酸序列“tatac”对应于参考序列“tatac”，与参考序列“gtata”互补。
术语“降解有效”量是指与不接触酶的底物相比，处理至少50％底物所需的酶量。
本文中使用的术语“确定的序列框架”是指一组基于非随机选择的具体序列，一般基于实验数据或结构数据；例如，一个确定的序列框架，除其它变体外，可包括预测形成β片层结构的一组氨基酸序列，或可包括亮氨酸拉链七肽重复基序(motif)、锌指结构域。“确定的序列核”是包括有限范围可变性的一组序列。而(1)20个常规氨基酸的完全随机10-mer序列可以是(20)10个序列中的任一条序列，以及(2)20个常规氨基酸的伪随机10-mer序列可以是(20)10个序列中的任一条序列，但表现出特定位置和/或整体的特定残基有偏差，(3)如果各残基位置被允许是20个常规氨基酸(和/或允许的非常规氨基/亚氨基酸)中的任一个，则确定的序列核是序列的子序列。确定的序列核一般包括变化和未发生变化的残基位，和/或包括变化的残基位，该变化的残基位可包括一个选自氨基酸残基的确定子集的残基等，该残基为选自从序列库中筛选出的单独序列的片段或全长中的残基。确定的序列核可以指氨基酸序列或多核苷酸序列。确定的序列核的实例为，但不限于，序列(nnk)10和(nnm)10，其中，n代表a、t、g或c；k代表g或t；以及m代表a或c。
dna的“消化”是指用仅在dna的某些序列发挥作用的限制酶催化dna的裂解(cleavage)。本文中使用的各种限制酶可市售获得，它们采用的反应条件、辅助因子和其它要求是本领域普通技术人员已知的。为了进行分析，一般向含有1微克质粒或dna片段的约20微升缓冲液中加入约2单位的酶。为了分离用于构建质粒的dna片段，一般在较大体积中用20至250单位的酶消化5至50微克的dna。合适的缓冲液和用于特定限制酶作用的底物量由制造商指定。通常在37℃进行孵育，时间约1小时，但按照供应商的说明可能会有所不同。消化结束后，反应物直接在凝胶上进行电泳，分离出所需的片段。
“定向连接”是指其中多核苷酸的5'端和3'端不同的连接，该不同足以确定较佳的连接方向。例如，具有两个钝末端的未经处理的和未消化的pcr产物，在连接至经消化的多克隆位点处形成钝末端的克隆载体中时，一般没有较佳的连接方向；因而，在这些情况下一般不会出现定向连接。相比之下，一般在具有用ecori处理的5'端和用bamhi处理的3'端的经消化的pcr产物连接至多克隆位点用ecori和bamhi消化的克隆载体中时，出现定向连接。
本文中使用的术语“dna改组(shuffling)”是指基本上同源但不完全相同的序列之间的重组，在一些实施方案中，dna改组可包括通过非同源重组的交叉(crossover)，如通过cer/lox和/或flp/frt系统等。dna改组可以是随机或者非随机的。
术语“药物”或“药物分子”是指包括一种将其对人体或动物体施用时对人体或动物体产生有利效果的物质的治疗剂。优选地，所述治疗剂包括可以治疗、治愈或缓解人体或动物体中一种或多种症状、疾病或异常病症的物质或可以增进人体或动物体健康的物质。
“有效量”是指向活的有机体给药一段时间，对于治疗或预防活的有机体内疾病有效的条件活性生物蛋白或片段的量，例如在所需的给药间隔期内提供治疗效果。
本文中使用的术语“电解质”的含义为在血液或其它体液中带有电荷的矿物质(mineral)。例如，在一个方面，正常生理条件和异常条件可以是“电解质浓度”的条件。在一个方面，待测电解质浓度选自一种或多种离子化的钙、钠、钾、镁、氯、碳酸氢盐和磷酸盐浓度。例如，在一个方面，血清钙的正常范围为8.5-10.2mg/dl。在这方面，异常的血清钙浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个实例中，在一个方面，血清氯的正常范围为每升96-106毫当量(meq/l)。在这方面，异常的血清氯浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个实例中，在一个方面，血清镁的正常范围为1.7-2.2mg/dl。在这方面，异常的血清镁浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个实例中，在一个方面，血清磷的正常范围为2.4-4.1mg/dl。在这方面，异常的血清磷浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个实例中，在一个方面，正常的血清或血液中钠的范围是135-145meq/l。在这方面，异常的血清或血液中钠浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个实例中，在一个方面，正常的血清或血液中钾的范围为3.7-5.2meq/l。在这方面，异常的血清或血液中钾浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在另一个方面，正常的血清碳酸氢盐范围为20-29meq/l。在这方面，异常的血清或血液中碳酸氢盐的浓度可以在高于或低于正常范围内选择。在一个不同的方面，碳酸氢盐水平可以用来指示血液中酸度的正常水平(ph)。术语“电解质浓度”也可以用来定义除血液或血浆以外的组织或体液中特定电解质的条件。在这种情况下，正常生理条件被认为是该组织或液体的临床正常范围。在这方面，异常的组织或体液的电解质浓度可以在高于或低于正常范围内选择。
本文中使用的术语“抗原表位”是指抗原如酶多肽上的抗原决定簇，抗体互补位如酶的特异性抗体结合到抗原决定簇上。抗原决定簇通常是由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成的，可具有特定的三维结构特点以及特定的电荷特性。本文中使用的“抗原表位”是指能够形成结合相互作用(bindinginteraction)的抗原或其它大分子的那部分，其与抗体的可变区结合体相互作用。通常情况下，这种结合相互作用表现为与cdr的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。
本文中使用的“酶”是具有特定催化性能的蛋白。例如底物浓度、ph、温度和有无抑试剂存在等因素可以影响催化的速率。通常情况下，对于野生型酶，q10(温度系数)以温度上升10℃描述反应速率的增加。对于野生型酶，q10＝2-3；换言之，温度每上升10℃反应速率提高到两倍或三倍。在高温下，蛋白变性。在ph值与酶的最佳ph值略有不同时，酶以及也许底物分子所带电荷发生微小变化。离子的变化可以影响底物分子的结合。在极端的ph水平，酶会发生变性，其活性位点被破坏，不再适合底物分子。
本文中使用的术语“演变(evolution)”或“演变(evolving)”是指使用一种或多种诱变方法，产生编码新多肽的新多核苷酸，新多肽本身就是一种改进的生物分子和/或有助于另一种改进的生物分子的生成。在一个特定的非限制性方面，本发明涉及从亲本野生型蛋白中演变出条件活性生物蛋白。例如，在一个方面，演变涉及采用美国专利申请公开号2009/0130718中公开的非随机的多核苷酸嵌合(chimerization)和非随机的定点诱变的方法。更具体地，本发明提供在正常生理条件下较野生型酶亲本分子表现出活性下降，而在一种或多种异常条件下较野生型酶表现出活性增强的条件活性生物酶的演变方法。
当提及参考多肽时的术语“片段”、“衍生物”和“类似物”，包括保留至少一种至少在本质上与参考多肽相同的生物功能或活性的多肽。此外，术语“片段”、“衍生物”或“类似物”的实例是分子的“前体形式”，如低活性原蛋白(proprotein)，其可通过切割修饰而产生具有显著高活性的成熟酶。
本文提供了一种由模板多肽生成一组其中在各氨基酸位表现出“单个氨基酸全方位替换”的后代多肽(progenypolypeptide)的方法。本文中使用的“单个氨基酸全方位替换”是关于本文中所描述的形成20个自然编码的多肽的α-氨基酸。
术语“基因”是指参与产生多肽链的dna片段；它包括编码区之前和之后的区域(前导区和拖尾区)以及各编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
本文中使用的“遗传不稳定”是指在减少事件(reductiveevents)过程中(其一般涉及通过重复序列的丢失使序列简化)高度重复序列被丢失的自然倾向。缺失往往涉及一个重复拷贝以及重复拷贝之间的一切的丢失。
术语“异源”是指一条单链核酸序列无法与另一条单链核酸序列或其互补序列进行杂交。因而，异源区是指多核苷酸区或多核苷酸的序列中具有无法与另一条核酸或多核苷酸进行杂交的区或区域。这种区域或区例如为突变区。
术语“同源(homologous)”或“部分同源(homeologous)”是指一条单链核酸序列可以与单链核酸序列的互补序列进行杂交。杂交的程度可能取决于许多因素，包括序列之间同一性数量和杂交条件如稍后讨论的温度和盐浓度。优选地，同一性区大于约5bp，更优选地，同一性区大于约10bp。
本发明的益处延伸到“工业应用”(或工业生产过程)，该术语用于包括在商业性工业中适当的应用(或简称工业)以及非商业性的工业应用(例如在非营利机构的生物医学研究中)。相关的应用包括在诊断、医药、农业、制造业和学术界领域的那些。
术语“相同”或“同一性(identity)”是指两条核酸序列有相同的序列或互补序列。因而，“同一性区”，是指核苷酸或整条多核苷酸区域或区是相同的或与另一条多核苷酸序列区互补。
术语“分离的”是指该物质被从原来的环境(例如，自然环境，如果它是天然存在的)中移出。例如，存在于活体动物中自然产生的核苷酸或酶是未分离的，但从天然系统中共存的部分或全部物质中分离出的相同的核苷酸或酶是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或酶可以是组合物的一部分，由于这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，其仍然是分离的。
术语“分离的核酸”用来定义与5'和3'侧翼序列不紧密连接的核酸，例如dna或rna分子，而在衍生其的有机体中天然产生的基因组中通常是紧密连接的。因而，该术语描述为，例如，整合至载体如质粒或病毒载体中的核酸；整合至异源细胞基因组(或同源细胞基因组，但位点不同于其天然发生的位点)中的核酸；以及作为单独分子存在的核酸，例如通过pcr扩增或限制酶切产生的dna片段，或通过体外转录产生的rna分子。该术语还描述了形成编码其它多肽序列的杂交基因的一部分的重组核酸，该其它多肽可用于例如产生融合蛋白。
本文中使用的“配体”是指可被特定受体识别的分子，如随机肽或可变区序列。本领域的熟练技术人员应知道，分子(或大分子复合物)既可以是受体也可以是配体。在一般情况下，具有较小分子量的结合配偶体是指配体，具有较大分子量的结合配偶体是指受体。
“连接”是指两条双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(sambrook等人，(1982).分子克隆:分子克隆手册，冷泉港实验室(molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharbourlaboratory),coldspringharbor,ny.,p.146；sambrook等人，分子克隆:分子克隆手册，第二版(molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.),coldspringharborlaboratorypress,1989)。除另有规定外，连接可采用已知的缓冲液和条件来完成，用10个单位的t4dna连接酶(“连接酶”)连接每0.5微克约等摩尔量的dna片段。
本文中使用的“接头”或“间隔子”是指连接两个分子如dna结合蛋白和随机肽的分子或分子组合，以使两个分子处于较佳的构型，例如，以使随机肽以最小空间位阻与dna结合蛋白的受体结合。
本文中使用的“微环境”是指与身体的组织或区的其它区域具有持续的或暂时的、生理的或化学的差异的组织或身体的任何部分或区域。
本文中使用的“要被演变的分子特性”包括含有多核苷酸序列的分子，含有多肽序列的分子，含有部分多核苷酸序列和部分多肽序列的分子。与被演变的分子特性特别相关但绝不限于以下的实例，包括：特定条件下蛋白的活性，如涉及温度；盐度；渗透压；ph；氧化应激以及甘油、二甲基亚砜、去污剂和/或在反应环境中接触的任何其它分子种类的浓度。其它的与被演变的分子特性特别相关但绝不限于以下的实例，包括稳定性，例如在经过曝露于特定环境一段时间后表现出的剩余的分子特性的量，特定环境如在存储过程中会遇到的情况。
术语“突变(mutation)”是指在野生型核酸序列中序列的变化或在肽序列中序列的变化。这种突变可以是点突变，如转换或颠换。所述突变可以是缺失、插入或重复。
本文中使用的简并“n,n,g/t”核苷序列代表32种可能的三联体，其中“n”可以是a、c、g或t。
本文中使用的术语“天然存在”所适用的对象所指事实为可以在自然界中发现的对象。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的，其可以从自然来源中分离，且未在实验室中被人为地有意改造过。一般而言，术语“天然存在”是指对象存在于非病理(未病变)的个体中，这在物种中是普遍存在的。
本文中使用的“正常生理条件”或“野生型工作条件”是指那些在个体的给药部位或在个体作用部位将被考虑的正常范围内的条件：温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度。
本文中使用的“核酸分子”由至少一个碱基或一个碱基对组成，这取决于它是否分别是单链或双链。此外，核酸分子可能唯一地(exclusively)或嵌合地(chimerically)属于任一组含有核苷的分子，作为实例但不限于以下组的核酸分子：rna、dna、基因组核酸、非基因组核酸、天然存在的和非天然存在的核酸以及合成的核酸。通过非限制性举例的方式，这包括与任何细胞器如线粒体、核糖体rna和由不随天然存在的成分一起天然存在的一种或多种成分嵌合组成的核酸分子相关的核酸。
此外，“核酸分子”可部分包含一种或多种基于非核苷的成分，作为实例但不限于氨基酸和糖类。因而，通过举例的方式，但不限于此，部分基于核苷和部分基于蛋白的核酶是被认为是“核酸分子”。
此外，通过示例的方式，但不限于此，用可检测到的基团如放射性的或者非放射性的标记来标记的核酸分子，同样被认为是“核酸分子”。
术语“编码特定酶的核酸序列”或特定酶的“dna编码序列”或“编码特定酶的核苷酸序列”，以及其它同义词是指dna序列被置于适当的调控序列控制下，被转录并翻译成酶。“启动子序列”是能够在胞内结合rna聚合酶的dna调控区，并启动下游(3'方向)编码序列的转录。启动子是dna序列的一部分。在该序列的3'端具有起始密码子。该启动子序列包括最低数目的碱基，这种组成对于在高于背景的可检测到的水平上起始转录是必需的。然而，在rna聚合酶结合序列且从起始密码子(启动子的3'端)开始转录之后，转录朝着下游的3'方向进行。在该启动子序列内会找到转录起始位点(可方便地由核酸酶s1图谱确定)以及负责结合rna聚合酶的蛋白结合域(共有序列)。
术语“编码酶(蛋白)的核酸”或“编码酶(蛋白)的dna”或“编码酶(蛋白)的多核苷酸”和其它同义词包括仅含有酶的编码序列的多核苷酸以及含有其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
在一个优选的实施方案中，“特定的核酸分子种类”是由其化学结构，例举但不限于，其一级结构来确定的。在另一个优选的实施方案中，特定的“核酸分子种类”是由该类核酸的功能或由衍生自该类核酸的产物的功能来确定的。因而，通过非限制性举例的方式，“特定的核酸分子种类”可由归属于它的一种或多种活性或性质来确定，包括归属于它的表达产物的活性或性质来确定。
“将工作的核酸样品组装至核酸库中”的即时定义包括将核酸样品整合至基于载体的集合(collection)的过程，如通过连接至载体并转化宿主。相关载体、宿主和其它试剂以及它们具体的非限制性实例的说明在下文中提供。“将工作的核酸样品组装至核酸库中”的即时定义还包括将核酸样品整合至非基于载体的集合的过程，如通过连接至接头(adaptor)。优选地，接头能够退火至pcr引物，以便于pcr扩增。
因此，在非限制性的实施方案中，“核酸库”是由一种或几种核酸分子的基于载体的集合组成。在另一个优选的实施方案中，“核酸库”是由核酸分子的非基于载体的集合组成。而在另一个优选的实施方案中，“核酸库”是由部分基于载体和部分基于非载体的核酸的组合集合组成。优选地，根据各核酸分子种类，含有库的分子集合是可查询的且可分离的。
本发明提供“核酸构建体”或“核苷酸构建体”或“dna构建体”。本文中使用的术语“构建体”用以描述可任选地与一种或多种其它分子基团如载体或载体的部分进行化学结合的分子，如多核苷酸(例如，酶多核苷酸)。在一个具体的但绝非限制性的方面，核苷酸构建体的实例是适于宿主细胞转化的dna表达构建体。
“寡核苷酸”(或同义的“寡”)是指可化学合成的单链多聚脱氧核苷酸或两条互补的多聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核核苷酸可以带有或不带有5'磷酸。在激酶存在下不随atp加入磷酸的情况下，那些不带有5'磷酸的寡核核苷酸不会与另一条寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸会与未被去磷酸化的片段连接。为了实现基于聚合酶的扩增(如通过pcr)，提到“32倍简并寡核苷酸是连续地(inseries)由至少第一同源序列、简并n,n,g/t序列和第二同源序列组成。”本文中使用的“同源”是关于基于聚合酶扩增的寡核苷酸和亲本多核苷酸之间的同源性。
本文中使用的术语“可操作连接的”是指功能关系中的多核苷酸元件之间的连接。当核酸被置于与另一条核酸序列的功能关系中时，它是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响到编码序列的转录，则它与该编码序列是可操作连接的。可操作连接是指被连接的dna序列通常是连续的，且在需要连接两个蛋白质编码区时是连续的并位于阅读框内。
编码序列“可操作连接至”另一条编码序列，则rna聚合酶转录这两条编码序列为一条mrna，然后其被翻译成含有来自两条编码序列的氨基酸的一条多肽。只要表达的序列被最终加工成所需的蛋白，编码序列不必与另一条编码序列是连续的。
本文中使用的术语“亲本多核苷酸组合”是由一种或多种不同的核苷酸种类组成的组合。通常该术语在提及优选通过诱变处理亲本组合获得的后代多核苷酸组合时使用，在这种情况下，术语“亲本”、“起始物”和“模板”可互换使用。
术语“患者”或“受试体”是指作为治疗对象的动物，例如哺乳动物如人。所述受试体或患者，可以是雄性或雌性。
本文中使用的术语“生理条件”是指温度、ph、渗透压、离子强度、粘度等生化参数，其与活有机体相容和/或通常存在于活的酵母培养细胞或哺乳动物细胞的细胞内。例如，在典型的实验室培养条件下生长的酵母细胞的胞内条件是生理条件。用于体外转录混合物(cocktails)的合适体外反应条件一般是生理条件。通常体外生理条件包括50-200mmnacl或kcl，ph6.5-8.5，20-45℃和0.001-10mm二价阳离子(例如mg++、ca++)；优选约150mmnacl或kcl，ph7.2-7.6，5mm二价阳离子，而且往往包括0.01-1.0％的非特异性蛋白(例如，牛血清白蛋白(bsa))。往往存在非离子型去污剂(吐温、np-40、tritonx-100)，通常约0.001-2％，典型地为0.05-0.2％(v/v)。特定的水溶液条件由医生按常规方法选择。对于一般性的指导，以下缓冲的水溶液条件可以适用：10-250mmnacl，5-50mmtrishcl，ph5-8，任选加入二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子型去污剂和/或膜组分和/或消泡剂和/或闪烁材料(scintillant)。正常生理条件是指病人或个体体内给药部位或作用部位的温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度，其被考虑到是在患者体内的正常范围内。
本文中采用标准惯例(standardconvention)(5'到3')来描述双链多核苷酸的序列。
本文中使用的术语“群(population)”是指如多核苷酸、多核苷酸的部分或多核苷酸或蛋白成分的集合。“混合的群”是指属于相同的核酸或蛋白家族(即，是相关的)但序列不同(即，不同源)因而生物活性不同的成分的集合。
具有“前体形式”的分子是指经过一种或多种共价和非共价化学修饰(例如糖基化、蛋白水解裂解、二聚化或寡聚化、温度诱导或ph诱导的构象变化、与辅因子相连等)的任何组合的分子，从而获得较参考前体分子更成熟的性质不同(例如活性增加)的分子形式。当两种或两种以上的化学修饰(例如两种蛋白水解裂解或一种蛋白水解裂解和一种去糖基化)能够被区分，从而产生成熟的分子，所述参考前体分子可被称为“原前体形式(pre-pro-form)”分子。
本文所用的术语“蛋白”是指其中单体为氨基酸且单体通过肽或二硫键连接在一起的聚合物。“蛋白”是指全长天然存在的氨基酸链或其片段，例如在结合相互作用中感兴趣的多肽的选定区域、或合成氨基酸链或其组合。因此，蛋白片段是指作为全长蛋白的一部分的氨基酸序列，其长度为约8个氨基酸至约500个氨基酸，优选约8个氨基酸至约300个氨基酸，更优选约8个氨基酸至约200个氨基酸的氨基酸序列，更加优选约10个氨基酸至约50个氨基酸或100个氨基酸。此外，天然存在的氨基酸之外的氨基酸(例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)可以包括在蛋白中。通常遇到的不是基因编码的氨基酸也可以用于本发明。本发明中使用的所有氨基酸可以是d-旋光异构体或l-旋光异构体。d-异构体优选用于特定上下文，如下所述。此外，其他肽模拟物也是有用的，例如用于本发明的多肽的接头序列中(参见spatola,1983,inchemistryandbiochemistryofaminoacids.peptidesandproteins,weinstein,ed.,marceldekker,newyork,p.267)。通常，除了包括通过共价键或非共价键保持在一起的两个或多个多肽链的结构外，术语“蛋白”不旨在表达与术语“多肽”的任何显著差异。
本文中使用的术语“伪随机”是指具有有限可变性的一组序列，例如，在另一个位置的残基可变性程度，但任何伪随机位置允许一定程度的残基变化，然而变化是有限的。
本文中使用的“准重复单元(quasi-repeatedunits)”是指将被重新排列的重复且被定义为不相同。事实上，该方法的提出不仅用于由相同起始序列诱变形成的几乎相同的编码单元，还用于某些区显著不同的类似或相关序列的重新排列。然而，如果序列中含有足够的可被该方法重新排列的同源序列，则它们可被称为“准重复”单元。
本文中使用的“随机肽库”是指编码一组随机肽的一组多核苷酸序列和由那些多核苷酸序列编码的随机肽的组合，以及含有那些随机肽的融合蛋白。
本文中使用的“随机肽序列”是指由两种或两种以上的氨基酸单体组成且通过随机的(stochastic)或随机(random)方法构建的氨基酸序列。随机肽可包括含有不可变序列的框架(framework)或骨架(scaffolding)基序。
本文中使用的“受体”是指对给定的配体具有亲和力的分子。受体可以是自然产生或人工合成的分子。受体可以其未改变的状态或与其它种类形成聚集体而应用。受体可直接或通过特定的结合物质共价或非共价连接于结合单元。受体的实例包括但不限于抗体，其包括单克隆抗体且能够与特定的抗原决定簇(如位于病毒、细胞或其它材料上)发生抗血清反应，细胞膜受体、碳水化合物和糖蛋白的复合物、酶和激素受体。
“重组”酶是指通过重组dna技术产生的酶，即通过将编码所需酶的外源dna构建体转化的细胞产生的酶。“合成”的酶是指那些通过化学合成制备的酶。
术语“相关的多核苷酸”是指多核苷酸的区域或区是相同的，且多核苷酸的区域或区是异源的。
本文中使用的“减少重排(reductivereassortment)”是指通过由重复序列介导的缺失(和/或插入)事件而产生的分子多样性的增加。
下列术语用来描述两种或两种以上的多核苷酸序列之间的关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分数”和“实质同一性”。
“参考序列”是确定的、用作序列比较基础的序列；参考序列可以是一个较大序列的子序列，例如全长cdna中的一段序列或序列表中给定的基因序列，或可包括完整的cdna或基因序列。一般来说，参考序列的长度至少是20个核苷酸，通常至少是25个核苷酸，往往至少是50个核苷酸。由于两个多核苷酸可各自为(1)包括两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整的多核苷酸序列的一部分)以及(2)可进一步包括两个多核苷酸之间不同的序列，两个(或两个以上)多核苷酸之间的序列比较是在“比较窗口”中通过比较两个多核苷酸的序列来进行，以确定和比较序列相似的局部区域。
本文中使用的“重复指数(ri)”是指克隆载体中包含的准重复单元(quasi-repeatedunit)的平均拷贝数。
术语“限制位点”是指显示限制酶发生作用所必需的识别序列，其包括催化切割位点。可知切割位点可包含于或不包含于含有低多义性序列(lowambiguitysequence)(即含有限制位点出现频率的主要决定因素的序列)的限制位点的一部分中。因而，在许多情况下，相关限制位点仅含有内部具有切割位点(例如ecori位点的g/aattc)或紧邻切割位点(例如ecorii位点的/ccwgg)的低多义性序列。在其它情况下，相关限制酶[例如eco75i位点或ctgaag(16/14)]包含具有外部切割位点(例如eco57i位点的n.sub.16部分)的低多义性序列(例如eco57i位点中的ctgaag序列)。当提到酶(例如限制酶)“切割”多核苷酸时，它被理解为限制性酶催化或促进多核苷酸的裂解。
在一个非限制性的方面，“可选择的多核苷酸”是由5'端区(或末端区域)、中间区域(即内部或中心区)和3'端区(或末端区域)组成的。如在所述的方面中所用，5'端区是位于朝向5'多核苷酸末端(或5'多核苷酸尾)的区；因而它一部分或全部位于多核苷酸5'端的一半核苷酸内。同样，3'端区是位于3'多核苷酸末端(或3'多核苷酸尾)方向的区；因而它一部分或全部位于朝向多核苷酸3'端一半核苷酸内。如该非限制性的示例中所用，可以是在任两个区或甚至全部三个区之间重叠的序列。
术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列在比较窗口上是相同的(即，在逐个核苷酸比对的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过以下步骤计算得到：将比较窗口上的两个最佳比对序列进行比较，确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基(例如a、t、c、g、u或i)的位置的数量以获得匹配位置的数量，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
本文使用的“实质同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中与至少25-50个核苷酸的比较窗口的参考序列相比，该多核苷酸包含具有至少80％序列同一性、优选至少85％同一性、通常90-95％序列同一性、最常见至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性的百分比通过在比较窗口将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算，该多核苷酸序列可以包括在比较窗口上总共占参考序列的20％以下的缺失或增加。
如本领域所知，两种酶之间的“相似性”通过将一种酶的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二种酶的序列进行比较来确定。相似性可以由本领域众所周知的步骤确定，例如blast程序(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具)。
如果它们彼此结合的亲和力要高于与其它非特异性分子的亲和力，则该分子对(例如，抗体-抗原对或核酸对)的成员被描述为彼此“特异性结合”。例如，对抗抗原的抗体与该抗原的结合比非特异性的蛋白更有效，可以描述为抗体特异性地结合抗原。(同样，如果核酸探针与靶核酸通过碱基配对作用(见上)形成了特异的二聚体，可以描述为核酸探针特异性地结合靶核酸。)
本文中定义的“特异性杂交”是指在第一多核苷酸和第二多核苷酸(例如，具有与第一多核苷酸序列不同，但序列大致相同的多核苷酸)之间形成杂交，其中大致不相关的多核苷酸序列在该混合物中不形成杂交。
术语“特定的多核苷酸”是指具有特定的终点和特定的核酸序列的多核苷酸。两个多核苷酸，其中一个多核苷酸具有与第二多核苷酸的一部分相同的序列，但末端不同，构成了两个不同的特定的多核苷酸。
“严格杂交条件”是指两条序列之间仅当同一性为至少90％，优选至少95％，更优选至少97％时才发生的杂交。见sambrook等人,分子克隆:分子克隆手册第二版，冷泉港实验室出版社，1989年(molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborlaboratorypress,1989)。
本发明中还包括具有与酶多肽的序列“基本上相同(substantiallyidentical)”的序列的多肽。“基本上相同”的氨基酸序列是与参考序列仅保守氨基酸替换不同的序列，例如，将同一类的一种氨基酸替换为另一种氨基酸(例如，将一种疏水性氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替换为另一种，或将一种极性氨基酸替换为另一种，如精氨酸替换为赖氨酸、谷氨酸替换为天冬氨酸，或谷氨酰胺替换为天冬酰胺)。
其它“基本上相同”的氨基酸序列是与参考序列仅一种或多种非保守替换、缺失或插入不同的序列，特别是当替换发生在分子的非活性位点时，且前提是多肽基本上保留了其行为特性。例如，可以从酶多肽中删除一个或多个氨基酸，导致多肽结构的改进，而没有显着改变其生物活性。例如，不是酶发挥生物活性所必需的氨基端或羧基端氨基酸可被删除。这种改进导致开发了更小的活性酶多肽。
本发明提供了“基本上纯的酶”。本文中使用的术语“基本上纯的酶”用来描述基本上不含其它蛋白、脂类、碳水化合物、核酸和自然情况下与其结合的其它生物材料的分子，如多肽(例如，酶多肽或其片段)。例如，基本上纯的分子，如多肽，可至少占目标分子的60％干重。可采用标准方法，包括，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如，sds-page)、柱层析(例如，高效液相色谱(hplc))和氨基末端氨基酸序列分析来确定多肽的纯度。
本文中使用的“基本上纯的”表示目标分子是主要存在的分子(即基于摩尔，它在组合物中比任何其它个别大分子种类更丰富)，优选地，基本上纯的部分是指组合物中目标分子占所有大分子种类的至少50％(基于摩尔)。一般来说，基本上纯的组合物包括高于组合物中所有大分子种类约80％到90％的目标分子。更优选地，目标分子被纯化至基本均一(采用常规检测方法检测不到组合物中的污染分子)，其中组合物主要由单一的大分子种类组成。溶剂、小分子(<500道尔顿)和离子元素不视为大分子。
术语“治疗”包括：(1)预防或延缓发生于动物体内的状态(state)、疾病或病症的临床症状出现，该动物可能患有或易感于该状态、疾病或病症但尚未经历或表现出该状态、疾病或病症的临床或亚临床症状；(2)抑制该状态、疾病或病症(即，阻止、减少或延缓疾病的发展，或维持治疗情况下疾病的复发，或至少一种临床或亚临床症状)；和/或(3)减轻病症(即，引起该状态、疾病或病症的衰退或引起至少其一种临床或亚临床症状的衰退)。对将要进行治疗的患者的好处是在统计学上显著，或至少对患者或医生的好处是可察觉到的。
本文中使用的术语“可变区段(variablesegment)”是指包括随机的、伪随机的或确定的核心序列的新生肽的一部分。“可变区段”是指包括随机的、伪随机的或确定的核心序列的新生肽的一部分。可变区段可包括可变的或不可变的残基位，可变的残基位上的残基可变程度可能是有限的：两种选择由医生定夺。通常情况下，可变区段长约5至20个氨基酸残基(例如，8至10)，尽管可变区段可以更长，并可能包括抗体部分或受体蛋白，如抗体片段、核酸结合蛋白、受体蛋白等。
术语“变体(variant)”是指在野生型蛋白亲本分子的一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基(分别)被修饰的本发明的多核苷酸或多肽。变体可由任何方法产生，这些方法包括例如，易错pcr(error-pronepcr)、改组(shuffling)、寡核苷酸定向诱变、装配pcr(assemblypcr)、有性pcr诱变(sexualpcrmutagenesis)、体内诱变、盒式突变、循环总体诱变(recursiveensemblemutagenesis)、指数总体诱变(exponentialensemblemutagenesis)、位点特异性诱变、基因再组装、饱和诱变和它们的任意组合。本文公开了用于生产在正常生理条件，例如温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度中的一种或多种条件，较野生型蛋白活性下降，以及在异常条件下活性增强的变体蛋白的技术。可另外筛选出较野生型蛋白抗化学性和抗蛋白水解性能增强的变体。
本文中使用的术语“野生型”是指不包括任何突变的多核苷酸。“野生型蛋白(wildtypeprotein)”、“野生-型蛋白(wild-typeprotein)”、“野生-型生物蛋白(wild-typebiologicprotein)”或“野生型生物蛋白(wildtypebiologicprotein)”是指可以从自然界中分离的在自然条件下具有一定水平活性的且包含在自然条件下发现的氨基酸序列的蛋白。术语“亲本分子”和“目标蛋白”也指野生型蛋白。
术语“工作”，如在“工作样本”中，例如，仅简单地指正在工作的样本。同样，“工作分子”，例如，是指正在工作的分子。
术语“条件活性抗体”是指野生型抗体的变体或突变体，其在一种或多种正常生理条件下比亲本野生型抗体更具活性或活性更低。这种有条件活性的抗体可以在身体的选定区域中显示活性和/或在异常或容许的生理条件下可能表现出增强的活性或降低的活性。在一个方面，条件活性抗体在正常生理条件下几乎无活性，但是在除了正常生理条件之外的条件下的活性水平比在正常生理条件下的活性水平高。例如，在一个方面，演变的条件活性抗体可能在体温条件下几乎无活性，但在更低的温度下有活性。在另一方面，条件活性抗体可在正常生理条件下可逆地或不可逆地失活。在另一方面，野生型抗体是治疗性抗体。另一方面，条件活性抗体用作药物或治疗剂。在另一方面，抗体在高度充氧的血液中(例如在通过肺之后或在肾脏中发现的较低ph环境中)或多或少具有活性。
术语“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的免疫球蛋白结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。针对靶细胞表面的配体特异性高亲和力igg抗体刺激细胞毒性细胞，是这种杀伤所需要的。目标细胞的溶解是细胞外的，需要直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。
可以测定任何特定抗体介导adcc对靶细胞溶解的能力。为了评估adcc活性，将感兴趣的抗体与免疫效应细胞组合加入到显示靶配体的靶细胞上，免疫效应细胞可被抗原抗体复合物激活，导致靶细胞的细胞溶解。通常通过从溶解的细胞中释放标记(例如放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白)来检测细胞溶解。用于这种测定的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。在下述文献中对体外adcc测定的具体实例进行了描述：bruggemannetal,1987,jexpmed,vol.166,page1351；wilkinsonetal,2001,/immunolmethods,vol.258,page183；pateletal,1995/immunolmethods,vol.184,page29。
可选地，或此外，可以在体内对感兴趣的抗体的adcc活性进行评估，例如在动物模型中，例如在clynesetal,1998,pnasusa,vol.95,p.652中所描述的。
如本文中使用的术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“nsclc”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
本文中使用的术语“多特异性抗体”是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的多特异性抗体可以结合bbb-r和脑抗原。可以将多特异性抗体作为全长抗体或抗体片段(例如f(ab')2双特异性抗体)进行制备。还考虑了具有两个、三个或更多(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(参见例如us2002/0004587a1)。可以将多特异性抗体作为全长抗体或抗体片段制备。
术语“全长抗体”是指包含抗原结合可变区(vh或vl)以及轻链恒定结构域(cl)和重链恒定结构域chi、ch2和ch3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体归属为不同的“类别”。全长抗体有五种主要类型：iga、igd、ige、igg和igm，其中几种可进一步分为“亚类”(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“文库”是指在单个库中的蛋白的集合。本发明的文库优选使用dna重组技术产生。例如，可以将cdna或任何其他蛋白质编码dna的集合插入到表达载体中以产生蛋白文库。表达载体可以选自质粒、粘粒、人造染色体和病毒表达载体。也可以将cdna或蛋白质编码dna的集合插入到噬菌体基因组中以产生野生型蛋白的噬菌体展示文库。可以从选择的细胞群或组织样品中产生cdna的集合，例如通过sambrook等人(molecularcloning,coldspringharborlaboratorypress,1989)公开的方法产生。由所选细胞类型产生的cdna集合也可从诸如
如本文所用的术语“重组抗体”是指由重组宿主细胞表达的抗体(例如嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)，所述重组宿主细胞包含编码该抗体的核酸。用于制备重组抗体的“宿主细胞”的实例包括：(1)哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)、cos、骨髓瘤细胞(包括y0和nso细胞)、幼仓鼠肾(bhk)、hela和vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9，sf21和tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属的植物(烟草(nicotianatabacum))；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(saccharomyces)的酵母细胞(例如酿酒酵母)或属于曲霉属的酵母细胞(例如黑曲霉)；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞等。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
详细描述
本发明涉及改造或演变蛋白以产生在野生型条件下可逆或不可逆失活，而在非正常条件下表现出活性与在野生型条件下相同或相当水平的新分子的方法。本文中这些新蛋白是指条件活性生物蛋白。us2012/0164127中已经描述了这些条件活性生物蛋白和产生这些蛋白的方法。条件活性生物蛋白对于发展新疗法特别有价值，其在很短的时间或有限的时期内在宿主中有活性。给定剂量该蛋白的扩展工作(extendedoperation)将对宿主是有害的，这点特别有价值，但为了进行所需的治疗，其活性必须是有限的。有益的应用实例包括以高剂量进行局部或全身治疗，以及以高浓度进行局部治疗。在生理条件下的失活可通过给药和蛋白失活速率的组合来确定。催化活性在较短的时间内造成重大的负面影响，这种基于失活的条件对于酶疗法尤为重要。
本发明还涉及改造或演变蛋白从而产生不同于野生型分子的新分子的方法，所述新分子随时间可逆或不可逆地活化或失活或仅在体内特定微环境包括在体内特定器官(如膀胱或肾脏)中才活化或失活。在一些实施方案中，条件活性生物蛋白是针对本文所述的一种或多种靶蛋白的抗体。
目标野生型蛋白
任何治疗性蛋白可以作为用于生产条件活性生物蛋白的目标蛋白，或野生型蛋白。在一个方面，目标蛋白是野生型的酶。目前常用的治疗性酶包括尿激酶和链激酶，用于治疗血液凝块；以及透明质酸酶，作为提高其它药物的吸收和分散的佐剂。在一个方面，为了避免或尽量减少野生型蛋白或酶带来的有害副作用，所选用于生产条件活性生物蛋白的野生型蛋白可以是目前使用的治疗性酶。或者，目前没有作为治疗性酶而使用的酶可选择用于生产条件活性生物蛋白。某些非限制性的实例将在下文进一步详细讨论。
治疗性蛋白是那些可以单独用于药物或与其它疗法结合以治疗各种疾病或病症(indications)的蛋白。本发明的条件活性生物蛋白适用于一种或多种病症，包括治疗循环系统疾病、关节炎、多发性硬化症、自身免疫性疾病、癌症、皮肤病，并用于各种诊断形式(diagnosticformats)。取决于蛋白和病症，条件活性生物酶蛋白可以如下讨论的肠外、外用或口服制剂给药。
循环疾病-血栓形成与溶栓治疗
血栓(血块)的定义是在循环系统中形成的来自血液成分中的固体块。血栓是由一系列涉及凝血因子、血小板、红细胞以及与血管壁相互作用的事件而形成的。血小板是可能会导致血管阻塞的血小板、纤维蛋白和被捕获(entrapped)的血细胞的血管内聚集。通过阻塞或阻断血流，血栓剥夺了下游组织的氧气供应。血栓的片段(栓塞)可破坏或阻塞较小的血管。动脉血栓的形成是由于各种因素中的任一种因素所导致的沉淀，这些因素包括潜在的狭窄-动脉粥样硬化、低流量心脏功能、癌症或凝血因子缺乏所形成的血凝过快(hypercoagubility)，或异物如支架或导管。导致动脉缺血的血栓可以导致肢体或组织损伤、急性心肌梗死(ami)、中风、截肢或肠梗塞。发病率和死亡率的主要原因是动脉血栓(冠状动脉血栓和脑动脉血栓)和肺血栓的形成。静脉血栓的形成可能是由于内皮损伤如创伤、不动所导致的瘀积或血凝过快所引起的，但动脉粥样硬化不是一个因素。治疗策略包括机械去除血栓、药物-机械去除血栓及溶栓。血栓治疗用以尽量减少血栓的形成和有助于血栓的去除。
血栓治疗包括使用能够抑制血小板活化的抗血小板试剂、抗凝疗法和/或溶栓治疗，以降低血液凝块。抗血小板试剂的实例包括阿司匹林、潘生丁和噻氯匹啶。抗凝血剂的实例包括肝素、华法林、水蛭素和活化的人类蛋白c。溶栓的实例包括组织型纤溶酶原激活物(tpa)/tpa变体、尿激酶和链激酶。溶栓显示了作用的催化模式。
急性心肌梗死中的溶栓治疗是公认的。溶栓试剂的使用已成为标准的紧急治疗方法。虽然有效，这些产品仅在约50％的患者中实现完全再灌注(reperfusion)，且副作用包括出血(尤其是颅内出血)以及高血压的风险。受损或病变的血管的血凝块的减少，被称为“纤溶”或“纤溶过程”。纤溶是一个蛋白水解过程，是由纤溶酶原激活剂激活蛋白纤维溶酶原，从而形成纤溶酶。纤溶酶降解血液凝块的纤维蛋白丝以溶解凝块。纤维特异性的纤溶酶原激活剂包括组织型纤溶酶原激活剂或变体。非特异性的纤溶酶原激活剂可以包括链激酶和尿激酶。
某些常用的溶栓疗法利用几种可获得的组织型纤溶酶原激活剂(tpa)变体中的一种。例如，先前已批准使用的基于tpa的产品变体是阿替普酶(rt-pa)、瑞替普酶(r-pa)和替奈普酶(tnk)。tpa变体批准使用的用途包括例如，用以改善ami影响心室功能的急性心肌梗死，充血性心力衰竭发病率的减少，以及ami所致死亡率的下降，用于促进神经功能的恢复并减少残疾的发病率的成人缺血性中风治疗(management)，用于急性肺栓塞溶解以及用于伴有不稳定血流动力学的肺栓塞溶解的成人急性大面积肺栓塞治疗。
另一种常用的溶栓治疗采用尿激酶。尿激酶是一种用于外周血管疾病治疗的标准溶解剂。
链激酶是由几种链球菌分泌的、可以结合并激活人纤溶酶原的蛋白。链激酶与人纤溶酶原的复合物可通过键断裂产生纤溶酶而水解激活其它未结合的纤溶酶原。通常纤溶酶原激活是通过蛋白水解arg561-val562键。然后val562的氨基与asp740形成盐桥，导致构象变化而产生活化的蛋白酶纤溶酶。纤溶酶产生于血液中以分解血液凝块的主要成分-纤维蛋白。
链激酶作为一种有效的血块溶解药物用于下列疾病的某些情况：心肌梗死(心脏病发作)、肺栓塞(肺血块)和下肢深静脉血栓(腿部血液凝块)。链激酶属于一组称为纤维蛋白溶解剂的药物。心脏病发作后尽快施以链激酶，可溶解心壁动脉中的血块并减少对心脏肌肉的损害。链激酶是一种细菌产品，因此身体能够形成对该蛋白的免疫力。因此，建议不应在第一次给药四天后再次施用这种产品，因为它可能没有效力并会引起过敏反应。出于这个原因，通常只在第一次心脏病发作后给药，进一步的血栓性事件通常用组织型纤溶酶原激活剂(tpa)治疗。链激酶有时也用于预防手术后粘连。
链激酶的副作用包括出血(主要和次要)、低血压和呼吸抑制以及可能的过敏反应。此外，改变血小板功能的抗凝血剂、试剂(例如阿司匹林、其它nsaid、潘生丁)可能会增加出血的风险。
溶栓的给药一般通过输液或通过静脉单次剂量注射(bolusintravenousdose)；或通过机械输液系统。不利的影响可包括严重的颅内、消化道、腹膜后或心包出血。如果发生出血，给药必须立即停止。
在本发明的特定实施方案中，tpa、链激酶或尿激酶被选作目标或野生型蛋白。
在一个实施方案中，本发明的方法被用于选择在低于正常生理条件的异常温度条件下具有高活性，且在正常生理条件(例如37℃)下完全灭活或失活的条件活性重组的或合成的链激酶变体。在一个方面，异常的温度条件是室温，例如20-25℃。在另一个方面，本发明提供治疗中风或心脏病发作的方法，该方法包括对患有中风或心脏病发作的病人施以高剂量的条件活性链激酶变体，但允许链激酶变体的迅速失活以免失血过多。
循环疾病-肾素/血管紧张素
肾素/血管紧张素系统是一种调节血压和水(流体)平衡的激素系统。在低血容量时，肾脏分泌肾素。肾素是一种酶，其将肝脏分泌的血管紧张素水解为肽血管紧张素i。血管紧张素i进一步在肺中被内皮结合的血管紧张素转化酶(ace)切割成血管紧张素ⅱ，最重要的血管活性肽。血管紧张素ⅱ引起血管收缩，导致血压升高。然而，血管紧张素ⅱ也能刺激肾上腺皮质分泌激素醛固酮。醛固酮引起肾脏的肾小管增加了对钠和水的吸收。这增加了体内的液量，也增加了血压。过度活性的肾素-血管紧张素系统导致血管收缩及钠和水的滞留。这些影响导致了高血压。有很多药物可中断这个系统中的不同步骤，以降低血压。这些药物是用来控制高血压(高血压症)、心力衰竭、肾衰竭和糖尿病的有害影响的主要途径之一。
低血容性休克(hypovolemicshock)是一种急性病症，其中严重的血液和/或体液流失使心脏无法充分地带给人体细胞含氧血。创伤、受伤和内部出血可导致失血。由于烧伤、腹泻、过度出汗或呕吐导致的过多的液体流失可形成血液循环的量下降。低血容性休克的症状包括焦虑、皮肤湿冷、神志不清、呼吸急促或失去知觉。检查时可见休克的迹象，包括血压低、体温低和可能微弱的或虚弱的(thready)脉快。治疗包括静脉输液，输血或血制品，休克治疗和药物如多巴胺、多巴酚丁胺、肾上腺素和去甲肾上腺素，以升高血压和提高心输出量。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选在正常生理温度下可逆失活，但在低血容性休克病人的异常较低温度下恢复活性的条件活性重组肾素变体的方法。该条件活性蛋白可用于治疗低血容性休克，以帮助提高体内的液体量并升高血压。
循环疾病-雷诺氏现象
雷诺氏现象(rp)，是引起手指、脚趾和偶尔其它四肢变色的血管痉挛症。情绪紧张和寒冷经常引发此现象。当暴露在寒冷的气温下，四肢失去热量。手指和脚趾血液供应通常放缓，以保持身体的核心温度。通过四肢皮肤下的小动脉变窄使血流量减少。压力会在体内导致与寒冷类似的反应。雷诺氏病中，正常的反应被扩大了。该病可引起疼痛、变色以及寒冷和麻木的感觉。该现象是血管痉挛的结果，其减少了对各区域的血液供应。雷诺氏病(原发性雷诺氏现象)中，这种疾病是先天的。雷诺氏综合征(继发性雷诺氏病)中，这种现象是由一些其它的促发因素造成的。手的温度梯度测量是一种用来区分原发性和继发性形式的工具。原发性形式可以发展为继发性形式，在极端情况下，继发性形式可以发展为指尖的坏死或坏疽。
雷诺氏现象是一种对寒冷或情绪紧张作出的扩大反应。原发性rp基本上是由微血管血管痉挛介导的。交感神经系统过度活跃，会导致外周血管的极度血管收缩，导致缺氧。慢性、反复发作的情况可导致皮肤、皮下组织和肌肉的萎缩。它也很少导致溃疡和缺血性坏疽。
雷诺氏现象的传统的治疗方案包括扩张血管和促进血液循环的处方药。这些处方药包括钙通道阻滞剂，如硝苯地平或地尔硫卓；α阻滞剂，其对抗去甲肾上腺素(收缩血管的激素)的作用，如哌唑嗪或沙唑嗪；以及放松血管的血管扩张剂，如硝酸甘油膏，或血管紧张素ⅱ抑制剂氯沙坦、西地那非或前列腺素。由于心理压力，氟西汀(一种选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂)及其它抗抑郁药物可降低发作频率和严重程度。这些药物可能会引起副作用，如头痛、面色潮红和踝部水肿。药物也可能随着时间的推移失去效力。
皮肤血管收缩和血管扩张的调控涉及改变的交感神经活性和许多神经调节剂，包括肾上腺素和非肾上腺素，以及redox信号传递和其它信号传递，如rhoa/rock通路。皮肤中血管平滑肌细胞(vsmc)的血管收缩被认为是由α1和α2肾上腺素受体介导的去甲肾上腺素激活的。α2c-ar从反式高尔基体转移至vsmc的细胞表面，然后对涉及rhoa/rhokinase(rock)信号传递通路的这些响应的刺激和信号传递作出反应。皮肤动脉中的冷刺激导致vsmc线粒体中活性氧(ros)的立即生成。通过rhoa/rock通路，ros参与redox信号传递。rhoa是一种gtp结合蛋白，其作用是调控依赖于肌动蛋白-肌球蛋白的过程，如vsmc中的迁移和细胞收缩。脉管系统(vascluature)中可能涉及rp已知功能的非肾上腺素神经肽包括降钙素基因相关肽(cgrp)、p物质(sp)、神经肽y(npy)和血管活性肠肽(vip)。fonseca等人,2009,“雷诺氏现象和系统性硬化症中的神经调节剂和血管功能障碍(neuronalregulatorsandvasculardysfunctioninraynaud'sphenomenonandsystemicsclerosis)”,curr.vascul.pharmacol.7:34-39。
rp的新疗法包括α-2c肾上腺素受体阻滞剂、酪氨酸蛋白激酶抑制剂、rho激酶抑制剂和降钙素基因相关肽。
降钙素基因相关肽(cgrp)是降钙素家族肽中的一个成员，以两种形式存在：α-cgrp和β-cgrp。α-cgrp是由降钙素/cgrp基因的选择性剪接形成的37个氨基酸的肽。cgrp是外周和中枢神经元中产生的最丰富的肽之一。它是一种强效的肽血管扩张剂，可在疼痛的传递中发挥功能。偏头痛是一种常见的神经系统疾病，其与增加的cgrp水平有关。cgrp扩张颅内血管并传递血管伤害感受(vascularnociception)。将cgrp受体拮抗剂用于治疗偏头痛已经过测试。arulmani等人，2004,“降钙素基因相关肽以及它在偏头痛病理生理中的作用(calcitoningene-relatedpeptideanditroleinmigrainepathophysiology)”,eur.j.pharmacol.500(1-3):315-330。至少有三个受体亚型已经确定，cgrp通过g蛋白-偶联受体发生作用，该受体的存在和功能的变化调节该肽在各种组织中的效果。cgrp通过受体的信号转导依赖于两个辅助蛋白：受体活性修饰蛋白1(rampl)和受体组成蛋白(rcp)。ghatta2004,降钙素基因相关肽：认识其作用(calcitoningene-relatedpeptide:understandingitsrole).indianj.pharmacol.36(5):277-283。一项使用激光多普勒血流计(ldf)的有关三种扩血管剂：内皮依赖性血管扩张剂腺苷三磷酸(atp)、不依赖于内皮的血管扩张剂前列环素(依前列醇；pgi2)和cgrp对雷诺的现象患者和相似数量年龄和性别匹配的对照组的影响的研究表明，由雷诺氏症患者的皮肤血流量上升造成cgrp诱导脸部和手潮红，而对照组cgrp仅引起脸部潮红。pgi2引起两组中脸部和手相似的血流量上升。atp没有引起患者手或脸部血流量的任何大的改变，但增加了对照组的脸部血流量。shawket等人，1989,“雷诺氏现象中手的降钙素基因相关肽的选择性过敏症(selectivesuprasensitivitytocalcitonin-gene-relatedpeptideinthehandsinreynaud'sphenomenon)”，《柳叶刀》(thelancet),334(8676):1354-1357。在一个方面，野生型蛋白的目标分子是cgrp。
在一个实施方案中，本发明提供筛选与雷诺氏综合征相关的、在正常生理温度下可逆失活但在手指或足趾中较低的异常温度下恢复活性的条件活性重组蛋白变体的方法。该条件活性蛋白可用于治疗雷诺氏现象，以防止或减少由于低循环导致的手指或足趾功能的损失。
循环疾病-血管加压素
精氨酸血管加压素(avp、血管加压素、抗利尿激素(adh)是发现于大多数哺乳动物中的一种肽类激素，其通过影响组织通透性控制肾脏的肾小管中分子的重吸收。血管加压素的最重要作用之一，是调节体内保水力(waterretention)。在高浓度下，它通过引入适度的血管收缩提升高血压。血管加压素具有三种效应导致尿渗透压增加(浓度增加)并减少水的排泄。首先，血管加压素会使得肾脏集合管细胞(collectingductcells)的水通透性增加，从而允许水的重吸收和较小体积浓缩尿的排泄(抑制尿分泌(antidiuresis))。这是通过将水通道蛋白-2的水通道插入集合管细胞的顶膜中而产生的。其次，血管加压素引起集合管的内髓部分对尿素的通透性增加，从而允许髓间质增加了对尿素的重吸收。第三，通过增加na+-k+-2cl-协同转运蛋白的活性，血管加压素引起在亨利氏环厚上行支血管中对钠和氯重吸收的刺激。nacl的重吸收驱动了反流倍增，其为髓质集合管中水通道蛋白介导的水重吸收提供渗透梯度。
肾集合管周围的高渗组织间液提供了高渗透压以去除水。由蛋白组成的跨膜通道称为水通道蛋白，它插入质膜中极大地增加了水的渗透性。当通道打开时，水通道蛋白通道每秒3百万个水分子通过。水通道蛋白-2通道的插入需要血管加压素传递信号。血管加压素与集合管细胞的基底表面上的受体(称为v2受体)结合。该激素的结合触发了细胞内camp水平的提高。该“第二信使”启动了一连串事件，最终在集合管细胞的顶端表面的插入水通道蛋白-2通道。水通道使水移出肾元，从而增加了从形成的尿液中重吸收而返回血液中的水的量。
从脑垂体后叶释放的血管加压素的主要刺激是增加了血浆渗透压。任何使身体脱水的方法，如大量出汗，增加了血液渗透压并打开了血管加压素-v2受体-水通道蛋白-2通路。因此，低至0.5升/天的尿可能会保持原有180升/天的肾滤液。尿中的盐浓度可以是血液中的四倍。如果血液变得太稀，喝大量的水会使血液变得太稀，血管加压素分泌受到抑制，水通道蛋白-2通道可通过内吞作用进入细胞内。结果是，形成大量的盐浓度仅为血液盐浓度四分之一的水样尿。
血管加压素释放的减少或肾对avp敏感度的下降导致尿崩症(diabetesinsipidus)、高钠血症(增加的血钠浓度)、多尿(产生过多的尿)和多饮(口渴)。
高水平的avp分泌(抗利尿激素分泌过多综合征，siadh)和由此造成的低钠血症(血液中钠含量低)，发生于脑部疾病和肺疾病(小细胞肺癌)。在围手术期，手术应激和一些常用的药物(例如，鸦片、催产素、止吐药)的影响，导致类似的血管加压素分泌过度的情况。这可能会导致数天的轻度低钠血症。
血管加压素激动剂用于治疗各种病症，其长效的合成类似物去氨加压素(desmopressin)用于血管加压素分泌量低的病症，以及控制出血(以某些血管性血友病的形式)和极端案例儿童尿床中。特利加压素(terlipressin)和相关类似物用作特定病症中的血管收缩剂。血管加压素输液已被用来作为对高剂量影响肌力药(inotropes)(例如，多巴胺或去甲肾上腺素)没反应的感染性休克(septicshock)患者的第二线治疗。血管加压素受体拮抗剂是干扰血管加压素受体作用的试剂。它们可用于治疗低钠血症。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选用于涉及血管加压素响应的、在正常生理渗透压下可逆失活但在血液中异常的渗透压下恢复活性的条件活性生物重组的或合成的蛋白变体的方法。在另一个实施方案中，涉及血管加压素响应的蛋白变体在低钠条件下被激活，但在正常血清钠浓度下失活。在一个方面，低钠条件是血清钠<135meq/l。
癌-血管抑素
血管抑素是在几种动物中自然产生的蛋白。它作为一种内源性血管生成抑制剂(即，它阻止新血管的生长)。血管抑素能够通过抑制内皮细胞增殖和迁移来抑制肿瘤细胞的生长和转移。血管抑素是纤溶酶的38kd片段(其本身是纤溶酶原的片段)。血管抑素包括纤溶酶原可里格尔区(kringle)1-3。血管抑素产生，例如，通过纤溶酶原的自溶裂解，包括磷酸激酶引起的胞外二硫键还原。血管抑素也可以由不同的基质金属蛋白酶(mmp)，包括mmp2、mmp12和mmp9以及丝氨酸蛋白酶(中性粒细胞弹性蛋白酶、前列腺特异抗原(psa))切割纤溶酶原而得到。在体内，血管抑素抑制肿瘤的生长和使实验性转移(experimentalmetastasis)保持休眠状态。血管抑素在具有原发肿瘤和其它炎症和退行性疾病的动物中是升高的。
已知血管抑素结合许多蛋白，包括血管抑素动蛋白(angiomotin)和内皮细胞表面ato合酶，还有整合素(integrin)、膜联蛋白ii(annexinii)、c-met受体、ng2-蛋白多糖、组织型纤溶酶原激活物、硫酸软骨素糖蛋白和cd26。一项研究表明，il-12，一种具有强效抗血管生成活性的th1因子，是血管抑素活性介质。albin".,j.translationalmedicine.jan.4,2009,7:5。血管抑素结合并抑制内皮细胞表面atp合成酶。atp合成酶还出现在多种癌细胞的表面。发现肿瘤细胞表面atp合成酶在胞外低ph下更活跃，肿瘤微环境的一个标志。发现在胞外酸性ph(phe)下，血管抑素影响肿瘤细胞表面的atp合成酶活性。在胞外低ph下，血管抑素直接抗肿瘤发生。在低ph下，血管抑素和抗-β-亚基抗体诱导a549癌细胞的胞内酸化，以及直接的毒性，该毒性在具有低水平的胞外atp合成酶水平的肿瘤细胞中是不存在的。据推测，肿瘤细胞毒的作用机制依赖于由细胞表面的atp合成酶的抑制引起的胞内ph异常。chi和pizzo,“在胞外低ph值下血管抑素对肿瘤细胞的直接细胞毒性：依赖于细胞表面相关的atp合酶的机制(angiostatinisdirectlycytotoxictotumorcellsatlowextracellularph:amechanismdependentoncellsurface-associatedatpsynthase)”,cancerres.,2006,66(2):875-82。
在一个实施方案中，本发明提供用于确定在正常生理血液ph下活性低于野生型血管抑素，但在低ph下活性增强的条件活性血管抑素变体的方法。低ph被定义为比正常生理ph低。在一个方面，低ph是≤约7.2。在一个特定的方面，低ph是约6.7。
在一个方面，条件活性血管抑素变体可被配制并用作抗癌剂。
组织通透性的增强-透明质酸酶
透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族。通过催化间质屏障(interstitialbarrier)的主要成分透明质酸的降解，透明质酸酶降低了透明质酸的粘度，从而提高组织的通透性。在医学上，它被用于与其它药物结合以加速其分散和运送。最常见的应用是在眼科手术中，与局部麻醉剂组合使用。动物源性透明质酸酶包括hydasetm(primapharminc.；akorninc.)、羊型透明质酸酶(vitrase)(istapharmaceuticals)和牛型透明质酸酶(amphadase)(amphastarpharmaceuticals)。目前已批准重组人透明质酸酶作为佐剂以增加其它药物的吸收；皮下输液(皮下注射液体)；改善造影剂(radioopaqueagent)吸收的皮下尿路造影中的附属物(adjunct)。(hylenex；halozymetherapeutics,inc.；baxterhealthcarecorp.)。在一个实施方案中，透明质酸酶可作为野生型蛋白(亲本分子)用于制备条件活性生物蛋白。透明质酸酶可能在癌症转移和或许在血管生成中发挥作用；因此，过度暴露这些酶可能是有害的。在一个方面，条件活性生物透明质酸酶蛋白将会在正常生理温度下不可逆或可逆失活，但会在特定的低于正常生理温度的温度范围内较野生型透明质酸酶的活性水平相同或高于其活性水平。
自身免疫性疾病-条件活性生物反应调节剂
类风湿关节炎(ra)是一种自身免疫性疾病，其特点是导致关节发炎和肿胀并伴随关节逐渐破坏的异常免疫机制。ra也可影响皮肤、结缔组织和身体中的器官。传统的疗法包括非甾体抗炎药(nsaid)、cox-2抑制剂和改善病情抗风湿药(disease-modifyinganti-rheumaticdrugs)(dmards)，如甲氨蝶呤。传统的治疗方案都不理想，尤其是对于长期使用而言。
生物反应调节剂，其作用靶标是炎症介质，提供了一种相对新的治疗类风湿关节炎和其它自身免疫性疾病的方法。这种生物反应调节剂包括抗各种炎症介质，如il-6、il-6受体、tnf-α、il-23和il-12的抗体或其活性部分。
一些第一生物反应调节剂是靶向肿瘤坏死因子α(tnf-a)，参与ra发病机制的一种前炎症细胞因子的药物。目前市面上可获得几种用于治疗ra的抗tnf-α药物。例如，
其它生物反应调节剂包括人源化的抗-白细胞介素-6(il-6)受体抗体。il-6是一种细胞因子，其有助于ra中的消炎、消肿和关节损伤。一种人源化的抗il-6受体抗体，阿克特姆拉(actemra)(tocilizumab，roche)，通过了fda和欧盟委员会批准用于治疗患有类风湿关节炎的成人患者。阿克特姆拉也在日本批准用于治疗ra和青少年特发性关节炎(sjia)。iii期临床研究表明，阿克特姆拉作为单一疗法，或与mtx或其它dmard组合治疗，与其它疗法相比减少了ra的迹象和症状。阿克特姆拉是人源化的抗人il-6受体单克隆抗体，其竞争性地阻止il-6与其受体的结合。因此，它抑制il-6的细胞增殖作用，从而导致在ra中滑膜增厚和血管翳形成。阿克特姆拉的严重副作用包括严重的感染和过敏反应，其包括少数病例的过敏性反应。其它副作用包括上呼吸道感染、头痛、鼻咽炎、高血压和增加的alt。
另一种常见的自身免疫性疾病是牛皮癣。过于活跃的免疫系统可导致高水平的il-12和il-23、两种已在银屑病斑块中发现的细胞因子蛋白。il-12和il-23参与炎症和免疫反应，如自然杀伤细胞的活化和cd4+t细胞分化和活化。
中度或重度牛皮癣的一种治疗包括皮下注射stelaratm(ustekinumab,centocororthobiotech,inc.)，一种人源化的抗il-12和il-23因子的p40亚基的iggik单克隆抗体。已证明stelara可减轻与银屑病斑块有关的某些症状，如斑块厚度、脱屑和发红。stelara的配方包括l-组氨酸和l-组氨酸盐酸盐一水合物、聚山梨醇酯80和蔗糖，以水配制。stelaratm的使用影响免疫系统，并可能增加感染的机会，包括肺结核和由细菌、真菌或病毒引起的感染；以及增加某些类型的癌症的风险。
生物反应调节剂的副作用很值得注意，部分由于注射患者后的高水平使患者易患严重感染或死亡。这是一种与此类重要药物有关的主要副作用。挑战之一是避免所需抗体剂量的初始高活性水平，从而注射后提供一个长期治疗效果。
在一个实施方案中，本发明提供制备能够避免所需抗体剂量的高活性水平，从而注射后提供一个长期治疗效果的条件活性生物反应介质或其片段的方法。本发明的方法可用于设计炎症介质，如il-6、il-6受体、tnf-α、il-23和il-12的抗体，其在给药条件下如室温下是无活性的，但在体温下慢慢地重折叠(可逆或不可逆的)。它们的抗体或片段在初始注射时是无活性的，但注射后接触到血液数小时至数天后，复性或恢复活性。这可以允许较高的给药量和较长的半衰期(或给药期间)并减少副作用。
在一个方面，本发明提供制备在给药条件下如室温下无活性，但在体温下缓慢复性(可逆或不可逆的)的炎症介质的条件活性抗体或其片段的方法。该方法包括以下步骤：选择一种炎症介质，通过杂交瘤细胞进行筛选以确定炎症介质的抗体，人源化该抗炎症介质的抗体，演变该抗炎症介质的抗体并差异化筛选用于在两种或两种以上条件下的结合，例如，两种或两种以上温度条件，如在室温和在37℃或更高温度；选择在第一条件下相对于野生型无活性的突变，但在第二条件下相对于野生型抗体活性(结合)显示增强的活性(例如结合)。然后将在重链和轻链变化中确定的改善型突变在重链和轻链内部重新组合，以及通过重链和轻链的组合关联。在两种条件下，例如室温或37℃或更高温度条件下重复筛选这些重组的重链和轻链。此外，可筛选在储存和生理条件下保持活性和稳定性的重组抗体或片段。
或者，炎症介质的野生型抗体是已知抗体或变体或其活性片段。
在一个方面，第一条件和第二条件选自以下条件：ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度。在另一个方面，炎症介质选自il-6、il-6受体、tnf-α、il-23和il-12。
在另一个方面，本发明提供制备在给药条件如室温下无活性但在体温下缓慢复性(可逆或不可逆的)的il-6的条件活性抗体或其片段的方法。该方法包括以下步骤。在全人体文库中筛选il-6的抗体。演变该抗体，并在室温和37℃或更高温度条件下差异化筛选分子；选择在室温下相对于野生型无活性的突变，但相对于野生型抗体活性(结合)显示增强的活性(例如结合)。。然后将在重链和轻链变化中确定的改善型突变在重链和轻链内部重新组合，以及通过重链和轻链的组合关联。在室温或37℃或更高温度条件下重复筛选这些重组的重链和轻链。此外，测试在储存和生理条件下重组抗体或片段的活性和稳定性。
如此确定并产生的条件活性抗-il-6抗体可用于治疗自身免疫性疾病如类风湿关节炎或牛皮癣的方法中，通过对有需要的患者施以有效剂量，较施以传统的抗-il-6抗体生物反应调节剂减少了副作用的严重性。这种方法的一个优点是，相对于目前的高水平生物反应调节剂药物在数周或数月后消除(clearance)半衰期，它使在治疗一段时间后的药物量保持平缓或维持药物水平。
从文库中选择野生型蛋白
野生型蛋白可以选自野生型蛋白文库，例如噬菌体展示文库。在这样的实施方案中，野生型蛋白的大量候选物在噬菌体文库中表达，特别是通过表面展示技术表达。对选自文库的的候选物进行筛选得到合适的野生型蛋白。典型的噬菌体文库可能含有在细菌宿主中表达候选物的噬菌体。在一个实施方案中，噬菌体文库可以包括多个噬菌体。
为了构建噬菌体文库，通过将编码候选物的寡核苷酸插入噬菌体外壳蛋白之一的编码序列对典型地丝状噬菌体(例如丝状大肠杆菌噬菌体m113)进行遗传修饰。因此，噬菌体颗粒的外壳蛋白与候选物一起表达，使得候选物显示在噬菌体颗粒的表面上。然后可以筛选所显示的候选物以获得合适的野生型蛋白。
用于筛选合适的野生型蛋白的一种常见技术是通过将具有所需候选物的噬菌体颗粒固定在支持物(support)上。支持物可以是涂有“诱饵”的塑料板，该诱饵可以与期望的候选物结合。可以将非结合性噬菌体颗粒从板上冲走。通过洗涤洗脱结合于板的噬菌体颗粒(具有理想的候选物)，将洗脱的噬菌体颗粒在细菌中扩增。然后可以通过测序确定编码所选择的噬菌体颗粒中的候选物的序列。候选物和诱饵之间的关系可以是例如配体-受体关系或抗原-抗体关系。
筛选合适的野生型蛋白的另一种常见技术是使用酶测定法测定各个噬菌体克隆的所需酶活性，该酶活性为候选物所展示的酶活性。根据具体的酶活性，本领域技术人员可以设计合适的测定法筛选具有所需水平的酶活性的候选物。
在一些实施方案中，噬菌体文库作为阵列提供，使得每个噬菌体克隆占据阵列上的特定位置。这种阵列可以提供在固体支持物，例如膜、琼脂平板或微量滴定板上，在这种情况下，文库的每个噬菌体克隆附着或粘附到固体支持物的特定的预定位置。在琼脂板的情况下，这样的板优选包括细菌生长培养基以支持细菌生长。当阵列设置在膜(例如硝化纤维素或尼龙膜)上时，将细菌培养物施加到膜上，并用营养生长培养基浸泡该膜。此外，也可以在珠粒上提供噬菌体克隆，在这种情况下，可以将单个噬菌体克隆粘附到单个珠粒上。或者，每个噬菌体克隆可以设置在光纤的端部上，在这种情况下，纤维用于光学传递来自光源的紫外线辐射。
典型的噬菌体文库可以含有106至1010种重组噬菌体，其中每一种噬菌体的特征在于携带不同候选物的外壳蛋白(例如噬菌体m113的gp3或gp8)。噬菌体文库的细菌宿主可以选自细菌属，包括例如沙门氏菌属(salmonella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、志贺氏菌属(shigella)、李斯特菌属(listeria)、弯曲杆菌属(campyicbacter)、克雷伯菌属(klebsiella)、耶尔森菌属(yersinia)、假单胞菌属(pseudomonas)和埃希氏菌属(escherichia)。
编码候选物的寡核苷酸可以是编码野生型蛋白的cdna的集合。已知用于合成来自生物样品的cdna的方法，从而可以表达合适的野生型蛋白。任何通过转录物表现生理活性的遗传信息可以作为cdna收获。当产生cdna时，必须合成全长cdna。有若干可用于合成全长cdna的方法。例如，合适的方法包括使用酵母或hela细胞的帽结合蛋白标记5'加帽位点的方法(i.ederyetal.,"anefficientstrategytoisolatefull-lengthcdnasbasedonamrnacapretentionprocedure(capture)",mol.cell.biol.,vol.15,pages3363-3371,1995)；通过使用碱性磷酸酶除去不具有5'帽的不完整cdna的磷酸，然后用烟草花叶病毒的脱帽酶处理完整cdna，从而使得仅全长cdna具有磷酸的方法(k.maruyamaetal.,"oligo-capping:asimplemethodtoreplacethecapstructureofeukaryoticmrnaswitholigoribonucleotides",gene,vol.138,pages171-174,1995；和s.katoetal.,"constructionofahumanfull-lengthcdnabank",gene,vol.150,pages243-250,1995)。
野生型蛋白的候选物文库也可以使用衍生自生物体的完整抗体谱的重组抗体来产生。表示该抗体谱的遗传信息被汇编为完全抗体的大集合，可以对其进行筛选获得具有所需抗原结合活性和/或一种或多种其它功能特征的合适的野生型抗体。在一些实施方案中，分离来自用抗原免疫的动物(例如人、小鼠或兔)的b细胞。收集来自分离的b细胞的mrna(转化为cdna)并测序。将编码轻链的最常见的cdna片段和编码重链的最常见的cdna片段组装成抗体。在一个实施方案中，组装编码轻链的100个最常见的cdna片段和编码重链的100个最常见的cdna片段以产生抗体。在另一个实施方案中，最常见的cdna片段仅编码重链的可变区和轻链的可变区，因此所组装的抗体仅包含可变区而不包含恒定区。
在一些实施方案中，编码igg重链可变区的cdna片段(包括来自从b细胞分离的mrna的那些cdna片段)与轻链中最常见的igk或igk可变区组装。组装的抗体含有来自igg的重链可变区和来自igk的轻链可变区或igk。
然后克隆并表达编码组装的抗体的cdna，优选以板为基础的形式。可以用基于磁珠(bead)的elisa测定法测定表达的抗体的结合活性，并且可以基于elisa测定法选择合适的野生型抗体。也可以在噬菌体展示文库中表达编码组装的抗体的cdna，然后可以通过本文公开的任何技术筛选一种或多种所需的野生型抗体。
在野生型蛋白为抗体的实施方案中，野生型抗体优选具有使其更容易生长成条件活性抗体的特征。在某些实施方案中，野生型抗体在正常生理条件和异常条件下可具有相似的结合活性和/或特征。在这样的实施方案中，基于在正常生理条件和异常条件下具有最相似的结合活性和/或一个或多个特征的最相似的组合来选择野生型抗体。例如，如果正常生理条件和异常条件分别为ph7.4和ph6.0，相对于在ph7.4和6.0具有不太相似的结合活性的抗体，可以选择在ph7.4和6.0下具有最相似结合活性的野生型抗体。
在选择野生型蛋白之后，使用合适的诱变技术演变编码野生型蛋白的dna以产生突变dna，然后可以将突变dna表达以产生突变蛋白，对突变蛋白进行筛选以确定条件活性生物蛋白。在一些实施方案中，演变可能是极小的，例如，为了产生具有所需条件活性的突变蛋白，仅将少量突变引入野生型蛋白。例如，通过cpe在每个位置引入少于20个变化、可能少于18个变化可能足以产生合适的条件活性生物蛋白。对于cps，在野生型蛋白中组合小于6个改善型突变、或小于5个改善型突变、或小于4个改善型突变，或小于3个改善型突变，或小于2个改善型突变可能足以产生理想的条件活性生物蛋白。
在一些实施方案中，当野生型蛋白文库(例如噬菌体文库和/或重组抗体文库)足够大时，演变和表达步骤可能是不必要的。这样一个大的文库可以含有具有条件活性特征的野生型蛋白(在正常生理条件下的测定中具有低活性，在异常条件下的测定中具有高活性)。在这些实施方案中，文库中的野生型蛋白经受选择步骤以发现具有以下特性的条件活性生物蛋白：其在正常生理条件下的测定中的活性低于其在异常条件下的测定中的活性。在一个实施方案中，对文库中的野生型蛋白与参照蛋白分别进行正常生理条件下的测定和异常条件下的测定。从文库中选择的条件活性生物蛋白为在正常生理条件下活性低于在异常条件下的相同蛋白的活性的条件活性生物蛋白。在该实施方案中，由于文库已经足够大，并且已经在文库中存在具有条件活性特征的野生型蛋白，所以不需要野生型蛋白的演变以发现条件活性生物蛋白。
在一些实施方案中，选择步骤可以使用参照蛋白进行比较。参照蛋白可能不具有条件活性，因为它在正常生理条件和异常条件下具有相似或相同的活性。参照蛋白是与文库中野生型蛋白相同类型的蛋白，例如相同类型的酶、抗体或功能性肽。参照蛋白也可以是相同类型的组织纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、肾素、透明质酸酶、降钙素基因相关的肽(cgrp)、物质p(sp)、神经肽y(npy)、血管活性肠肽(vtp)、加压素或血管抑素。例如，当文库含有大量针对抗原的野生型抗体时，参照蛋白是针对相同抗原的抗体，其在正常生理条件和异常条件下具有相同或相似的与抗原结合的活性。
因此，在一个实施方案中，对文库中的野生型蛋白与参照蛋白分别进行正常生理条件下的测定和异常条件下的测定。从文库中选择的条件活性生物蛋白显示以下两种特性：(a)在正常生理条件下较参照蛋白活性降低，和(b)在异常条件下较参照蛋白活性增强。
生成条件活性生物蛋白的方法
使用一种或多种诱变技术来产生编码野生型蛋白的dna，以产生突变dna文库；将突变dna进行表达以产生突变蛋白的文库；并在正常生理条件下和在一个或多个异常条件下对文库进行筛选测定。条件活性生物蛋白选自表现出以下两种特性的那些蛋白：(a)在正常生理条件下的测定中较参照蛋白活性降低，和(b)在异常条件下的测定中较参照蛋白活性增强。或者，条件活性生物蛋白选自在两个或多个不同生理条件下表现出可逆或不可逆的活性变化的那些蛋白。在一些实施方案中，野生型蛋白是抗体。
在一些实施方案中，待演变的蛋白可以是野生型蛋白的片段或野生型抗体的片段。在一些其他实施方案中，待演变的蛋白可以是通过诱变方法选择的蛋白，其中蛋白被选择为具有所需特性，例如高结合亲和力、高表达水平或人源化。所选择的蛋白(在这种情况下不是野生型蛋白)可以在本文公开的方法中用作待演变的蛋白。在这样的实施方案中，本发明的方法包括：从野生型蛋白、野生型蛋白的片段和突变蛋白中选择蛋白，演变编码所选蛋白的dna以产生突变dna，表达突变dna以产生突变蛋白，筛选突变蛋白以产生显示出以下两种特性的条件活性生物蛋白：(a)在正常生理条件下的测定中较所选蛋白活性降低，和(b)在异常条件下的测定中较所选蛋白活性增强，。
由母体分子生成演变分子
条件活性蛋白可通过对野生型蛋白进行诱变并筛选单个突变的过程产生，该单个突变在野生型条件下活性降低，在非野生型条件下保持与野生型条件相同的活性或具有更高的活性。
本发明提供生产编码具有酶活性的多肽的核酸变体的方法，其中所述变体具有较天然存在的改变的生物活性，该方法包括：(a)修饰核酸，通过(i)将一个或多个核苷酸替换成不同的核苷酸，其中所述核苷酸包括天然的或非天然的核苷酸，(ii)缺失一个或多个核苷酸，(iii)添加一个或多个核苷酸，或(iv)它们的任意组合。在一个方面，非天然的核苷酸包括肌苷。在另一个方面，该方法进一步包括检测由修饰的核酸编码的多肽的改变的酶活性，以确定编码具有改变的酶活性的多肽的修饰的核酸。在一个方面，修饰的步骤(a)由pcr、易错pcr、改组、寡核苷酸定向诱变、装配pcr、有性pcr诱变、体内诱变、盒式诱变、循环总体诱变、指数总体诱变、位点特异性诱变、基因重组、基因位点饱和诱变、连接酶链式反应、体外诱变、连接酶链式反应、寡核苷酸合成、任何生成dna的技术和它们的任意组合构成。在另一个方面，该方法进一步包括至少一个修饰步骤(a)的重复。
本发明进一步提供一种从两个或两个以上的核酸生成多核苷酸的方法，该方法包括：(a)确定两个或两个以上的核酸之间的相同部分和不同部分，其中至少一个核酸包括本发明的核酸；(b)提供一组与两个或两个以上核酸中的至少两个序列对应的寡核苷酸；以及(c)用聚合酶延伸该寡核苷酸，由此生成多核苷酸。
任何诱变技术可用于本发明的各种实施方案中。随机的(stochastic)或随机(random)诱变例举亲本分子突变(修饰的或改变的)情形，产生一组具有预先不确定突变的后代分子。因而，在体外随机诱变反应中，例如预期不产生具体预定的产物；有关获得的突变的确切性质，还有有关生成的产物是不确定的，因此是随机的。随机诱变出现于例如易错pcr和随机改组的方法中，其中获得的突变是随机的和预先不确定的。变体形式可由易错转录如易错pcr产生，或使用缺少纠错功能的聚合酶(见liao(1990)gene88:107-111)，第一变体形式，或通过在致突变菌株(mutatorstrain)(致突变宿主细胞将在下面作进一步详细讨论，其通常是众所周知)中复制该第一变体形式。致突变菌株可包括在任何错配修复功能受损的生物体中的任何突变。这些突变包括muts、mutt、muth、mutl、ovrd、dcm、vsr、umuc、umud、sbcb、recj等的突变基因产物。损伤是通过加入试剂，如小化合物或表达的反义rna或其它技术产生的基因突变、等位基因置换、选择性抑制而获得的。损伤可以是基因的损伤，或任何生物体同源基因的损伤。
目前广泛使用的用于从起始分子产生可替代蛋白的诱变方法是寡核苷酸定向诱变技术、易错聚合酶链式反应(易错pcr)和盒式诱变，其中特定的待优化区被合成的诱变寡核苷酸替换。在这些情况下，许多突变位点围绕起始序列中的某些位点产生。
在寡核苷酸定向诱变中，短序列被合成的诱变寡核苷酸替换。在寡核苷酸定向诱变中，使用限制性酶消化，从多核苷酸中去掉多核苷酸的短序列，且其被合成的其中多个碱基相对于起始序列发生变化的多核苷酸替换。多核苷酸序列也可以通过化学诱变改变。化学诱变剂包括，例如，亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或甲酸。核苷酸前体的类似物的其它试剂包括亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或吖啶。一般来说，这些试剂被添加到pcr反应中替换核苷酸前体，从而使序列突变。也可使用插入剂如普罗黄素、吖啶黄、奎纳克林等。多核苷酸序列的随机突变也可通过x射线或紫外线照射获得。一般来说，如此诱变的质粒多核苷酸被引入大肠杆菌中并作为杂种质粒的池(pool)或库扩繁。
易错pcr使用低精确度(low-fidelity)聚合条件在长序列上引入低水平的随机点突变。在未知序列的片段的混合物中，可使用易错pcr诱变该混合物。
在盒式诱变中，单模板的序列块通常由(部分)随机序列替换。reidhaar-olsonjf和sauerrt:作为蛋白序列信息内容探针的组合盒式诱变(combinatorialcassettemutagenesisasaprobeoftheinformationalcontentofproteinsequences)；science241(4861):53-57,1988。
此外，任何非随机的(non-stochastic)或非随机(non-random)诱变技术可用于本发明的各种实施方案中。非随机诱变的示例情况为如亲本分子被突变(被修饰或改变)，从而产生具有一个或多个预定突变的后代分子。可以理解，现实是在许多发生分子加工的反应中存在一定量的背景产物，这些背景产物的存在不影响具有预定产物的诱变方法的非随机性质。定点饱和诱变和合成连接重组是目标产物确切化学结构被预定的诱变技术的实例。
一种定点饱和突变的方法公开于美国专利申请公开第2009/0130718号，通过参考并入于此。该方法提供了与模板多核苷酸的密码子对应的一组简并引物，进行聚合酶延伸产生包含对应于该简并引物的序列的多核苷酸后代。可表达和筛选该多核苷酸后代以用于定向演变。具体来说，这是产生一组后代多核苷酸的方法，包括步骤(a)提供模板多核苷酸拷贝，各含有大量编码模板多肽序列的密码子；以及(b)对各模板多核苷酸的密码子进行如下步骤：(1)提供一组简并引物，其中各引物含有与模板多核苷酸的密码子对应的简并密码子和至少一个与模板多核苷酸密码子的毗邻序列同源的毗邻序列；(2)提供条件使引物退火至模板多核苷酸的拷贝；以及(3)从引物开始沿着模板进行聚合酶延伸反应；由此产生多核苷酸后代，各多核苷酸后代含有与退火引物的简并密码子对应的序列；由此生成一组多核苷酸后代。
定点饱和诱变涉及核酸的定向演变和筛选含有演变的核酸的克隆以获得目标活性，如核酸活性和/或特定的蛋白尤其是酶的目标活性。
由这一技术提供的突变分子可含有嵌合分子和具有点突变的分子，包括含有碳水化合物、脂类、核酸和/或蛋白成分的生物分子，具体的但不限于以下实例，包括抗生素、抗体、酶、甾体和非甾体类激素。
定点饱和诱变一般涉及方法：1)制备后代分子(包括由多核苷酸序列组成的分子，由多肽序列组成的分子，以及由部分多核苷酸序列和部分多肽序列组成的分子)，从一个或多个祖先或亲代模板，诱变以获得至少一个点突变、添加、缺失和/或嵌合；2)筛选后代分子，(优选采用高通量法)筛选出至少一种目标特性(如酶活性的提高或稳定性的增加或新的化疗效果)；3)任选地获得和/或编录结构和/或与亲代和/或后代分子有关的功能性信息；以及4)任选地重复步骤1)-步骤3)的任何步骤。
在定点饱和诱变中，产生(例如从亲代多核苷酸模板)—在称为“密码子定点饱和诱变”中—多核苷酸后代，各多核苷酸后代含有至少一组多达三个连续的点突变(即含有新密码子的不同碱基)，从而每个密码子(或每个编码相同氨基酸的简并密码子家族)在每个密码子位置被代表。对应于并由该多核苷酸后代编码，也产生一组多肽后代，各自具有至少一个单独的氨基酸点突变。在一个优选的方面，在所称的“氨基酸定点饱和诱变”中，沿着多肽在每个氨基酸位置上产生针对19种天然编码的多肽形成α氨基酸置换的突变多肽。对于沿着亲代多肽的每个氨基酸位置，这产生了包括原始氨基酸在内的总计20种不同的多肽后代，如果使用其他氨基酸代替20种天然编码的氨基酸或者在20种天然氨基酸之外使用其他氨基酸，则产生可能≥21种不同的多肽后代。
也可采用其它诱变技术，包括重组和更具体的通过含有部分同源区的多核苷酸序列的体内重排的方法来制备编码多肽的多核苷酸的方法，重组该多核苷酸以生成至少一个多核苷酸，并筛选该多核苷酸以产生具有有用属性的多肽。
在另一个方面，诱变技术利用细胞的自然属性，以重组分子和/或介导降低序列复杂性和重复或连续的具有同源区的序列范围的还原过程。
各种诱变技术，可单独使用或组合使用，提供制备编码生物活性增强的杂种多肽的杂种多核苷酸的方法。在实现这些和其它目标中，按照本发明的一个方面，提供了向合适的宿主细胞中引入多核苷酸并使该宿主细胞在产生杂种多核苷酸的条件下生长的方法。
通过使用由限制性酶产生的相容粘末端连接2个多核苷酸片段生成嵌合基因，其中各片段来自单独的祖先(或亲代)分子。另一个实例是亲代多核苷酸的单一密码子位置的诱变(即获得密码子替换、添加或缺失)，以产生编码单一位点诱变的多肽的单一多核苷酸后代。
此外，已采用体内位点特异性重组系统产生基因杂种，以及体内重组中的随机方法，和同源的但在质粒中截短的基因之间的重组。也有报道通过重叠延伸和pcr产生诱变。
非随机的方法已被用来获得大量的点突变和/或嵌合(chimerization)，例如全面或详尽的方法已被用来在特定的突变组中产生所有分子，功能归于模板分子中的特定结构群(例如特定的单一氨基酸位置或由两个或两个以上氨基酸位置构成的序列)，用以分类和比较特定的突变组。
这些或其它演变方法中的任一种方法可用于本发明中，从一个或多个亲代分子产生新的分子群体(文库)。
一旦形成，根据已公开的方案(protocol)，构建体可以或不必在琼脂糖凝胶上区分大小，插入克隆载体，并转染到合适的宿主细胞内。
演变分子的表达
一旦生成突变分子库，可采用常规分子生物技术表达dna。因而，可采用各种已知的方法表达蛋白。
例如，简单地说，可采用各种随机的或非随机的方法如本文中描述的那些方法来演变野生型基因。然后采用标准的分子生物技术来消化突变的dna分子并连接至载体dna，如质粒dna。采用标准方法(protocol)将含有单个突变的载体dna转化至细菌或其它细胞中。可在多孔板，如96-孔板的单个孔中进行高通量表达和筛选。重复该方法获得各突变分子。
将所述筛选和分离的多核苷酸引入合适的宿主细胞内。合适的宿主细胞是任何能够促进重组和/或还原重排的细胞。筛得的多核苷酸优选已存在于载体中，该载体包括适当的调控序列。宿主细胞可以是高等的真核细胞如哺乳动物细胞，或低等的真核细胞如酵母细胞，或优选地，宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。将构建体引入宿主细胞内可以是磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导转染或电穿孔(例如ecker和davis,1986,通过表达反义rna抑制基因在植物细胞中的表达(inhibitionofgeneexpressioninplantcellsbyexpressionofantisenserna),procnatlacadsciusa,83:5372-5376)。
作为可使用的表达载体的代表性实例，可提及的是病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、养粒(fosmids)、细菌人工染色体、病毒dna(如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病和sv40的衍生物)、基于p1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和其它任何特定的目的宿主(如芽孢杆菌、黑曲霉和酵母菌)。因而，例如，dna可包括于任一种用于表达多肽的表达载体中。这种载体包括染色体的、非染色体的和人工合成的dna序列。大量合适的载体是本领域众所周知的且可市售获得。以下载体通过举例的方式提供；细菌：pqe载体(qiagen)、pbluescript质粒、pnh载体、λ-zap载体(stratagene)；ptrc99a、ρkk223-3、pdr540、prit2t(pharmacia)；真核：pxtl、ρsg5(stratagene)、psvk3、pbpv、pmsg、psvlsv40(pharmacia)。然而，可使用任何其它质粒或其它载体，只要它们是在宿主中可复制且存活的。本发明中可采用低拷贝量或高拷贝量载体。
表达载体中的dna序列可操作地连接至适当的表达调控序列(启动子)来导向rna的合成。特殊命名的细菌启动子包括lad、lacz、t3、t7、gpt、λpr、pl和trp。真核启动子包括cmv早期(immediateearly)、hsv胸苷激酶、早期和晚期sv40、来自逆转录病毒的ltr和小鼠金属硫蛋白-1。合适的载体和启动子的选择是本领域的普通技术水平。表达载体还含有用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。载体还包括适当的用于扩增表达的序列。用氯霉素转移酶(cat)载体或其它具有筛选标记的载体，可以从任何目标基因中筛选出启动子区。此外，优选表达载体含有一个或多个选择标记基因，以提供用于筛选转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
因此，在本发明的另一个方面，可通过还原重组的方法产生新的多核苷酸。该方法包括制备含有连续序列(原始编码序列)的构建体，将它们插入合适的载体，随后将它们引入到合适的宿主细胞中。通过在具有同源区的构建体中的连续序列之间或在准重复单元之间的组合方法产生单独分子识别(molecularidentity)的重排。重排方法重组和/或降低了重复序列的复杂性和规模，并产生了新的分子。可采用各种处理来增强重组率。这些可能包括使用紫外光或破坏dna的化学品和/或使用显示更高水平的“遗传不稳定”的宿主细胞。因而，重组方法可涉及同源重组或指导自身演变的准重复序列的自然属性。
在一个方面，宿主生物体或细胞包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真核有机体。在本发明的另一个方面，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌或荧光假单胞菌。在本发明的另一个方面，革兰氏阳性菌包括streptomycesdiversa、格氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、乳脂链球菌(lactococcuscremoris)或枯草芽孢杆菌。在本发明的另一个方面，真核有机体包括酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、汉逊酵母或黑曲霉(aspergillusniger)。作为合适宿主的代表性实例，可提及的是：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇s2和夜蛾sf9；动物细胞如cho、cos或黑色素瘤；腺病毒和植物细胞。选择合适的宿主被认为在本领域熟练技术人员教导的范围内。
特别提到可用于表达重组蛋白的各种哺乳动物细胞培养系统，哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的cos-7系，描述于“sv40病毒转化的猴细胞支持早期sv40病毒突变的复制”(gluzman，1981)，以及其它能表达相容载体的细胞系，例如，c127、3t3、cho、hela和bhk细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起点位点、合适的启动子和增强子，以及任何必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5'侧翼非转录序列。来自sv40拼接和多聚腺苷酸位点的dna序列，可用来提供所需的非转录基因元件。
然后扩繁细胞和进行“还原重组”。如果需要，可通过引入dna损伤来刺激还原重组率。体内重组集中于“分子间”的方法统称为“重组”，其在细菌中一般被视为“reca-依赖”现象。本发明依靠宿主细胞的重组来重组和重排序列，或依靠细胞的能力来介导还原过程，以通过缺失降低细胞中准重复序列的复杂性。这种“还原重组”过程通过“分子内”，reca-非依赖的方法发生。最终的结果是分子重组至所有可能的组合中。
含有目标多核苷酸的宿主细胞可以在经过修饰的适合于激活启动子、筛选转化子或扩增基因的常规营养培养基中培养。培养条件，如温度、ph等，是以前所用的筛选宿主细胞表达的条件，对本领域熟练技术人员而言是明显的。
蛋白表达可通过各种已知的方法诱导，许多遗传系统已被公开用来诱导蛋白表达。例如，使用合适的系统，添加诱导剂可诱导蛋白表达。然后离心沉淀细胞，弃上清液。将细胞与dna酶、rna酶和溶菌酶孵育，富集周质蛋白。离心后，将含有新蛋白的上清液转移至新的多孔板中，检测前贮存。
一般通过离心收集细胞，通过物理或化学方法破坏细胞，所得的粗提物用于进一步纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可通过任何方便的方法破坏，包括冻融循环、超声，机械破碎或细胞裂解液的使用。此类方法是本领域熟练技术人员所熟知的。采用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水层析、亲和层析、羟基磷灰石色谱和凝集素层析的方法，可从重组细胞培养物中回收和纯化表达的多肽或其片段。必要时可使用蛋白复性的步骤，来完成多肽的构型。如果需要，可采用高效液相色谱法(hplc)作为最后的纯化步骤。
然后对鉴定出的具有目标活性的克隆进行测序，以确定编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
从这些文库中鉴定出的多肽可用于治疗、诊断、研究和相关的目的，和/或可进行一个或多个循环的改组和/或筛选。本发明提供至少为10个氨基酸大小的条件活性生物蛋白的片段，其中该片段具有活性。
本发明提供具有酶活性的密码子优化的多肽或其片段，其中密码子使用针对特定生物体或细胞进行了优化。narum等人，“编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白的基因片段的密码子优化，提高了dna疫苗蛋白在小鼠体内的表达和免疫原性(codonoptimizationofgenefragmentsencodingplasmodiumfalciparummerzoiteproteinsenhancesdnavaccineproteinexpressionandimmunogenicityinmice)”.infect.immun.2001december,69(12):7250-3描述了在小鼠表达系统中密码子的优化。outchkourov等人，“equistatin在毕赤酵母中表达的优化，蛋白表达和纯化(optimizationoftheexpressionofequistatininpichiapastoris,proteinexpressionandpurification)”,proteinexpr.purif.2002february；24(1):18-24描述了在酵母表达系统中密码子的优化。feng等人，“使用人工合成的基因进行人磷脂转移蛋白的高效表达重组和诱变：c-末端膜结合结构域的证据(highlevelexpressionandmutagenesisofrecombinanthumanphosphatidylcholinetransferproteinusingasyntheticgene:evidenceforac-terminalmembranebindingdomain)”biochemistry2000dec.19,39(50):15399-409描述了在大肠杆菌表达系统中密码子的优化。humphreys等人，“使用真核生物信号肽在大肠杆菌中进行高水平的周质表达：编码序列5'端密码子使用的重要性(high-levelperiplasmicexpressioninescherichiacoliusingaeukaryoticsignalpeptide:importanceofcodonusageatthe5'endofthecodingsequence)”,proteinexpr.purif.2000nov.20(2):252-64describeshowcodonusageaffectssecretionine.coli。
条件活性生物蛋白的演变可通过方便的高通量筛选或选择的方法来辅助实现。
一旦确定，本发明的多肽和肽可以是合成的或重组生成的多肽。肽和蛋白可以在体外或体内重组表达。可以使用本领域已知的任何方法制备和分离本发明的多肽和肽。还可以使用本领域熟知的化学方法对本发明的多肽或肽进行全部或部分合成。参见例如caruthers(1980)"newchemicalmethodsforsynthesizingpolynucleotides",nucleicacidsres.symp.ser.215-223；horn(1980),"synthesisofoligonucleotidesoncellulose.partii:designandsyntheticstrategytothesynthesisof22oligodeoxynucleotidescodingforgastricinhibitorypolypeptide(gip)1",nucleicacidsres.symp.ser.225-232；banga,a.k.,therapeuticpeptidesandproteins,formulation,processinganddeliverysystems(1995)technomicpublishingco.,lancaster,pa.。例如，可以使用各种固相技术进行肽合成(参见例如roberge(1995)"astrategyforaconvergentsynthesisofn-linkedglycopeptidesonasolidsupport(用于在固体支持物上汇集合成n-连接的糖肽的策略)",science269:202；merrifield(1997)"conceptandearlydevelopmentofsolid-phasepeptidesynthesis(固相肽合成的概念和早期发展)",methodsenzymol.289:3-13)，可以根据制造商提供的说明书，例如使用abi43ia肽合成仪(perkinelmer)实现自动化合成。
本发明的肽和多肽也可以是糖基化的。糖基化可以在翻译后以化学方式或通过细胞生物合成机制添加，其中后者包括已知糖基化基序的使用，该糖基化基序可以对该序列而言是天然的或可以作为肽添加或添加至核酸编码序列中。糖基化可以是o-连接的或n-连接的。
如上所定义的本发明的肽和多肽包括所有“模拟物”和“拟肽物”形式。术语“模拟物”和“拟肽物”是指具有与本发明的多肽基本相同的结构和/或功能特性的合成化合物。模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物的嵌合分子。只要天然氨基酸保守取代不会实质上改变模拟物的结构和/或活性，模拟物也可以包含任何量的这样的取代。就作为保守变体的本发明的多肽而言，将使用常规实验确定模拟物是否在本发明的范围内，即，其结构和/或功能是否未发生实质性改变。
本发明的多肽模拟物组合物可以包含非天然结构组分的任何组合。在另一方面，本发明的模拟物组合物包括以下三个结构基团中的一个或全部：a)除天然酰胺键(“肽键”)连接之外的残基连接基团；b)替代天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟的残基，即诱导或稳定二级结构(例如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象等)的残基。例如，当本发明的多肽的全部或一些残基通过除天然肽键之外的化学手段连接时，其可以称为模拟物。
单独的肽模拟物残基可以通过肽键、其它化学键或偶联方式连接，例如戊二醛、n-羟基琥珀酰亚胺酯、双官能马来酰亚胺、n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)或n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)。可用作传统酰胺键(“肽键”)的替代物的连接基团包括例如酮亚甲基(例如用-c(＝o)-ch2-代替-c(＝o)-nh-)、氨基亚甲基(ch2-nh)、亚乙基、烯烃(ch＝ch)、醚(ch2-o)、硫醚(ch2-s)、四唑(cn4-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见例如spatola(1983)inchemistryandbiochemistryofaminoacids,peptidesandproteins,第7卷,pp267-357,"peptidebackbonemodifications(肽主链修饰),"marcelldekker,n.y.)。
当本发明的多肽包含全部或一些非天然残基以代替天然存在的氨基酸残基时，本发明的多肽也可称为模拟物。非天然残基在科学和专利文献中有详细描述；以下描述了用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物及其指南。可以通过使用例如以下物质进行代替生成芳香族氨基酸的模拟物：d-或l-萘丙氨酸；d-或l-苯基甘氨酸；d-或l-2-噻吩基丙氨酸；d-或l-1、-2、3-或4-芘酰基丙氨酸；d-或l-3-噻吩基丙氨酸；d-或l-(2-吡啶基)-丙氨酸；d-或l-(3-吡啶基)-丙氨酸；d-或l-(2-吡嗪基)-丙氨酸；d-或l-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；d-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；d-(三氟甲基)-苯丙氨酸；d-p-氟-苯丙氨酸；d-或l-p-联苯基苯丙氨酸；d-或l-p-甲氧基-联苯基苯丙氨酸；d-或l-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和d-或l-烷基胺，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。
酸性氨基酸的模拟物可以通过用例如非羧化氨基酸取代并同时保持负电荷，通过用(膦酰基)丙氨酸取代，或通过硫酸化苏氨酸取代生成。羧基侧基(例如，天冬氨酰基或谷氨酰基)还可以通过与诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺的碳二亚胺(r'-n＝c＝n-r')反应来选择性修饰。通过与铵离子反应，天冬氨酰基或谷氨酰基也可以被转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。可以通过用例如(除赖氨酸和精氨酸外还有)以下氨基酸取代产生碱性氨基酸的模拟物：鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸或(胍基)烷基-乙酸取代，其中烷基定义如上。腈衍生物(例如，含有代替cooh的cn-部分)可以被取代以得到天冬酰胺或谷氨酰胺。可以将天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基脱酰胺得到相应的天门冬酰基或谷酰基残基。可以通过使精氨酰基与例如一种或多种常规试剂(包括例如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己烷二酮或茚三酮)反应来产生精氨酸残基模拟物，该反应优选在碱性条件下进行。可以通过使酪氨酰基与例如芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应来产生酪氨酸残基模拟物。n-乙酰基咪唑和四硝基甲烷可分别用于形成o-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。通过使半胱氨酰残基与例如α-卤代乙酸酯(如2-氯乙酸或氯乙酰胺)和相应的胺反应产生半胱氨酸残基模拟物；以得到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。也可以通过使半胱氨酰残基与例如以下物质反应产生半胱氨酸残基模拟物：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯、n-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚；或氯-7-硝基苯并-氧杂-1,3-二唑。可通过赖氨酰与例如琥珀酸酐或其它羧酸酐反应产生赖氨酸模拟物(和改变氨基末端残基)。赖氨酸和其它含α-氨基的残基模拟物也可以通过与亚氨酸酯如吡啶亚氨酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、o-甲基异脲、2,4-戊二酮反应以及转酰胺酶催化的与乙醛酸的反应。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应产生。脯氨酸的模拟物包括例如哌啶酸、噻唑烷羧酸、3-或4-羟基脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸或3,3-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可通过组氨酰基与例如二乙基原碳酸酯或对溴苯甲酰甲基溴反应而产生。其它模拟物包括例如通过脯氨酸和赖氨酸的羟基化产生的模拟物；通过丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化产生的模拟物；通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α-氨基的甲基化产生的模拟物；通过n-末端胺的乙酰化产生的模拟物；通过主链酰胺残基的甲基化或用n-甲基氨基酸取代产生的模拟物；或通过c-末端羧基的酰胺化产生的模拟物。
本发明多肽的残基(例如氨基酸)也可以被相反手性的氨基酸(或拟肽残基)替代。因此，任何以l-构型天然存在的氨基酸(根据化学实体的结构，其也可以称为r或s)可以被相同化学结构类型但手性相反的氨基酸或手性相反的肽模拟物取代，称为d-氨基酸，其也可以称为r-或s-形式。
本发明还提供通过天然过程(例如翻译后加工(例如磷酸化、酰化等))或通过化学修饰技术修饰本发明的多肽的方法。修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的几个位点。给定的多肽也可以具有许多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、peg化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化和转移rna介导的氨基酸添加至蛋白质，例如精氨酰化。参见例如creighton,t.e.,proteins—structureandmolecularproperties(蛋白质—结构和分子性质)2nded.,w.h.freemanandcompany,newyork(1993)；posttranslationalcovalentmodificationofproteins(蛋白质的翻译后共价修饰),b.c.johnson,ed.,academicpress,newyork,pp.1-12(1983)。
固相化学肽合成方法也可用于合成本发明的多肽或片段。自1960年代早期以来，这种方法已经是已知的(merrifield,r.b.,"solid-phasesynthesis.i.thesynthesisofatetrapeptide",/.am.chem.soc,85:2149-2154,1963)(还参见stewart,j.m.andyoung,j.d.,solidphasepeptidesynthesis,2nded.,piercechemicalco.,rockford,111.,pp.11-12)，并且最近已被用于市售的实验室肽设计和合成试剂盒(剑桥研究生物化学研究所)。这种市售的的实验室试剂盒通常利用文献h.m.geysenetal.,"useofpeptidesynthesistoprobeviralantigensforepitopestoaresolutionofasingleaminoacid,"proc.natl.acad.sci.,usa,81:3998(1984)的教导，并且提供了在多个“棒”或“针”的尖端上合成肽，所有棒或针均连接至单个板。当使用这样的系统时，将连接有棒或针的板倒置并插入对应的孔或储存器的第二板中，其中含有用于将适当的氨基酸附接或锚接到针或棒的尖端的溶液。通过重复这种工艺步骤，即将棒和针的尖端倒置并插入合适的溶液中，将氨基酸组合为所需的肽。此外，还有许多可用的fmoc肽合成系统。例如，可以使用appliedbiosystems，inc.431atm自动肽合成仪在固体支持物上进行多肽或片段的组装。这种设备可以通过直接合成或通过合成可使用其它已知技术偶联的一系列片段使得容易获得本发明的肽。
合成多肽或其片段可以通过已知方法回收和纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。如果需要，可以使用蛋白重折叠步骤来完成多肽的构型。如果需要，高效液相色谱(hplc)可用于最终纯化步骤。
本发明提供了包含至少一种蛋白变体的条件活性蛋白变体制剂，其中所述制剂是液体或干燥的。蛋白制剂任选地包含缓冲液、辅因子、第二蛋白或其他蛋白、或一种或多种赋形剂。在一个方面，所述制剂用作治疗性条件活性生物蛋白，其在异常或非生理条件下有活性但在正常生理条件(例如温度、ph、渗透压、氧化应激和重量摩尔渗透压浓度)下活性较低或无活性。
标准纯化技术可用于重组条件活性生物蛋白或合成条件活性生物蛋白。
筛选突变体以鉴定可逆或不可逆突变体
确定目标分子主要是通过在允许的条件和野生型条件下测定蛋白活性来直接实现的。然后可筛选出活性比(允许/野生型)最大的突变体并采用标准方法通过单个突变的组合生成点突变的排列(permutation)。然后筛选该组合的排列蛋白文库得到在允许和野生型条件之间显示出最大活性差异的蛋白。
可采用多种方法筛选上清液的活性，例如采用高通量活性测定，如荧光检测，鉴定出对想要的特征(温度、ph等)敏感的蛋白突变体。例如，筛选温度敏感的突变体，使用市售底物，在较低温度(如25℃)和原始蛋白起作用的温度(如37℃)下测定各突变体的酶活性或抗体活性。反应最初可以是多孔检测的形式，如96-孔检测，采用不同的形式，如14ml管的形式进行验证。
本发明进一步提供用于确定酶的筛选检测，其包括：(a)提供大量核酸或多肽；(b)从大量多肽中获得待测酶活性的候选多肽；(c)测试候选多肽的酶活性；以及(d)确定那些在异常或非生理条件下表现出增加的酶活性，而在正常生理条件，如温度、ph、氧化应激、重量摩尔渗透压浓度、电解质浓度或渗透压下，较野生型酶蛋白的酶活性减少的候选多肽。
在一个方面，该方法进一步包括在测试具有条件生物活性的候选多肽之前，修饰至少一种核酸或多肽。在另一个方面，测试步骤(c)还包括：检测在宿主细胞或宿主生物体中多肽的增加表达。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约ph3-约ph12的ph范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约ph5-约ph10的ph范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约ph6-约ph8的ph范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在ph6.7和约ph7.5下测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约4℃-约55℃的温度范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约15℃-约47℃的温度范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括：在约20℃-约40℃的温度范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在约25℃-约37℃的温度范围内测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在正常渗透压和异常(正的或负的)渗透压的条件下测试酶活性。在另一个方面，测试步骤(c)还包括在正常电解质浓度和异常(正的或负的)电解质浓度的条件下测试酶活性。受试电解质浓度选自钙、钠、钾、镁、氯、碳酸氢盐和磷酸盐浓度中的一种，在另一个方面，测试步骤(c)还包括测试形成稳定反应产物的酶活性。
在另一个方面，本发明提供特异结合本发明具有酶活性的多肽或其片段的纯化的抗体。在一个方面，本发明提供特异结合具有酶活性的多肽的抗体片段。
抗体和基于抗体的筛选方法
本发明提供特异结合本发明酶的分离的或重组抗体。这些抗体可用于分离、鉴定或定量本发明的酶或相关多肽。这些抗体可用于在本发明范围内分离其它多肽或其它相关的酶。所述抗体可被设计用来结合酶的活性位点。因而，本发明提供使用本发明的抗体抑制酶的方法。
所述抗体可用于免疫沉淀、染色、免疫亲和柱等。如果需要，编码特定抗原的核酸序列的生成，可通过免疫后进行多肽或核酸的分离、扩增或克隆以及将多肽固定于本发明的阵列(array)。或者，本发明的方法可用于修饰由待修饰细胞产生的抗体的结构，例如，抗体的亲和力可增加或减少。而且，制备或修饰抗体的能力可为通过本发明的方法改造至细胞的表型。
免疫方法、制备和分离抗体(多克隆的和单克隆的)的方法是本领域熟练技术人员已知的，并描述于科学和专利文献中，见例如coligan,免疫学流行手册(currentprotocolsinimmunology),wiley/greene,ny(1991)；stites(eds.)基础和临床免疫学(第7版)(basicandclinicalimmunology)(7thed.)langemedicalpublications,losaltos,calif.("stites")；goding,单克隆抗体：原理及操作(第2版)(monoclonalantibodies:principlesandpractice)(2ded.)academicpress,newyork,n.y.(1986)；kohler(1975)“分泌特异性抗体的融合细胞的连续培养物(continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity)”,nature256:495；harlow(1988)抗体，实验室手册(antibodies,alaboratorymanual),coldspringharborpublications,newyork。除了传统在动物体内的方法以外，抗体也可在体外产生，例如使用重组抗体结合位点表达噬菌体展示库。见例如，hoogenboom(1997)“生产高亲和力抗体的文库筛选策略的设计和优化(designingandoptimizinglibraryselectionstrategiesforgeneratinghigh-affinityantibodies)”,trendsbiotechnol.15:62-70；andkatz(1997)“通过噬菌体展示技术发现或改造的配体亲和力和特异性的结构和机械确定(structuralandmechanisticdeterminantsofaffinityandspecificityofligandsdiscoveredorengineeredbyphagedisplay)”,annu.rev.biophys.biomol.struct.26:27-45。
多肽或肽可用于制备特异结合多肽，例如本发明酶的抗体。得到的抗体可用于免疫亲和色谱法以分离或纯化多肽或确定多肽是否存在于生物样本中。在该方法中，蛋白制剂如提取物或生物样本与能够特异结合本发明的一种多肽的抗体接触。
在免疫亲和法中，所述抗体附着在固体支持物，如珠或其它柱形基质上。所述蛋白制剂在抗体能够特异结合本发明的一种多肽的条件下与抗体接触。洗涤后去除非特异结合的蛋白，洗脱特异结合的多肽。
生物样本中蛋白结合抗体的能力可采用任何一种本领域熟练技术人员所熟悉的方法来确定。例如，结合可通过用可检测标记，如荧光剂、酶标物或放射性同位素标记抗体而确定。或者，抗体结合样本的能力可利用带有可检测标记的二级抗体来测定。特定的检测包括elisa检测、双抗体夹心法、放射免疫分析和western印迹。
产生的作用于本发明多肽的多克隆抗体可通过向动物体内直接注射多肽或通过对非人类的动物施用多肽而获得。然后获得的抗体结合多肽自身。在这种方式下，即使仅编码多肽片段的序列也可用于产生可结合于整个原生多肽的抗体。然后该抗体可用于从表达该多肽的细胞中分离多肽。
为了制备单克隆抗体，可采用由连续细胞株培养产生抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术、单克隆抗体的制备，可使用提供由连续的细胞株培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术，三体杂交瘤技术、人类b细胞杂交瘤技术和eb病毒杂交瘤技术(见例如，cole(1985年)，单克隆抗体和癌症治疗(monoclonalantibodiesandcancertherapy),alanr.liss,inc.,pp.77-96)。
所述用于生产单链抗体的技术(见例如，美国专利第4946778号)可适用于生产作用于本发明多肽的单链抗体。或者，可用转基因小鼠表达作用于这些多肽或其片段的人源化抗体。产生的作用于本发明多肽的抗体可用于从其它生物体和样本中筛选类似的多肽(例如，酶)。在这些技术中，来自于生物体的多肽与抗体接触，检测到那些特异结合抗体的多肽。任何以上描述的方法可用于检测抗体结合。
筛选方法和“在线”监测装置
在本发明方法的操作中，可使用多种仪器和方法用于本发明的多肽和核酸，例如，为了筛选具有酶活性的多肽，为了筛选作为潜在的调节剂，例如酶活性的激活剂或抑制剂的化合物，为了筛选结合本发明多肽的抗体，为了筛选与本发明核酸杂交的核酸，为了筛选表达本发明的多肽的细胞等。
阵列或“生物芯片”
本发明的核酸或多肽可以被固定于或应用到阵列上。阵列可用于筛选或监测组合物(例如，小分子、抗体、核酸等)文库，针对它们结合或调节本发明核酸或多肽的活性的能力。例如，在本发明的一个方面，监测的参数是酶基因的转录表达。细胞的一种或多种或所有转录物可通过含有细胞转录物，或细胞转录物的核酸代表或其互补核酸的样本的杂交来测定，通过与固定于阵列或“生物芯片”上的核酸杂交来测定。通过使用微芯片上的核酸“阵列”，一些或全部细胞转录物可同时被定量。或者，含有基因组核酸的阵列也可用于测定通过本发明方法新改造的细胞株的基因型。多肽“阵列”也可用于同时定量多种蛋白。本发明可利用任何已知的“阵列”，还被称作“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”或它们的变体来操作。一般地，阵列是大量的“点”或“靶元件”，各靶元件包括确定量的一种或多种生物分子，例如，寡核苷酸，固定于底物表面的特定区，用于特异结合样本分子，例如，mrna转录物。
在本发明方法的操作中，任何已知的阵列和/或制作和使用阵列的方法或它们的变体可全文或部分并入于此，描述于例如，美国专利号6277628、6277489、6261776、6258606、6054270、6048695、6045996、6022963、6013440、5965452、5959098、5856174、5830645、5770456、5632957、5556752、5143854、5807522、5800992、5744305、5700637、5556752、5434049；也见，例如，wo99/51773、wo99/09217、wo97/46313、wo96/17958；也见，例如，johnston(1998)“基因芯片：了解基因调控的希望阵列(genechips:arrayofhopeforunderstandinggeneregulation)”,curr.biol.8:r171-r174；schummer(1997)“用于构建高密度核酸阵列的廉价手持装置(inexpensivehandhelddevicefortheconstructionofhigh-densitynucleicacidarrays)”,biotechniques23:1087-1092；kern(1997)“在高密度网格cdna过滤检测中基因组大克隆插入的直接杂交(directhybridizationoflarge-insertgenomicclonesonhigh-densitygriddedcdnafilterarrays)”,biotechniques23:120-124；solinas-toldo(1997)“用于基因组失衡筛查的生物芯片：基于基质的比较基因组杂交(matrix-basedcomparativegenomichybridization:biochipstoscreenforgenomicimbalances)”,genes,chromosomes&cancer20:399-407；bowtell(1999)“通过微阵列用于获得从起始到终止的表达数据的选择(optionsavailable--fromstarttofinish--forobtainingexpressiondatabymicroarray)”,naturegeneticssupp.21:25-32。也见公开的美国专利申请号20010018642、20010019827、20010016322、20010014449、20010014448、20010012537、20010008765。
毛细管阵列
毛细管阵列，如gigamatrixtmdiversacorporation,sandiego,calif可用于本发明的方法中。本发明的核酸或多肽可固定于或应用于阵列上，包括毛细管阵列。阵列可用于筛选或监测组合物(例如，小分子、抗体、核酸等)文库，针对它们结合或调节本发明核酸或多肽活性的能力。毛细管阵列提供另一个捕捉(holding)和筛选样本的系统。例如样本筛选装置可包括大量毛细管形成相邻的毛细血管阵列，其中各毛细管包括至少一个壁，其限定腔用于保留样本。所述装置可进一步包括置于阵列相邻的毛细管之间的间质材料，并在间质材料内形成一种或多种参考标记。用于筛选样本的毛细管，其中所述毛细管适合于结合在毛细管阵列中，可包括第一壁，其限定的腔用于保留样本，以及第二壁，其由过滤材料形成，过滤提供给腔的激发能量以激发样品。多肽或核酸，例如配体可被引入第一组件中到至少毛细管阵列的一个毛细管的一部分中。毛细管阵列的各毛细管可包括至少一个壁，其限定的腔用于保留第一组件。气泡可被引入在第一组件后面的毛细管中。第二组件可被引入毛细管中，其中第二组件通过气泡与第一组件分开。目标样本可作为用可检测粒子标记的第一液引入毛细管阵列的毛细管中，其中毛细管阵列的各毛细管包括至少一个壁，其限定的腔用于保留第一液和可检测粒子，其中至少一个壁包被有用于使可检测粒子结合到至少一个壁的结合物质。该方法可进一步包括从毛细管中去掉第一液，其中结合的可检测粒子保留在毛细管内，并向毛细管中引入第二液。所述毛细管阵列可包括许多含有限定腔的至少一个外壁的单个毛细管。毛细管外壁可以是一个或多个融合在一起的壁。同样地，所述壁可限定的腔是圆柱形、方形、六角形或任何其它几何形状，只要壁形成保留液体或样本的腔即可。毛细管阵列的毛细管可以靠近在一起，形成一个平面结构。毛细管可结合在一起，通过融合(例如，其中的毛细血管是由玻璃制成)、粘合、键合或侧壁-侧壁夹紧。毛细管阵列可由任何数量的单个毛细管组成，例如，范围从100到4,000,000个毛细管。毛细管阵列可由约100,000或更多单个毛细管结合在一起形成微滴度板。
在一些实施方案中，本发明的条件活性生物蛋白的活性在正常生理条件下被小分子抑制，但在异常条件下不受相同小分子的抑制。例如，条件活性生物蛋白的活性可以被人血浆中以一定浓度存在的氧、葡萄糖或碳酸氢盐所抑制，但在肿瘤微环境中相同蛋白的活性可能在较小程度上或根本不被抑制，因为氧、葡萄糖或碳酸氢盐的浓度在肿瘤微环境中比在人血浆中可能更低。
在一些实施方案中，本发明的方法可以同时改善模板多肽的结合亲和力和选择性。例如，该方法可以从模板抗体开始产生具有以下特性的条件活性抗体：其在异常条件下具有比模板抗体更高的抗原结合亲和力，并且其在异常条件下的活性与正常生理条件下的活性比相较于模板抗体更高。在一个实施方案中，这些结果是通过使用如美国第8859467号专利中所述的组合蛋白合成(cps)来实现的。具体而言，cps可用于将改善条件活性和亲和力的突变同时引入，从而同时提高所选条件活性生物蛋白的亲和性和选择性。
测试条件
可以使用选自温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度以及两种或更多种这样的条件的组合的任何条件进行筛选步骤中使用的测试的正常生理条件和异常条件。例如，温度的正常生理条件可以是37.0℃的正常人体温度，而温度异常条件可以是与37.0℃的温度不同的温度，例如肿瘤微环境中的温度比正常生理温度高1-2℃。在另一个实例中，正常的生理条件和异常条件也可以是在7.2-7.6范围内的正常生理ph，并且在肿瘤微环境中呈现异常ph，例如在6.2-6.8范围内。
在正常生理条件和异常条件下的测试可以在测试培养基中进行。测试介质可以是溶液，该溶液可以包含例如缓冲液以及其它组分。可以在测试培养基中使用的普通缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸钠)、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液(例如krebs缓冲液)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、hank's缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液等。可以使用本领域技术人员已知的适于该测试的其它缓冲液。这些缓冲液可以用于模拟人体或动物的体液(如血浆或淋巴液)的组成的特征或组分。
用于本发明方法的测试溶液可以含有选自无机化合物、离子和有机分子的至少一种组分，优选通常存在于哺乳动物(例如人或动物)的体液中的组分。这些组分的实例包括营养成分和代谢物，以及可能存在于体液中的任何其它组分。本发明预期该组分可以是或不是缓冲系统的一部分。例如，测试溶液可以是添加有碳酸氢根离子的pbs缓冲液，其中碳酸氢盐不是pbs缓冲液的一部分。或者，碳酸氢根离子是碳酸氢盐缓冲液的一部分。
无机化合物或离子可以选自硼酸、氯化钙、硝酸钙、磷酸二铵、硫酸镁、磷酸一铵、磷酸一钾、氯化钾、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硝酸钙、钙、铜、铁、锰和锌的螯合物、钼酸铵、硫酸铵、碳酸钙、磷酸镁、碳酸氢钾、碳酸氢钠、硝酸钾、盐酸、二氧化碳、硫酸、磷酸、碳酸、尿酸、氯化氢、尿素、磷离子、硫酸离子、氯离子、镁离子、钠离子、钾离子、铵离子、铁离子、锌离子和铜离子中的一种或多种。
一些无机化合物的正常生理浓度的实例包括：浓度范围为2-7.0mg/dl的尿酸、浓度范围为8.2-11.6mg/dl的钙离子、浓度范围为355-381mg/dl的氯离子、浓度范围为0.028-0.210mg/dl的铁离子、浓度范围为12.1-25.4mg/dl的钾离子、浓度范围为300-330mg/dl的钠离子、浓度范围为15-30mm的碳酸、约80μm的柠檬酸根离子、0.05-2.6mm的组氨酸离子、0.3-1μm的组胺、1-20μm的hapt离子(氢化的三磷酸腺苷)、1-20μm的hadp离子。
在一些实施方案中，用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的离子选自氢氧根离子、卤离子(氯离子、溴离子、碘离子)、卤氧根离子、硫酸根离子、镁离子、钙离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、磺酸根离子、卤氧根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、过硫酸根离子、单过硫酸根离子、硼酸根离子、铵离子，或有机离子，例如羧酸根离子、酚盐离子、磺酸根离子(有机硫酸盐如甲基硫酸盐)、钒酸根离子、钨酸根离子、硼酸根离子、有机硼酸根离子、柠檬酸根离子、草酸根离子、乙酸根离子、五硼酸根离子、组氨酸离子和酚酸根离子。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以选自例如氨基酸，如组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸及其混合物。
一些氨基酸的正常生理浓度的实例包括：3.97±0.70mg/dl的丙氨酸、2.34±0.62mg/dl的精氨酸、3.41±1.39mg/dl的谷氨酸、5.78±1.55mg/dl的谷氨酰胺、1.77±0.26mg/dl的甘氨酸、1.42±0.18mg/dl的组氨酸、1.60±0.31mg/dl的异亮氨酸、1.91±0.34mg/dl的亮氨酸、2.95±0.42mg/dl的赖氨酸、0.85±0.46mg/dl的甲硫氨酸、1.38±0.32mg/dl的苯丙氨酸、2.02±6.45mg/dl的苏氨酸、1.08±0.21mg/dl的色氨酸、1.48±0.37mg/dl的酪氨酸和2.83±0.34mg/dl的缬氨酸。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以选自非蛋白、含氮化合物，如肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、尿酸、尿囊素、腺苷、尿素、氨和胆碱。这些化合物中的一些的正常生理浓度的实例包括：1.07±0.76mg/dl的肌酸、0.9-1.65mg/dl的肌酸酐，0.26±0.24mg/dl的胍基乙酸、4.0±2.9mg/dl的尿酸、0.3-0.6mg/dl的尿囊素、1.09±0.385mg/dl的腺苷、27.1±4.5mg/dl的尿素和0.3-1.5mg/dl的胆碱。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以是有机酸，例如柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸、和挥发性脂肪酸。这些有机酸中的一些有机酸的正常生理浓度的实例包括：2.5±1.9mg/dl柠檬酸、0.8mg/dl的α-酮戊二酸、0.5mg/dl的琥珀酸、0.46±0.24mg/dl的苹果酸、0.8-2.8mg/dl的乙酰乙酸、0.5±0.3mg/dl的β-羟基丁酸、8-17mg/dl的乳酸、1.0±0.77mg/dl的丙酮酸、0.6-2.1mg/dl的α-酮酸、1.8mg/dl的挥发性脂肪酸。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以选自糖(糖类)，如葡萄糖、戊糖、己糖、木糖、核糖、甘露糖和半乳糖、以及包括乳糖、glcnacβ1-3gal、galα1-4gal、manα1-2man、galnacβ1-3gal和o-糖苷、n-糖苷、c-糖苷或s-糖苷的二糖。这些糖类中的一些糖的正常生理浓度的实例包括：83±4mg/dl的葡萄糖、102±73mg/dl的多糖(如己糖)、77±63mg/dl的葡糖胺、0.4-1.4mg/dl的己糖醛酸酯(作为葡萄糖醛酸)和2.55±0.37mg/dl的戊糖。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以选自脂肪或其衍生物，例如胆固醇、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂和胆汁酸。这些化合物中的一些化合物的正常生理浓度的实例包括：40-70mg/dl的游离胆固醇、100-200mg/dl的卵磷脂、0-30mg/dl的脑磷脂、10-30mg/dl的鞘磷脂和0.2-0.3mg/dl的胆汁酸(作为胆酸)。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以选自蛋白，例如纤维蛋白原、抗血友病球蛋白、免疫γ球蛋白、免疫优球蛋白、同种凝集素、β-假球蛋白、糖蛋白、脂蛋白和白蛋白。例如，哺乳动物血清白蛋白的正常生理浓度为3.35-5.0g/dl。在一个实施方案中，白蛋白为牛血清白蛋白。
用于在正常生理条件和异常条件下测试的测试溶液中存在的有机化合物可以是维生素，例如维生素a、胡萝卜素、维生素e、抗坏血酸、硫胺素、肌醇、叶酸、生物素、泛酸、核黄素。这些维生素中一些维生素的正常生理浓度的实例包括：0.019-0.036mg/dl的维生素a、0.90-1.59mg/dl的维生素e、0.42-0.76mg/dl的肌醇、0.00162-0.00195mg/dl的叶酸和0.00095-0.00166mg/dl的生物素。
测试溶液中的无机化合物、离子或有机分子的浓度(对于在正常生理条件下的测试和在异常条件下的测试)可以在人或动物血清中的无机化合物、离子或有机分子的正常生理浓度范围内。然而，也可以使用在正常生理范围之外的浓度。例如，人血清中镁离子的正常范围为1.7-2.2mg/dl，钙为8.5-10.2mg/dl。测试溶液中镁离子的浓度可以为约0.17mg/dl至约11mg/dl。测试溶液中钙离子的浓度可以为约0.85mg/dl至约51mg/dl。通常，测试溶液中无机化合物、离子或有机分子的浓度可以低至人血清中无机化合物、离子或有机分子的正常生理浓度的5％、或10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％，或高达人血清中无机化合物、离子或有机分子的正常生理浓度的1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或7倍、或9倍、或10倍、或甚至20倍。测试溶液的不同组分可以以相对于它们各自的正常生理浓度不同的浓度水平使用。
在正常生理条件和异常条件下的测试用于测量突变蛋白的活性。在测试期间，突变蛋白及其结合配偶体存在于测试溶液中。突变蛋白与其结合配偶体之间的关系可以是例如抗体-抗原、配体-受体、酶-底物或激素-受体。为了突变蛋白表达其活性，突变蛋白应该能够与其结合配偶体接触并结合。然后在突变蛋白与其结合配偶体结合之后证明并测量了突变蛋白对其结合配偶体的活性。
在一些实施方案中，用于测试中的离子可用于形成被筛选的突变蛋白与其结合配偶体之间的桥接，特别是包含带电荷的氨基酸残基的那些离子。因此离子可以通过氢键和/或离子键与突变蛋白及其结合配偶体结合。这可以通过使离子能够到达大分子(突变蛋白或其结合配偶体)可能难以达到的位点来帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合。在一些情况下，测试溶液中的离子可增加突变蛋白及其结合配偶体彼此结合的可能性。此外，离子可以通过与更大的分子(突变蛋白或其结合配偶体)结合而另外或可选地辅助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合。这种结合可改变大分子的构象和/或使较大的分子保持在有利于与其结合配偶体结合的特定构象。
已观察到，离子可以有助于突变蛋白与其结合配偶体之间的结合，该作用可能通过与突变蛋白及其结合配偶体形成离子键实现。因此，与没有离子的相同测试法相比，筛选可以有效得多，并且可以鉴定更多的命中物(候选条件活性生物蛋白)。合适的离子可以选自镁离子、硫酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、柠檬酸根离子、hapt离子、hadp离子、碳酸根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、过硫酸根离子、单硫酸根离子、硼酸根离子、乳酸根离子、柠檬酸根离子、组氨酸离子、组胺离子和铵离子。
已发现在离子在其pka附近的ph的条件下有助于突变蛋白与其结合配偶体之间的结合。优选地，相对于突变蛋白的尺寸，这样的离子相对较小。
在一个实施方案中，当异常条件是与正常生理条件下的正常生理ph不同的ph时，适于增加候选条件活性生物蛋白的命中数的离子可以选自具有与测试中要测试的异常ph值接近的pka。例如，离子的pka可以偏离异常ph1个ph单位，偏离异常ph0.8个ph单位，偏离异常ph0.6个ph单位，偏离异常ph0.5个ph单位，偏离异常ph0.4个ph单位，偏离异常ph0.3个ph单位，偏离异常ph0.2个ph单位，或偏离异常ph0.1个ph单位。
可用于本发明的离子的pka可以在不同温度下略微变化，示例性的离子的pka如下：pka约为9.24的铵离子、pka约为7.2的二氢磷酸盐、pka约为4.76的乙酸、pka约为6.04的组氨酸、pka约为6.4的碳酸氢根离子、pka为6.4的柠檬酸、pka约为3.86乳酸根离子、pka约为6.9的组胺、pka为6.95的
在一个实施方案中，条件活性生物蛋白在硫化氢的存在下进行测试和选择。硫化氢的pka为7.05。在一些实施方案中，可以在代表正常和异常生理条件的测试中使用不同浓度的硫化氢。或者，用于正常生理条件和异常条件的测试介质具有大致相同的硫化氢浓度，以及特定条件的数值上有一些差异，例如，可以在不同的ph下进行测试。在测试中使用的硫化氢的浓度可以为100μm至约100mm。优选地，测试介质的硫化氢浓度为1-10mm、或1-5mm、或1-3mm。在硫化氢存在下进行的测试是已知的。
在某些实施方案中，一旦知晓异常条件的ph(即异常ph)，适合于增加候选条件活性生物蛋白的命中物(hits)的离子可以选自具有与异常ph相同的pka或接近异常ph的pka的离子，例如，候选离子的pka可以与异常ph相差1个ph单位，与异常ph相差0.8个ph单位，与异常ph相差0.6个ph单位，与异常ph相差0.5个ph单位，与异常ph相差0.4个ph单位，与异常ph相差0.3个ph单位，与异常ph相差0.2个ph单位，或与异常ph相差0.1个ph单位。
如上所述，在ph与离子的pka相同或接近的条件下，离子最有效地帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合。例如，已经发现，在ph7.2-7.6的测试溶液中，碳酸氢根离子(pka约为6.4)在辅助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合方面不是非常有效。当测试溶液中的ph降低至6.7并进一步降至约6.4时，碳酸氢根离子在帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合方面变得越来越有效。结果，与ph为7.2-7.6的测试相比，在ph为6.4的测试中可以鉴定更多的命中物。类似地，在ph7.4的条件下，组氨酸在帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合方面不是很有效。当测试溶液的ph降低至6.7并进一步降至约6.0时，组氨酸在帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合方面变得越来越有效，还使得在例如约6.2-6.4的ph范围内能够鉴定出更多的命中物。
本发明惊奇地发现，当正常生理条件(即，正常生理ph)和异常条件(即，异常ph)的测试溶液的ph不同时，具有下述pka的离子可以大大帮助被正在被筛选的突变蛋白与其结合配偶体之间的结合：pka的范围是从正常生理ph和异常ph的约中间点至约异常ph。因此，筛选测试在发现于异常条件下具有高活性的更多命中物或候选条件活性生物蛋白方面效率更高。
在一些实施方案中，pka甚至可以与异常ph相差至少一个ph单位。当异常ph是酸性ph时，合适离子的pka可以在从(异常ph-1)到异常ph与正常生理ph之间的中间点的范围内。当异常ph是碱性ph时，合适离子的pka可以在从异常ph和正常生理ph之间的中间点至(异常ph+1)的范围内。离子可以选自本申请中描述的那些离子。然而，还可以使用尚未在本申请中明确描述的更多离子。应当理解，一旦选择了用于筛选测试的异常ph和正常生理ph，本领域技术人员可以使用本发明的指导原则来选择具有合适pka的任何离子以提高在鉴别更多在异常条件下具有高活性的命中物方面的筛选效率。
例如，当示例性筛选的异常ph为8.4以及正常生理ph为7.4时，pka在约7.9(中间点)至9.4(即8.4+1)的范围内的任何离子可以用于筛选。pka在这个范围内的一些离子包括衍生自n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)(pka8.05)、肼(pka8.1)、n,n-二羟乙基甘氨酸(bicine)(pka8.26)、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(4-丁磺酸)(pka8.3)、n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(pka8.4)、牛磺酸(pka9.06)的离子。再举一例，当示例性筛选的异常ph为6以及正常生理ph为7.4时，pka在约5(即6-1)至6.7(中间点)范围内的任何离子可用于筛选。pka在这个范围内的一些离子包括衍生自苹果酸盐(pka5.13)、吡啶(pka5.23)、哌嗪(pka5.33)、卡可基酸盐(pka6.27)、琥珀酸盐(pka5.64)、2-(n-吗啉代)乙磺酸酸(pka6.10)、柠檬酸盐(pka6.4)、组氨酸(pka6.04)和bis-tris(6.46)的离子。本领域技术人员能够参考大量的化学手册和教科书来鉴定可以转化为pka在所述范围内的离子的已知化合物，所述化合物包括无机化合物和有机化合物。在具有合适的pka的化合物中，分子量较小的化合物可能是优选的。
因此，本发明意外地发现，最终鉴定的条件活性生物蛋白的生产不仅取决于从野生型蛋白产生正确的蛋白突变体，而且还取决于在测试溶液中使用具有合适pka的离子。本发明设想除了产生大型突变蛋白文库(例如，通过cpe和cps)之外，还应努力找到用于测试溶液中的合适的离子(具有适当的pka)，因为离子可以促进从大型文库中高效地选择具有高活性的突变体。进一步设想，在没有合适的离子的情况下，筛选效率较低，发现具有高活性的突变体的可能性降低。因此，在没有合适的离子的情况下，可能需要进行多轮筛选以获得相同数量的具有高活性的突变体。
测试溶液中的离子可以由测试溶液的组分原位形成，或直接包含在测试溶液中。例如，来自空气的co2可以溶解在测试溶液中以提供碳酸根和碳酸氢根离子。再举一例，可以将磷酸二氢钠加入到测试溶液中以提供磷酸二氢根离子。
测试溶液(对于在正常生理条件下的测试和在异常条件下的测试)中该组分的浓度可以与通常在天然存在的哺乳动物(例如人)的体液中发现的相同组分的浓度相同或基本相同。在其他实施方案中，组分的浓度可能更高，特别是当组分为能够起到帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合的作用的离子的情况下，因为观察到较高浓度的这种离子可以与突变蛋白及其结合配偶体形成离子键，所以它们实际上可促进结合并增加发现更多命中物或候选条件活性蛋白的可能性。
在一些实施方案中，测试溶液中的离子的浓度与使用测试发现更多命中物的概率成正相关，特别是当使用超过正常生理浓度的浓度时。例如，人血清中碳酸氢根离子的浓度约为15-30mm。在一个实例中，当测试溶液中的碳酸氢根离子的浓度从3mm增加至10mm、增加至20mm、增加至30mm、增加至50mm和增加至100mm时，测试中的命中物的数目也随着每次碳酸氢盐浓度的增加而增加。鉴于此，测试溶液可以使用的碳酸氢根浓度范围为约3mm至约200mm，或约5mm至约150mm，或约5mm至约100mm，或约10mm至约100mm，或约20mm至约100mm，或约25mm至约100mm，或约30mm至约100mm，或约35mm至约100mm，或约40mm至约100mm，或约50mmmm至约100mm。
在另一个实施方案中，测试溶液中柠檬酸根的浓度可以为约30μm至约120μm，或约40μm至约110μm，或约50μm至约110μm，或约60μm至约100μm，或约μm至约90μm，或约μm。
已发现条件活性生物蛋白与作为其衍生源的野生型蛋白相比具有较高比例的带电氨基酸残基。例如，有三种带正电荷的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和两种带负电荷的氨基酸残基：天冬氨酸和谷氨酸。这些带电荷的氨基酸在所选条件活性生物蛋白中与在作为突变蛋白的演变源的野生型蛋白中相比是过度表现的(over-represented)，并且条件活性生物蛋白选自突变蛋白。这可能与测试溶液中使用离子有关，因为更多的带电荷的氨基酸残基可以与离子形成更多的氢键/离子键。
在一个实施方案中，正常生理条件是7.2-7.6范围内的正常生理ph，异常条件是6.2-6.8范围内的异常ph。用于正常生理条件下的测试的测试溶液具有正常的生理ph和50mm的碳酸氢根离子。用于异常条件下测试的测试溶液具有异常的ph和50mm的碳酸氢根离子。由于碳酸氢根离子的pka约为6.4，所以碳酸氢根离子可以帮助在异常ph值6.2-6.8(如ph6.4)下的突变蛋白与其结合配偶体之间的结合。
在另一个实施方案中，正常生理条件是7.2-7.6范围内的正常生理ph，异常条件是6.2-6.8范围内的异常ph。用于正常生理条件下的测试的测试溶液具有正常的生理ph和80μm的柠檬酸根离子。用于异常条件下测试的测试溶液具有异常的ph和80μm的柠檬酸根离子。由于柠檬酸根离子的pka为6.4，所以柠檬酸根离子可以有效地帮助在用于异常条件的、ph值为6.2-6.8的测试溶液中突变蛋白与结合配偶体之间的结合。因此，可以鉴定更多在ph6.4的条件下具有较高结合活性且在7.2-7.8的ph条件下活性较低的候选条件活性生物蛋白。包括乙酸、组氨酸、碳酸氢根、hatp和hadp在内的其他离子以类似的方式起作用，以使含有离子的测试溶液能有效筛选出在离子的pka附近的ph下结合活性较高、在不同于离子的pka的ph下(例如，正常生理ph)下的结合活性较低的突变蛋白。
在另一个实施方案中，正常生理条件是37℃的正常生理温度，异常条件是38-39℃的异常温度(某些肿瘤微环境中的温度)。用于正常生理条件下的测试的测试溶液具有正常生理温度和70mm碳酸氢根离子。用于在异常条件下测试的测试溶液具有异常温度和70mm碳酸氢根离子。
在另一个实施方案中，正常生理条件是正常人血清中电解质的特定浓度，异常条件是同种电解质的不同的、异常的浓度，该浓度可能位于动物或人类不同的位置，或者可能由动物或人的病症导致，所述病症改变人血清中电解质的正常生理浓度。
突变蛋白和/或其结合配偶体之间的结合也可能受到许多其它方式的影响。通常，这种影响将通过在测试介质中包含一种或多种其他组分来实现。可以将这些其他组分设计为与突变蛋白、结合配偶体或两者相互作用。此外，这些其他组分可以使用两种或更多种相互作用以及两种或更多种类型的相互作用的组合来影响结合。
在一个实施方案中，感兴趣的结合相互作用为抗体和抗原之间的相互作用。在该实施方案中，可以在测试介质中包含一种或多种其他组分以对抗体、抗原或两者施加影响。以这种方式，可以增强所需的结合相互作用。
除了可以与突变蛋白和/或其结合配偶体形成离子键以帮助突变蛋白和结合配偶体之间的结合的离子之外，本发明还包括其他可以用于帮助突变蛋白与结合配偶体结合的组分。在一个实施方案中，使用可以与突变蛋白和/或其结合配偶体形成氢键的分子。在另一个实施方案中，可以使用能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行疏水相互作用的分子。在另一个实施方案中，考虑了能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行范德华氏相互作用的分子。
本文中所用的术语“氢键”是指共价键合到电负性原子(如碳、氮、氧、硫、氯或氟)的氢(氢键供体)与具有非共享电子对的电子供体原子(例如氮、氧、硫、氯或氟)(氢键受体)之间的相对弱的非共价相互作用。
能够与突变蛋白和/或其结合配偶体形成氢键的组分包括有机分子以及具有极性键的无机分子。突变蛋白和/或突变蛋白的结合配偶体通常含有可形成氢键的氨基酸。合适的氨基酸具有含有极性基团的侧链，所述极性基团能够形成氢键。合适的氨基酸的非限制性实例包括谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、天门冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、赖氨酸(lys)、组氨酸(his)、丝氨酸(ser)苏氨酸(thr)、酪氨酸(tyr)、半胱氨酸(cys)、甲硫氨酸(met)和色氨酸(trp)。
这些氨基酸可以充当氢供体和氢受体。例如，-oh基团(例如可以在ser、thr和tyr中发现的)中的氧原子、-c＝o基团(例如可以在glu和asp中发现的)中的氧原子、-sh基团或-sc-(例如可以在cys和met中发现的)中的硫原子、-nh3+基团(例如可以在lys和arg中发现的)中的氮原子以及-nh-基团(例如可以在trp、his和arg中发现的)中的氮原子都可以作为氢受体发挥作用。此列表中包含氢原子的基团(例如-oh、-sh、nh3+和-nh-)可以作为氢供体。
在一些实施方案中，突变蛋白和/或其结合配偶体的主链也可以参与形成一个或多个氢键。例如，骨架可以具有-(c＝o)-nh-的重复结构，例如在肽键中。该结构中的氧和氮原子可以用作氢受体，而氢原子可以参与氢键。
具有至少一个包含氢或包含可用于与氢键合的氧原子的极性键的无机化合物可以包括例如h2o、nh3、h2o2、肼、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐。有机化合物如醇；酚；硫醇；脂肪族、胺类、酰胺类；环氧化物、羧酸；酮；醛；醚，酯；有机氯化物和有机氟化物。可以形成氢键的化合物在化学文献中是众所周知的，例如在例如“thenatureofthechemicalbond,"bylinuspauling,cornelluniversitypress,1940,pages284to334”(由于其列举的化合物能够进行氢键相互作用，其全部公开内容通过引用并入本文)中讨论的那些化合物。
在一些实施方案中，醇可以包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、1-己醇、2-辛醇、1-癸醇、环己醇和高级醇；二醇，如乙二醇、丙二醇、甘油、二甘醇和聚亚烷基二醇。合适的酚包括氢醌、间苯二酚、儿茶酚、苯酚、邻甲酚、间甲酚和对甲酚、百里酚、α-萘酚和β-萘酚、连苯三酚、愈创木酚和间苯三酚。合适的硫醇包括甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、2-丙硫醇、丁硫醇、叔丁硫醇、戊硫醇、己硫醇、苯硫酚、二巯基琥珀酸、2-巯基乙醇和2-巯基吲哚。适合的胺包括甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、苯胺、二甲胺和甲基乙胺、三甲胺、氮丙啶、哌啶、n-甲基哌啶、联苯胺、环己胺、乙二胺、六亚甲基二胺、邻甲苯胺、间甲苯胺和对甲苯胺、n-苯基哌啶。合适的酰胺包括乙酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基甲氧基乙酰胺和n-甲基-n-对氰基乙基甲酰胺。环氧化物可以包括环氧乙烷、环氧丙烷、叔丁基过氧化氢、氧化苯乙烯、环氧化物缩水甘油(epoxideglycidol)、环己烯氧化物、二叔丁基过氧化物、氢过氧化枯烯或过氧化氢乙苯、异丁烯氧化物和1,2-环氧辛烷。羧酸可以包括对苯二甲酸、间苯二甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、苯甲酸、乙酸、月桂酸、己二酸、乳酸、柠檬酸、丙烯酸、甘氨酸、六氢苯甲酸、邻甲苯甲酸、间甲苯甲酸和对甲苯甲酸、烟酸、异烟酸和对氨基苯甲酸。酮可以包括丙酮、3-丙酮、丁酮、戊酮、甲基乙基酮、二异丁基酮、乙基丁基酮、甲基异丁基酮、甲基叔丁基酮、环己酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基丁基酮、甲基戊基酮、甲基己基酮、二乙基酮、乙基丁基酮、二丙基酮、二异丁基酮、双丙酮醇、佛尔酮、异佛尔酮、环己酮、甲基环己酮和苯乙酮。醛可以包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、苯甲醛、肉桂醛、异丁醛(sobutyraldehyde)、戊醛、辛醛、苯甲醛、肉桂醛、环己酮、水杨醛和糠醛。酯包括乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸戊酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸甲基异戊酯(methylisoamylacetate)、乙酸甲氧基丁酯、乙酸己酯、乙酸环己酯、乙酸苄酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸戊酯、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸乙酯等。可用于本发明的醚包括二甲醚、甲基乙基醚、乙醚、甲基丙基醚和二甲氧基乙烷。醚可以是环状的，例如环氧乙烷、四氢呋喃和二噁烷。
有机氯化物包括氯仿、五氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯甲烷、四氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯和二氯乙烯。有机氟可以包括氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、三氟乙烷、四氟乙烷、五氟乙烷、二氟丙烷、三氟丙烷、四氟丙烷、五氟丙烷、六氟丙烷和七氟丙烷。
可以按照键的强度将氢键分为强氢键、中等氢键或弱氢键(jeffrey,georgea.；anintroductiontohydrogenbonding,oxforduniversitypress,1997)。强氢键的供体-受体距离为
在一些实施方案中，本发明中使用的组分可以与突变蛋白和/或其结合配偶体形成强氢键。这些组分往往含有具有强电负性的原子。已知具有最强电负性的原子依次为f>o>cl>n。因此，本发明优选使用包含氟、羟基或羰基的有机化合物来形成氢键。在一个实施方案中，有机氟可用于本发明中以形成强氢键。
在另一个实施方案中，使用能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行疏水相互作用的组分。这些组分包括具有疏水基团的有机化合物。
本文所用的术语“疏水相互作用”是指疏水化合物或化合物的疏水区域与另一疏水化合物或另一个化合物的疏水区域之间的可逆吸引相互作用。这种相互作用已在文献“hydrophobicinteractions,”a.ben-nairn(1980),plenumpress,newyork中描述，因其对疏水相互作用的描述，该文献公开内容通过引用并入本文。
疏水物质由于其非极性而被水分子排斥。当水溶液中相对非极性的分子或基团与其它非极性分子缔合而不与水缔合时，称为“疏水相互作用”。
突变蛋白及其结合配偶体通常包含能够进行疏水相互作用的氨基酸。通常这些氨基酸的特征在于具有至少一个含有能够进行疏水相互作用的非极性基团的侧链。疏水性氨基酸包括例如丙氨酸(ala)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、缬氨酸(val)、脯氨酸(pro)、甘氨酸(gly)，在较小程度上，蛋氨酸(met)和色氨酸(trp)。
能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行疏水相互作用的组分包括有机化合物，该有机化合物为疏水分子或含有至少一个疏水部分的分子。在一些实施方案中，这些疏水组分可以是选自芳烃、取代的芳烃、聚芳烃、芳族或非芳族杂环、环烷烃、烷烃、烯烃和炔烃的烃。疏水基团可以包括芳基、烷基、环烷基、烯基和炔基。本文所用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”是指具有一至三十个碳原子的不饱和脂族基团，包括直链烯基/炔基、支链烯基/炔基、环烯基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烯基/炔基。这样的烃部分也可以在一个或多个碳原子上被取代。
可以理解，疏水相互作用的强度基于可能彼此相互作用的“疏水物”的可用量。因此，疏水相互作用可以通过例如增加参与疏水(hydrophonbic)相互作用的分子中的疏水部分的量和/或“疏水”性来调节。例如，可以将疏水部分(其原始形式可以包括烃链)进行修饰，通过使其具有连接至其碳主链的碳原子之一的疏水侧链来增加其疏水性(增加该部分所参与的疏水相互作用的强度的能力)。在本发明的优选实施方案中，这可包括各种多环化合物的连接，包括例如各种类固醇化合物和/或其衍生物，例如甾醇型化合物，更具体是胆固醇。通常，侧链可以是本领域技术人员所想到的直链、芳族、脂族、环状、多环或任何各种其它类型的疏水性侧链。
能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行范德华相互作用的组分的类型通常是但不总是具有极性部分的化合物。本文所用的“范德华相互作用”是指原子、部分、分子和表面之间的吸引力，该吸引力由在邻近的原子、部分或分子的波动极化中作为量子动力学结果发生的偶极-偶极相互作用和/或相关性引起。
本发明范德华相互作用是突变蛋白或结合配偶体与组分之间的吸引力。范德华相互作用可能来自三个来源。首先，一些分子/部分虽然是电中性的，但它们可以是永久的电偶极子。由于在一些分子/部分的结构中电子电荷分布的固定变形，该分子/部分的一侧总是稍微带正电的，而相对的一侧则是稍微带负电的。这种永久偶极子的彼此对齐的倾向导致净吸引力。这是两个永久偶极子之间的相互作用(葛生力(keesomforce))。
第二，作为永久偶极子的分子的存在可能暂时使附近的其它极性或非极性分子中的电子电荷变形，从而引起进一步的极化。永久偶极子与邻近的诱导偶极子之间的相互作用产生了另一个吸引力。这是永久偶极子和相应的诱导偶极子之间的相互作用，可以称之为德拜力。第三，尽管参与的分子不是永久偶极子(例如有机液体苯)，但在分子中具有两个瞬时诱导偶极子的分子之间存在吸引力。这是两个瞬时诱导的偶极子之间的相互作用，可以称之为伦敦分散力。
突变蛋白和/或结合配偶体中能够进行范德华相互作用的氨基酸很多。这些氨基酸可以具有极性侧链，包括谷氨酰胺(gln)、天冬酰胺(asn)、组氨酸(his)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、酪氨酸(tyr)、半胱氨酸(cys)、甲硫氨酸(met)、色氨酸(trp)。这些氨基酸还可以具有包含非极性基团的侧链，包括丙氨酸(ala)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、缬氨酸(val)、脯氨酸(pro)、甘氨酸(gly)。
能够与突变蛋白和/或其结合配偶体进行范德华相互作用的组分包括可溶于测试溶液中的极性或非极性无机化合物。测试溶液通常是水溶液，因此这些极性或非极性无机化合物优选可溶于水。用于进行范德华相互作用的优选物质为极性物质，如此它们能够进行偶极-偶极相互作用。例如aif3具有极性的al-f键，并且可溶于水(在20℃下约为0.67g/100ml水)。hgcl2具有极性的hg-cl键，并且在20℃下可以以7.4g/100ml水的量溶于水中。prcl2具有极性pr-cl键，并且在20℃下可以以约1g/100ml水的量溶于水中。
能够进行范德华相互作用的合适的极性化合物包括醇、硫醇、酮、胺、酰胺、酯、醚和醛。这些化合物的合适实例已经在上文关于形成氢键的内容中进行了描述。能够进行范德华相互作用的合适的非极性化合物包括芳烃、取代的芳烃、聚芳烃、芳族或非芳族杂环、环烷烃、烷烃、烯烃、炔烃。
可以使用形成氢键的组分、疏水组分和范德华组分以多种方式影响突变蛋白与其结合配偶体的结合。在一个实施方案中，氢键、疏水相互作用和/或范德华相互作用可以在突变蛋白与其结合配偶体之间形成桥连。这样的桥连可以使突变蛋白和结合配偶体更靠近彼此，以促进结合和/或将突变蛋白和/或结合配偶体以促进结合的方式相对于彼此定位。
在另一个实施方案中，氢键形成和/或疏水相互作用可以增加突变蛋白与其结合配偶体的结合的可能性，例如通过使蛋白质和结合配偶体以增加蛋白质和结合配偶体结合可能性的方式相互聚集或连接(association)来增加结合可能性。因此，这些相互作用中的一种或多种可以单独使用或组合使用以使突变蛋白和结合配偶体更加靠近地聚集在一起，或以促进结合的方式排列突变蛋白和结合配偶体，例如将结合位点拉近在一起或排列分子的非结合部分使其彼此更加远离，从而使结合位点彼此靠得更近。
在另一个实施方案中，氢键形成和/或疏水相互作用可影响突变蛋白和/或其结合配偶体的构象，以提供更有利于突变蛋白与其结合配偶体结合的构象。具体地，与突变蛋白和/或结合配偶体的一个或多个氨基酸的结合或相互作用可能引起突变蛋白或结合配偶体中有利于突变蛋白/结合配偶体结合反应的一个或多个构象变化。
本发明进行两对测试，一对测试是寻找具有以下特性的突变蛋白：在正常生理条件下的测试中，与在所述正常生理条件下衍生出突变蛋白的蛋白相比，该突变蛋白活性降低；第二对测试是寻找具有以下特性的突变蛋白：在异常条件下的测试中，与在所述异常条件下衍生出突变蛋白的蛋白相比，该突变蛋白的活性增加。在某些情况下，衍生出突变蛋白的蛋白是野生型蛋白。在其他情况下，衍生出突变蛋白的蛋白本身可以是使用本文其他地方描述的一种或多种突变技术制备的突变蛋白。
用于本发明的两对测试中的条件可以选自温度、ph、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激、电解质浓度以及测试溶液或介质的任何其它组分的浓度。因此，测试介质的特定组分可以在两对测定中以实质上相同的浓度使用。在这种情况下，该组分的存在通常用于模拟人或动物中的特定环境，例如血清、肿瘤微环境、肌肉环境、神经环境或在给药点可能遇到的任何其它环境、所施加的治疗可能经历的任何其他环境或者在治疗点可能遇到的任何其他环境。选择模拟这些环境的一种或多种组分的一个重要方面在于它可以改进使用两对测试进行的选择过程的结果。例如，模拟特定环境使得能够在选择过程中得到该环境的特定组分对待评估突变蛋白的各种效果。特定环境的组分可以例如改变蛋白或与突变蛋白结合，抑制突变蛋白的活性，使突变蛋白失活等。
在一些实施方案中，测试溶液的一种或多种组分优选为小分子，例如硫化氢、碳酸氢盐、组胺、乳酸和乙酸。在一个实施方案中，小分子组分在测试溶液中优选以约100μm至约100mm、或更优选约0.5mm至约50mm、或约1mm至约10mm的浓度存在。
测试溶液中组分的浓度可以与通常在哺乳动物(例如人)的、天然存在的体液中发现的同种组分的浓度相同或基本相同。该浓度可以被称为体液中该组分的正常生理浓度。在其它实施方案中，测试溶液中特定组分的浓度可以小于或大于哺乳动物(例如人)天然存在的体液中通常存在的同种组分的浓度。
在另一个实施方案中，在每对测试中组分可以以明显不同的浓度存在。在这种情况下，组分的存在、不存在或组分浓度成为正在被测试的条件，因为该组分的浓度为在用于正常生理条件下的测试的测试溶液和用于异常条件下测试的测试溶液之间存在的有差异的条件。因此，将对根据本发明方法的该实施方案产生的条件活性生物蛋白进行选择以获得其活性至少部分地依赖于所述组分的浓度的条件活性生物蛋白。
在一些实施方案中，组分可以在一对测试溶液中存在，但在另一对测试溶液中完全不存在。例如，异常条件的测试溶液中的乳酸浓度可以设定为模拟肿瘤微环境中乳酸浓度的水平。在用于正常生理条件的一对测试溶液中，可能不存在乳酸。
在一个实施方案中，正常生理条件是代表正常生理条件的第一乳酸浓度，异常条件是代表存在于身体特定位置的异常条件的第二乳酸浓度。
在另一个实例中，在异常条件的测试溶液中可能不存在葡萄糖，以模拟可能在肿瘤微环境中发现的葡萄糖缺乏，而在用于正常生理条件的一对测试溶液中，可以将葡萄糖设定为模拟血浆葡萄糖浓度的水平。该特征可以用于将条件活性生物蛋白优先递送到所述位置或环境，条件活性蛋白在运输过程中没有活性或具有最小活性，当到达异常条件的测试溶液中的组分浓度存在的环境时，条件活性生物蛋白被活化。
例如，与人血清相比，肿瘤微环境通常具有较低的葡萄糖浓度和较高的乳酸浓度。在血清中葡萄糖的正常生理浓度在约2.5mm至约10mm的范围内。相反，在肿瘤微环境中葡萄糖的浓度通常非常低，在0.05mm至0.5mm的范围内。在一个实施方案中，用于在正常生理条件下的测试的测试溶液具有约2.5mm至约10mm的葡萄糖浓度，用于在异常条件下测试的测试溶液具有约0.05mm至约0.5mm的葡萄糖浓度。由此产生的条件活性生物蛋白在低葡萄糖环境中比在较高葡萄糖环境中具有更高的活性。该条件活性生物蛋白将在肿瘤微环境中起作用，但在血流中的运输过程中活性较低。
血清中乳酸的正常生理浓度在约1mm至约2mm的范围内。另一方面，在肿瘤微环境中，乳酸浓度通常在10mm至20mm的范围内。在一个实施方案中，用于在正常生理条件下的测试的测试溶液具有约1mm至约2mm的乳酸浓度，用于在异常条件下的测试的测试溶液具有约10mm至约20mm的乳酸浓度。由此产生的条件活性生物蛋白在高乳酸环境中比在较低乳酸环境中具有更高的活性。因此，该条件活性生物蛋白在肿瘤微环境中起作用，但在血流中的运输过程中活性较低。
类似地，已知疼痛肌肉的乳酸浓度比正常浓度的更高(异常)。因此，当寻求在疼痛肌肉环境中有活性的突变蛋白时，异常条件下的一对测定在较高浓度的乳酸的存在下进行以模拟疼痛肌肉环境，而在正常生理条件下的一对测定可以在较低浓度的乳酸或不存在乳酸的条件下进行。以这种方式，可以选择在具有增加的乳酸浓度的疼痛肌肉环境中活性增强的突变蛋白。这样的条件活性生物蛋白可以用作例如抗炎剂。
在另一个实施方案中，可以在两对测试溶液中使用两种或更多种组分。在这种类型的测试中，可以使用上述的两种测试法的特征来选择条件活性生物蛋白。或者，可以使用两种或更多种组分来增加条件活性生物蛋白的选择性。例如，就肿瘤微环境而言，可以在具有高乳酸浓度和低葡萄糖浓度的测试介质中进行异常条件下的一对测定，而在正常生理条件下的相应一对测定可以在具有相对较低的乳酸浓度和较高葡萄糖浓度的测试介质中进行。
本发明考虑了选自无机化合物，离子和有机分子的每种组分可以单独使用或组合使用以选择在组分的一个浓度下比在相同组分的不同浓度下更有活性的条件活性生物蛋白。
依赖于作为正常环境和异常环境之间的区分条件的不同浓度的一种或多种代谢物的测试可能特别适合于选择在肿瘤微环境中比在血浆中更有活性的条件活性生物蛋白，因为肿瘤微环境中通常具有显著数量的浓度与血浆中相同代谢物的浓度不同的代谢物。
文献kinoshitaetal.,"absoluteconcentrationsofmetabolitesinhumanbraintumorsusinginvitroprotonmagneticresonancespectroscopy,"nmrinbiomedicine,vol.10,pp.2-12,1997比较了正常脑和脑肿瘤中的代谢物。该小组发现，n-乙酰天冬氨酸在正常脑中的浓度为5000-6000μm，但在胶质母细胞瘤中的浓度仅为300-400μm，在星形细胞瘤中的浓度为1500-2000μm，在间变性星形细胞瘤中的浓度为600-1500μm。此外，肌醇在正常脑中的浓度为1500-2000μm，在胶质母细胞瘤中的浓度为2500-4000μm，在星形细胞瘤中的浓度为2700-4500μm，在间变性星形细胞瘤中的浓度为3800-5800μm。磷脂酰乙醇胺在正常脑中的浓度为900-1200μm，但在胶质母细胞瘤中的浓度为2000-2800μm，在星形细胞瘤中的浓度为1170-1370μmμm，在间变性星形细胞瘤中的浓度为1500-2500μm。甘氨酸在正常脑中的浓度为600-1100μm，但在胶质母细胞瘤中的浓度为4500-5500μm，在星形细胞瘤中的浓度为750-1100μm，在间变性星形细胞瘤中的浓度为1900-3500μm。丙氨酸在正常脑中具有700-1150μm的浓度，但在胶质母细胞瘤中的浓度为2900-3600μm，在星形细胞瘤中的浓度为800-1200μm，间变性星形细胞瘤中的浓度为300-700μm。这些代谢物在血液中也可能具有不同的浓度，例如n-乙酰天冬氨酸在血液中的浓度约为85000μm，肌醇在血液中浓度约为21700μm，甘氨酸在血液中的浓度约为220-400μm，丙氨酸在血液中的浓度约为220-300μm。
因此，这些代谢物，至少包括n-乙酰天冬氨酸、肌醇、甘氨酸和丙氨酸，其可以在测试溶液中以不同的浓度使用，以选择在脑肿瘤中有活性但在血液或正常脑组织中无活性的条件活性生物蛋白。例如，n-乙酰天冬氨酸浓度为85000μm的测试溶液可以用于在正常生理条件下的一对测试和n-乙酰天门冬氨酸浓度为350μm的测试溶液可用于在异常条件下的一对测定，以选择在胶质母细胞瘤的肿瘤微环境中有活性、但在血液或正常脑组织中无活性或至少较低活性的条件活性生物蛋白。
文献mayersetal.,"elevatedcirculatingbranchedchainaminoacidsareanearlyeventinpancreaticadenocarcinomadevelopment,"naturemedicine,vol.20,pp.1193-1198,2014研究了胰腺患者预诊血浆中包括支链氨基酸在内的各种不同代谢物的浓度。发现几种代谢物在胰腺肿瘤患者的血流中的浓度与未患胰腺癌的人的血液中同种代谢物的浓度不同。mayers等人还发现与正常个体相比，胰腺癌患者血浆中的支链氨基酸显著增多。以升高的浓度存在的支链氨基酸包括异亮氨酸、氨酸和缬氨酸(mayers的表1)。mayers的图1所示的其他代谢物在胰腺癌患者血浆中的浓度显著不同于正常健康人。这些代谢物至少包括乙酰甘氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、2-氨基己二酸、牛磺脱氧胆酸/牛磺鹅去氧胆酸盐、乌头酸盐、异柠檬酸、乳酸、α-甘油磷酸酯和尿酸。因此，基于胰腺癌患者和正常健康个体的血浆中某些代谢物以不同的浓度存在这一发现，可以预测胰腺癌的肿瘤微环境中这些代谢物的浓度也不同于健康个体的胰腺微环境中的浓度。
因此，在一个实施方案中，这些代谢物中的一种或多种可以用于正常生理条件的测试溶液中，其用量接近健康个体血浆中这些代谢物的浓度(即正常生理浓度的代谢物)。例如，健康个体血浆中已知的异亮氨酸的正常生理浓度约为1.60±0.31mg/dl，亮氨酸约为1.91±0.34mg/dl，缬氨酸约为2.83±0.34mg/dl。正常生理条件的测试溶液可以具有正常生理浓度的这些支链氨基酸中的一种或多种，该正常生理浓度在上述范围内。异常条件的测试溶液中同种支链氨基酸的浓度是健康个体中相应支链氨基酸的正常生理浓度的约5倍、或约10倍、或约20倍、或约50倍、或约70倍、或约100倍、或约150、或约200倍或约500倍。由于在mayers等人检测的血浆中发现的高浓度的这些支链氨基酸是源于肿瘤微环境的并在血流中稀释，基于mayers等人的发现，可以反映出以下事实：预期胰腺肿瘤微环境中这些支链氨基酸的浓度显著升高。类似地，即使癌症患者中特定代谢物的浓度显著低于正常个体，异常条件下的测试也可反映胰腺癌患者血液中其他代谢物的浓度。以这种方式，筛选可以模拟实际环境，从而确保选择在该特定环境具有最高活性的突变体。
在一些其它实施方案中，正常生理条件的测试溶液可包含一种或多种支链氨基酸，其浓度模拟胰腺癌患者血浆中的浓度，从而模拟这些患者的实际血浆环境。在这样的实施方案中，异常条件的测试溶液可以包含相同的支链氨基酸，其浓度是胰腺癌患者血浆中相应的支链氨基酸的浓度的约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约7倍、或约8倍、或约10倍、或约15倍、或约20倍、或约50倍，以反映这些较高浓度源于肿瘤微环境以及血流中的浓度代表了对肿瘤微环境实际浓度的稀释。类似地，在正常生理条件的测试溶液和异常条件的测试溶液中，其他代谢物也可以具有不同的浓度，以反映根据从血流中收集的数据预期的实际差异。在某些情况下，可以注意到在胰腺患者的血流中特定代谢物的缺乏，在这种情况下，可以在正常生理条件下的测试中使用反映血流中测量到的浓度的浓度，可在异常条件下的测试中使用更低的浓度，以解释所述代谢物可能在肿瘤微环境中被消耗的预期。使用这些测试溶液如此选择的条件活性生物蛋白在胰腺癌微环境中比在胰腺癌患者的血浆中更有活性。
在一些实施方案中，胰腺癌患者的整个血浆可用于本发明。例如，在一个实施方案中，在用于正常生理条件下的测试和异常条件下的测试中的一种或两种测试的测试溶液中，可以模拟胰腺癌患者血浆中一种或多种组分。在一个示例性实施方案中，正常生理条件的测试溶液的ph在7.2-7.6的范围内，其中加入了30wt％的胰腺癌患者的血浆，异常条件的测试溶液的ph在6.4-6.8的范围内，其中加入了30wt％的胰腺癌患者的血浆。在本实施方案中，存在胰腺癌患者的血浆，从而即使在存在胰腺癌患者血液中发现的代谢物的组合物的情况下(1)确保条件活性生物蛋白在ph7.2-7.6的血液中未被活化，以及(2)还确保条件活性生物蛋白可以在ph6.2-6.8的肿瘤微环境中被活化。这将使的能为胰腺癌患者定制治疗。
在另一个示例性实施方案中，正常生理条件的测试溶液的ph值在7.2-7.6的范围内，其中加入了30wt％的胰腺癌患者的血浆，并且异常条件的测试溶液的ph在6.4-6.8的范围内，其中没有加入任何胰腺癌患者的血浆。
选自无机化合物、离子和有机分子的相同组分可以用于上述几种类型的测试中的每一种。例如，在乳酸的情况下，在正常生理条件和异常条件下的测试溶液对中，乳酸可以以基本相同的浓度使用。然而，正常生理条件和异常条件将在一个或多个其它方面(例如温度、ph、另一组分的浓度等)不同。在不同的实施方案中，乳酸可以作为正常生理条件和异常条件的区别因素之一，以反映乳酸在异常肿瘤微环境中的浓度高于正常生理条件(非肿瘤微环境)下的浓度这一事实。
在一些实施方案中，将两种或更多种组分以基本相同的浓度加入正常生理条件和异常条件的两种测试溶液。例如，将柠檬酸盐和牛血清白蛋白(bsa)都加入到测试溶液中。在两种测试溶液中，柠檬酸盐的浓度可以为约80μm，bsa浓度可以为约10-20％。更具体而言，用于正常生理条件下的一对测试的测试溶液可以具有7.2-7.6范围内的ph，柠檬酸盐的浓度约为80μm，bsa的浓度约为10-20％。用于异常条件下的一对测试的测试溶液可以具有6.4-6.8范围内的ph，柠檬酸盐的浓度约为80μm，bsa的浓度约为10-20％。
在一个实施方案中，可以向正常生理条件的和异常条件的两种测试溶液中以基本上相同的浓度加入人血清。由于人血清中含有大量的无机化合物、离子、有机分子(包括蛋白)，测试溶液将具有多种和大量的选自无机化合物、离子、有机分子的组分，其在两种测试溶液中的浓度基本相同。
在一些其它实施方案中，将两种或多种组分中的至少一种以不同的浓度添加到正常生理条件的测试溶液和异常条件的测试溶液。例如，将乳酸和牛血清白蛋白(bsa)都加入到测试溶液中。正常生理条件的测试溶液和异常条件的测试溶液的乳酸浓度可能不同，而bsa在两种测试溶液中可以具有相同的浓度。在异常条件的测试溶液中，乳酸的浓度可以为30-50mg/dl，在正常生理条件的测试溶液中，乳酸的浓度可以为8-15mg/dl。另一方面，bsa在两种测试溶液中具有相同的浓度，例如约10-20％。在bsa的存在下，使用这些测试溶液选择的条件活性生物蛋白在30-50mg/dl的高乳酸浓度下比在8-15mg/dl的低乳酸浓度下更有活性。
在一些实施方案中，可以设计测试溶液用于选择具有依赖于两种或更多种条件的活性的条件活性生物蛋白。在一个示例性实施方案中，条件活性生物蛋白可具有依赖于ph和乳酸两者的活性。用于选择这种条件活性生物蛋白的测试溶液可以是ph为7.2-7.6的正常生理条件的测试溶液，其乳酸浓度在8-15mg/dl的范围内。异常条件的测试溶液的ph可以为6.4-6.8，乳酸的浓度在30-50mg/dl的范围内。任选地，正常生理条件和异常条件的测试溶液还可以包含离子以帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合，从而增加候选生物活性蛋白的命中物的数量。
在另一个示例性实施方案中，条件活性生物蛋白可以具有依赖于ph、葡萄糖和乳酸的活性。用于选择这种条件活性生物蛋白的测试溶液可以是ph为7.2-7.6的正常生理条件的测试溶液，其葡萄糖浓度为2.5-10mm，乳酸浓度为8-15mg/dl。异常条件的测试溶液的ph可以为6.4-6.8，葡萄糖浓度在0.05-0.5mm范围内，乳酸浓度在30-50mg/dl的范围呃逆。任选地，正常生理条件的测试溶液和异常条件的测试溶液还可以包含离子以帮助突变蛋白与其结合配偶体之间的结合，从而增加与结合配偶体在ph6.4-6.8的条件下的结合的候选生物活性蛋白的数量。使用这种测试溶液选择的条件活性生物蛋白在ph为6.4-6.8、葡萄糖浓度为0.05-0.5mm、乳酸浓度为30-50mg/dl的环境中比在ph为7.2-7.6、葡萄糖浓度为2.5-10mm、乳酸浓度为8-15mg/dl的环境中更有活性。
选自无机化合物、离子和有机分子的两种或更多种组分用于制备异常条件的测试溶液，该异常条件的测试溶液模拟所选条件活性生物蛋白将被递送到的位置/位点(即，靶位点)处的环境。在一些实施方案中，可以向测试溶液中添加在靶位点处的环境中存在的至少三种组分，或者可以向测试溶液中添加在靶位点处的环境中存在的至少四种组分，或者可以向测试溶液中添加在靶位点处的环境中存在的至少五种组分，或者可以向测试溶液中添加在靶位点处的环境中存在的至少六种组分。
在一个实施方案中，从靶位点取出的流体可以直接用作用于异常条件下的测试的测试溶液。例如，可以从个体，优选从需要治疗的患有关节疾病的个体，取出滑液。被任选稀释的取出的滑液可以在异常条件下的一对测试中用作测试溶液以选择条件活性生物蛋白。通过使用被任选稀释的取出的滑液作为用于异常条件下的测试的测试溶液和模拟人血浆用于正常生理条件下的测试的测试溶液，所选条件活性生物蛋白(例如tnf-α)在关节处比在其他位置或器官更有活性。例如，可以用tnf-α治疗具有炎症关节(例如关节炎)的个体。然而，tnf-α通常具有损害其他组织和器官的严重副作用。在滑液中更有活性、但在血液中无活性或活性较低的条件活性tnf-α可将tnf-α的活性递送至关节，同时减轻或可能消除tnf-α对身体其余部位的副作用。
具有依赖于多种条件的活性的条件活性生物蛋白的开发将提高条件活性生物蛋白对个体体内的靶位点的选择性。理想情况下，在只存在一些条件的其他位置，条件活性生物蛋白无活性或至少活性显著降低。在一个实施方案中，可以将在ph为6.4-6.8、葡萄糖浓度为0.05-0.5mm、乳酸浓度为30-50mg/dl的条件下具有活性的条件活性生物蛋白特异性递送至肿瘤微环境，因为肿瘤微环境中存在所有这些条件。其他组织或器官中可能存在这些条件中的一种或两种，因此在其他组织或器官中不足以完全活化所述条件活性生物蛋白。例如，运动后的肌肉可以具有在6.4-6.8范围内的低ph。然而，可能没有另一种测试条件。因此，条件活性生物蛋白在运动后的肌肉中无活性或至少活性较低。
在一些实施方案中，可以采取步骤来确认条件活性生物蛋白的活性的确依赖于用于选择条件活性生物蛋白的条件。例如，条件活性生物蛋白被选择为依赖于以下三种条件：ph6.4-6.8、0.05-0.5mm的葡萄糖浓度、30-50mg/dl的乳酸浓度。然后可以单独地在三种条件中的每一种条件下以及在具有三种条件中的两种条件的多个环境中测试所选择的条件活性生物蛋白，以确认条件活性生物蛋白在这些测试中无活性或活跃较低。
在一些实施方案中，可以有目的地将血清的某些组分从测试介质中减到最少或除去。例如，当筛选抗体时，可以将结合或吸附抗体的血清成分从测试介质中减到最少或除去。这样的结合的抗体可能会产生假阳性，从而会包含不具有条件活性、而仅仅在各种不同条件下结合至血清中存在的成分的结合的突变抗体。因此，仔细选择测试组分以将测试中可能与突变体结合的组分减到最少或除去，可以使用该方法减少非功能突变体的数量，由于所述非功能突变体在测定中与组分而不是与所期望的结合配偶体结合，因此可能被无意地鉴定为条件活性阳性。例如，在筛选倾向于与人血清中的组分结合的突变蛋白的某些实施方案中，可将bsa用于测试溶液以减少或消除由突变蛋白与人血清的组分结合引起的假阳性的可能性。在特定情况下也可以进行其他类似的替换来实现相同的目标。
筛选形式
本发明的筛选步骤可以是本领域技术人员已知的任何合适的方法。实例包括elisa、酶活性测定、体外真实组织筛选(器官等)、组织切片、整个动物、细胞系和使用3d系统。例如，wo2013/040445中描述了基于合适的细胞的测定，us7,993,271中描述了基于组织的测定，us2010/0263599中描述了基于整个动物的筛选方法，us2011/0143960中描述了基于3d系统的筛选方法。
在一些实施方案中，筛选环境是细胞膜附近的环境，例如细胞膜内部的、细胞膜处的或细胞膜外部的环境，或关节中的环境。在细胞膜环境中筛选时可能影响结合亲和力的一些因素包括受体的表达、内化、抗体药物复合物(adc)效价等。
在一些实施方案中，演变步骤可以产生可能同时具有除上述条件活性特征之外的其它所需特性的突变蛋白。可以演变出的合适的其它所需特性可以包括结合亲和力、表达、人源化等。因此，本发明可以用于生产条件活性生物蛋白，其还具有改进的这些其它所需特性中的至少一种或多种。
在一些实施方案中，本发明产生条件活性生物蛋白。在例如第二演变步骤中，可以使用本文公开的一种诱变技术进一步对所选择的条件活性生物蛋白进行突变，以改善所选条件活性生物蛋白的另一特性，例如结合亲和力、表达、人源化等。在第二演变步骤之后，可以对突变蛋白按照条件活性和改进的特性进行筛选。
在一些实施方案中，在演变野生型蛋白以产生突变蛋白后，选择第一条件活性生物蛋白，其显示以下两种特性：(a)在正常生理条件下的测试中较野生型蛋白活性降低，和(b)在异常条件下在测试中较野生型蛋白活性增强。然后可以进一步对第一条件活性生物蛋白进行一个或多个其他的演变、表达和选择步骤以至少选择第二条件活性生物蛋白，其显示以下两种特性：(a)在正常生理条件下的测试中较野生型蛋白活性降低，和(b)在异常条件下在测试中较野生型蛋白活性增强，与第一条件活性生物蛋白和/或野生型蛋白相比，其在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比值更大。
在某些实施方案中，本发明旨在制备条件活性生物蛋白，其在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的活性比值较大(例如，在异常生理条件和正常生理条件之间更大的选择性)。在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比值或选择性可以为至少约2:1，或至少约3:1，或至少约4:1，或至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约30:1，或至少约40:1，或至少约50:1，或至少约60:1，或至少约70:1，或至少约80:1，或至少约90:1，或至少约100:1。
在一个实施方案中，条件活性生物蛋白是一种抗体，其在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性比值为至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1。在一个实施方案中，条件活性生物蛋白用于靶向肿瘤部位，并且条件活性生物蛋白在肿瘤部位有活性，而在非肿瘤部位(正常生理条件)活性显著较低或不具有活性。
在一个实施方案中，条件活性生物蛋白为旨在与另一种试剂(例如本文别处公开的那些试剂)缀合的抗体。条件活性抗体在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性比值更高。例如，待与另一试剂缀合的条件活性抗体的在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比值为至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1。当缀合的试剂是例如有毒或放射性时，这可能是特别重要的，因为希望这种缀合的试剂集中在患病部位或治疗部位。
条件活性生物蛋白的工程化
本发明的条件活性抗体可以通过本文所述的一种或多种抗体工程化技术来工程化。抗体工程化技术的非限制性实例包括抗体缀合、工程化多特异性抗体和工程化抗体的fc区。
缀合条件活性抗体
本发明提供的条件活性抗体可以与分子缀合。因为条件活性抗体优先作用于例如脑、滑液、肿瘤微环境或干细胞小环境，所以条件活性抗体可以与分子缀合以将该分子转运到脑、滑液或肿瘤微环境之一。在一些实施方案中，缀合的分子具有一定程度的毒性，通过缀合至条件活性抗体可以减轻该分子转运通过身体时的毒性。因此，毒性剂可以这样被影响以优先作用于患病部位或治疗部位。
条件活性抗体与分子(例如治疗剂或诊断剂)的缀合可以是通过共价或非共价键合实现的。共价缀合可以是直接缀合或通过接头缀合。在某些实施方案中，通过蛋白融合(即通过对编码条件活性抗体和神经病症药物的两个基因进行基因融合并表达为单一蛋白)实现直接缀合。在某些实施方案中，直接缀合是通过在条件活性抗体上的反应基团与分子上的相应基团或受体之间形成共价键来实现。在某些实施方案中，通过修饰(例如基因修饰)待缀合的两个分子中的一个使其包括反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)而该反应基团在适当条件下与另一待缀合的分子共价连接实现直接缀合。作为一个非限制性实例，可将具有所需反应基团(例如半胱氨酸残基)的分子(例如氨基酸)引入例如条件活性抗体并与该分子(例如神经药物)形成的二硫键。用于将核酸共价缀合至蛋白的方法也是本领域已知的(即光交联，参见例如zatsepinetal.russ.chem.rev.,74:77-95(2005))。
如本领域普通技术人员容易理解的，非共价缀合可以为任何非共价连接手段，包括疏水键、离子键、静电相互作用等。
还可以使用多种接头进行缀合。例如，可以使用各种双功能蛋白偶联剂缀合条件活性抗体和神经药物，双功能蛋白偶联剂例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、亚氨基四氢噻吩(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。也可以使用由通过肽键连接的一至二十个氨基酸组成的肽接头。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。
接头可以是在递送至患病部位或治疗部位时促进神经药物释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(charietal.,cancerres.,52:127-131(1992)；u.s.patentno.5,208,020)。用于抗体缀合的交联剂试剂的一些实例包括bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、slab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、磺基-smpb和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
缀合的治疗剂可以对身体有毒，例如放射性颗粒、化疗药物或细胞毒素。使用本发明的条件活性抗体将缀合的治疗剂递送至患病部位将显著降低这些治疗剂在不需要其活性的身体部位的毒性作用。将放射性粒子与抗体缀合的技术是本领域已知的。替伊莫单抗
预期任何一种放射性粒子、化疗药物和细胞毒素均可以缀合到本发明的条件活性抗体以降低这些试剂在被递送至治疗部位或患病部位期间的副作用。
在一些实施方案中，缀合至条件活性抗体的放射性粒子包括用一种或多种放射性同位素浸渍的粒子，并且具有足够的放射性用于细胞的局部消融。粒子可以包括玻璃、金属、树脂、白蛋白或聚合物。放射性粒子中的金属可以选自铁、钆和钙。放射性粒子中的一种或多种放射性同位素的实例选自镓67(67ga)、钇-90(90y)、镓-68(68ga)、铊-201(201t1)、锶-89(89sr)、铟-iii(111in)、碘-131(131i)、钐-153(153sm)、锝-99m(99mtc)、铼-186(186re)、铼-188(188re)、铜-62(62cu)和铜-64(64cu)。优选地，组合物中的放射性同位素发射β辐射、γ辐射和/或正电子。
在一些实施方案中，与条件活性抗体缀合的化疗药物选自蒽环类药物、拓扑异构酶i和/或ii抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、烷化剂、抗代谢物、玫瑰树碱和骆驼蓬碱。
蒽环类药物(或蒽环类抗生素)源自链霉菌属细菌。这些化合物用于治疗大范围的癌症，包括例如肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。蒽环类药物包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、地托比星(detorubicin)、洋红霉素(carminomycin)、吗啉代阿霉素(morpholinodoxorubicin)、吗啉代柔红霉素(morpholinodaunorubicin)、甲氧基吗啉基多柔比星(methoxymorpholinyldoxorubicin)及其药学上可接受的盐。
拓扑异构酶是维持dna拓扑结构的必需酶。i型或ii型拓扑异构酶的抑制通过扰乱正确的dna超螺旋而干扰dna的转录和复制。一些i型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱衍生物。喜树碱衍生物是指喜树碱类似物，例如伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、己糖胺、昔来替康(silatecan)、鲁特替康(lutortecan)、卡伦替康(karenitecin，bnp1350)、吉马替康(gimatecan，st1481)、贝曲替康(belotecan，ckd602)或其药学上可接受的盐。ii型拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷和替尼泊苷(teniposide)。这些是表鬼臼毒素的半合成衍生物，表鬼臼毒素为天然存在于美国盾叶鬼臼(podophyllumpeltatum)根中的生物碱。
纺锤体毒素植物生物碱源自植物并通过阻碍细胞分裂所必需的微管功能来阻断细胞分裂。这些生物碱包括但不限于长春花生物碱(如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和长春西汀)和紫杉烷类。紫杉烷包括但不限于紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、奥他赛(ortataxel)、替司他赛(tesetaxel)及其药学上可接受的盐。
烷化剂包括但不限于氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和铂化合物(如奥沙利铂、顺铂或卡铂)。
抗代谢物是抑制代谢物的利用的化学物，代谢物是正常代谢的一部分。抗代谢物的存在改变细胞生长和细胞分裂。嘌呤类似物或嘧啶类似物防止核苷酸并入dna，从而停止dna合成并因此阻止细胞分裂。它们还影响rna合成。嘌呤类似物的实例包括硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨。嘧啶类似物的实例包括抑制胸苷酸合酶的5-氟尿嘧啶(5fu)、氟尿苷(fudr)和胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)。
抗叶酸剂是损害叶酸功能的化疗药物。众所周知的实例是甲氨蝶呤，其是抑制二氢叶酸还原酶(dhfr)的叶酸类似物，因此防止了四氢叶酸的形成。这会抑制dna、rna和蛋白质的产生(因为四氢叶酸还参与氨基酸丝氨酸和甲硫氨酸的合成)。其它抗叶酸剂包括但不限于甲氧苄啶、雷替曲塞、乙胺嘧啶和培美曲塞。
其他化疗药物也可以与条件活性抗体缀合，例如玫瑰树碱和骆驼蓬碱。玫瑰树碱及其衍生物，例如9-羟基玫瑰树碱鎓、n2-甲基-9-羟基玫瑰树碱鎓、2-(二乙基氨基-2-乙基)-9-羟基玫瑰树碱乙酸乙酯、2-(二异丙基氨基乙基)-9-羟基玫瑰树碱乙酸乙酯、2-(β哌啶基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱鎓都是有效的化疗药物。
骆驼蓬碱是从骆驼蓬种子中分离的天然植物生物碱产物。骆驼蓬碱类化疗药物包括：骆驼蓬碱、二氢骆驼蓬碱，骆驼蓬醇(harmol)、去甲骆驼蓬碱(harmalol)和哈尔满碱(harman)、以及喹唑啉衍生物：鸭嘴花碱(vasicine)和鸭嘴花酮碱(vasicinone)。
在一些实施方案中，与条件活性抗体缀合的细胞毒素包括紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其它毒素包括例如蓖麻毒素、cc-1065和类似物、多卡霉素。其他毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如眼镜蛇毒)。
在一些实施方案中，本发明的条件活性抗体可以与诊断剂缀合。用于本发明的诊断剂可以包括本领域已知的任何诊断剂，例如在以下参考文献中提供的诊断剂：armstrongetal,diagnosticimaging(诊断影像学),5thed.,blackwellpublishing(2004)；torchilin,v.p.,ed.,targeteddeliveryofimagingagents(显象剂的靶向递送),crcpress(1995)；vallabhajosula,s.,molecularimaging:radiopharmaceuticalsforpetandspect(分子成像：用于pet和spect的放射性药物),springer(2009)。可以以多种方式检测诊断剂，包括使用该诊断剂提供和/或增强可检测信号，所述可检测信号包括但不限于γ-发射、放射性信号、回声信号、光学信号、荧光信号、吸收信号、磁性信号或断层扫描信号。用于对诊断剂成像的技术可以包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(spect)、磁共振成像(mri)、光学成像、正电子发射断层摄影(pet)、计算机断层摄影(ct)、x射线成像、γ射线成像等。
在一些实施方案中，诊断剂可以包括结合例如金属离子以用于多种诊断成像技术的螯合剂。示例性的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、[4-(1,4,8,11-四氮杂环十四-1-基)甲基]苯甲酸(cpta)、环己烷二胺四乙酸(cdta)、亚乙基双(氧亚乙基次氮基)(egta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、柠檬酸、羟乙基乙二胺三乙酸(hedta)、亚氨基二乙酸(ida)、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(dotp)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(teta)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)及其螯合衍生物。
放射性同位素可以掺入本文所述的一些诊断剂中，并且可以包括发射γ射线、正电子、β和α粒子和x射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于ac、as、at、nb、128ba、212bi、75br、77br、14c、109cd、62cu、64cu、67cu、18f、67ga、68ga、3h、123i、125i、130i、131i、111in、177lu、13n、15o、32p、33p、212pb、103pd、186re、188re、47sc、153sm、89sr、99mtc、88y和90y。在某些实施方案中，放射性试剂可包括min-dtpa、99mtc(co)3-dtpa、99mtc(co)3-enpy2、62/64/67cu-teta、99mtc(co)3-ida和99mtc(co)3三胺(环状或直链)。在其他实施方案中，试剂可以包括dota及其与111in、177lu、153sm、88/90y、62/64/67cu或67/68ga的各种类似物。在一些实施方案中，脂质体可以例如通过掺入附着于螯合物的脂质如dtpa-脂质进行放射性标记，如以下参考文献中所提供：phillipsetal,wileyinterdisciplinaryreviews:nanomedicineandnanobiotechnology,第1卷,第69-83页(2008)；torchilin,v.p.&weissig,v.,eds.liposomes2nded.:oxforduniv.press(2003)；elbayoumi,t.a.&torchilin,v.p.,eur.j.nucl.med.mol.imaging,33:1196-1205(2006)；mougin-degraef,m.etal,int'lj.pharmaceutics,344:110-117(2007)。
在其他实施方案中，诊断剂可以包括光学剂，例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。许多试剂(例如染料、探针、标记物或指示剂)是本领域已知的，并且可以用于本发明。(参见例如invitrogen,thehandbook--aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies,tenthedition(2005))。荧光剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可以包括但不限于花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸、二吡咯并嘧啶、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明、吖啶、蒽醌、硫属吡喃鎓类似物、二氢卟酚、萘酞菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、薁、氮杂薁、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青和具有4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚通用结构的bodipytm衍生物，和/或这些中的任何一个的缀合物和/或衍生物。可以使用的其它试剂包括但不限于例如荧光素、荧光素-聚天冬氨酸缀合物、荧光素-聚谷氨酸缀合物、荧光素-聚精氨酸缀合物、吲哚菁绿、靛青-十二天冬氨酸缀合物、吲哚菁(nird)-聚天冬氨酸缀合物、异硫丹蓝、吲哚二磺酸盐、苯并吲哚二磺酸盐、双(乙基羧甲基)吲哚菁、双(戊基羧甲基)吲哚菁、多羟基吲哚磺酸盐、聚羟基苯并吲哚磺酸盐、刚性杂原子吲哚磺酸盐、吲哚菁二丙酸(indocyaninebispropanoicacid)、吲哚菁二联己酸(indocyaninebishexanoicacid)、3,6-二氰基-2,5-[n,n,n',n'-四(羧甲基)氨基]吡嗪、3,6-[(n,n,n',n'-四(2-羟乙基)氨基]吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(n-氮杂环丁烷基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(n-吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(n-哌嗪基)吡嗪-2,5-二羧酸、3,6-双(n-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸，3,6-双(n-硫代吗啉基)吡嗪-2,5-二羧酸s-氧化物、2,5-二氰基-3,6-双(n-硫代吗啉基)吡嗪s,s-二氧化物、吲哚羰花青四磺酸盐、氯代吲哚羰花青和3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羧酸。
在其它实施方案中，诊断剂可包括本领域通常众所周知的造影剂，包括例如超顺磁性氧化铁(spio)、钆或锰的络合物等。(参见例如armstrongetal,diagnosticimaging,5thed.,blackwellpublishing(2004))。在一些实施方案中，诊断剂可以包括磁共振(mr)显像剂。示例性的磁共振成像试剂包括但不限于顺磁性试剂、超顺磁性试剂等。示例性的顺磁性试剂可以包括但不限于钆喷酸、钆特酸、钆双胺、钆、加多利道(gadoteridol)、锰福地吡(mangafodipir)、钆弗塞胺(gadoversetamide)、檬酸铁铵、钆贝酸、钆布醇或钆塞酸。超顺磁性试剂可以包括但不限于超顺磁性氧化铁和铁烯。在某些实施方案中，诊断剂可包括例如在以下参考文献中提供的x射线造影剂：h.sthomsen,r.n.mullerandr.f.mattrey,eds.,trendsincontrastmedia,(berlin:springer-verlag,1999)；p.dawson,d.cosgroveandr.grainger,eds.,textbookofcontrastmedia(isismedicalmedia1999)；torchilin,v.p.,curr.pharm.biotech.,第1卷,第183-215页(2000)；bogdanov,a.a.etal,adv.drugdel.rev.,第37卷,第279-293页(1999)；sachse,a.etah,investigativeradiology,第32卷,第44-50页(1997)。x射线造影剂的实例包括但不限于碘帕醇、碘美普尔、碘海醇、碘普罗胺、碘普胺、碘沙星、碘佛醇、碘替拉唑、碘替卡因、碘克沙醇、碘克莫司、碘葡萄糖、碘克沙醇、碘磺胺、碘沙仑、伊洛比林、碘帕醇、碘美醇(iosimenol)。在某些实施方案中、x射线造影剂可以包括碘帕醇、碘美普尔、碘普胺、碘海醇、碘伏特、碘佛醇、碘卡醇、碘克沙醇、碘吡咯和碘西莫。
在一些实施方案中，条件活性抗体可以与蛋白缀合，例如白细胞介素、细胞因子、酶、生长因子或其他抗体。这种蛋白的一些实例包括例如肿瘤坏死因子、α-干扰素(efn-α)、β-干扰素(ifn-β)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、组织纤溶酶原激活物(tpa)、凋亡剂(例如wo97/33899中公开的tnf-α、tnf-β、aimi)，aimii(参见wo97/34911)、fas配体(takahashietal.,j.immunol.,第6卷,第1567-1574页,1994)和vegi(wo99/23105)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如，血管抑素或内皮抑制素)；或生物反应调节剂，例如淋巴因子(例如白细胞介素-1(“il-1”)、白细胞介素-2(“il-2”)、白细胞介素-6(“il-6”)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)和粒细胞集落刺激因子(“g-csf”))或生长因子(例如生长激素(“gh”))。
在一些实施方案中，用于穿过脑血屏障(bbb)的条件活性抗体可以缀合至用于治疗神经病症的药物。药物将与抗体一起转运穿过bbb，并保留在脑中用于治疗神经病症。神经病症是指影响cns和/或病因在中枢神经系统(cns)中的疾病或病症。示例性cns疾病或病症包括但不限于神经病、淀粉样变性、癌症、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神经变性疾病、癫痫、行为障碍和溶酶体贮积病。
为了本申请的目的，cns将被理解为包括眼睛，其通常通过血液-视网膜屏障与身体的其余部分隔离。神经疾病的具体实例包括但不限于神经变性疾病(包括但不限于路易体病、脊髓灰质炎后综合征、shy-draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体黑质变性、tau蛋白病理性改变(例如阿尔茨海默病和核上性麻痹)、朊病毒疾病(例如牛海绵状脑病、瘙痒病、克雅氏综合征、库鲁病、gerstmann-straussler-scheinker病、慢性消耗性疾病和致命家族性失眠)，延髓性麻痹、运动神经元疾病和神经系统异型变性疾病(例如于卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大病、图雷特氏综合征、menkes卷发综合症、科凯恩氏综合症(cockaynesyndrome)、halervorden-spatz综合症、拉福拉病(laforadisease)、rett综合症、肝性关节变性、lesch-nyhan综合症和unverricht-lundborg综合症)、痴呆(包括但不限于皮克氏病和脊髓小脑性共济失调)、癌症(例如cns和/或脑，包括由身体其它部位的癌症引起的脑转移)。
用于治疗神经病症的药物可包括但不限于抗体、肽、蛋白、一个或多个cns靶的天然配体、一个或多个cns靶的天然配体的修饰形式、适体、抑制性核酸(即小抑制性rna(sirna)和短发夹rna(shrna))、核酶和小分子或任何上述的活性片段。示例性神经病症药物包括但不限于：抗体、适体、蛋白、肽、抑制性核酸和小分子和任何上述的活性片段，以上物质本身为或特异性识别和/或作用于(即，抑制、激活或检测)cns抗原或靶分子，靶分子例如但不限于淀粉样蛋白前体蛋白或其部分、淀粉样蛋白β、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、dr6、早老素、apoe、神经胶质瘤或其他cns癌症标志物和神经营养因子。神经病症药物和其可以治疗的疾病的非限制性实例包括用于治疗阿尔茨海默氏病、急性和慢性脑损伤、中风的抗bace1抗体；用于治疗阿尔茨海默病的抗aβ抗体；用于治疗中风、急性脑损伤、脊髓损伤的神经营养因子；用于治疗慢性脑损伤(神经发生)的脑源性神经营养因子(bdnf)和成纤维细胞生长因子2(fgf-2)；用于治疗脑癌的抗表皮生长因子受体(egfr)-抗体；用于治疗帕金森病的神经胶质细胞系衍生的神经因子(gdnf)；用于治疗肌萎缩性侧索硬化和抑郁症的脑源性神经营养因子(bdnf)；用于治疗脑的溶酶体贮积病症的溶酶体酶；用于治疗肌萎缩性侧索硬化的睫状神经营养因子(cntf)；用于治疗精神分裂症的神经调节蛋白-1；和用于治疗her2阳性癌症的脑转移的抗her2抗体(例如曲妥单抗)。
在一些实施方案中，条件活性抗体可以缀合至这些抗体的fc区上。上述缀合分子、化合物或药物可以与fc区缀合，如美国专利号8,362,210中所述。例如，fc区可以与细胞因子或毒素缀合以被递送至条件活性抗体显示优先活性的部位。将多肽与抗体的fc区缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095和5,112,946；ep307,434；ep367,166；ep394,827；wo91/06570、wo96/04388、wo96/22024、wo97/34631和wo99/04813；ashkenazietal.,proc.natl.acad.sci.usa,第88卷,第10535-10539页，1991；trauneckeretal.,nature,第331卷,第84-86页,1988；zhengetal.,j.immunol.,第154卷,第5590-5600页,1995；和viietal.,proc.natl.acad.sci.usa,第89卷,第11337-11341页,1992。
在一个实施方案中，本文公开的用于缀合的条件活性抗体的在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比值优选为至少约10:1，或至少约12:1，或至少约14:1，或至少约16:1，或至少约18:1，或至少约20:1，或至少约22:1，或至少约24:1，或至少约26:1。
在一些实施方案中，条件活性抗体可以通过具有至少两个反应性基团的中间体接头共价连接到缀合剂上，所述两个反应性基团中的一个与条件活性抗体反应，另一个与缀合剂反应。可以选择可包括任何相容的有机化合物的接头，使得与条件活性抗体或与缀合剂的反应不会不利地影响条件活性抗体的反应性和/或选择性。此外，接头与缀合剂的连接不能破坏缀合剂的活性。
用于被氧化的条件活性抗体的合适的接头包括含有选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基的基团的接头。用于被还原的条件活性抗体的合适的接头包括具有能够与还原的条件活性抗体的巯基反应的某些反应性基团的接头。这样的反应性基团包括但不限于反应性卤代烷基(包括例如卤代乙酰基)，对-汞苯甲酸酯基和能够进行迈克尔型加成反应的基团(包括例如马来酰亚胺和文献mitraandlawton,j.amer.chem.soc.vol.101,pages3097-3110,1979中所述的基团类型)。
工程化多特异性条件活性抗体
多特异性抗体是具有多表位特异性的抗体。多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)的抗体，其中vhvl单元具有多表位特异性；具有两个或更多个vl和vh结构域的抗体，其中每个vhvl单元结合不同的表位；具有两个或更多个单可变结构域的抗体，其中每个单可变结构域结合不同的表位；包含一个或多个抗体片段的抗体；以及包含已经共价或非共价连接的抗体片段的抗体。
为了构建包括双特异性抗体在内的多特异性抗体，获得了具有至少一个游离巯基的抗体片段。抗体片段可以从全长条件活性抗体获得。可以将条件活性抗体酶促消化以产生抗体片段。示例性酶促消化方法可以使用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和lys-c。示例性抗体片段包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、双抗体(db)；串联双抗体(tadb)、线性抗体(参见美国专利号5,641,870；5,641,870，实施例2；zapataetal.,proteineng.,第8卷,第1057-1062页(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、迷你抗体(olafsenetal(2004)proteineng.design&sel.,第17卷,第315-323页)、单链抗体分子、fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗id)抗体、cdr(互补决定区)和表位结合片段。抗体片段也可以使用dna重组技术产生。编码抗体片段的dna可以克隆到质粒表达载体或噬菌粒载体中并直接在大肠杆菌中表达。抗体酶促消化方法、dna克隆和重组蛋白表达方法是本领域技术人员熟知的。
抗体片段可以使用常规技术纯化，并且进行还原以产生游离硫醇基。具有游离硫醇基的抗体片段与交联剂例如双马来酰亚胺反应。这种交联的抗体片段被纯化，然后与具有游离硫醇基的第二抗体片段反应。将两个抗体片段交联的最终产物纯化。在某些实施方案中，每个抗体片段为fab，并且其中两个fab通过双马来酰亚胺连接的最终产物在本文中被称为双马来酰亚胺-(硫-fab)2或双fab。可利用此类多特异性抗体和抗体类似物(包括双fab)快速合成大量抗体片段组合或天然抗体的结构变体或特定抗体片段组合。
多特异性抗体可以用改性交联剂合成，使得其他功能部分可以连接到多特异性抗体。改性交联剂允许任何巯基反应性部分的连接。在一个实施方案中，n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基硫代乙酸酯(sata)连接到双马来酰亚胺以形成双马来酰亚胺基-乙酰基硫代乙酸酯(bmata)。在对掩蔽的硫醇基去保护之后，具有巯基反应性(或硫醇-反应性)部分的任何官能团可以连接到多特异性抗体。
示例性的硫醇反应性试剂包括多功能接头试剂、捕获剂(即亲和性标记试剂，例如生物素-接头试剂)、检测标记(例如荧光团试剂)、固相固定试剂(例如sepharosetm、聚苯乙烯或玻璃)或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个实例是n-乙基马来酰亚胺(nem)。这种具有改性交联剂的多特异性抗体或抗体类似物可以进一步与药物部分试剂或其它标记物反应。多特异性抗体或抗体类似物与药物-接头中间体的反应分别提供多特异性抗体药物缀合物或抗体类似物药物缀合物。
用于制备多特异性抗体的许多其它技术也可用于本发明中。描述这些技术的参考文献包括：(1)milsteinandcuello,nature,第305卷,第537页(1983),wo93/08829,和trauneckeretal.,emboj.,第10卷,第3655页(1991)，关于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达；(2)美国专利号5,731,168，关于杵臼(knob-in-hole)工程化；(3)wo2009/089004a1，关于用于制备抗体fc异源二聚体分子的工程化静电转向效应；(4)美国专利号4,676,980和brennanetal.,science,第229卷,第81页(1985)，关于交联两个或多个抗体或片段；(5)kostelnyetal.,j.immunol.,第148卷,第1547-1553页(1992)，关于使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体；(6)hollingeretal.,proc.natl.acad.sci.usa,第90卷,第6444-6448页(1993)，关于使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段；(7)gruberetal.,j.immunol.,第152卷,第5368页(1994)，关于使用单链fv(sfv)二聚体；(8)tuttetal.j.immunol.147:60(1991)，关于制备三特异性抗体；和(9)us2006/0025576a1和wuetal.naturebiotechnology,第25卷,第页1290-1297页(2007)，关于具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(octopusantibodies)”或“双重可变结构域免疫球蛋白”(dvd)。
在一个实施方案中，用于穿过bbb的条件活性抗体被工程化以制备多特异性抗体(例如双特异性抗体)。该多特异性抗体包含结合bbb-r的第一抗原结合位点和结合脑抗原的第二抗原结合位点。至少bbb-r的第一抗原结合位点是条件活性的。脑抗原是在脑中表达的抗原，其可以被抗体或小分子靶向。这种抗原的实例包括但不限于：β-分泌酶1(bace1)、淀粉样蛋白β(aβ)、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)、tau、载脂蛋白e4(apoe4)、α-突触核蛋白、cd20、亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(prp)、富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6(dr6)、淀粉样蛋白前体蛋白(app)、p75神经营养因子受体(p75ntr)和半胱天冬酶6。在一个实施方案中，抗原为bace1。
多特异性抗体具有高选择性以优先靶向含有多特异性抗体可结合的所有或大多数靶(抗原)的组织。例如，与仅可以表达一种抗原的非靶细胞相比，双特异性抗体可以通过对表达由双特异性抗体识别的两种抗原的靶细胞显示出更大的偏好性来提供对靶细胞的选择性。因此，由于系统的动力学，在平衡时，结合靶细胞的双特异性抗体比结合非靶细胞的双特异性抗体多。
工程化针对免疫效应细胞表面抗原和靶抗原的双特异性条件活性抗体
本发明的双特异性条件活性抗体可以将免疫效应细胞吸引到存在靶抗原的疾病部位。双特异性条件活性抗体是可以特异性结合两种不同抗原的抗体：免疫效应细胞表面抗原和靶抗原。双特异性抗体可以是全长抗体，其包含两个臂，一个臂与免疫效应细胞表面抗原结合，另一个臂与靶抗原结合。双特异性抗体可以是仅包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)的抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段包括至少两个vhvl单元：一个用于结合免疫效应细胞表面抗原，另一个臂结合至靶抗原。在另一实施方案中，抗体片段包括至少两个单可变结构域(vh或vl)：一个可结合免疫效应细胞表面抗原，另一个臂结合靶抗原。在一些实施方案中，双特异性条件活性抗体包含两个scfv：一个与免疫效应细胞表面抗原结合，另一个与靶抗原结合。
被吸引的免疫效应细胞对免疫效应细胞和病变细胞或病变组织上的靶抗原均具有结合活性，能够将免疫效应细胞吸引到含有靶抗原的患病毒细胞或患病组织。然后被吸引的免疫效应细胞将攻击病变细胞或病变组织，从而帮助治愈疾病，因为免疫效应细胞能够抑制或甚至破坏患病细胞或患病组织。例如，免疫效应细胞可以破坏肿瘤细胞或被感染的细胞。免疫效应细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞和t细胞。
双特异性条件活性抗体具有两种结合活性，一种针对免疫效应细胞表面抗原和另一种针对靶抗原。在一个实施方案中，两种结合活性都是条件活性，这意味着在正常生理条件下，双特异性条件活性抗体对免疫效应细胞表面抗原和靶抗原的结合活性低于野生型抗体的结合活性，在异常条件下，双特异性条件活性抗体的活性高于野生型抗体的活性。在一个实施方案中，两个结合活性中只有一个是有条件的，这意味着双特异性条件活性抗体对免疫效应细胞表面抗原的结合活性或双特异性条件活性抗体对靶抗原的结合活性是有条件的。在这种情况下，在正常生理条件下，双特异性条件活性抗体对免疫效应细胞表面抗原的结合活性或双特异性条件活性抗体对靶抗原的结合活性之一低于野生型抗体的相应活性，而在异常条件下，高于野生型抗体的相应活性。
双特异性条件活性抗体中的两个臂(例如两个vhvl单元或两个scfv)可以通过常规方法连接起来。如本领域众所周知的，含有完整抗原结合位点的最小抗体片段具有非共价连接的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域(vh和vl)的二聚体。这种结构对应于天然抗体中发现的结构，其中每个可变结构域的三个互补决定区(cdr)相互作用以界定vhvl二聚体表面上的抗原结合位点。总共六个cdr赋予抗体抗原结合特异性。cdr侧翼的框架(fr)具有三级结构，其在例如人和小鼠的物种的天然免疫球蛋白中基本上是保守的。这些fr用于使cdr保持其适当的取向。恒定结构域不是结合功能所必需的，但有助于稳定vh-vl相互作用。即使是单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管结合亲和力通常比整个结合位点的结合亲和力更低(painteretal.,"contributionsofheavyandlightchainsofrabbitimmunoglobulingtoantibodyactivity.i.bindingstudiesonisolatedheavyandlightchains,"biochemistry,vol.11pages1327-1337,1972)。因此，双特异性条件活性抗体的结合位点的所述结构域可以理解为是不同免疫球蛋白的一对vh-vl、vh-vh或vl-vl结构域。
在一些实施方案中，可以通过重组dna技术将双特异性条件活性抗体构建为连续的多肽链，例如。以下述方式构建：表达编码双特异性条件活性抗体的核酸分子以构建连续的多肽链(例如参见macketal.,"asmallbispecificantibodyconstructexpressedasafunctionalsingle-chainmoleculewithhightumorcellcytotoxicity,"proc.natl.acad.sci.usa,vol.92,pages7021-7025,2005)。多肽链内的vh和vl结构域的顺序对于本发明而言并不是关键的，只要排列vh和vl结构域使得抗原结合位点能够适当折叠以形成针对免疫效应细胞表面抗原的一个结合位点和针对靶抗原的一个结合位点即可。
本文所述的用于工程化多特异性条件活性抗体的一些技术可用于产生针对免疫效应细胞表面抗原和靶抗原的双特异性条件活性抗体。
被构造为单条多肽链的双特异性抗体是本领域已知的，并描述于wo99/54440,mack,j.immunol.(1997),158,3965-3970,mack,pnas,(1995),92,7021-7025,kufer,cancerimmunol.immunother.,(1997),45,193-197,loftier,blood,(2000),95,6,2098-2103,bruhl,j.immunol.,(2001),166,2420-2426。双特异性抗体的特别优选的构型是多肽构建体，其中vh和vl区域通过接头结构域相互连接。单条多肽链中vh和vl区的顺序并不重要。在一个实施方案中，单条多肽链被构造为vh1-接头结构域-vl1-接头结构域-vh2-接头结构域-vl2。在另一个实施方案中，单条多肽链被构造为vl1-接头结构域-vh1-接头结构域-vl2-接头结构域-vh2。在另一个实施方案中，单条多肽链被构造为vh1-接头结构域-vh2-接头结构域-vl1-接头结构域-vl2。在另一个实施方案中，单条多肽链被构造为vh1-接头结构域-vl2-接头结构域-vl1-接头结构域-vh2。单条多肽链可以折叠成两个臂，每个臂能够与免疫效应细胞表面抗原或靶抗原结合。
双特异性条件活性抗体中的接头结构域是长度足以使得这些vh和vl结构域进行分子间连接的肽片段。现有技术中描述了适用于此目的的接头的设计，例如ep623679b1、第5,258,498号美国专利、ep573551b1和第5,525,491号美国专利。接头结构域优选为1-25个氨基酸的亲水柔性接头，选自甘氨酸、丝氨酸和/或甘氨酸/丝氨酸。在一个实施方案中，接头结构域是一个15个氨基酸的接头，(gly4ser)3序列。
其他的接头结构域包含寡聚化结构域。寡聚化结构域可以使其两个或几个vh和vl结构域的组合折叠成两个臂，每个臂能够与免疫效应细胞表面抗原或靶抗原结合。寡聚化结构域的非限制性实例包括亮氨酸拉链(如jun-fos,gcn4,e/ebp；kostelny,j.immunol.148(1992),1547-1553；zeng,proc.natl.acad.set94(1997),3673-3678,williams,genesdev.5(1991),1553-1563；suter,"phagedisplayofpeptidesandproteins",chapter11,(1996),academicpress)、抗体衍生的低聚化结构域如恒定结构域ch1和cl(mueller,febsletters422(1998),259-264)和/或四聚化结构域如gcn4-li(zerangue,proc.natl.acad.sci.97(2000),3591-3595)。
在一些实施方案中，可以使用杵臼(knob-in-hole)技术来稳定单个多肽链双特异性条件性抗体的折叠。ridgway等人("'knobs-into-holes'engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization,"蛋白eng.1996jul；9(7):617-21)描述了杵臼技术。这种方法已被用于氨基酸侧链在相邻α-螺旋之间的堆积，其中α-螺旋中残基的侧链被表示为在圆柱体的表面上与臼交替设置的被隔开的杵，所述臼中可能容纳有相邻的α-螺旋的杵(o'sheaetal.,(1991)science,254,539-544)。
免疫效应细胞表面抗原应当对一种或一类免疫效应细胞所特有的。许多免疫效应细胞的表面抗原是已知的。自然杀伤细胞具有表面抗原，包括cd56、cd8、cd16、kir家族受体、nkp46、nkp30、cd244(2b4)、cd161、cd2、cd7、cd3和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(angelisetal.,“expansionofcd56-negative,cd16-positive,kir-expressingnaturalkillercellsaftertcell-depletedhaploidenticalhematopoieticstemcelltransplantation,”actahaematol.2011；126(1):13-20；dalleetal.,“characterizationofcordbloodnaturalkillercells:implicationsfortransplantationandneonatalinfections,”pediatricresearch(2005)57,649–655；agarwaletal.,“rolesandmechanismofnaturalkillercellsinclinicalandexperimentaltransplantation,”expertrevclinimmunol.2008；4(1):79-91)。
巨噬细胞具有表面抗原，所述表面抗原包括cd11b、f4/80、cd68、csf1r、mac2、cd11c、ly6g、ly6c、il-4rα、cd163、cd14、cd11b、f4/80(小鼠)/emr1(人)、cd68和mac-1/mac-3、pecam-1(cd31)、cd62、cd64、cd45、yml、cd206、cd45ro、25f9、s100a8/a9和pm-2(murrayetal.,“protectiveandpathogenicfunctionsofmacrophagesubsets,”naturereviewsimmunology,11,723-737；tayloretal.,“macrophagereceptorsandimmunerecognition,”annurevimmunol2005；23:901-44；pilling,etal.,“identificationofmarkersthatdistinguishmonocyte-derivedfibrocytesfrommonocytes,macrophages,andfibroblasts,”plosone4(10):e7475.doi:10.1371/journal.pone.0007475,2009)。
淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞具有表面抗原，所述表面抗原包括t3、t4、t11、t8、tii、leu7、leul1(ferrinietal.,“surfacemarkersofhumanlymphokine-activatedkillercellsandtheirprecursors,”intjcancer.1987jan15；39(1):18-24；bagnascoetal.,“glycoproteicnatureofsurfacemoleculesofeffectorcellswithlymphokine-activatedkiller(lak)activity,”intjcancer.1987jun15；39(6):703-7；kaufmannetal.,“interleukin2induceshumanacutelymphocyticleukemiacellstomanifestlymphokine-activated-killer(lak)cytotoxicity,”thejournalofimmunology,august1,1987,vol.139no.3977-982)。
t细胞，特别是细胞毒性t细胞具有表面抗原，所述表面抗原包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd8、cd28、t58、cd27、cd45、cd84、cd25、cd127和cd196(ccr6)、cd197(ccr7)、cd62l、cd69、tcr、t10、t11和cd45ro(ledbetteretal.,“enhancedtransmembranesignallingactivityofmonoclonalantibodyheteroconjugatessuggestsmolecularinteractionsbetweenreceptorsonthetcellsurface,”molimmunol.1989feb；26(2):137-45；jondaletal.,“surfacemarkersonhumantandblymphocytes,”journalofexperimentalmedicine,volume136,1972,207-215；mingarietal.,“surfacemarkersofhumantlymphocytes,”ricclinlab.1982jul-sep；12(3):439-448)。
双特异性条件活性抗体在与免疫效应细胞结合后可以将免疫效应细胞带到存在靶抗原的细胞或组织，优选靶抗原存在于表面上。一旦双特异性条件活性抗体(以及免疫效应细胞)与靶抗原结合，免疫效应细胞就可以攻击患病细胞或患病组织。诸如自然杀伤细胞、巨噬细胞、lak细胞、t细胞(细胞毒性)的免疫效应细胞都能够杀死和/或破坏患病的细胞或组织，例如破坏肿瘤组织。
患病细胞或患病组织可以选自癌症、炎性疾病、神经元疾病、糖尿病、心血管疾病或感染性疾病。靶抗原的实例包括由各种免疫细胞、癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤和与各种血液病、自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的细胞表达的抗原。
可被双特异性条件活性抗体靶向的、癌症所特有的靶抗原包括4-ibb、5t4、腺癌抗原、α-胎蛋白、baff、b淋巴瘤细胞、c242抗原、ca-125、碳酸酐酶9(ca-ix)、c-met、ccr4、cd152、cd19、cd20、cd200、cd22、cd221、cd23(ige受体)、cd28、cd30(tnfrsf8)、cd33、cd4、cd40、cd44v6、cd51、cd52、cd56、cd74、cd80、cea、cnt0888、ctla-4、dr5、egfr、epcam、cd3、fap、纤连蛋白超结构域b、叶酸受体1、gd2、gd3神经节苷脂、糖蛋白75、gpnmb、her2/neu、hgf、人散点因子受体激酶、igf-1受体、igf-1、igg1、li-cam、il-13、il-6、胰岛素样生长因子i受体、整合素α5β1、整合素ανβ3、morab-009、ms4a1、muc1、粘蛋白canag、n-羟乙酰神经氨酸、npc-ic、pdgf-rα、pdl192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、rankl、ron、ror1、sch900105、sdc1、slamf7、tag-72、腱生蛋白c、tgfβ2、tgf-β、trail-r1、trail-r2、肿瘤抗原ctaa16.88、vegf-a、vegfr-1、vegfr2或波形蛋白。
用本发明的基因工程化的细胞毒性细胞或药物组合物治疗的癌症的类型包括癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。癌症可能是非实体肿瘤(如血液肿瘤)或实体瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血液性)癌症的实例包括白血病，白血病包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛形式和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。按照形成实体瘤的细胞类型命名了不同类型的实体瘤(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns肿瘤(例如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合型胶质瘤)、成胶质细胞瘤(glioblastoma，也称为glioblastomamultiforme)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
双特异性条件活性抗体可靶向的、炎性疾病特有的靶抗原包括aoc3(vap-1)、cam-3001、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、cd125、cd147(基础免疫球蛋白，basigin)、cd154(cd40l)、cd2、cd20、cd23(ige受体)、cd25(il-2受体链)、cd3、cd4、cd5、ifn-α、ifn-γ、ige、igefc区、il-1、12、il-23、il-13、il-17、il-17a、il-22、il-4、il-5、il-5、il-6、il-6受体、整合素α4、整合素α4β7、lamaglama、lfa-1(cd1la)、medi-528、肌生成抑制素、ox-40、rhumabβ7、硬化蛋白、sost、tgfβ1、tnf-α或vegf-a。
本发明的双特异性条件活性抗体可靶向的、神经元病症所特有的靶抗原包括β淀粉样蛋白或mabt5102a中的一种或多种。本发明的双特异性条件活性抗体可靶向的、糖尿病特有的抗原包括l-iβ或cd3中的一种或多种。本发明的双特异性条件活性抗体可靶向的、心血管疾病特有的抗原包括c5、心肌肌球蛋白、cd41(整联蛋白α-lib)、纤维蛋白ii、β链、itgb2(cd18)和鞘氨醇-1-磷酸中的一种或多种。
本发明的双特异性条件活性抗体可靶向的、感染性疾病所特有的靶抗原包括炭疽毒素、ccr5、cd4、凝聚因子a、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白b、内毒素、大肠杆菌、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、hiv-1、hsp90、甲型流感血凝素、脂磷壁酸、铜绿假单胞菌、狂犬病病毒糖蛋白、呼吸道合胞病毒和tnf-α中的一种或多种。
靶抗原的其它实例包括以特有或扩增的方式存在于癌细胞上的表面蛋白，例如b细胞淋巴瘤的il-14受体、cd19、cd20和cd40，各种癌的lewisy和cea抗原，乳腺和结肠直肠癌的tag72抗原，肺癌的egf-r，通常在人乳腺癌和卵巢癌中扩增的叶酸结合蛋白和her-2蛋白，或病毒蛋白，例如人类免疫缺陷病毒(hiv)的gp20和gp41包膜蛋白，乙型肝炎和c型病毒的包膜蛋白，人巨细胞病毒的糖蛋白b和其他包膜糖蛋白，以及来自诸如卡波西肉瘤相关疱疹病毒的甲基病毒的包膜蛋白。其他可能的靶抗原包括cd4，其中配体是hivgp120包膜糖蛋白，以及其它病毒受体，例如icam，其是人类鼻病毒的受体，以及脊髓灰质炎病毒的相关受体分子。
人类免疫缺陷病毒(hiv)不能进入人细胞，除非它首先结合细胞表面上的两个关键分子，即cd4和共受体。最初识别的共受体是ccr5，后来在病毒的生命周期中，另一种趋化因子受体cxcr4成为hiv-1的共受体(d'souza,naturemed.2,1293(1996)；premack,naturemed.2,1174；fauci,nature384,529(1996))。通过性接触进行大部分病毒传播的hiv-1病毒株被称为m-热带病毒。这些hiv-1病毒株(也称为非合胞体诱导(nsi)原代病毒))可以在原代cd4+t细胞和巨噬细胞中复制，并使用趋化因子受体ccr5(和ccr3，ccr3较不常见)作为其共受体。t-热带病毒(有时称为合胞体诱导(si)原代病毒)可以在原代cd4+t细胞中复制，但也可以体外感染建立的cd4+t细胞系，它们通过趋化因子受体cxcr4(融合病毒蛋白)实现上述功能。至少在某些体外条件下，这些t-热带病毒株中的许多病毒株除了可以使用cxcr4以外还可以使用ccr5，有些可通过ccr5进入巨噬细胞(d'souza,naturemed.2,1293(1996)；premack,naturemed.2,1174；fauci,nature384,529(1996))。由于m-热带hiv-1病毒株涉及约90％的hiv性传播，ccr5是患者病毒的主要共受体。
靶细胞上的共受体分子的数目和身份以及hiv-1病毒株可通过不同的共受体进入细胞的能力似乎是疾病进展的关键决定因素。在霍奇金病患者的淋巴结t细胞和b细胞中也观察到ccr3和ccr5的高表达。i型糖尿病被认为是t细胞介导的自身免疫性疾病。胰腺中ccr5受体的表达与相关动物模型中i型糖尿病的进展相关(cameron(2000)j.immunol.165,1102-1110)。在一个实施方案中，双特异性条件活性抗体结合作为靶抗原的ccr5，可用于抑制宿主细胞的hiv感染以及减缓其他疾病的进展。
特异性结合(人)ccr5的几种抗体是本领域已知的，包括mc-1(mack(1998)j.exp.med.187,1215-1224ormc-5(blanpain(2002)molbiolcell.13:723-37,segerer(1999)kidneyint.56:52-64,kraft(2001)biol.chem.14；276:34408-18)。因此，双特异性条件活性抗体优选包含例如对ccr5(特别是人ccr5)具有特异性的抗体的vl和vh结构域(即来自ig的第二结构域)和对t细胞上的cd3抗原具有特异性的抗体的vh和vl结构域。
在另一实施方案中，本发明提供以t细胞上的cd3，和cd19作为靶抗原的双特异性条件活性抗体。已证明cd19是非常有用的医疗靶标。cd19在从前体b细胞到成熟b细胞的整个b细胞谱系中表达，在所有淋巴瘤细胞上均匀表达，在干细胞中不存在(haagen,clinexpimmunol90(1992),368-75；uckun,proc.natl.acad.sci.usa85(1988),8603-7)。已经公开了使用针对cd19的抗体和其他免疫调节性抗体的组合疗法，用于治疗b细胞恶性肿瘤(wo02/04021、us2002006404、us2002028178)和自身免疫疾病(wo02/22212/us2002058029)。wo00/67795公开了使用针对cd19的抗体用于治疗进展缓慢的和进展期的b细胞淋巴瘤、以及急性和慢性淋巴性白血病。wo02/80987公开了基于针对抗原cd19的抗体的免疫毒素的治疗用途，其用于治疗b细胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或b细胞白血病(例如b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all))、(例如毛细胞淋巴瘤)b细胞前体急性淋巴细胞白血病(pre-b-all)、b细胞慢性淋巴细胞白血病(b-cll))等疾病。
在另一实施方案中，本发明提供以t细胞上的cd3，以及cd20作为靶抗原的双特异性条件活性抗体。cd20是b淋巴细胞上存在的细胞表面蛋白之一。cd20抗原存在于正常和恶性的前体b淋巴细胞和成熟b淋巴细胞中，包括在90％的b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl)中的那些。造血干细胞、激活的b淋巴细胞(浆细胞)和正常组织中不存在该抗原。已经描述了几种主要鼠源的抗体：1f5(pressetal.,1987,blood69/2,584-591)、2b8/c2b8、2h7、1h4(liuetal.,1987,jimmunol139,3521-3526；andersonetal.,1998,第5,736,137号美国专利；haismaetal.,1998,blood92,184-190；shanetal.,1999,j.immunol.162,6589-6595)。
已在使用编码与载体蛋白连接的scfv的dna进行疫苗接种以治疗浆细胞恶性肿瘤的免疫治疗策略中对cd20进行了描述(treonetal.,2000,seminoncol27(5),598)，已证明使用cd20抗体(idec-c2b8)的免疫治疗在治疗非霍奇金b细胞淋巴瘤方面是有效的。
在一些实施方案中，双特异性条件活性抗体是由多核苷酸分子编码的单条多肽链。多核苷酸可以是例如dna、cdna、rna、或合成产生的dna或rna、或重组产生的以单独或组合的形式包含那些多核苷酸中的任何多核苷酸的嵌合核酸分子。多核苷酸可以是载体的一部分，例如表达载体，包括质粒、粘粒、病毒和噬菌体、或基因工程中常规使用的任何表达系统。载体可以包含其他基因，例如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中在合适的条件下选择载体。
在一个方面，多核苷酸可操作地连接到允许在原核或真核细胞中进行表达的表达调控序列。衍生自病毒(如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送到哺乳动物细胞中。包含本发明的多核苷酸的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，这些方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。
工程化掩蔽的条件活性生物蛋白
本发明的条件活性生物蛋白，特别是条件活性抗体，可以掩蔽其条件活性和/或通过掩蔽部分掩蔽与其缀合的试剂的活性。一旦将掩蔽部分从条件活性生物蛋白中去除或切割，便可获得被掩蔽的活性。合适的掩蔽技术描述于例如desnoyersetal.,“tumor-specificactivationofanegfr-targetingprobodyenhancestherapeuticindex,”sci.transl.med.5,207ra144,2013。
在一些实施方案中，条件活性抗体与掩蔽部分连接，掩蔽部分掩蔽该条件活性和/或与其缀合的试剂的活性。例如，当条件活性抗体与掩蔽部分连接时，这种连接或修饰会引起结构变化，所述结构变化可减少或抑制条件活性抗体与其抗原特异性结合的能力。一旦条件活性抗体到达靶组织或微环境，掩蔽部分就被靶组织或微环境中存在的酶切割，从而释放被掩蔽的活性。例如，酶可以是在肿瘤微环境中通常具有活性的蛋白酶，其可以切割掩蔽部分以释放在肿瘤组织内具有活性的条件活性抗体。
在一些实施方案中，活性被掩蔽至小于原始活性的约50％，或小于原始活性的约30％，或小于原始活性的约10％，或小于原始活性的约5％，或小于原始活性的约2％，或小于原始活性的约1％，或小于原始活性的约0.1％，或小于原始活性的约0.01％。例如，在某些实施方案中，为了确保足够的递送时间，掩蔽效应被设计为在进行体内测量或在体外免疫吸附测定中的靶置换中持续至少2、4、6、8、12、28、24、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长。
在某些实施方案中，掩蔽部分在结构上类似于条件活性抗体的天然结合配偶体(抗原)。掩蔽部分可以是经修饰的、条件活性抗体的天然结合配偶体，其含有至少可轻微降低与条件活性抗体结合的亲和力和/或亲合力的氨基酸变化。在一些实施方案中，掩蔽部分不包含条件活性抗体的天然结合配偶体或基本上与条件活性抗体的天然结合配偶体没有同源性。在其他实施方案中，掩蔽部分与条件活性抗体的天然结合配偶体之间的序列同一性不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。
掩蔽部分可以以各种不同的形式提供。在某些实施方案中，掩蔽部分可以是条件活性抗体的已知结合配偶体，条件是掩蔽部分与条件活性抗体的结合亲和力和/或亲合力比掩蔽部分被切割后条件活性抗体靶向的靶蛋白与条件活性抗体的结合亲和力和/或亲合力小，以便减少掩蔽部分对所期望的与靶标的结合的干扰。因此，掩蔽部分优选为具有以下特性的掩蔽部分：在掩蔽部分被切割之前，掩蔽部分掩蔽条件活性抗体使其不与靶标结合，但当掩蔽部分已从抗体切割下来之后，其不会实质上或显著干扰活性分子与靶标的结合或与靶标竞争。在具体的实施方案中，条件活性抗体和掩蔽部分不包含天然存在的结合配偶体对的氨基酸序列，这使得条件活性抗体和掩蔽部分中的至少一个不具有作为天然存在的结合配偶体成员的氨基酸序列。
或者，掩蔽部分可以不特异性结合条件活性抗体，而是通过非特异性相互作用(如空间位阻)干扰条件活性抗体-靶标的结合。例如，掩蔽部分可以被定位成使抗体的结构或构象允许掩蔽部分通过例如基于电荷的相互作用来掩蔽条件活性抗体，从而干扰靶标接近条件活性抗体。
在一些实施方案中，掩蔽部分通过共价结合连接到条件活性抗体。在另一个实施方案中，通过将掩蔽部分与条件活性抗体的n-末端结合，防止条件活性抗体与其靶标结合。在另一个实施方案中，通过掩蔽部分和条件活性抗体之间的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，条件活性抗体连接到掩蔽部分。
在某些实施方案中，条件活性抗体还与可裂解部分(cm)连接。cm能够被酶切割，或者cm能够被还原剂还原，或者cm能够被光解。在一个实施方案中，cm的氨基酸序列可与掩蔽部分重叠或包含在掩蔽部分内。在另一个实施方案中，cm在条件活性抗体和掩蔽部分之间。应当注意，cm的全部或一部分可以帮助在裂解之前掩蔽条件活性抗体。当cm被切割掉时，条件活性抗体与其抗原结合的活性增强。
cm可以是酶的底物，所述酶与靶抗原在个体的治疗部位共定位。或者或另外，cm可以具有半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，该二硫键可以由于对其进行的还原而断裂。cm也可以是可由光源激活的、对光不稳定的底物。
切割cm的酶应优先位于条件活性抗体的所期望的靶组织中，其中条件活性抗体在靶组织(如病变组织或肿瘤组织)提供的条件(异常条件)下更具有活性。例如，存在在许多癌症(例如实体瘤)中具有增加的水平的已知蛋白酶。参见例如laroccaetal,(2004)britishj.ofcancer90(7):1414-1421。这些疾病的非限制性实例包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、黑素瘤、sle、心血管损伤、局部缺血等。因此，可以选择合适的cm，其包含可被存在于肿瘤组织中的蛋白酶切割的肽底物，特别是与非癌性组织相比在肿瘤组织中以升高的水平存在的酶。
在一些实施方案中，cm可以是选自豆蔻质素、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mt1-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬酶、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa和psa的酶的底物。切割cm的酶在治疗部位的靶组织(例如患病组织或肿瘤组织；例如用于治疗性治疗或诊断治疗)中存在的水平与在非治疗部位的组织(例如在健康组织)中存在的水平相比相对较高。因此，抗体的条件活性在患病组织或肿瘤组织处活性更高，而且在患病组织或肿瘤组织中存在的酶可以切割cm，这进一步增强了条件活性抗体的活性或其缀合物的活性。未修饰或未切割的cm可以有效地抑制或掩蔽条件活性抗体的活性，使得条件活性抗体在正常组织中活性较低。抑制条件活性抗体在正常组织中的活性的双重机制(条件活性和掩蔽部分)使得可以使用高剂量的条件活性抗体，而不引起显著的不良反应。
在一些实施方案中，cm可以是选自下表1所列酶的酶的底物。
表1.示例性酶/蛋白酶
或者或此外，cm可以包括半胱氨酸对的二硫键，该二硫键可以通过诸如细胞还原剂的还原剂断裂，所述细胞还原剂包括谷胱甘肽(gsh)、硫氧还蛋白、nadph、黄素、抗坏血酸盐等，其可以大量存在于实体瘤的组织内或周围。
在一些实施方案中，条件活性抗体包含cm和掩蔽部分。在酶将cm切割掉时，解除对条件活性抗体的活性的掩蔽。在一些实施方案中，可能需要在抗体、掩蔽部分和cm之间插入一个或多个接头(例如柔性接头)以提供柔性。例如，掩蔽部分和/或cm可能没有包含足够数量的残基(例如gly、ser、asp、asn，特别是gly和ser，特别是gly)以提供所需的柔性。因此，引入一个或多个氨基酸以提供柔性接头可能是有益的。例如，被掩蔽的条件活性抗体可以具有以下结构(其中下式表示n-至c-末端方向或c-至n-末端方向的氨基酸序列)：
(mm)-l1-(cm)-(ab)
(mm)-(cm)-l1-(ab)
(mm)-l1-(cm)-l2-(ab)
环[l1-(mm)-l2-(cm)-l3-(ab)]
其中mm是掩蔽部分，ab是条件活性抗体；l1、l2和l3各自独立地且任选地存在或不存在，它们是包含至少一个柔性氨基酸(例如gly)的相同或不同的柔性接头；在环存在的情况下，由于在结构的n末端和c末端处或n末端和c末端附近的一对半胱氨酸之间存在二硫键，整个结构是环状结构的形式。
适用于本发明的接头通常是为掩蔽部分提供柔性以便于抑制条件活性抗体的活性的接头。这样的接头通常被称为柔性接头。合适的接头可以容易地选择并且可以具有任何合适的不同的长度，例如1个氨基酸(例如gly)到20个氨基酸、2个氨基酸到15个氨基酸、3个氨基酸到12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(gs)n、(gsggs)n和(gggs)n，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。示例性的柔性接头包括但不限于gly-gly-ser-gly、gly-gly-ser-gly-gly、gly-ser-gly-ser-gly、gly-ser-gly-gly-gly、gly-gly-gly-ser-gly、gly-ser-ser-ser-gly等。
wo2010081173a2中描述了用于掩蔽条件活性抗体活性的一些技术。
药物组合物
本发明提供至少一种组合物，其包括(a)条件活性生物蛋白；和(b)合适的载体或稀释剂。本发明还提供至少一种组合物，其包括(a)由本文所述的核酸编码的条件活性生物蛋白；和(b)合适的载体或稀释剂。所述载体或稀释剂可任选为(已知的)药学上可接受的载体或稀释剂。所述组合物可任选进一步包括至少一种化合物、蛋白或组合物。在一些实施方案中，条件活性生物蛋白为条件活性抗体。
条件活性生物蛋白可以是药学上可接受的盐的形式。药学上可接受的盐表示其在制药行业一般可以以治疗性蛋白的盐形式使用，包括例如钠盐、钾盐、钙盐等，普鲁卡因、二苄胺、乙二胺、乙醇胺、泛影葡胺、牛磺酸的胺盐等，以及酸加成盐如盐酸盐、碱性氨基酸等。
本发明进一步提供至少一种条件活性生物蛋白的制备方法或组合物，用于以治疗有效量给药以调节或治疗至少一种在细胞、组织、器官、动物或患者中与亲本分子相关疾病，和/或在相关疾病之前、之后或期间的本领域已知的和/或描述于本文中的相关疾病。因而，本发明提供诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中与野生型蛋白相关的疾病的方法，包括使细胞、组织、器官或动物接触或向其施以有效量的本发明的至少一种条件活性生物蛋白。该方法可任选进一步包括用有效量的本发明的0.001-50mg/kg的条件活性生物蛋白作用于细胞、组织、器官或动物。该方法可任选进一步包括采用至少选自下列模式中的一种进行接触或给药：肠外、皮下、肌肉、静脉、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、侧脑室、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹腔、胸腔内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜腔内、胸内、胎儿宫内、膀胱内、药丸(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮吸收。该方法可任选进一步包括在条件活性生物蛋白接触或给药之前、同时或之后，给药含有有效量的至少一种选自至少一种下列可检测标记或报告因子的化合物或蛋白的至少一种组合物：tnt拮抗剂、抗风湿药、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇消炎药(nsak)、止痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药物、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞毒性或其它抗癌药物、抗代谢药，如甲氨蝶呤或抗增殖剂。
本发明进一步提供至少一种条件活性生物蛋白用于诊断至少一种细胞、组织、器官、动物或患者中野生型蛋白相关疾病的方法，和/或在相关疾病之前、之后或期间的本领域已知的和/或描述于本文中的相关疾病。
药用载体部分由所施用的特定组合物来确定，以及通过用于给药的特定方法来确定。因此，有多种适合本发明药物组合物的试剂。可施用多种载体溶液，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的且一般不含杂质。这些组合物可通过常规的众所周知的杀菌技术进行灭菌。这些组合物可含有大约生理条件所需的药学上可接受的辅料，如ph调节和缓冲液、毒性调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些试剂中的条件活性生物蛋白的浓度可以有很大的不同，主要基于液体体积、粘度、体重等，按照选定的给药模式和病人的需求进行选择。
适于口服给药的试剂可包括：(a)溶液，如有效量的被包裹的核酸悬浮于稀释剂中，如水、盐水或peg400；(b)胶囊、袋装剂或片剂，各含有预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)在合适的溶液中的悬浮剂；以及(d)合适的乳剂。本发明的用于口服给药的药物组合物和制剂，可采用本领域众所周知的适当的和合适剂量的药用载体进行配制。此类载体能够使药物以单位剂量适合病人摄入形式进行配制，如片剂、丸剂、粉剂、锭剂、胶囊、液体、糖锭、凝胶剂、糖浆、膏剂、悬浮物等。如果需要，在加入合适的其它化合物之后，口服药物制剂可配制成固体赋形剂、任选地研磨产生的混合物和加工颗粒混合物，以得到片剂或锭剂的药芯。合适的固体赋形剂为碳水化合物或蛋白填料包括，例如，糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或钠羧甲基纤维素；及树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；及蛋白，例如，明胶和胶原蛋白。可加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，如海藻酸钠。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄蓍胶、微晶纤维素、洋槐、明胶、胶体二氧化硅、交联甲羧纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂，着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、滋润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上可接受的载体中的一种或多种。
本发明提供含有与适于制备悬浮液的赋形剂混合的条件活性生物蛋白的悬浮液。此类赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、胶黄蓍胶和胶洋槐悬浮剂，及分散或润湿剂，如自然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、环氧烷烃(alkyleneoxide)与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳乙烯-氧十六醇)、环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)。悬浮液也可包含一种或多种防腐剂，如乙基或正丙基对羟基苯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可调节制剂的重量摩尔渗透压浓度。
锭剂形式可包括有风味的活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶，以及含有在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等中的锭剂，除了活性成分之外，还含有本领域已知的载体。已知当口服给药条件活性生物蛋白时，必须使其免于被消化。这一般是通过将条件活性生物蛋白与可使其抵抗酸或酶的水解的组合物混合或将条件活性生物蛋白包裹于合适的抵抗载体如脂质体中而实现的。使蛋白免于被消化的方法是本领域众所周知的。药物组合物可被包裹，例如，在脂质体中，或在制剂中，使活性成分缓慢释放。
被包裹的条件活性生物蛋白，可单独地或与其它合适的成分组合制备气雾剂(例如，它们可被“雾化”)，通过吸入给药。气雾剂可被放入加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。适合的直肠给药试剂包括，例如，由栓剂基体包裹的核酸组成的栓剂。适合的栓剂基体包括天然或人工合成的甘油三酸脂或石蜡烃。此外，也有可能使用由被基质包裹的核酸的组合组成的明胶直肠胶囊，所述基质包括，例如液体甘油三酸脂、聚乙二醇和石蜡烃。
本发明的皮肤或局部给药组合物除了条件活性生物蛋白之外，还可包括乳膏、软膏、溶液或水凝胶制剂中的药学上可接受的载体和其它化合物，只要添加的成分不影响治疗性蛋白的给药。也可加入常规的药学上可接受的乳化剂、表面活性剂、助悬剂、抗氧化剂、渗透促进剂、填料、稀释剂和防腐剂。水溶性聚合物也可用作载体。
适合肠外(例如，通过关节内(关节中)、静脉、肌肉、皮内、腹膜内，及皮下途径)给药的制剂，包括水性和非水性的等渗无菌注射液，它可包含抗氧化剂、缓冲液、硫双二氯酚和使制剂与接受的血液等渗的溶质，以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的操作中，组合物可通过，例如静脉输液、口服、外用、腹膜内、膀胱内或鞘内给药。在一个方面，肠外给药模式是优选的给药含有条件活性生物蛋白的组合物的方法。所述组合物可方便地以单位剂量形式给药并可通过制药领域任何众所周知的方法来制备，例如，描述于“remington药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)”,mackpublishingco.eastonpa.,18thed.,1990。静脉给药制剂可含有药学上可接受的载体如无菌水或盐水，聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。还可参见和修改美国专利号4318905中的描述。
含有条件活性生物蛋白的包裹组合物制剂可存在于单剂量或多剂量密封容器中，如安瓶和小瓶。注射液和悬浮液可由前面描述的无菌粉末、颗粒和片剂制备得到。
本发明还提供至少一种条件活性生物蛋白组合物、装置和/或根据本发明用于诊断至少一种野生型蛋白相关疾病的给药方法。
本发明还提供含有至少一种条件活性生物蛋白和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。所述组合物可任选进一步包括有效量的至少一种选自至少一种可检测标记或报告因子，细胞毒性或其它抗癌药物，抗代谢药如甲氨蝶呤，抗增殖剂，细胞因子或细胞因子拮抗剂，tnf拮抗剂，抗风湿药，肌肉松弛剂，麻醉剂，非类固醇消炎药(nsaid)，镇痛药，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻滞剂，抗菌剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，合成代谢类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药物，兴奋剂，哮喘药物，β-受体激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物的化合物或蛋白。
本发明还提供含有至少一种本发明的条件活性生物蛋白的医疗装置，其中所述装置适于通过至少一种选自以下的模式接触或给药至少一种条件活性生物蛋白：肠外、皮下、肌肉、静脉、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、胎儿宫内、膀胱内、药丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮吸收。
在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，其含有在第一容器中的至少一种本发明的条件活性生物蛋白或其片段的冻干形式，以及任选的第二容器，其含有无菌水、无菌缓冲液或至少一种选自下组的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、苯基亚硝酸盐、苯氧乙醇、甲醛、三氯叔丁醇、氯化镁、烷基尼泊金酯(alkylparaben)、苯扎氯铵、苯乙铵氯、钠脱氢和硫柳汞或它们在稀释剂水溶液中的混合物。在一个方面，试剂盒中第一容器中的条件活性生物蛋白或特定部分或变体的浓度与第二容器的成分复原为浓度约0.1mg/ml至约500mg/ml。在另一个方面，第二容器进一步包括等渗剂。在另一个方面，第二容器进一步包括生理上可接受的缓冲液。在一个方面，本发明提供治疗至少一种野生型蛋白介导的疾病的方法，包括对有需求的患者施用试剂盒中的制剂，在给药前进行复原。
本发明还提供人类药用或诊断用的制品，其包括包装材料和含有溶液或冻干形式的至少一种本发明的条件活性生物蛋白的容器。该制品可任选地包括容器作为以下给药途径的装置或系统的组件，所述给药途径为：肠外、皮下、肌肉、静脉、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、胎儿宫内、膀胱内、药丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮吸收。
本发明还提供了本文所述的任何公开内容。
实施例1：用于温度突变的多壁检测(例如，96-孔检测)的概述
荧光底物被添加到多壁板的每一个孔中，在野生型或新的较低反应温度(例如，上述的37℃或25℃)下保持适当的时间。通过在荧光酶标仪中在适合的激发和发射光谱(例如，320nm激发/405nm发射)下测定荧光来检测荧光。测定相对荧光单位(rfu)。从野生型分子和质粒/载体转化的细胞中获得的上清液作为阳性和阴性对照。对每个样品，各反应温度下，以及阳性和阴性对照进行重复反应。
在较低的温度下有活性(例如，突变体在25℃有活性)，且在野生型温度下活性下降(例如，在37℃下活性下降10％、20％、30％、40％或更多)，因而活性比高于或等于约1.1或以上(例如，在25℃或37℃下的活性比(25℃/37℃)高于或等于1.1或以上)的突变体，可被视为推测的初级的温度敏感型命中物(hit)。然后采用相同的检测方法，重新筛选这些推测的初级的温度敏感型命中物，以验证任何初级的命中物。
实施例2：用于确定温度突变体活性的不同的检测方法(例如，14-ml检测)的概述
将鉴定为的温度敏感型初级命中物在14ml培养试管中表达，并在野生型(例如，37℃)和较低的温度(例如，25℃)下测定它们的酶活性。按照上述多壁法表达蛋白并纯化，除了表达是以不同的形式(14ml试管)中进行，而不是多壁(96-孔板)形式。
各突变体的上清液被转移至多壁板中，例如96-孔板。在指定的反应温度(野生型，较低温度)下向各管中加入荧光底物，保持所需的一段时间。野生型分子用作阳性对照，来自仅用载体转化的细胞的上清液用作阴性对照。通过在荧光酶标仪中在适合的激发和发射光谱(例如，320nm激发/405nm发射)下测定荧光来检测荧光。测定相对荧光单位(rfu)。对每个样品，各反应温度下，以及阳性和阴性对照进行重复反应。
在较低温度(例如，25℃)下有活性，但在野生型(例如，37℃)下显示出活性下降至少30％或以上，因而在较低温度(例如，25℃)下与在野生型温度(例如，37℃)下的活性比等于或高于1.5的突变体，被确定为是温度敏感型命中物。
将突变体在较低温度(例如，25℃)下的活性与野生型分子在野生型温度(例如，37℃)下的活性进行比较。如果分子较野生型分子在较低温度(例如，25℃)下的活性高(其表示为剩余活性＞1，优选为2或高于2)，并且如果突变体在野生型温度(37℃)下较野生型分子显示出总体的活性下降，可确定突变体的表型为温度敏感的突变体。
实施例3：所发现的命中物的进一步演变的概述
如果需要，由先前鉴定的所有的或筛选出的突变体命中物产生新的组合变体库。新的文库可被设计成含有各筛选突变体的每个可能的氨基酸变体的组合，并如前所述述重新筛选得到新的命中物。
实施例4：温度下降后酶活性的可逆性的概述
通过将突变体暴露于高温下然后返回到较低温度(例如，25℃)下，可进一步检测温度敏感的、演变的突变体，以确定酶活性在较低温度(例如，25℃)下是可逆的还是不可逆的。温度敏感的突变体表达于任何需要的形式中，例如前面所述的14ml培养试管中。检测突变体在几种条件下的活性，包括野生型温度(例如，37℃)以及其它温度，随后再暴露于必不可少的低温(例如，25℃)下。在较低温度下有活性，而在当温度上升或升至野生型温度时活性下降(即，在较低和较高温度下的活性比等于或大于1、1.5或2或更高)，并且当再次降至较低温度时显示出基线(baseline)活性的突变体，被评为“可逆型命中物”。在较低温度下有活性，而在当温度上升或升高至野生型温度时显示出活性下降(即，在较低和较高温度下的活性比等于或高于1、1.5或2或更高)，并且当温度再次下降至较低温度时活性显示出至少等量的下降的的突变体被评为“不可逆型命中物”。
实施例5：筛选条件活性血管抑素变体的材料和方法
筛选条件活性血管抑素变体的材料和方法可适用chiandpizzo,“在胞外低ph值下血管抑素对肿瘤细胞的直接细胞毒性：依赖于细胞表面相关的atp合酶的机制(angiosatinisdirectlycytotoxictotumorcellsatlowextracellularph:amechanismdependentoncellsurface-associatedatpsynthase)”,cancerres.2006；66(2):875-882。
材料。来自于人纤溶酶原的野生型血管抑素因子1-3，可从calbiochem(darmstadt,德国)获得并在无菌pbs中重新配制。直接作用于有催化活性的atp合酶β亚基的多克隆抗体可以制备得到，牛f1atp合酶亚基可如前述方法进行纯化(moser等人，“血管抑素结合人内皮细胞表面的atp合酶(angiostatinbindsatpsynthaseonthesurfaceofhumanendothelialcells)”,procnatlacadsciusa1999；96:2811-6；moser等人，“内皮细胞表面的fl-foatp合酶在atp合成中是有活性的并受到血管抑素的抑制(endothelialcellsurfacefl-foatpsynthaseisactiveinatpsynthesisandisinhibitedbyangiostatin)”,procnatlacadsciusa；2001；
细胞培养。a549(来自肺癌组织的人上皮细胞株)或其它癌细胞株(du145、lncap或pc-3细胞)可以从例如，atcc获得。人脐静脉内皮细胞(huvec)可以从人脐静脉中分离得到，如grant等人，“在分化中的内皮细胞以基质胶诱导胸腺素h4基因(matrigelinducesthymosinh4geneindifferentiatingendothelialcells)”,jcellsci1995；108:3685-94所述。huvec细胞可用来作为在细胞表面表达atp合酶的细胞系的阳性对照。细胞可培养于含有1％青霉素链霉素和10％血清替代培养基3(sigma,st.louis,mo)的dmem(lifetechnologies,carlsbad,ca)中，以尽量减少纤溶酶原的存在。低ph(6.7)培养基可通过在5％co2条件下减少碳酸氢钠至10mmol/l，并补充34mmol/lnacl以保持渗透压，或在17％co2条件下孵育22mmol/l碳酸氢钠培养基来制备。使用的降低ph的方法可根据试验限制和检测而不同。
流式细胞实验。为了保证atp合酶在肿瘤细胞株的细胞表面发挥功能，可采用流式细胞实验。例如，a549细胞株可培养于不同ph培养基(10、22和44mmol/l碳酸氢钠的dmem)中，在缺氧(0.5％o2、5％co2，n2平衡)与常氧(21％o2、5％co2)的条件下培养1、12、24、48和72小时。活细胞可以被封闭(block)，与抗β-亚基抗体孵育，洗涤、封闭，与羊抗兔fitc标记的二抗(southernbiotech,birmingham,al)孵育，再次洗涤，所有步骤于4℃下进行。碘化丙啶(bdbiosciences,sanjose,ca)可包含于所有样本中以区分出具有受损细胞膜的细胞。10,000个细胞fitc的平均荧光强度可通过facsccalibur流式细胞仪(bectondickinson,franklinlakes,nj)进行定量，摄入碘化丙啶的细胞可以被排除，以除去线粒体atp合酶在cellquest软件(bdbiosciences)中的检测。
细胞表面atp生成检测。96-孔板中的a549或1-ln细胞(每孔60,000个细胞)可加入新鲜的培养基并用血管抑素、血管抑素变体、抗β-亚基抗体、兔抗牛血清白蛋白igg(organonteknika,westchester,pa)、茋类化合物(piceatannol)(已知的atp合酶f1的抑制剂，用作阳性对照，sigma)处理，或单独将培养基置于37℃，5％co2中30分钟。然后细胞与0.05mmol/ladp孵育20秒。移走上清液，采用如(23)描述的celltiterglo发光检测(promega,madison,wi)检测产生的atp。细胞裂解液可进行类似的分析以确定细胞内的atp池在任何条件下无差异。可通过luminoskanascent(thermolabsystems,helsinki,finland)进行记录。基于为各独立试验确立的标准，数据以每个细胞atp的摩尔数来表示。
细胞增殖检测。血管抑素对癌细胞株的影响可用无血清培养基中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑盐、内盐(innersalt)(mts)增殖检测来评价。在37℃，5％co2中孵育20小时后，在存在或不存在血管抑素情况下，96-孔板的各孔中的相对细胞数可按照制造商的方案(protocol)采用aqueous单细胞增殖检测(promega)来测定。培养基的ph值可在5％co2条件下通过改变碳酸氢盐浓度来调节。
细胞的细胞毒性评估。为了量化细胞死亡和细胞裂解，从细胞质释放到上清液中的乳酸脱氢酶(ldh)的活性，可用细胞毒性检测试剂盒(roche,indianapolis,in)进行测定。用血管抑素、血管抑素变体，抗β-亚基抗体、兔igg、卡立泊来德(cariporide)和tritonx(用于透化细胞的去污剂)处理的癌细胞(例如a549细胞)(每孔5,000个细胞)可分别在37℃，5％co2或17％co2，，中性和低ph条件下孵育15小时。细胞毒性指数可用一式四份的处理样本的平均吸收度除以对应于相同ph培养基的一式四份的未处理样本的平均吸收度计算得到。细胞坏死和凋亡的评价。为了确定血管抑素诱导的细胞坏死模式，可进行组蛋白-dnaelisa。血管抑素、血管抑素变体、抗β-亚基抗体、兔igg和卡立泊来德(cariporide)对a549细胞的影响(每孔5,000个细胞)可采用elisa细胞凋亡和坏死检测(roche)来确定，该检测取决于核外组蛋白-dna片段的检测。细胞凋亡或坏死可分别由在含或不含试剂的条件下，在37℃孵育15小时之后一式四份的样本的细胞裂解液或上清液来确定。细胞凋亡或坏死指数可通过一式四份的处理样本的平均吸收度除以对应于相同ph值培养基的一式四份的未处理样本的平均吸收度来计算得到。培养基的ph值可由在5％co2或17％co2条件下进行孵育来调节。
细胞内ph值(phi)测定。phi可根据带有盖玻片的35mm微孔盘(mattek,ashland,ma)中细胞的荧光来测定。细胞可被置于细胞生长因子减少的、不含酚红的matrigel(bdbiosciences)中。过夜生长后，更换培养基，并向细胞中加入ph敏感的荧光染料csnarf(molecularprobes,eugene,or)，15分钟后置于新鲜的培养基中恢复20分钟。然后细胞被放入37℃，5％co2的显微镜载片台上1小时，收集发射光谱，从各含7个细胞和15个细胞之间的区域中计算得到phi(wahlml,grantds.“胞外ph值的微环境和胞外基质蛋白对血管抑素活性和胞内ph值的影响(effectsofmicroenvironmentalextracellularphandextracellularmatrixproteinsonangiostatin'sactivityandonintracellularph)”,genpharmacol2002；35:277-85)。在开始收集光谱时，从盘中去掉培养基，将细胞置于1ml含或不含ph抑制剂血管抑素、抗β-亚基抗体、兔igg或卡立泊来德(cariporide，一种钠氢交换抑制剂)的新鲜培养基中。培养基的ph值可在如上所述在固定的5％co2的条件下通过改变碳酸氢盐浓度来调节。
实施例6.演变抗体的轻链或重链
使用cpe分别演变抗体f1-10f10的重链和轻链。筛选轻链突变体以发现具有条件活性的26个轻链突变体，在这种情况下，突变体在ph6.0下比野生型更具有活性，并且突变体在ph7.4下比野生型活性低。26个轻链突变体在轻链中的8个不同位置具有突变。26个轻链突变体中的多于5个在所述8个位置中的3个位置出现突变。这3个位置被认为是轻链中的热点。筛选重链突变体以发现具有条件活性的28个重链突变体。28个重链突变体在重链的8个不同位置具有突变。28个重链突变体中的多于5个在所述8个位置中的3个位置处具有突变。这3个位置被认为是重链中的热点。通过elisa测定来证实轻链突变体和重链突变体的条件活性。
由该实施例产生的最佳条件活性抗体在ph6.0下的活性与在ph7.4下的活性具有17倍的差异。此外，许多条件活性抗体具有在正常生理ph7.4和异常ph6.0之间的ph下可逆的活性。有趣的是，当在5.0-7.4的ph范围内通过elisa测定测试条件活性抗体的活性时，由该实施例产生的大多数条件活性抗体在约5.5-6.5的ph下表现出最佳的结合活性。
使用全细胞的facs(荧光激活细胞分选)测定也证实了由本实施例产生的条件活性抗体的活性，其中cho细胞用于在ph6.0和ph7.4下表达抗体的抗原。将条件活性抗体加入cho细胞中以测量结合活性。facs测定证实了在用于测量条件活性抗体在ph6.0下相对于在ph7.4下的选择性的elisa测定的结果中的总趋势。
实施例7：在特殊缓冲液中选择条件活性抗体
对根据本发明通过演变步骤产生的突变抗体在正常生理ph7.4下进行测定，并在异常ph6.0下进行测定。使用包括在人血清中发现的碳酸氢盐的磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液进行两种测定。溶液中碳酸氢盐的浓度是人血清中碳酸氢盐的典型浓度，即生理浓度。使用不含碳酸氢盐的相同pbs溶液进行比较试验。
在本实施例中测量突变型抗体或条件活性抗体的结合活性的测定法为elisa测定法，该测定法按如下步骤进行：
1.elisa的前一天：使用100μl在pbs中的浓度为1μg/ml的抗体ab-aecdhistag(组氨酸标签)(2.08mg/ml)抗原对孔进行包被，
3.从用抗体ab-a-his抗原包被的96孔板中弹去缓冲溶液，并在纸巾上吸干。
4.将板用缓冲液n或pbs洗涤3次，
5.将板用200μl指定缓冲液在室温下封闭1小时，
6.根据布局将选择的cpe/cps突变体和野生型蛋白在指定的缓冲溶液中稀释至75ng/ml。缓冲溶液的ph设定为6.0或7.4(以下称为“指定缓冲溶液”)，
6.将缓冲液弹去，根据板的布局向每个孔中加入100μl的75ng/ml样品，
7.将板在室温下温育1小时，
8.将缓冲液从96孔板中弹去，并在纸巾上吸干，
9.根据布局将板用200μl的指定缓冲液总共洗涤3次，
10.在指定的缓冲溶液中以1:5000的稀释度制备抗flaghrp，根据布局向每个孔中加入100μlanti-flaghrp(辣根过氧化物)，
11.将板在室温下温育1小时，
13.将板用200μl的指定缓冲溶液洗涤3次，
14.将板用50μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)显色1.5分钟。
发现在含有碳酸氢盐的pbs缓冲溶液中的测定使条件活性抗体的选择的成功率显著更高。此外，使用含有碳酸氢盐的pbs缓冲溶液选择的条件活性抗体在ph6.0下的活性与ph7.4下的活性的比值往往高得多，从而提供明显更高的选择性。
进一步观察到，当在没有碳酸氢盐的pbs缓冲溶液中测试使用具有碳酸氢盐的pbs缓冲溶液选择的条件活性抗体时，条件活性抗体在ph6.0下的选择性相对于在ph7.0下的选择性显著降低，当将生理量的碳酸氢盐加入到该pbs缓冲溶液中时，相同的条件活性抗体的选择性得以恢复。
在另一个测定中，在添加了碳酸氢盐的krebs缓冲液中测试所选择的条件活性抗体。在该添加有碳酸氢盐的krebs缓冲液中也观察到ph6.0下的活性与ph7.4下的活性的比值较高。看起来这可能至少部分是由于在krebs缓冲溶液中存在碳酸氢盐。
当在pbs缓冲溶液中碳酸氢盐的浓度降低至低于其生理浓度的浓度时，观察到条件活性抗体在7.4的正常生理ph下的活性增加。观察到条件活性抗体在ph7.4的活性增加与pbs缓冲溶液中碳酸氢盐浓度的降低有关。
当在ph7.4下进行测定时，野生型抗体不受pbs缓冲溶液中不同的碳酸氢盐含量的影响，因为其活性在用于测试条件活性抗体的pbs缓冲溶液的所有碳酸氢盐浓度下保持相同。
实施例8：在不同缓冲液中选择条件活性抗体
将根据本发明的演变步骤产生的突变抗体在正常生理ph(7.4)和异常ph(6.0)下进行elisa测定。两种elisa测定使用不同的缓冲液进行，包括基于krebs缓冲液的具有牛血清白蛋白(bsa)的缓冲液和基于pbs缓冲液的具有碳酸氢盐和bsa的缓冲液。
所述elisa测定法按如下步骤进行：
1.elisa的前一天：使用100μl在包被缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液)中浓度为1μg/ml的抗体ab-aecdhistag(2.08mg/ml)抗原对孔进行包被，
2.从用抗体ab-a-his抗原包被的96孔板中弹去缓冲溶液，并在纸巾上吸干。
3.将板用200ul的20缓冲液洗涤3次，
4.将板用200μl的20缓冲液在室温下封闭1小时，
5.根据布局将突变体和嵌合体在20缓冲溶液中稀释至75ng/ml，
6.将缓冲液弹去，根据板的布局向每个孔中加入100μl的稀释样品，
7.将板在室温下温育1小时，
8.将缓冲液从96孔板中弹去，使用纸巾将板吸干，
9.将板用200μl的20缓冲液总共洗涤3次，
10.在20缓冲溶液中以1:5000的稀释度制备抗flagigghrp，向每个孔中加入100μl抗flagigghrp(辣根过氧化物)溶液，
11.将板在室温下温育1小时，
12.将板用200μl的20缓冲溶液总共洗涤3次，
13.将板用50μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)显色30秒。
与使用在不含碳酸氢盐的pbs缓冲溶液中的测定所选择的那些条件活性抗体相比，使用在具有碳酸氢盐的pbs缓冲溶液中的测定所选择的条件活性抗体显示在ph6.0下的活性与ph7.4下的活性的比值要高得多。此外，当与不含碳酸氢盐的pbs缓冲溶液中的测定相比时，添加有碳酸氢盐的krebs缓冲溶液也提供更高的ph6.0下的活性与ph7.4下的活性的比值。看来碳酸氢盐对于选择合适的条件活性抗体是重要的。
实施例9：在不同缓冲液中选择条件活性抗体
在该实施例中筛选了在ph6.0下较野生型抗体活性更高、且在ph7.4下较野生型抗体活性低的针对抗原的条件活性抗体。使用下表2和3中的缓冲液进行筛选步骤。表2中的缓冲液基于krebs缓冲液，添加的其他成分示于表2的第1列。
表2.基于krebs缓冲液的测定缓冲液
基于pbs缓冲液的添加有其他成分的一些测定缓冲液示于下表3中。请注意，表2和表3的缓冲液中的组分以1升缓冲液中加入的量(克)表示。但人血清的浓度为缓冲液的10wt％。
表3.基于pbs缓冲液的测定缓冲液
通过使用这些测定缓冲液的elisa测定进行筛选。如实施例7-8中所述进行elisa测定。使用10种测定缓冲液中的每一种选择的条件活性抗体表示于下表4中。od450吸光度与elisa测定中的结合亲和力负相关。
表4.使用不同的测定缓冲液所选的条件活性抗体(突变体)
使用缓冲液8和9证实了一些所择的条件活性抗体的选择性，并且发现它们在ph6.0下(相对于ph7.4)确实具有所需的的选择性，如图1所示。注意使用不同的缓冲液影响条件活性抗体的选择性。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种(a、an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此外，术语“一种(a、an)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。术语“包含”、“包括”、“具有”和“由…构成”也可以互换使用。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质如分子量、百分比、比例、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论术语“约”是否存在。因此，除非指出为相反，否则说明书和权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原理的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数应当至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中我们尽可能精确地报告列出的数值。然而，任何数值必然固有地包含某些误差，该误差是由在这些数值的各自的测试测量中发现的标准偏差导致的。
应当理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数应被解释为公开为单独使用或与一种或多种本文公开的每种其它组分、化合物、取代基或参数组合使用。
还应理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值的范围被解释为也与本文公开的任何其它组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值的范围相组合公开，因此为了本说明书的目的，用于本文公开的两种或多种组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值范围的任何组合也彼此组合地公开。
还应当理解，本文公开的每个范围应被解释为对具有相同数量的有效数字的公开范围内的每个具体值的公开。因此，1-4的范围应被解释为对值1、2、3和4的明确公开。还应当理解，本文公开的每个范围的每个下限应解释为结合对于相同的组分、化合物、取代基或参数的每个范围的每个上限和本文公开的每个范围内的每个具体值。因此，本发明被解释为对通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限或每个范围内的每个具体值组合或通过将每个范围的每个上限与每个范围的每个特定值结合而得到的所有范围的公开。
此外，在说明书或实施例中公开的组分、化合物、取代基或参数的具体量/值应解释为对一个范围的下限或上限的公开，因此可以与在本申请其他地方公开的针对相同组分、化合物、取代基或参数的一个范围的任何其他下限或上限或具体量/值组合以形成针对该组分、化合物、取代基或参数的范围。
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