从干细胞生成肌肉谱系细胞的制作方法

相关申请本申请要求于2015年4月22日提交的美国临时专利申请号62/151,352的权益，所述申请通过引用整体并入本文。背景卫星细胞为骨骼肌细胞的前体。在成人的肌肉中，卫星细胞通常是静息的(quiescent)，但可响应于疾病或机械应变如损伤或运动而激活并经历肌发生。卫星细胞还参与肌肉的正常生长。激活后，卫星细胞可以增殖。此外，这些卫星细胞中的一些可分化为成肌细胞，该成肌细胞可融合形成肌管和其他骨骼肌组分。成肌细胞还可通过与现有的肌管融合来增加现有的肌纤维。发育性和退行性的肌肉疾病和病症都可引起由于肌细胞减少或死亡而造成的肌肉功能的逐渐或突然丧失，以及由于发育性疾病造成的肌肉发育减少。先天性肌病是呈现这些特征的肌肉疾病的实例。肌肉损失还可由于衰老、疾病治疗或许多其他原因而发生。这些类型的肌肉损失的实例包括少肌症和恶病质。本领域需要针对各种类型肌肉损失的疗法。技术实现要素：本公开内容提供了人工产生的卫星细胞或卫星样细胞，以及制备这类细胞的方法，该卫星细胞或卫星样细胞可用于与包括疾病、病症和衰老在内的各种原因相关的肌肉损失的潜在疗法。该细胞还可用于筛选以鉴别对卫星细胞具有特定效果的药物。在一方面，提供了一种产生表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的方法，该方法包括提供在体外培养物中的多潜能干细胞，以及使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触直接导致表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞具有形成成肌细胞的潜力。在一些实施方案中，使体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触，从而直接导致所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，从而直接导致所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，所述方法包括在某个时间段内维持所述一种化合物在所述体外培养物中的浓度。在一些实施方案中，所述方法包括在某个时间段内维持所述两种或更多种化合物在所述体外培养物中的浓度。在一些情况下，所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的生成并非由核酸转染引起。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞作为与其他细胞分离的单细胞进行平板接种。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞与其他多潜能干细胞一起平板接种在单层内。在一些实施方案中，所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞的生成发生在单个步骤中。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞为人多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞为人胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞为人诱导多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞被遗传修饰。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞包含与遗传性肌肉疾病或病症相关的突变。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞被遗传修饰以校正患有遗传疾病或病症的受试者的表型。在一些实施方案中，至少一部分所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞为pax3/pax7/cd56细胞。在一些实施方案中，从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞。在一些实施方案中，所述超过五种表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞为超过10种表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞。在一些实施方案中，所述少于20天为少于15天。在一些实施方案中，至少一部分所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞为卫星样细胞。在一些实施方案中，至少一部分所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞为卫星细胞。在一些实施方案中，至少一部分所述表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞具有横截面积为至少约170μm2的核。在一些实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物包含tgf-β受体抑制剂。在一些实施方案中，所述tgf-β受体抑制剂为alk抑制剂。在一些实施方案中，所述tgf-β受体抑制剂为alk5抑制剂。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含血清或抗坏血酸。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含马血清。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含选自运铁蛋白、xav939、vegf、sb431542、成纤维细胞生长因子、bix01294、igf-1、头蛋白(noggin)、肌酸、pd169316、smo拮抗物和丁酸钠的化合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含wnt途径激活剂或gsk3β抑制剂。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含gsk3β抑制剂。在一些实施方案中，所述gsk3β抑制剂为chir99021或azd1080。在一些实施方案中，从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达myod、myog或myf5的细胞。在另一方面，提供了一种使人多潜能干细胞体外分化为能够形成成肌细胞的细胞的方法，该方法包括使所述人多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，其中所述两种或更多种化合物包含wnt途径激活剂和tgf-β受体抑制剂。在一些实施方案中，所述能够形成成肌细胞的细胞表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7。在一些实施方案中，所述wnt途径激活剂为gs3kβ抑制剂。在一些实施方案中，所述wnt途径激活剂以0.1μm至8μm之间的浓度存在，包括端点值。在一些实施方案中，所述gs3kβ抑制剂为chir99021或azd1080。在一些实施方案中，所述tgf-β受体抑制剂为alk5抑制剂。在一些实施方案中，所述tgf-β受体抑制剂为sb431542。在一些实施方案中，所述tgf-β受体抑制剂为a83-01。在一些实施方案中，所述tgfβ受体抑制剂以0.1μm至10μm之间的浓度存在，包括端点值。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞向能够形成成肌细胞的细胞的分化发生在单个步骤中。在一些实施方案中，使所述人多潜能干细胞与所述wnt途径激活剂和tgf-β受体抑制剂接触，wnt途径激活剂与tgf-β受体抑制剂之比至少为1:1。在一些实施方案中，使所述人多潜能干细胞与所述wnt途径激活剂和所述tgf-β受体抑制剂接触，wnt途径激活剂与tgf-β受体抑制剂之比至少为3:2。在一些实施方案中，所述接触发生10天或更短。在一些实施方案中，所述接触发生20天或更短。在任何上述实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含生长因子。在任何上述实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含fgf、igf或hgf。在任何上述实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含fgf2。在任何上述实施方案中，所述多潜能干细胞未与生长因子接触。在任何上述实施方案中，由所述方法产生的所述细胞不表达选自下组的一种或多种基因：myod、myog和myf5。在任何上述实施方案中，所述方法不包括细胞分选。在任何上述实施方案中，由所述方法生成的细胞中的至少约50％表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7。在任何上述实施方案中，由所述方法生成的细胞中的至少约90％表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7。在任何上述实施方案中，所述方法进一步包括在涂覆有细胞外基质的培养物表面上培养细胞。在一些实施方案中，所述细胞外基质包含层粘连蛋白。在一些实施方案中，所述细胞外基质包含选自下组的物质：层粘连蛋白111、层粘连蛋白211和层粘连蛋白521。在一些实施方案中，所述细胞外基质包含胶原蛋白。在一些实施方案中，该胶原蛋白为i型胶原蛋白。在任何上述实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物包含富亮氨酸重复序列激酶2(lrrk2)抑制剂。在一些实施方案中，所述lrrk2抑制剂为lrrk2-in-1。在任何上述实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物包含rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，所述rock抑制剂为y-27632。在一些实施方案中，所述rock抑制剂以0.1μm至10μm之间的浓度存在，包括端点值。在任何上述实施方案中，由所述方法生成的细胞可进一步分化以生成细胞群体，其中该细胞群体的至少50％由成肌细胞组成。在任何上述实施方案中，由所述方法生成的细胞可进一步分化以生成细胞群体，其中该细胞群体的至少50％形成肌管。在其他方面，本公开内容提供了通过本文描述的任何方法产生的细胞。在另一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞表达cd56/pax3。在另一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞表达cd56/pax7。在又一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞表达cd56、pax3和pax7。在又一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞表达pax3/pax7。在另一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞能够体外分化为成肌细胞。在另一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞能够体内分化为成肌细胞。在另一方面，本公开内容提供了采用任何上述实施方案的方法产生的细胞，其中所述细胞不会自然产生。在另一方面，提供了一种方法，其包括：(a)提供在体外培养物中的hla无效人多潜能干细胞；以及(b)使所述hla无效人多潜能干细胞分化为谱系定向hla无效细胞。在一些实施方案中，将所述谱系定向hla无效细胞或其衍生物引入有需要的受试者中。在一些实施方案中，所述hla无效人多潜能干细胞向所述谱系定向hla无效细胞的分化发生在单个步骤中。在一些实施方案中，所述谱系定向hla无效细胞为骨骼肌祖细胞。在一些实施方案中，所述谱系定向hla无效细胞能够形成成肌细胞。在一些实施方案中，所述谱系定向hla无效细胞为卫星细胞或卫星样细胞。在一些实施方案中，所述谱系定向hla无效细胞表达pax3、pax7、myod、mf20和cd56中的至少一种。在又一方面，提供了一种方法，其包括使多潜能干细胞与设计用于改变编码hla的基因组基因座的crispr酶接触，使得所述编码hla的基因组基因座不再产生功能性hla，由此生成hla无效多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞来源于人。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述hla无效多潜能干细胞分化为hla无效骨骼肌祖细胞。在一些实施方案中，所述hla无效骨骼肌祖细胞能够形成成肌细胞。在一些实施方案中，将所述crispr酶与两种或更多种指导rna一起引入，以删除所述编码hla的基因组基因座的一部分，这足以使得所述多潜能干细胞不再产生功能性hla。在一些实施方案中，将所述crispr酶与一种或多种指导rna一起引入，以产生所述编码hla的基因组基因座的突变，这足以使得所述多潜能干细胞不再产生功能性hla。在一些实施方案中，将所述crispr酶与一种或多种指导rna和与所述编码hla的基因组基因座相似或围绕hla的模板dna分子一起引入，以便诱导重组事件，这足以使得所述多潜能干细胞不再产生功能性hla。在一些实施方案中，所述crispr酶为cas9。在又一方面，提供了一种方法，其包括在促进hla无效多潜能干细胞分化为表达pax3和pax7的细胞的条件下培养所述hla无效多潜能干细胞，由此产生表达pax3和pax7的hla无效细胞。在一些实施方案中，培养所述hla无效多潜能干细胞的条件包括使所述hla无效多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，以促进所述hla无效多潜能干细胞分化为所述表达pax3和pax7的细胞。在一些实施方案中，所述培养hla无效多潜能干细胞的条件包括转染条件。在另一方面，提供了一种治疗患有肌肉缺陷的受试者的方法，其包括：(a)获得由上述实施方案的任一方法产生的细胞；以及(b)将所述细胞引入所述患有肌肉缺陷的受试者中。在一些实施方案中，所述肌肉缺陷由肌营养不良引起。在一些实施方案中，所述肌肉缺陷由杜氏肌营养不良引起。在一些实施方案中，所述肌肉缺陷由恶病质引起。在一些实施方案中，所述肌肉缺陷由少肌症引起。在一些实施方案中，通过上述实施方案的任一方法获得的细胞为卫星样细胞，其在被引入所述患有肌肉缺陷的受试者之前被移植在支架上。在一些实施方案中，在将所述细胞引入所述患有肌肉缺陷的受试者之后，所述患有肌肉缺陷的受试者不会对所述细胞产生显著的免疫应答。在一些实施方案中，向所述受试者提供的所述细胞的剂量基于所述受试者疾病的严重程度。在一些实施方案中，所述细胞的剂量足以引起所述受试者肌肉质量的增加。在一些实施方案中，将所述细胞引入所述患有肌肉缺陷的受试者包括将所述细胞注射至所述患有肌肉缺陷的受试者的手臂肌肉中。在一些实施方案中，将所述细胞引入所述患有肌肉缺陷的受试者包括将所述细胞注射至所述患有肌肉缺陷的受试者的腿部肌肉中。在一些实施方案中，所述细胞的剂量足以引起所述患有肌肉缺陷的受试者的腿部肌肉中肌肉质量的增加。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞来源于所述患有肌肉缺陷的受试者。在一些实施方案中，来源于所述患有肌肉缺陷的受试者的所述多潜能干细胞被遗传修饰以逆转与所述肌肉缺陷相关的表型。在另一方面，提供了一种细胞培养物，其包括：(a)具有形成成肌细胞的潜力的、表达cd56/pax3、cd56/pax7或pax3/pax7的细胞；(b)wnt途径激活剂；以及(c)tgf-β受体抑制剂。在另一方面，提供了一种筛选候选药剂的方法，其包括：(a)提供由任何上述实施方案的方法生成的一种或多种细胞，其中由所述方法生成的一种或多种细胞包含表型；(b)使由所述方法生成的一种或多种细胞与所述候选药剂接触；以及(c)检测所述候选药剂是否对所述表型有影响。在一些实施方案中，所述候选药剂对所述表型的影响为所述表型的减少或逆转。在一些实施方案中，所述候选药剂对所述表型的影响为所述表型的增强。在一些实施方案中，所述表型与所述一种或多种细胞中的突变相关。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞来源于患有肌肉缺陷的患者。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞来源于患有肌营养不良的患者。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞来源于患有杜氏肌营养不良的患者。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞来源于患有由恶病质或少肌症引起的肌肉缺陷的患者。在一些实施方案中，所述一种或多种多潜能干细胞已被遗传修饰以包含突变，该突变引起遗传疾病或病症或与遗传疾病或病症相关。援引并入本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用整体并入本文，其程度如同具体且单独指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。附图说明本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，附图中：图1是示出了根据本公开内容的实施方案生成并使用卫星细胞或卫星样细胞的方法的概述；图2是根据本公开内容的实施方案，hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞的分化过程和用途的方法的概述；图3是根据本公开内容的实施方案，从多潜能干细胞向肌管分化的四个阶段的图解；图4是根据本公开内容的实施方案，多潜能干细胞在一步过程中分化为卫星细胞或卫星样细胞的图解；图5是根据本公开内容的实施方案，用于人胚胎干细胞系(gen002)分化的分化培养基内的血清组分的比较的图解；图6是根据本公开内容的实施方案，用于人胚胎干细胞系(gen019)分化的分化培养基内的血清组分的比较的图解；图7是根据本公开内容的实施方案，用于人胚胎干细胞系(gen020)分化的分化培养基内的血清组分的比较的图解；图8是根据本公开内容的实施方案，gen002、gen019和gen020人胚胎干细胞系之间各种分化培养基内的血清组分中细胞计数的比较的图解；图9是根据本公开内容的实施方案，各种分化培养基中呈现卫星细胞样标志物的细胞的图解；图10是根据本公开内容的实施方案，卫星细胞或卫星样细胞经三次传代繁殖的图解；图11a是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的细胞的细胞计数的比较的图解。图11b是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的细胞的pax3表达的比较的图解。图11c是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的细胞的pax7表达的比较的图解；图12a是根据本公开内容的实施方案，在各种细胞外基质分子上生长的细胞中pax7表达的比较的图解。图12b是根据本公开内容的实施方案，在各种细胞外基质分子上生长的细胞的细胞计数的比较的图解；图13a是根据本公开内容的实施方案，在存在或不存在lrrk2抑制剂lrrk2-in-1的情况下生长的细胞的细胞计数的比较的图解。图13b是根据本公开内容的实施方案，在存在或不存在lrrk2抑制剂lrrk2-in-1的情况下生长的细胞的pax3表达的比较的图解；图14是根据本公开内容的实施方案，在存在或不存在lrrk2抑制剂lrrk2-in-1的分化培养基中生长的人胚胎细胞系(gen019和gen067)的比较的图解；图15a是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen019)中pax3表达水平的比较的图解。图15b是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen019)中pax7表达水平的比较的图解。图15c是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen015)中pax3表达水平的比较的图解。图15d是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen015)中pax7表达水平的比较的图解。图15e是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen02)中pax3表达水平的比较的图解。图15f是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen02)中pax7表达水平的比较的图解；图16a是根据本公开内容的实施方案，在各种激酶抑制剂的存在下生长的人胚胎干细胞系(gen019)中pax7表达水平的比较的图解。图16b是根据本公开内容的实施方案，在各种激酶抑制剂的存在下生长的人胚胎干细胞系(gen015)中pax7表达水平的比较的图解；图17a是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen019)的细胞数目(左图)和pax3-阳性细胞数目(右图)的比较的图解。图17b是根据本公开内容的实施方案，在各种分化培养基中生长的人胚胎干细胞系(gen019)中pax3-阳性细胞百分比(左图)和pax3表达水平(右图)的比较的图解；图18是根据本公开内容的实施方案，在存在或不存在rock抑制剂的情况下生长的人胚胎干细胞系(gen019和gen067)的细胞计数的比较的图解；图19是根据本公开内容的实施方案，与小鼠成肌细胞系(c2c12)共培养的卫星样细胞的体外肌管形成的图解；图20是根据本公开内容的实施方案，来自人胚胎干细胞系(gen015)的i类hla上感兴趣区域的实例的图解；以及图21是由根据本公开内容的实施方案设计的指导rna(grna)靶向的人胚胎干细胞系(gen015)的hla-a外显子6区域的实例的图解。具体实施方式i.概述a.综述本公开内容突出了用于将多潜能干细胞分化为卫星样细胞的独特方法，该卫星样细胞是与卫星细胞类似的肌肉谱系细胞，并且可具有产生成肌细胞和其他肌细胞以及肌肉纤维的潜力。该方法大体涉及使多潜能干细胞与一种或多种介导细胞向卫星样细胞分化的化合物接触。该方法通常涉及一步过程，因此往往是高效的。在一些情况下，该一步过程包括使人多潜能干细胞与包含两种化合物(例如，wnt途径激活剂和tgf-β受体抑制剂)的分化培养基接触，该分化培养基使多潜能干细胞沿着肌肉分化途径行进并导致卫星样细胞的产生，通常是通过调节与卫星细胞相关的基因如pax3、pax7和/或cd56。该方法可产生高产率的卫星样细胞(特别是与起始多潜能干细胞的数目相比)，在这种意义上，该方法也可能是高效的。临床上，卫星样细胞在许多情况下可能非常有用，该情况包括治疗患者，如患有由多种原因导致的肌肉退行性疾病或病症的患者，这些原因包括但不限于遗传疾病、散发性疾病、恶病质、肌肉劳损、肌肉损伤、肌肉萎缩以及少肌症和一般老化过程。本文提供的卫星样细胞可用于这类患者的细胞疗法，特别是用于补偿或补充患者天然存在的卫星细胞的疗法。在这样的细胞疗法中，可将卫星样细胞注射到患者的部位，如肌肉部位，并且它们可继续在患者体内形成后期肌细胞(例如，成肌细胞)。成肌细胞可彼此融合或与患者天然存在的成肌细胞融合，并在患者体内形成肌管和功能性骨骼肌组织。因此，患者可经历肌肉张力或功能的改善，包括肌力改善。在一些情况下，出于美容、运动或其他目的而试图加强肌肉张力或功能的受试者可从本公开内容提供的方法和组合物受益。在一些情况下，所述方法可涉及利用衍生自遗传修饰细胞的卫星样细胞(或者甚至是被直接遗传修饰的卫星样细胞)来治疗受试者。例如，可从患有遗传疾病(例如，亨廷顿病、脊髓性肌萎缩、杜氏肌营养不良等)的受试者分离分化的细胞。然后，可使分化的细胞经受成为多潜能干细胞(例如，成为诱导多潜能干细胞)的条件。为了拯救或改善疾病状况，可对多潜能干细胞进行遗传修饰或改变。然后，这些遗传修饰的多潜能细胞可分化为卫星细胞或卫星样细胞，将该卫星细胞或卫星样细胞移植至受试者中以减少疾病或病症的影响。与来源于不同受试者的细胞相比，这些细胞可能不太可能引起受试者中的免疫应答。在另一实例中，卫星细胞或卫星样细胞可由被修饰成使人白细胞抗原(hla)编码区失效(以便产生hla无效人多潜能干细胞)的人多潜能干细胞分化。然后，hla无效人多潜能干细胞可分化为可用于细胞疗法的hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞。由于该细胞可能能够完全或部分地逃避受试者的免疫应答，因此它们可能是特别有益的。本文提供的卫星样细胞(包括衍生自经遗传修饰或未修饰的多潜能干细胞的细胞)还可用于药物筛选试验，特别是用于鉴别用于改善肌肉缺陷的药剂的试验。该细胞还可用于疾病建模和其他类型的疾病研究。在一些情况下，卫星细胞或卫星样细胞可由被遗传修饰成具有导致人类遗传疾病的相同或基本相似的突变的人多潜能干细胞分化。然后，这样的卫星细胞或卫星样细胞可筛选逆转或减少突变影响的药剂。可使这些细胞进一步分化为成肌细胞和肌管，以研究疾病或病症，或进行药物筛选。b.通用方法本公开内容提供了用于产生、培养和储存卫星细胞或卫星样细胞的方法和组合物，该卫星细胞或卫星样细胞具有产生其他卫星细胞或卫星样细胞的能力或分化为骨骼肌细胞以形成功能性骨骼肌的能力。本公开内容进一步描述了从所述卫星细胞或卫星样细胞(例如，成肌细胞，肌管)分化的细胞，其制备及其储存。分化过程的一般概述如图1所示。这些步骤可以以任何顺序包括：获得多潜能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞(100)。在一些情况下，从来自患者的分化细胞获得诱导多潜能干细胞。在一些情况下，多潜能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞)被遗传修饰。该步骤还可包括使多潜能干细胞与一种或多种化合物接触，以使细胞分化为(例如，通过化学分化)卫星细胞或卫星样细胞(110)；鉴别卫星细胞或卫星样细胞(120)；以及任选地储存该细胞(130)。在这些步骤之间可穿插有用于维持细胞的步骤，包括培养或扩展细胞。此外，细胞的储存可在该过程的许多步骤之后发生。进一步地，图1可任选地包括在鉴别卫星细胞或卫星样细胞(120)之后的纯化步骤。在一些情况下，本文公开的方法包括一个或多个纯化步骤，如涉及从细胞群体的其余细胞中分选具有特定表型的细胞的步骤。在一些情况下，本文公开的方法不包括纯化步骤。在一些情况下，该方法不包括分选细胞。在一些情况下，所述卫星细胞或卫星样细胞经历使其能够生成肌肉谱系中的进一步分化的细胞(例如，成肌细胞或肌管)的条件。特别地，所述卫星细胞或卫星样细胞可体外分化为成肌细胞和肌管(150)。在一些情况下，所述卫星细胞或卫星样细胞可体内分化。所述卫星样细胞可用于许多情况，如治疗用途或其他用途(140)。这些用途的实例包括细胞疗法、发育研究、疾病建模和药物筛选活动。在细胞疗法的一些实例中，可将卫星细胞或卫星样细胞移植至受试者(例如，患者)中，然后该卫星细胞或卫星样细胞可体内分化为其他肌肉谱系细胞，如成肌细胞和肌管(160)。移植的细胞还可体内倍增以产生额外的卫星细胞或卫星样细胞。移植的细胞(或由其衍生的细胞，如成肌细胞)可与宿主成肌细胞体内融合，以形成包含来自移植细胞(或移植衍生的细胞)和宿主细胞的细胞核的杂合肌管。在一些情况下，移植的卫星细胞或卫星样细胞(或由其衍生的细胞)可以其他方式促进肌肉生长，如通过分泌因子或提供机械支持。在一些情况下，移植的细胞或其分泌的因子可通过减轻炎症反应来保护肌肉。在一些情况下，移植的细胞是由从不同受试者获得的细胞产生的细胞。在一些情况下，受试者接受来源于最初从受试者获得的细胞样品的移植细胞。在一些情况下，从受试者获得的细胞样品包含被诱导形成诱导多潜能干细胞的分化细胞(例如，成纤维细胞，血细胞)。该诱导多潜能干细胞可被遗传修饰，例如，以校正表型。在一些情况下，所述卫星细胞或卫星样细胞体外分化为成肌细胞和/或肌管。然后，该成肌细胞和/或肌管可用作细胞疗法(例如，通过将细胞引入受试者中)、作为用于药物筛选试验的平台或用于其他目的。在另一实例中，卫星细胞或卫星样细胞可由被修饰成使人白细胞抗原(hla)编码区失效(以便产生hla无效人多潜能干细胞)的人多潜能干细胞分化而成。然后，hla无效人多潜能干细胞可分化为hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞。hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞可通过化学分化、通过使与卫星细胞或卫星样细胞相关的遗传标志物强制表达，或通过本领域已知的任何其他分化过程，从分化程度较低的细胞(例如，多潜能干细胞、多能干细胞、肌肉谱系限制性祖细胞)产生。可通过将编码蛋白质的表达载体引入细胞中、用重组病毒转导细胞、将感兴趣的外源性纯化多肽引入细胞中、将编码感兴趣多肽的外源性纯化mrna引入细胞中、使细胞与诱导感兴趣标志物(例如，pax3、pax7或cd56)表达的非天然存在的试剂接触，或用于诱导编码感兴趣多肽的基因的表达的任何其他生物、化学或物理过程来实现强制表达。图2示出了将hla无效多潜能干细胞分化为hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞的一些基本步骤。这些步骤可包括：获得多潜能干细胞，例如胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞(200)；使至少一个hla基因座(210)失效；例如通过化学分化使该细胞分化为表达多肽如pax3、pax7或cd56的细胞(220)；鉴别卫星细胞或卫星样细胞(230)；以及任选地储存该细胞(240)。在这些步骤之间可穿插有维持细胞的步骤，包括培养或扩展细胞。此外，细胞的储存可在该过程中的许多步骤之后发生。进一步地，图2可任选地包括在鉴别卫星细胞或卫星样细胞(230)之后的纯化步骤。在一些情况下，本文公开的方法包括一个或多个纯化步骤，如涉及从细胞群体的其余细胞中分选具有特定表型的细胞的步骤。在一些情况下，本文公开的方法不包括纯化步骤；在一些情况下，该方法不包括分选细胞。在一些情况下，hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞经历使其能够生成肌肉谱系中进一步分化的细胞(例如，成肌细胞或肌管)的条件。特别地，hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞可体外分化形成成肌细胞和肌管(260)。在一些情况下，hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞可移植至受试者(例如，患者)中，然后可体内分化为肌肉谱系细胞如成肌细胞和肌管(270)。移植的细胞还可体内倍增以产生额外的卫星细胞或卫星样细胞。此外，移植的hla无效卫星细胞或移植的hla无效卫星样细胞可逃避受试者的免疫应答(280)。移植的hla无效卫星细胞或移植的hla无效卫星样细胞还可在与宿主成肌细胞体内融合后通过展示出宿主hla抗原来逃避自然杀伤细胞反应。在一些情况下，卫星细胞或卫星样细胞体外分化为成肌细胞和/或肌管。然后成肌细胞和/或肌管可用作细胞疗法(例如，通过将细胞引入受试者中)、作为药物筛选试验的平台或用于其他目的。在其他实例中，卫星细胞或卫星样细胞可由疾病特异性多潜能干细胞分化而成，该多潜能干细胞例如是被鉴别为携带与遗传疾病或病症相关的突变的胚胎干细胞，或这样的诱导多潜能干细胞：其(a)从具有遗传突变的受试者获得，或(b)被遗传改变以携带遗传突变。然后可使这些疾病特异性干细胞分化为疾病特异性卫星细胞或卫星样细胞。疾病特异性卫星细胞或卫星样细胞可用于药物筛选和其他临床应用。ii.细胞的制备a.多潜能干细胞、多能干细胞和能够分化为卫星细胞或卫星样细胞的其他细胞在一些情况下，卫星细胞或卫星样细胞通过多潜能干细胞、多能干细胞或谱系定向细胞(如肌肉谱系定向的)的分化产生。多潜能干细胞通常具有分化为所有三种胚层(即，外胚层、中胚层和内胚层)的细胞的能力，而多能干细胞可发育成超过一种细胞类型，但与多潜能干细胞相比更加有限。多潜能干细胞有各种来源，但通常多潜能干细胞衍生自胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。多能干细胞可来源于各种来源，包括新生儿脐带血或从产后组织分离的细胞。在一个实例中，本文提供的方法可用于将间充质多能干细胞或肌肉谱系限制性祖细胞分化为卫星细胞。可分化为卫星细胞或卫星样细胞的细胞实例优选来自人类受试者，但也可来源于非人类受试者，例如非人哺乳动物。非人哺乳动物的实例包括但不限于非人灵长类动物(例如，猿、猴、大猩猩)、啮齿动物(例如，小鼠，大鼠)、牛、猪、羊、马、狗、猫或兔。胚胎干细胞(esc)可从受精后约4至5天的胚泡的内细胞团中分离，并以多潜能性和自我更新为特征。因此，esc可以以未分化状态无限期地繁殖。esc还可从已经在培养中繁殖无限定期限的先前分离的细胞获得。esc可从基因型为雄性或雌性的胚泡获得。esc可采用孤雌生殖从未受精卵获得。在进一步的实例中，esc可通过使用体细胞核转移(scnt)获得，或者可能是经历了scnt的细胞的后代。可从具有多种疾病状态的受试者收集esc。可从没有不良健康状况的胚胎收集该细胞。在其他情况下，胚胎可能通过植入前遗传学诊断(pgd)而被鉴别为具有升高的发展出疾病或病症的风险，所述疾病或病症例如肌肉退行性疾病，如肌营养不良、亨廷顿病、1a型分区蛋白缺乏、线状体肌病和脊髓性肌萎缩(sma)。肌营养不良的实例包括becker型、先天性、面肩胛肱型(fsh)、肌强直性(i型和ii型)、眼咽型、远端型、强直性肌肉营养不良、杜氏肌营养不良、肢带营养不良以及emery-dreifuss型肌营养不良。杜氏和becker型肌营养不良由位于x染色体上的基因的突变引起，并且主要影响雄性，尽管雌性有时也可能有严重症状。此外，大多数类型的肌营养不良是在包括心脏、胃肠系统、神经系统、内分泌腺、眼睛和大脑在内的身体系统中有临床表现的多系统病症。可从多种细胞类型诱导出诱导多潜能干细胞(ipsc)。合适的细胞群体的实例包括但不限于成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、血细胞、外周血淋巴细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、口腔角质形成细胞、毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。诱导多潜能干细胞还可来自许多不同类型的组织，例如骨髓、皮肤(例如，真皮、表皮)、肌肉、脂肪组织、外周血、包皮、骨骼肌或平滑肌。该细胞还可来源于新生组织，包括但不限于：脐带组织(例如，脐带、脐带血、脐带血管)、羊膜、胎盘或其他各种新生组织(例如，骨髓液、肌肉、脂肪组织、外周血、皮肤、骨骼肌等)。诱导多潜能干细胞、多能细胞或谱系定向细胞可来源于雄性或雌性受试者。该细胞可来源于在出生(包括剖腹产)到死亡的时间段内从受试者收集的新生组织或产后组织。在一些情况下，诱导多潜能干细胞来源于衰老的受试者，包括经历早衰的受试者。在一些情况下，该组织可来自>10分钟、>1小时、>1日、>1个月、>2个月、>6个月、>1岁、>2岁、>5岁、>10岁、>15岁、>18岁、>25岁、>35岁、>45岁、>55岁、>60岁、>65岁、>70岁、>75岁、>80岁、<80岁、<70岁、<60岁、<50岁、<40岁、<30岁、<20岁或<10岁的受试者。该受试者可为新生儿。在一些情况下，该受试者为儿童或成年者。在一些实例中，该组织来自2小时、5小时、10小时或20小时龄的人。在其他实例中，该组织来自1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或12个月龄的人。在一些情况下，该组织来自1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、18岁、20岁、21岁、23岁、24岁、25岁、28岁、29岁、31岁、33岁、34岁、35岁、37岁、38岁、40岁、41岁、42岁、43岁、44岁、47岁、51岁、55岁、61岁、63岁、65岁、70岁、77岁或85岁的人。ipsc、多能细胞或谱系定向细胞可收集自或来源于具有多种疾病状态的受试者，包括本文描述的任何受试者或患者。该细胞可从没有不良健康状况的受试者收集。在其他情况下，该受试者患有或存在患上疾病或病症的风险。在一些情况下，该受试者患有或存在患上肌肉退行性疾病或病症的风险，所述疾病或病症如本文描述的肌肉缺陷疾病(例如，肌营养不良如杜氏肌营养不良)或肌肉衰退或萎缩。在一些情况下，该受试者患有或存在患上遗传疾病或病症的风险；在这种情况下，本文提供的方法可用于治疗或改善该疾病或病症。该受试者还可患有其他疾病或病症，例如慢性健康状况，如心血管疾病、眼病(例如，黄斑变性)、听觉疾病(例如，耳聋)、糖尿病、认知障碍、精神分裂症、抑郁症、双相型障碍、痴呆、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、骨质疏松症、肝病、肾病、自身免疫性疾病、关节炎或增生性病症(例如，癌症)。在某些情况下，受试者提供细胞以供其将来使用(例如，自体疗法)，或供用于可能需要使用细胞的另一受试者，如用于治疗或疗法(例如，异体基因疗法，allogeneictherapy)。在一些情况下，供体和受体是免疫组织学相容的或hla匹配的。可通过将分化的细胞调节回多潜能性来获得ipsc。此外，可从包含单细胞或细胞群体的样品获得ipsc。该群体可以是同质或异质的。该细胞可以是在人细胞样品例如活检或血液样品中发现的细胞群体。通常，该细胞为体细胞。该细胞可为细胞系。在一些情况下，该细胞衍生自与其他细胞融合的细胞。在一些情况下，该细胞不是衍生自与其他细胞融合的细胞。在一些情况下，该细胞不是衍生自与其他细胞人工融合的细胞。ipsc的产生可通过强制多肽表达，特别是在维持或调节胚胎干细胞的自我更新和/或多潜能性中发挥作用的蛋白质的表达来实现。这类蛋白质的实例为oct3/4、sox2、klf4、l-myc、n-myc和c-myc转录因子，所有这些都在胚胎干细胞中高度表达。此外，在一些实例中，在不使用c-myc、n-myc或l-myc或将会导致癌症的蛋白质的情况下制备ipsc细胞。强制表达可包括将编码感兴趣多肽的表达载体引入细胞中、用重组病毒转导细胞、将感兴趣的外源性纯化多肽引入细胞中、将编码感兴趣多肽的信使rna引入细胞中、使细胞与诱导编码感兴趣多肽的内源基因(例如，oct3/4、sox2、klf4或c-myc)表达的非天然存在的试剂接触，或用于诱导编码感兴趣多肽的基因(例如，内源基因oct3/4、sox2、klf4或c-myc)的表达的任何其他生物、化学或物理手段。在另外的实例中，可使用诱导多潜能性的微rna(mirna)法或基因敲减法(knockdown)产生ipsc。ipsc的产生还可通过导致多潜能性标志物表达和形成分化细胞如中胚层的能力的其他方法来实现。诱导多潜能干细胞、多能细胞或谱系定向细胞可来自非胚胎组织，例如处于胚胎期之后的发育期的胚胎组织。在其他情况下，该细胞可来源于胚胎。在一些情况下，该细胞可来自处于胎儿期之后的发育期的组织。在其他情况下，该细胞可来源于胎儿。多潜能干细胞(例如，esc，诱导多潜能干细胞)、多能细胞或谱系定向细胞优选来自人类受试者，但也可来源于非人类受试者，例如非人哺乳动物。非人哺乳动物的实例包括但不限于非人灵长类动物(例如，猿、猴、大猩猩)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、牛、猪、羊、马、狗、猫或兔。所述细胞群体可包含分化细胞和未分化细胞。在一些情况下，该群体主要包含分化细胞。在其他情况下，该群体主要包含未分化细胞，例如，未分化的干细胞。在一些实例中，可将群体内的未分化细胞诱导为多潜能性或多能性。在一些情况下，将细胞群体内的分化细胞诱导为多潜能性或多能性。在另外的实例中，所述细胞群体可包含未分化的干细胞或幼稚干细胞。在一些情况下，未分化的干细胞是尚未经历表观遗传灭活修饰的干细胞，该表观遗传灭活修饰通过由于以下基因中至少四种基因、至少三种基因、至少两种基因、至少一种基因的dna甲基化或组蛋白修饰或并非由于所述基因的dna甲基化或组蛋白修饰造成的异染色质形成而进行：nanog、oct3/4、sox2和tert。这类基因例如tert、nanog、oct3/4或sox2的活化或表达可在从存在于人出生后组织中的未分化干细胞诱导出人多潜能干细胞时发生。用于鉴别候选多能或多潜能干细胞集落的形态学特征包括但不限于相对于周围细胞的更圆、更小的细胞大小和高核质比。候选诱导细胞的大小可为约5μm至约10μm；约5μm至约15μm；约5μm至约30μm；约10μm至约30μm；或约20μm至约30μm。在一些实例中，高核质比可为约1.5:1至约10:1，例如约1.5:1；约2：1；约3：1；约4：1；约5：1；约7：1；约8：1；约9.5：1；或约10：1。在一些情况下，诱导的细胞克隆显示出相对于es细胞扁平的形态。例如，衍生自外周血细胞或无饲养培养基中培养的细胞的候选诱导细胞可展现出与周围细胞相比扁平的形态。用于鉴别诱导细胞克隆的另一种形态学特征是在亲本细胞之间(例如，成纤维细胞之间)的空间内形成小单层集落。用于鉴别候选多能或多潜能干细胞的基因表达特征包括但不限于多潜能性标志物表达(例如，oct4、nanog、ssea-4、tra1-60)、全基因表达谱的表征(例如，pluritest，müller等人,2011)和另外的幼稚hesc标志物的表达。由于诱导多潜能干细胞，像胚胎干细胞也能够自我更新，因此这类细胞还可从已经在培养中繁殖无限定期限的先前分离的细胞获得。b.多潜能或多能干细胞通过crispr酶的遗传修饰可对多潜能干细胞(例如，esc、ipsc)或多能干细胞进行遗传修饰，并且可分离、培养并使用由此产生的细胞以产生具有所需基因型的分化细胞。这样的修饰可包括通过使多潜能干细胞与以下物质接触来改变多潜能干细胞(或其他细胞类型)的基因组基因座：(a)与rna分子相互作用的核酸酶(例如，成簇的规律间隔的短回文重复序列酶(crispr))；和(b)rna分子。这样的rna分子可包括crispr-rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)或嵌合cr/tracrrna(称为“指导rna”或“grna”)。crispr酶在基因组中与这些rna分子的区域相同或高度相同的位点处产生切口或双链断裂。crispr酶的实例包括但不限于cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cas9、csn2、csn4或cas10。在特别优选的实施方案中，该crispr酶为生成双链断裂的cas9。由于双链断裂的不完全修复，crispr酶可诱导基因组中的突变。将两端连接而无需同源模板的非同源末端连接(nhej)可导致使基因产物无功能的插入/缺失突变。双链断裂还可通过同源性指导的修复过程来解决，其中双链断裂诱导在断裂位点附近的序列与在第二个dna分子上的相似或相同序列的重组。同源性指导的修复过程可用于将序列整合到基因组中。序列向基因组中的整合可用于中断感兴趣的基因。同源性指导的修复可用于诱导与导致基因截短或缺失的模板分子的重组。例如，如果提供了由编码没有间插序列的基因的5'和3'非翻译区的基因组区域组成的模板分子，则所得的重组产物将缺少该基因的任何编码序列。c.多潜能或多能干细胞中hla系统的遗传修饰hla系统由染色体6上的遗传基因座构成，这些基因座编码向免疫细胞呈递小多肽片段的多肽。hlai类多肽呈递来自细胞内的多肽，如由健康细胞产生的多肽，以及在细胞内的来自外源来源如病毒的多肽。hlai类多肽与表达cd8的t细胞相互作用，并可诱导免疫应答。hlaii类多肽呈递来自细胞外来源的短多肽。利用hlaii类多肽呈递抗原的一些细胞包括树突细胞、巨噬细胞和b淋巴细胞。编码hla系统组分的遗传基因座是高度可变的。每个个体在其细胞中均具有相同的等位基因组合，但这些等位基因可因人而异。接受来自具有不同hla等位基因组合的人的组织或器官移植的人存在增加的移植排斥风险。因此，hla基因座是移植前最常分型的遗传基因座之一。通过使用具有降低排斥风险的hla基因座的细胞，可改善使用来源于受治疗受试者以外的来源的干细胞的治疗。干细胞可在其hla基因座处被基因分型并与受试者相匹配以降低移植排斥的风险。例如，干细胞或其衍生的分化细胞可移植至受试者(例如，自体受试者，hla匹配的受试者)中以治疗疾病或状况。在优选的实例中，本文公开的方法包括产生不表达部分hla基因座的细胞，以便降低移植排斥的风险。一个或多个hla基因座可通过任何本领域已知的方法去除或灭活，包括遗传修饰策略、重组和其他方法。在一些情况下，可使多潜能干细胞与设计用于改变编码hla的基因组基因座的crispr酶接触，使得它们不再产生功能性hla，从而生成hla无效多潜能干细胞。使用cas9作为crisper酶可使hla基因座无功能。可将cas9与一种或多种grna一起引入以诱导使hla基因座无功能的突变。或者，可将cas9与两种或更多种grna一起引入以诱导hla基因座的缺失。在一个实例中，可将crispr酶——cas9与一种或多种指导rna以及与编码hla的基因组基因座具有相似性或围绕hla的模板dna分子一起引入，以便诱导足以使得多潜能干细胞不再产生功能性hla的重组事件。可将cas9与一种或多种grna以及一种或多种模板核酸一起引入以诱导重组事件。这样的重组事件可导致hla基因座的缺失。该重组事件还可通过删除部分hla基因座使得hla基因座不再能产生功能性hla多肽而导致hla基因座的失效。缺失的大小可有所不同。在一些实例中，缺失的区域可以较小。小缺失的实例包括产生早期终止密码子、诱导转录物降解或产生非功能性多肽的缺失。在其他实例中，可删除一个或多个必需外显子。在其他实例中，可删除整个基因。在进一步的实例中，可删除含有多于一个hla基因座的区域。因此，缺失的范围可广泛地为>5bp、>10bp、>20bp、>50bp、>100bp、>500bp、>1kbp、>5kbp、>10kbp、>20kbp、>50kbp、>100kbp、>500kbp、>1mbp、>2mbp或>3mbp。或者，这样的重组事件可导致序列向hla基因座中的整合，使其变得无功能(hla无效)。这样的突变、缺失或插入可靶向影响hla基因座表达或功能的启动子、转录因子或其他遗传基因座。可在“人源化”小鼠模型(“hu小鼠”)中测试hla无效多潜能干细胞。通过将人胎儿胸腺组织和同基因cd34+胎儿肝细胞联合移植至免疫缺陷型nod/scid小鼠中，hu小鼠显示出功能性的人免疫系统(lan,p.,tonomura,n.,shimizu,a.,wang,s.和yang,y.(2006).reconstitutionofafunctionalhumanimmunesysteminimmunodeficientmicethroughcombinedhumanfetalthymus/liverandcd34+celltransplantation.blood,108(2),487–92.)。与hla多潜能干细胞相比，hla无效多潜能干细胞通常具有降低的被小鼠排斥的几率。可通过检测hla无效畸胎瘤来证明免疫系统的成功逃避。d.用于引入携带疾病的突变的遗传修饰可在健康干细胞系中引入已知导致遗传疾病的突变。例如，可删除肌养蛋白基因或肌养蛋白基因的一部分，或一个或多个外显子，以便引起移码突变或以其他方式使基因变得无功能。在雄性或雌性干细胞系中，突变可以是杂合的或纯合的。所得的经修饰干细胞系可分化为卫星细胞或卫星样细胞，并进一步分化为成肌细胞或肌管。这些卫星细胞、卫星样细胞、成肌细胞或肌管可显示出由引入的突变引起的疾病相关表型。未遗传修饰的干细胞系可用作同基因对照，该同基因对照可能对药物筛选、疾病建模和疾病研究特别有用。e.用于拯救致病突变的遗传修饰可对多潜能干细胞、多能干细胞或其他类型的干细胞进行遗传修饰，然后在本文提供的方法中使用。在一些情况下，可对携带导致疾病或病症的一个或多个遗传突变的干细胞如干细胞系进行遗传修饰，以校正突变并由此减轻受试者所经历的疾病或病症。该遗传修饰可通过本领域已知的任何方法实现。在一些实例中，从患有影响受试者肌肉组织的遗传疾病或病症(例如，肌营养不良、杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩等)的受试者获得细胞(例如，血细胞、皮肤细胞)。然后，可使该细胞经受使其能够变成多潜能干细胞或多能干细胞的条件。例如，该细胞可经历去分化并变成诱导多潜能干细胞，特别是诱导多潜能干细胞系。可对多潜能干细胞(或细胞系)进行遗传修饰以校正突变。例如，受试者可在肌养蛋白(dmd)基因中具有一个或多个突变，并且可对来源于受试者的干细胞进行遗传修饰以校正这类突变或这类突变的一部分。可采用本文所述的方法使经修饰的多潜能干细胞分化为卫星样细胞或卫星细胞。然后，可将经修饰的卫星样细胞或卫星细胞引入患有遗传疾病或病症的受试者中，以便治疗或改善该病症的一些方面。iii.多潜能干细胞的培养在生成或获得多潜能干细胞之后，可扩展多潜能干细胞(例如，esc，ipsc)。例如，多潜能干细胞可在任何合适的培养基中培养和扩展。多潜能干细胞可在饲养细胞的存在下培养。例如，该细胞可在一层或一片鼠或人胚胎成纤维细胞(例如，经辐射或丝裂霉素处理的胚胎成纤维细胞)上培养。多潜能干细胞可在无饲养层的培养基中培养。这样的培养基可具有限定的内容物，其中纯化的组分以已知量添加。这样的培养基可具有未完全限定的内容物，如已经在其他细胞的存在下调节的培养基，其中这些细胞被去除，但由其衍生的多肽和其他分子保留在培养基中。可将多潜能干细胞平板接种并直接培养在组织培养级塑料上。或者，可将细胞平板接种并培养在涂覆的衬底上，例如涂覆有纤连蛋白、明胶、matrigeltm(bdbioscience)、细胞外基质、胶原蛋白或层粘连蛋白及其组合的衬底上。用于涂覆平板的物质的浓度可为约5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml或200μg/ml，或1mg/ml，或其他适当的浓度。在一些情况下，使多潜能干细胞在涂覆有细胞外基质的衬底上生长可增加向卫星样细胞群体分化的效率。在一些情况下，可使用未处理的培养皿。在一些情况下，多潜能干细胞可在涂覆有一种或多种以下物质的平板上生长：胶原蛋白，例如i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白、iv型胶原蛋白、v型胶原蛋白、vi型胶原蛋白、vii型胶原蛋白、viii型胶原蛋白、ix型胶原蛋白、x型胶原蛋白、xi型胶原蛋白、xii型胶原蛋白、xiii型胶原蛋白、xiv型胶原蛋白、xv型胶原蛋白、xvi型胶原蛋白、xvii型胶原蛋白、xviii型胶原蛋白、xix型胶原蛋白、xx型胶原蛋白、xxi型胶原蛋白、xxii型胶原蛋白、xxiii型胶原蛋白、xxiv型胶原蛋白、xxv型胶原蛋白、xxvi型胶原蛋白、xxvii型胶原蛋白或xxviii型胶原蛋白。在一些实例中，多潜能干细胞可在涂覆有层粘连蛋白，例如层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-221、层粘连蛋白-332/层粘连蛋白-3a32、层粘连蛋白-3b32、层粘连蛋白-311/层粘连蛋白-3a11、层粘连蛋白-321/层粘连蛋白-3a21、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-213、层粘连蛋白-423、层粘连蛋白-522、层粘连蛋白523或其组合的平板上生长。在一些情况下，多潜能干细胞在涂覆有i型胶原蛋白、层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-211或层粘连蛋白-521的平板上生长。合适的细胞培养容器包括例如35mm、60mm、100mm和150mm的细胞培养皿、6孔、12孔、96孔、384孔、1536孔的细胞培养板、微量滴定板和其他大小相当的细胞培养容器。可在rho或rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂的存在下维持多潜能干细胞以减少凋亡。当细胞经受苛刻处理如酶处理时，rock抑制剂可能是特别有用的。例如，gsk429286a(selleckchem；水溶性)、y-27632(calbiochem；水溶性)或法舒地尔(fasudil)(ha1077：calbiochem)的添加可用于培养本公开内容的多潜能干细胞。在一些情况下，gsk429286a、y-27632或法舒地尔的浓度为约100nm、500nm、1μm、2.5μm、5μm、10μm、15μm或20μm。多潜能干细胞可在补充有特定血清组分的培养基中培养。在一些实施方案中，该血清为胎牛血清(fbs)、人血清白蛋白、马血清、plt-max人血小板提取物、牛血清白蛋白或敲除型血清替代物。也可使用血清组分的混合物，例如，fbs与马血清、敲除型血清替代物与牛血清白蛋白、fbs与牛血清白蛋白(bsa)的混合物。可用于培养多潜能干细胞的一些代表性培养基包括但不限于：灵长类es培养基(reprocell,japan)、tesrtm(stemcelltechnologies)、stemprohescsfmtm、hesf9、mc-es、胚胎干细胞(es)培养基、mef调节的es(mc-es)、m2培养基(geneabiocells制造)或补充有10％fbs的dulbecco’smodifiedeagle培养基(dmem)。hesf9可包含：补充有肝素和以下四种蛋白质组分的hesf基础培养基：胰岛素、运铁蛋白、与油酸缀合的白蛋白和成纤维细胞生长因子-2(fgf-2)(10ng/ml)。此外，es培养基可包含：40％dulbecco’smodifiedeagle培养基(dmem)、40％f12培养基、2mml-谷氨酰胺、1x非必需氨基酸(sigma,inc.,st.louis,mo)、20％敲除型血清替代物tm(invitrogen，inc.,carlsbad,ca)和10μg/ml庆大霉素。mc-es培养基可如下制备。将es培养基在丝裂霉素c处理的鼠胚胎成纤维细胞(mef)上调节20至24小时，收获，通过0.45-μm过滤器过滤，并补充约0.1mmb-巯基乙醇、约10ng/mlbfgf或fgf-2和任选的约10ng/ml激活蛋白a。在一些情况下，使用经辐射的mef代替丝裂霉素c处理的mef。在其他情况下，使用sto(atcc)小鼠细胞系或人成纤维细胞代替mef。在一些情况下，多潜能干细胞可以较低的密度平板接种(或培养)，这可通过以约1:8至约1:3，例如约1:8、约1:6、约1:5、约1:4或约1:3分配细胞来实现。该细胞可以以约103个细胞/cm2至约104个细胞/cm2的密度平板接种。在一些实例中，该细胞可以以约1.5×103个细胞/cm2至约104个细胞/cm2、约2×103个细胞/cm2至约104个细胞/cm2、约3×103个细胞/cm2至约104个细胞/cm2、约4×103个细胞/cm2至约104个细胞/cm2或约103个细胞/cm2至约9×103个细胞/cm2的密度平板接种。在一些实施方案中，该细胞可以以大于104个细胞/cm2，例如约1.25×104个细胞/cm2至约3×104个细胞/cm2的密度平板接种。可在37℃、5％co2培养箱(例如，在大气氧气水平下)中在维持培养基中培养多潜能干细胞。或者，可在37℃、5％co2、5％o2培养箱(例如，在低氧条件下)中在维持培养基中培养多潜能干细胞，其中优选每天或每隔一天更换培养基。在一些实施方案中，为了培养和生长从未分化干细胞诱导的多潜能干细胞，优选在小鼠胚胎成纤维细胞涂覆的塑料培养皿或基质胶(matrigel)涂覆的塑料培养皿上在含有本文所述添加剂的培养基中每5至7天将细胞传代培养。用于诱导的细胞的维持培养基的实例包括任何和所有完全es细胞培养基(例如，mc-es)。维持培养基可补充有b-fgf或fgf2。在一些情况下，维持培养基补充有其他因子，例如igf-ii、激活蛋白a或本文所述的其他生长因子，参见例如bendall等人(2007),nature,30:448(7157):1015-21。在一些实施方案中，在根据形态特征鉴别和选择候选多能或多潜能干细胞集落之前，培养并观察诱导的细胞约14天至约40天，例如15、16、17、18、19、20、23、24、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38天，或约14天至约40天的其他时间段。在一些情况下，可在进行本文所述的分化方法之前，将多潜能干细胞培养约1天、2天、3天、4.5天、5天、6.5天、7天、8天、9天、10天或任何其他天数。在其他情况下，可将细胞培养超过12天，例如约12天至约20天；约12天至约30天；或约12天至约40天。在一些情况下，该细胞可无限期地培养。在一些情况下，可将细胞的等份冷冻，随后从冷冻的等份重新开始培养。可在分化之前将多潜能干细胞传代多次(例如，多于一次、多于五次或多于十次)。可通过将细胞的等份放入新鲜培养基中实现传代。这样的等份可以是细胞中的一部分，如细胞中的一半、细胞中的三分之一、细胞中的四分之一、细胞中的十分之一，或甚至是单细胞。这样的等份可来自细胞的冷冻储液。为了从单细胞开始培养，通常需要解离细胞。一种解离细胞的手段是通过用蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)处理。在分化之前，可将培养的多潜能干细胞解离成单细胞。这种解离可通过使其与蛋白酶如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶一起温育来实现。在一些情况下，在分化之前，未将培养的多潜能干细胞解离成单细胞。在一些情况下，可在约12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃、38℃、40℃、42℃或44℃的温度下培养多潜能干细胞。在一些情况下，可在约<1％、<2％、<3％、<4％、<5％、<6％、<7％、<8％、<9％或<10％co2和约<1％、<2％、<3％、<4％、<5％、<6％、<7％、<8％、<9％、<10％或<20％o2下培养多潜能干细胞。iv.分化过程a.概述在分化过程期间，特化程度较低的细胞变成特化程度更高的细胞类型。分化可影响细胞的一些方面，如细胞大小、形状和/或功能性能。这些变化主要是由于基因表达的受控修饰而引起的。在分化的一个实例中，多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。然后，针对表征卫星细胞或卫星样细胞的一些性质(例如，形态、基因表达)对分化的卫星细胞或卫星样细胞进行筛选。然后可将满足这些筛选标准的分化的卫星细胞或卫星样细胞亚克隆并扩展。图3是根据本公开内容的实施方案，从多潜能干细胞分化为肌管的四个阶段的图示。图3中的图310示出通过免疫荧光染色检测到的表达多潜能性标志物nanog的多潜能干细胞。此外，图3中的图320示出分化的第一阶段，其中多潜能干细胞已经化学分化为表达pax3/pax7的卫星细胞或卫星样细胞。图3中的图330示出分化的第二阶段，其中卫星细胞或卫星样细胞已分化为针对成肌细胞标志物myod被免疫荧光染色的成肌细胞。此外，图3中的图340示出分化的第三阶段，其中成肌细胞连接在一起以形成肌管，该过程通过肌管形成的标志物——肌养蛋白的免疫荧光染色来检测。b.多潜能干细胞向卫星细胞或卫星样细胞的化学分化为了使多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞，可从冷冻储液或生长中的培养物获得多潜能干细胞。这些多潜能干细胞可在化学化合物的存在下在基础培养基中培养，该化学化合物诱导在一步过程中分化为卫星细胞或卫星样细胞，该一步过程可涉及或不涉及多种培养基变化。在一些情况下，在化学化合物的存在下在基础培养基中培养多潜能干细胞，该化学化合物诱导在多步过程，如涉及连续添加不同化学化合物的过程中分化为卫星细胞或卫星样细胞。通常，添加有一种或多种化合物以诱导分化的基础培养基可被称为“分化培养基”。i.分化培养基组分可用于化学分化过程的分化培养基的实例可包括包含以下组分的培养基：基础培养基、wnt激活剂和tgf-β受体抑制剂。在一些情况下，分化培养基可包含rock抑制剂、血清组分或其组合。在一些情况下，分化培养基可包含lrrk2抑制剂。通常，本文提供的分化培养基不含生长因子。在分化培养基的实例中使用的基础培养基可以改变，但其通常包含充满营养物的培养基。可使用的基础培养基的实例为mcdb120、骨骼肌细胞基础培养基(skeletalmusclecellbasalmedium)(由promocell制造)、skbm基础培养基(skbmbasalmedium)(由lonza制造)、skbm-2基础培养基(skbm-2basalmedium)(由lonza制造)、stemcelltechnologies“apel培养基”(由stemcelltechnologies制造)或dmem/f12。此外，rock抑制剂可存在于分化培养基中。rock抑制剂可减少低细胞密度下的凋亡。在一些情况下，rock抑制剂如gsk429286a、y-27632或法舒地尔的浓度为约100nm、500nm、1μm、2.5μm、5μm、10μm、15μm、20μm、40μm、50μm、60μm或更高。在一些情况下，rock抑制剂在从多潜能干细胞到卫星样细胞的分化过程期间持续存在。在一些情况下，rock抑制剂在从起始多潜能干细胞到卫星样细胞的分化过程的大部分期间(例如，多于1天、多于2天、多于3天、多于4天、多于5天、多于10天或多于15天)存在。基础培养基可另外包括所描述的培养基，或具有其它血清样组分的类似于上文所述培养基的培养基。这样的血清样组分可包括bsa、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素、胎球蛋白、表皮生长因子(egf)、马血清、敲除型替代血清、地塞米松或其组合。在一些实例中，bsa可以以至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，或至多约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的最终浓度存在。在一些情况下，细胞可与bsa接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，fgf(或其他生长因子)可以以至少约0.5ng/ml、1ng/ml、1.5ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml、3ng/ml、3.5ng/ml、4ng/ml、4.5ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml或25ng/ml的最终浓度存在。在一些情况下，fgf以至多约0.5ng/ml、1ng/ml、1.5ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml、3ng/ml、3.5ng/ml、4ng/ml、4.5ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml或25ng/ml的浓度存在。在一些情况下，细胞可与fgf接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，胰岛素可以以至少约2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml或10μg/ml的浓度存在。在一些情况下，细胞可与胰岛素接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些情况下，分化培养基基本不含生长因子或不存在任何生长因子(例如，没有egf、fgf、fgf2、胰岛素等)。在一些情况下，分化培养基基本不含异种物质(“无异种物质(xeno-free)”)或基本不存在来源于非人类生物体的组分。在一些情况下，分化培养基既不含生长因子也不含异种物质。在一些实例中，胎球蛋白可以以10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml的最终浓度存在。可添加egf至5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml和20ng/ml的最终浓度。在一些情况下，细胞可与胎球蛋白接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，马血清可以以0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的最终浓度存在。在一些情况下，细胞可与马血清接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，敲除型替代血清可以以0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的最终浓度存在。在一些情况下，细胞可与敲除型替代血清接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，地塞米松可以以约0.1μg/ml至1μg/ml，如0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml或1μg/ml的最终浓度存在。在一些情况下，细胞可与地塞米松接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。除了基础培养基和可选的rock抑制剂和/或血清组分之外，分化培养基可包含有助于多潜能干细胞(或其他类型的干细胞如多能干细胞)分化为卫星细胞或卫星样细胞的化合物。特别地，暴露于wnt途径激活剂以及tgf-β受体抑制剂(单独地或组合地)的多潜能干细胞(或其他类型的干细胞)可分化为卫星细胞或卫星样细胞。此外，使用这种方法产生的卫星细胞或卫星样细胞可能能够形成成肌细胞。在一些情况下，在用于将多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞的分化培养基中存在的化合物为wnt途径激活剂。这类激活剂可包括chir99021、qs11、iq1、丙戊酸(vpa)或脱氧胆酸(dca)。特别地，wnt途径激活剂的使用可用作gsk抑制剂(例如，gsk3-β抑制剂)。在一些实例中，wnt途径激活剂chir99021可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与wnt途径激活剂chir99021接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，wnt途径活化剂azd1080可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与azd1080接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，wnt途径激活剂qs11可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与qs11接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，wnt途径激活剂iq1可以以约1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml或20μg/ml或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与iq1接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，vpa可以以0.005μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与vpa接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，wnt途径激活剂dca可以以约0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与dca接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些情况下，tgf-β受体抑制剂单独地或与另一种化学剂如wnt途径激活剂组合地存在于分化培养基中。tgf-β受体抑制剂通常能够抑制tgf-β受体信号传导途径的至少一部分。在一些情况下，tgf-β受体抑制剂可抑制i型tgf-β受体信号传导途径的至少一部分；在一些情况下，tgf-β受体抑制剂可抑制ii型tgf-β受体信号传导途径。tgf-β受体抑制剂的实例可包括alk5抑制剂、sb431542和a83-01。具体而言，tgf-β受体抑制剂的使用可用作alk抑制剂，如alk5抑制剂。在一些实例中，tgf-β受体抑制剂(例如，alk5抑制剂)可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与tgf-β受体抑制剂(例如，alk5抑制剂)接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，sb431542可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与sb431542接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，a83-01可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与a83-01接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。除了存在wnt途径激活剂和tgf-β受体抑制剂之外，还可存在另外的信号传导分子。这样的信号传导分子可包括运铁蛋白、抗坏血酸、xav939、vegf、fgf、bix01294、igf-1、头蛋白、肌酸、pd169316、smo拮抗物、马血清或丁酸钠。在一些实例中，运铁蛋白可以以约10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、70μg/ml、90μg/ml、110μg/ml、130μg/ml、150μg/ml、170μg/ml、190μg/ml、210μg/ml、230μg/ml、250μg/ml、270μg/ml或300μg/ml或更高的浓度存在于细胞培养物中。在一些情况下，细胞可与运铁蛋白接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，抗坏血酸可以以约10μm、30μm、50μm、70μm、90μm、110μm、130μm、150μm、170μm、190μm、210μm、230μm、250μm、270μm，或290μm、310μm、330μm、350μm、370μm或400μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与抗坏血酸接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，xav939可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与xav939接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，vegf可以以5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml或50ng/ml的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与vegf接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，成纤维细胞生长因子(fgf)家族成员(例如，fgf、fgf1、fgf2、fgf3等)可以以约1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml或500ng/ml或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与fgf接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如，bix01294)可以以约0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些实例中，细胞可与bix01294接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，igf-1可以以0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml或50ng/ml的浓度存在于分化培养基中。在一些实例中，细胞可与fgf接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，头蛋白可以以10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml，或190ng/ml、210ng/ml、230ng/ml或250ng/ml的浓度存在于分化培养基中。在一些实例中，细胞可与头蛋白接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，肌酸可以以约0.1mm、0.5mm、1mm、2mm、5mm、10mm、20mm、50mm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与肌酸接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，pd169316可以以约0.001μm、0.005μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与pd169316接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，smo拮抗物可以以约0.001μm、0.005μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与smo拮抗物接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，马血清可以以约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更高的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与马血清接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些实例中，丁酸钠可以以约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、5μm、10μm、30μm、50μm、70μm、90μm、110μm、130μm、150μm、170μm、190μm、210μm、230μm、250μm、270μm，或290μm、310μm、330μm、350μm、370μm或400μm或更高的浓度存在于分化培养基。在一些情况下，细胞可与丁酸钠接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。在一些情况下，alk5抑制剂可包括2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶，在一些实例中，该化合物可以以0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、12.5μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm或50μm或更高的浓度存在。在一个具体的实施方案中，alk5抑制剂2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶的浓度为2μm或约2μm。在一些情况下，在用于使多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞的分化培养基中存在的化合物为富亮氨酸重复序列激酶2(lrrk2)抑制剂。这样的抑制剂可包括但不限于lrrk2-in-1、czc54252、gsk2578215a、gne-0877、gne-7915、gne-9605和pf06447475。在一些实例中，lrrk2抑制剂为lrrk2-in-1。lrrk2-in-1可以以约1nm、5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm或大于100μm的浓度存在于分化培养基中。在一些情况下，细胞可与lrrk2-in-1接触超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天或超过9天。ii.将多潜能干细胞暴露于分化培养基可通过将多潜能干细胞(或其他类型的干细胞)与一种或多种分化培养基接触，使多潜能干细胞(或其他类型的干细胞)分化为卫星细胞或卫星样细胞。本文提供的方法包括使多潜能干细胞(或其他干细胞)分化的一步法，其中单个药剂或同时提供的药剂的单个组合触发该分化途径。在一些情况下，该方法可包括将核酸引入多潜能干细胞中(例如，经由转染、转导、病毒转导、电穿孔等)，使得多潜能干细胞表达该核酸。在一些情况下，该方法不包括将核酸引入多潜能干细胞中，或不包括将核酸转染到多潜能干细胞中，或不包括将核酸电穿孔到多潜能干细胞中，或不包括将核酸(例如，经由病毒载体)转导到多潜能干细胞中，使得该核酸由细胞表达并且引起或有助于多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。在一些情况下，该方法包括将生肌蛋白引入多潜能干细胞。在一些情况下，该方法不包括将生肌蛋白引入多潜能干细胞。图4示出了使多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞的实例。可如本文所述或通过本领域已知的任何方法对多潜能干细胞(410)进行平板接种和培养，例如通过在合适的培养基中作为单细胞进行平板接种。在一些情况下，多潜能干细胞与分化培养基(420)在单个步骤中接触，从而导致多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞或以其他方式生成卫星细胞或卫星样细胞。通常，一步接触可包括将多潜能干细胞与一次性或随时间连续提供给细胞的单个分化培养基接触(例如，经由培养基更换)。在一些情况下，一步接触可包括将多潜能干细胞与随时间以不同浓度提供给细胞的单个分化培养基接触(例如，涉及改变分化培养基浓度的培养基更换)。在一些实施方案中，单个分化培养基中存在的组分足以导致多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞(例如，具有与那些天然存在的卫星细胞类似的功能、结构、形态或表达标志物特征的细胞)。在一些实施方案中，单个分化培养基中存在的组分足以导致从多潜能干细胞生成卫星细胞或卫星样细胞。在一些情况下，当细胞连续暴露于该组分时(例如，经由一种或多种培养基更换)，单个分化培养基中存在的组分足以导致多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。在一些情况下，将多潜能干细胞与单个分化培养基接触包括将细胞与分化培养基连续接触。在其他情况下，将多潜能干细胞与单个分化培养基接触包括将细胞与分化培养基间歇或连续接触。在一些情况下，本文提供的培养基内的一种组分或一系列组分可以能够直接导致从一个或多个多潜能干细胞生成卫星细胞或卫星样细胞。例如，在一些情况下，wnt途径激活剂和tgf-β受体抑制剂一起可以能够在不添加额外分化剂的情况下导致从多潜能干细胞生成卫星细胞或卫星样细胞。在一些情况下，所述接触包括将多潜能干细胞与两种或更多种不同的分化培养基接触。所述两种或更多种不同的分化培养基可包含不同的组分。在一些情况下，所述两种或更多种不同的分化培养基为2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、或10种或更多种不同的分化培养基。在一些情况下，多潜能干细胞可接触或暴露于一种或多种分化培养基(在进行或不进行培养基更换的情况下)至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天或至少28天。在一些情况下，多潜能干细胞可与一种或多种分化培养基接触(在进行或不进行培养基更换的情况下)至多1天、至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多11天、至多12天、至多13天、至多14天、至多21天或至多28天。在一些情况下，多潜能干细胞接触或暴露于分化培养基约12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、21天、28天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天或70天。一种或多种多潜能干细胞可与分化培养基的化合物同时接触，例如，将两种或更多种化合物在重叠的时间范围内施用于多潜能干细胞。例如，多潜能干细胞可在第1-3天与一种化合物接触，并在第2-5天与第二种化合物接触。在一些情况下，一种或多种多潜能干细胞可与分化培养基的化合物同时接触。例如，多潜能干细胞可在相同的时间范围内与两种化合物接触(例如，在第1-3天与两种化合物接触)。在一些情况下，多潜能干细胞与分化培养基的两种或更多种化合物连续或顺序接触。例如，多潜能干细胞可在第1-3天与一种化合物接触，并在第4-6天与第二种化合物接触。可在单个步骤中添加分化培养基的组分。可顺序添加培养基的组分。此外，可同时添加分化培养基的组分。还可通过在施加第二组分之前将细胞与一种组分接触一段时间，以重叠的方式添加分化培养基的组分。还可单独或混合地向细胞添加培养基的组分。这些添加可在整个过程中不改变培养基组分的情况下进行，使得分化因暴露于单个培养基组合物而发生。如本文所述，可随时间改变或更换分化培养基。在一些情况下，改变、添加或替换分化培养基。通常，在整个这些培养基更换中，分化培养基的组成在多潜能干细胞向卫星细胞或卫星样细胞的整个分化中保持稳定。在一些情况下，分化培养基的组分是变化的。可定期，如每六小时、每12小时、每一天、每隔一天、每三天、每四天或每五天进行培养基更换。在一些情况下，在使多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞的过程期间，分化培养基更换了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15次。还可如在恒化培养中，连续添加和去除培养基。多潜能干细胞可连续暴露于分化培养基。可在将多潜能干细胞返回维持培养基之前，暴露于分化培养基一段时间。此外，分化可持续特定的时间量(例如，三天、五天、七天、十天或十五天)或直至检测到给定基因或形态学标志物。iii.使用分化培养基产生卫星细胞和卫星样细胞的方法的产率、效率和其他有益特征本文提供的方法可导致卫星细胞或卫星样细胞的高产率，并且/或者可具有高效率。例如，当使用如本文所述的分化培养基使体外培养物中的多个多潜能干细胞分化时，从所述多个多潜能干细胞分化的细胞中超过40％可表达pax3、pax7和/或cd56。在一些情况下，从所述多个多潜能干细胞分化的细胞中超过20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％可表达pax3、pax7和/或cd56。在一些情况下，从所述多个多潜能干细胞分化的细胞中超过20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％能够分化为成肌细胞。在一些情况下，从所述多个多潜能干细胞分化的细胞中超过20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％能够分化为功能性成肌细胞。在一些情况下，通过进行本文提供的方法从多个多潜能干细胞生成卫星细胞或卫星样细胞的时间(或持续时间)可为数天至数周。在一些情况下，从多潜能干细胞到卫星细胞或卫星样细胞的持续时间可为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或约20天。持续时间可计算为从分化开始(例如，将多潜能干细胞平板接种在分化培养基中)到大多数多潜能干细胞已分化为卫星细胞或卫星样细胞(例如当培养物中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多潜能干细胞已分化为卫星细胞或卫星样细胞时)的时间。在一些情况下，通过进行本文提供的方法使多潜能干细胞分化为成肌细胞的持续时间可为数天至数周。例如，多潜能干细胞分化为成肌细胞的持续时间可为约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天或约30天。持续时间可计算为从分化开始(例如，将多潜能干细胞平板接种在分化培养基中)到大多数多潜能干细胞已分化为成肌细胞(例如，当培养物中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多潜能干细胞已分化为成肌细胞时)的时间。在体外培养物中提供的多潜能干细胞可与一种化合物接触，或与两种或更多种化合物同时接触，从而使所述人多潜能干细胞分化为表达pax3、pax7和/或cd56(例如pax3/cd56、pax7/cd56、pax3/pax7/cd56)的细胞。特别地，表达pax3、pax7和/或cd56的细胞可具有形成成肌细胞的潜力，其产率使得在一定的时间内(例如，九天的时间)从所述多潜能干细胞生成多于5种表达pax3、pax7和/或cd56的细胞。因此，当多潜能干细胞作为培养物中的群体生长时，该培养物可以以与多潜能干细胞的初始数目相比至少为5:1的比率产生表达pax3、pax7和/或cd56的细胞。在一些情况下，该比率至少为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、50:1或100:1。在一些情况下，该比例在2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、70天或100天内实现。本文提供的方法可以以高纯度从多潜能干细胞生成卫星细胞或卫星样细胞。纯度可指培养物中呈pax3、pax7和/或cd56阳性的总细胞的百分比(％)或分数。可在分化的每个阶段评估纯度，例如，可评估卫星细胞或卫星样细胞的纯度、成肌细胞的纯度和/或肌管的纯度。在一些情况下，在进行如本文提供的分化方法之后，培养物中的卫星细胞或卫星样细胞的纯度至少为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，在进行如本文所提供的分化方法之后，成肌细胞的纯度至少为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，在进行如本文提供的分化方法之后，肌管的纯度至少为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，在未首先进行一个或多个纯化或富集步骤，如一个或多个分选步骤(例如，流式细胞术)的情况下获得纯度。在一些情况下，在未进行一个或多个纯化或富集步骤，如一个或多个分选步骤(例如，流式细胞术)的情况下，卫星细胞或卫星样细胞、成肌细胞或肌管的纯度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，在进行本公开内容的分化方法之后，细胞群体基本上不含神经细胞或神经祖细胞。例如，在进行本文提供的分化方法之后，细胞群体含有不超过约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的神经细胞或神经祖细胞。分化后，卫星细胞或卫星样细胞可维持在适用于生肌培养的任何培养基如任何所述的基础培养基中。卫星样细胞可维持在含有用于诱导分化的化合物的培养基中。所得的卫星细胞或卫星样细胞可直接使用。可将所得的卫星细胞或卫星样细胞在培养物中再扩展一次加倍(doubling)、两次加倍、三次加倍、四次加倍、五次加倍或六次加倍、八次加倍、十次加倍、十二次加倍、十四次加倍、十六次加倍、十八次加倍、二十次加倍、二十二次加倍、二十四次加倍、二十六次加倍、二十八次加倍或三十次加倍。c.hla无效多潜能干细胞向卫星细胞或卫星样细胞的分化可通过化学分化、通过与卫星细胞或卫星样细胞相关的遗传标志物的强制表达或通过本领域已知的任何其他分化过程从分化程度较低的细胞(例如，多潜能干细胞、多能干细胞、肌肉谱系限制性祖细胞)产生本文所述的hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞。可通过将编码蛋白质的表达载体引入细胞中、利用重组病毒转导细胞、将感兴趣的外源性纯化多肽引入细胞中、将编码感兴趣多肽的mrna引入细胞中、使细胞与诱导感兴趣标志物(例如，pax3、pax7或cd56)表达的试剂(例如，非天然存在的试剂)接触，或用于诱导编码感兴趣多肽的基因的表达的任何其他生物、化学或物理过程来实现强制表达。在一些实例中，可通过本文所述的化学分化方法使hla无效多潜能干细胞分化。此外，hla无效多潜能干细胞可在包括转染的培养条件下分化为卫星细胞或卫星样细胞。可在促进hla无效多潜能干细胞分化为表达pax3、pax7和/或cd56的细胞的条件下培养hla无效多潜能干细胞，从而产生表达pax3、pax7和/或cd56的hla无效细胞。特别地，培养hla无效多潜能干细胞的条件可包括将所述hla无效多潜能干细胞与化合物接触，以促进所述hla无效多潜能干细胞分化为表达pax3、pax7和/或cd56的所述细胞。例如，hla无效多潜能干细胞可分化为hla无效骨骼肌祖细胞。hla无效骨骼肌祖细胞可表达pax3、pax7、myod、mf20和cd56中的至少一种。hla无效骨骼肌祖细胞可以能够形成成肌细胞。此外，hla无效人多潜能干细胞可分化为能够形成特定组织的前体的hla无效细胞。实例可包括使hla无效多潜能干细胞分化为间充质组织或肌肉谱系特异性祖细胞。然后，可向有需要的受试者提供该特定组织或分化的细胞。此外，hla无效人多潜能干细胞的分化可采用在单个步骤中发生的分化方法进行。可用外源多肽处理hla无效多潜能干细胞以诱导分化。例如，可通过以下方式将生肌因子提供给干细胞：i)用生肌因子蛋白处理所述细胞；ii)诱导所述细胞中的所述生肌因子表达；或iii)在所述细胞中引入能够表达生肌因子的核酸。在一个实施方案中，通过在细胞中引入能够表达生肌因子的核酸来提供生肌因子。在一个实施方案中，该生肌因子为编码myod的核酸。此外，可通过首先在促进向间充质干细胞分化的条件下培养，如通过用激活蛋白a处理，使hla无效多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。可分选这些细胞以获得pdgfrα阳性细胞高度富集的群体，然后可用氯化锂处理以诱导向卫星细胞或卫星样细胞的分化。v.卫星样细胞的特征和卫星样特征的检测如本文所用的，术语“卫星样细胞”是指具有与天然存在的卫星细胞(例如，生物体如人体内的卫星细胞)相关的结构或功能特征，但还具有至少一种将卫星样细胞与天然存在的卫星细胞相区分的结构或功能特征的任何细胞。在优选的实施方案中，卫星样细胞是这样的细胞，其(a)由从分化程度较低的细胞如干细胞(优选多潜能干细胞)体外产生，或(b)衍生自卫星样细胞，如由卫星样细胞增殖产生的细胞。如本文所用的，术语“卫星细胞”是指具有由天然存在的卫星细胞或肌卫星细胞展现出的结构和功能特征，并且可具有或不具有将其区分的至少一种结构或功能特征的细胞。本文提供的卫星样细胞具有与天然存在的卫星细胞共同的特征，并且还具有不同于在天然存在的卫星细胞中发现的那些特征的特征。本文提供的卫星样细胞在rna和/或蛋白质水平上表达特异性标志物。在一些情况下，该标志物为以下标志物中的一种或多种：pax3、pax7、myf5或cd56(其也可被称为白细胞抗原，或leu-19，或膜结合的神经细胞粘附分子，或n-cam)。在一些情况下，该标志物包括肌细胞核因子(mnf)或c-met原癌基因(肝细胞生长因子hgf的受体)。在优选的实施方案中，卫星样细胞表达pax3、pax7和cd56。在一些实施方案中，已部分分化的卫星样细胞可能仅表达这些标志物的子集，如仅cd56。在一些情况下，卫星样细胞不表达显著水平的cspg4。在一些情况下，卫星样细胞不表达显著水平的生肌调节因子(mrf)，例如myod、myf5、成肌蛋白或mrf4。天然存在的成年卫星细胞表达pax7，而pax3主要是天然存在的胚胎卫星细胞的标志物。卫星样细胞标志物可通过本领域已知的任何方法来检测。可通过检测mrna转录物如通过rt-pcr、rna测序或对mrna转录物的cdna互补序列进行测序来测定标志物的表达。可通过本领域已知的任何技术，包括微阵列和测序(例如，sanger测序、高通量测序、新一代测序、大规模平行高通量测序等)，来检测rna标志物的全面表达(或多种标志物的表达)。可通过免疫荧光、基因融合产物(例如，pax7-gfp报告基因构建体)的产生、放射性标记、免疫沉淀法、蛋白质印迹法或本领域已知的任何其他方法来测定蛋白质标志物的表达。还可使用蛋白质组技术(例如，蛋白质阵列)检测与卫星样细胞相关的蛋白质标志物。可通过测定标志物表达的下游效应，如通过检测其活性受该标志物控制的基因的激活或抑制来间接推断该标志物的表达。卫星细胞或卫星样细胞可通过其形态来鉴别。与成肌细胞、成纤维细胞或上皮细胞相比，卫星样细胞或卫星细胞可具有较高的细胞核与细胞质的体积比。与成肌细胞、成纤维细胞或上皮细胞相比，卫星细胞或卫星样细胞可具有较少的细胞器(例如，核糖体、内质网、线粒体、高尔基体)。卫星样细胞可具有横截面积约为170μm2的核。卫星细胞或卫星样细胞可具有相对于肌细胞核(myonuclei)而言大量的核异染色质。与静息的卫星细胞或卫星样细胞相比，激活的卫星细胞或卫星样细胞可具有数目增加的胞膜窖(caveolae)、细胞质细胞器，以及水平降低的异染色质。与成肌细胞相比，卫星样细胞或卫星细胞不太细长且不太呈纺锤形。通常，本文提供的卫星细胞或卫星样细胞能够形成成肌细胞，特别是可融合形成肌管的成肌细胞。这种能力可在功能上检测到，如通过展现出向成肌细胞或肌管的分化。分化可在培养物中进行。分化可体内进行，例如通过将卫星细胞或卫星样细胞注射到合适的动物受试者中并追踪它们的分化。对于hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞，可通过免疫荧光、蛋白质印迹法或任何已知的方法证明hla基因产物的不存在。在一些情况下，可使用本领域已知的方法例如pcr来评估hla基因的存在或不存在。vi.卫星细胞或卫星样细胞向成肌细胞和肌管的分化卫星细胞或卫星样细胞可以能够分化为成肌细胞和具有功能的肌管。卫星细胞或卫星样细胞可进一步体内分化为成肌细胞和肌管。这可通过将卫星细胞或卫星样细胞施用于合适的受试者，如用心脏毒素处理的hu小鼠或有需要的合适的人类受体来实现。例如，有需要的人类受体可为患有肌肉退行性疾病或病症的受试者。在一些情况下，卫星细胞或卫星样细胞可进一步体外分化为成肌细胞和肌管。这样的分化可通过施加生长因子如igf-1或tgf-β而发生。这样的分化可通过施加小分子如bix01294或sb431542而发生。vii.应用本文提供的卫星细胞或卫星样细胞(包括衍生自hla无效多潜能干细胞的hla无效卫星细胞和hla无效卫星样细胞)可用于多种临床应用，如涉及将细胞引入受试者(如患有肌肉退行性疾病或病症的患者)中的细胞疗法。本文提供的细胞还可用于药物筛选，和对正常发育和生理学的研究，以及疾病。a.受试者本文提供的卫星样和卫星细胞可用于治疗或改善多种受试者的症状。通常可从本文提供的细胞和方法受益的受试者是患有影响肌肉功能、张力或生理学的肌肉疾病或病症的受试者。在一些情况下，受试者可患有遗传疾病(例如，亨廷顿病、肌营养不良)；在一些情况下，受试者可患有获得性病症(例如，不活动导致的肌肉萎缩)。此外，患有肌营养不良的受试者可患有多系统病症，在包括心脏、胃肠系统、神经系统、内分泌腺、眼睛和大脑在内的身体系统中具有临床表现。需要治疗的受试者可包括已经经历肌肉劳损或损伤的那些受试者。肌肉损伤可由创伤性事件如在活动如锻炼期间滑倒或摔倒导致。需要治疗的受试者还可包括经历肌肉萎缩或衰退(包括可由于恶病质或衰退综合征而发生的肌肉萎缩)的那些受试者。恶病质可伴随着肌肉萎缩、体重减轻、疲劳、虚弱和体重明显减轻。本文提供的治疗方法可帮助逆转这些症状中的一些，特别是肌肉萎缩和虚弱。患有恶病质的受试者可包括患有癌症、获得性免疫缺陷综合征(aids)、慢性阻塞性肺病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、肺结核、家族性淀粉样多神经病、钆中毒、汞中毒(肢痛症)和激素缺乏症的患者。在一些情况下，需要治疗的受试者是患有少肌症的患者，或具有与衰老过程相关的肌肉质量或功能丧失的患者。本文提供的治疗可帮助逆转或改善少肌症，或肌肉质量或功能的丧失；在一些情况下，本文所提供的治疗有助于防止少肌症，或肌肉质量或功能丧失随时间恶化。可从所公开的组合物和方法受益的受试者包括希望预防性治疗的受试者，如存在肌肉质量丧失风险的受试者。这样的受试者可包括即将经历可能减少肌肉质量的治疗方案如化疗的那些受试者。这样的受试者还可包括例如由于无意识或穿戴固定铸件/石膏(cast)，已被固定或部分固定足以减少肌肉质量的一段时间的受试者。受试者的实例可包括最近经历了损伤或重新连接肌肉组织的手术的那些受试者。受试者的实例还可包括生来没有特定肌肉或需要肌肉移植的那些受试者。受试者还可以是出于美容原因或为了改善运动能力而寻求改善肌肉质量或功能的受试者。需要卫星细胞或卫星样细胞移植的受试者可包括雄性或雌性。这样的受试者可具有一定的年龄范围，该年龄范围可包括>10分钟、>1小时、>1日、>1个月、>2个月、>6个月、>1岁、>2岁、>5岁、>10岁、>15岁、>18岁、>25岁、>35岁、>45岁、>55岁、>65岁、>80岁、<80岁、<70岁、<60岁、<50岁、<40岁、<30岁、<20岁或<10岁。受试者可为新生儿。在一些情况下，受试者为儿童或成年者。在一些实例中，组织来自2小时、5小时、10小时或20小时龄的人。在其他实例中，组织来自1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或12个月龄的人。在一些情况下，组织来自1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、18岁、20岁、21岁、23岁、24岁、25岁、28岁、29岁、31岁、33岁、34岁、35岁、37岁、38岁、40岁、41岁、42岁、43岁、44岁、47岁、51岁、55岁、61岁、63岁、65岁、70岁、77岁或85岁的人。受试者可具有有不同的遗传背景，包括不同的种族或遗传混合群体。b.细胞疗法卫星细胞或卫星样细胞可用作治疗患有疾病或病症(例如，遗传缺陷)，特别是影响肌肉功能的疾病或病症的受试者的疗法。该疗法可涉及治疗疾病的病因并且/或者治疗疾病或病症的影响。可将卫星细胞或卫星样细胞转移至或靠近受试者的受伤部位；或者可以以允许细胞以迁移或归巢至受伤部位的方式将细胞引入受试者。例如，可将细胞包封在设计为将细胞运送至感兴趣部位的材料如微胶囊中。在一些实例中，转移的细胞可有利地代替受损、病变或受伤的细胞，并且使得受试者的整体状况得到改善。在一些情况下，转移的细胞可刺激组织生成或修复。在一个代表性实例中，用已在本文所述的方法中从多潜能干细胞衍生出的卫星细胞或卫星样细胞治疗患有肌肉退行性疾病或其他肌肉病症(例如，肌肉损伤)的受试者。特别地，可通过将多潜能干细胞与一种或多种药剂接触以使多潜能干细胞分化为移植至受试者中的卫星细胞或卫星样细胞而使多潜能干细胞分化。衍生自多潜能干细胞的卫星细胞或卫星样细胞可以能够在体外和/或体内形成成肌细胞。在一些情况下，可将卫星细胞或卫星样细胞引入有需要的受试者。可将卫星细胞或卫星样细胞引入患有肌肉退行性疾病或病症的受试者的肌肉中。在一些情况下，将衍生自卫星细胞或卫星样细胞的细胞如成肌细胞、肌管或遗传修饰的卫星细胞或卫星样细胞引入受试者中。在一些实例中，将遗传修饰或衍生自遗传改变的细胞(如遗传修饰的多潜能干细胞)的卫星细胞引入受试者中。在一些实例中，可由患有由遗传突变引起的肌肉缺陷疾病或病症如肌营养不良的患者生成诱导多潜能干细胞系。可校正诱导多潜能干细胞中的突变，随后可根据本公开内容使该诱导多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。然后可将具有校正突变的卫星样细胞或卫星细胞移植至患者中，以便恢复、改善或增强肌肉功能。在一些具体的实例中，诱导多潜能干细胞(或诱导多潜能干细胞系)可由具有导致肌营养不良(例如，杜氏肌营养不良)的突变的患者生成。可使用本领域已知的遗传修饰技术校正诱导多潜能干细胞中的突变。可根据本公开内容使遗传修饰的诱导多潜能干细胞分化为卫星细胞或卫星样细胞。可将卫星细胞或卫星样细胞移植至患者中，在其中它们可产生功能性的非突变蛋白质，从而恢复或增强肌肉功能。可通过将具有恢复肌肉损失的能力的卫星细胞或卫星样细胞注射到病变或损伤的肌肉中来实现肌肉退行性疾病如肌营养不良(例如，杜氏肌营养不良)的治疗。该卫星细胞或卫星样细胞可产生成肌细胞并与现有的肌管融合。由于肌管具有连续的细胞质，由衍生自移植的卫星细胞或卫星样细胞的成肌细胞所产生的肌养蛋白可在整个肌管中找到，并可弥补内源性缺陷。可进行类似的程序以校正或改善由缺乏足量的特定基因产物而引起的任何病况、疾病或病症。可将卫星细胞或卫星样细胞转移至罹患广泛疾病和病症的受试者。罹患神经性疾病或病症和/或神经肌肉疾病或病症的受试者可特别受益于卫星细胞疗法。在一些方法中，可将分化的细胞移植至肌肉部位以治疗神经肌肉病况，例如，肌营养不良、杜氏肌营养不良等。可用所公开的卫星样细胞和卫星细胞治疗或改善的肌肉疾病或病症可为遗传疾病或病症，或可具有非遗传的病因。在一些情况下，该疾病或病症是慢性的；在其他情况下，该疾病或病症是急性的或亚急性的；在其他情况，该疾病或病症为复发性疾病或病症。可用所公开的细胞治疗或改善的示例性疾病或病症可包括遗传疾病以及非遗传疾病。示例性的疾病或病症可包括：肌营养不良、亨廷顿病、1a型分区蛋白缺乏(merosindeficiency1a)、线状体肌病和脊髓性肌萎缩(sma)。可用所公开的细胞治疗或改善的肌营养不良的实例包括becker型、先天性、面肩胛肱型(fsh)、肌强直性(i型和ii型)、眼咽型、远端型、杜氏肌营养不良，以及emery-dreifuss型肌营养不良。杜氏和becker型肌营养不良由位于x染色体上的基因的突变引起，并且主要影响雄性，尽管雌性有时也可能有严重症状。可通过所公开的方法和组合物治疗或改善的其他疾病或病症可包括：恶病质、散发性疾病、少肌症、肌肉衰退、肌肉萎缩、肌肉劳损、肌肉损伤、多发性硬化症、帕金森病或与衰老相关的肌肉衰退。可将卫星细胞或卫星样细胞或由它们衍生出的细胞置于患者中以治疗疾病或病症。例如，可采用向骨骼肌中直接注射来移植卫星细胞或卫星样细胞。另外地或备选地，可使用支架、使用无支架方法或使用其他移植装置将卫星细胞或卫星样细胞移植至受试者中。该支架可由本领域已知的任何材料制成。在一些情况下，该支架为可生物降解的支架、可再吸收的支架或其他类型的支架。在一些情况下，该支架包含基质(例如，可生物降解的基质，可再吸收的基质)。在一些情况下，在移植之前，卫星细胞或卫星样细胞或由它们衍生出的细胞被封装在微胶囊中。在一些情况下，该微胶囊可具有归巢特征，使得细胞能够被引导至感兴趣的位置。卫星细胞或卫星样细胞，如骨骼肌祖细胞，可在受试者身体上的多个位置注射。例如，可在接近肌肉形成的位置，例如手臂肌肉如喙肱肌、肱二头肌和肱肌，腿部肌肉如胫骨前肌、长伸肌、指伸肌和第三腓骨肌(fibularistertius)或其他肌肉位置处注射卫星细胞或卫星样细胞。向受试者施用治疗的次数可以不同。将分化细胞引入受试者中可以是一次性事件；但在某些情况下，这样的治疗仅可在有限的一段时间内引起改善，并且需要持续的一系列重复治疗。在其他情况下，在观察到效果之前可能需要多次施用细胞。确切的方案取决于疾病或病况、疾病的阶段和正在治疗的个体受试者的参数。在一些实例中，可经由以下任一种途径将细胞引入受试者：肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、腹膜内或脊髓液中。特别地，可经由细胞向受试者骨骼肌中的直接注射而将细胞引入受试者。在卫星细胞或卫星样细胞的移植期间，可在同一时间段内向受试者给予药物。例如，可在卫星样细胞移植之前、期间或之后或以其组合的方式施用药物。可施用于受试者的药物的实例包括用于治疗受试者疾病或损伤的药物；免疫抑制药物；无免疫抑制药物；或其组合。示例性免疫抑制药物包括钙依赖磷酸酶抑制剂，如环孢菌素或他克莫司，mtor抑制剂，如西罗莫司或依维莫司，嘌呤合成抑制剂或嘌呤类似物如吗替麦考酚酯或硫唑嘌呤，或类固醇如泼尼松。可使用多种仪器如注射器来施用卫星细胞和卫星样细胞。卫星细胞和卫星样细胞还可与缓冲液如盐水、磷酸盐缓冲盐水或血清一起注射。卫星细胞和卫星样细胞可与抗生素如万古霉素或左氧氟沙星一起施用。可移植至受试者中的卫星细胞或卫星样细胞的剂量可根据受试者的疾病或损伤、受试者疾病或损伤的进展以及受试者疾病或损伤的严重程度而不同。此外，提供给受试者的治疗次数可以不同。可向受试者施用单次治疗，或者可向受试者给予多次治疗。在一些情况下，可用本文提供的细胞治疗受试者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25次或更多次。在一些情况下，受试者可在一年期内治疗少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。治疗本身在提供有卫星细胞或卫星样细胞的部位数目上也可以变化。在实例中，卫星细胞或卫星样细胞移植的单次治疗可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100个或更多个用于向骨骼肌直接注射卫星细胞或卫星样细胞的注射部位。在一些情况下，单剂量的细胞包含约101、约50、约102、约5x102、约103、约5x103、约104、约5x104、105、约5x105、约106、约5x106、约107、约5x107、约108、约5x108、约109、约5x109、约1010、约5x1010、约1011、约5x1011个或更多个细胞。在一些情况下，单剂量的细胞包含至多102、至多5x102、至多103、至多5x103、至多104、至多5x104、至多105、至多5x105、至多106、至多5x106、至多107、至多5x107、至多108、至多5x108、至多109、至多5x109、至多1010、至多5x1010、至多1011或至多5x1011个细胞。一旦将卫星细胞或卫星样细胞提供给患者，该卫星细胞或卫星样细胞可与受试者的成肌细胞融合并且可形成融合的肌细胞组分。治疗的结果可包括肌肉恢复；肌肉退化停止；肌肉退化减缓；与受试者的疾病或损伤相关的因素改善，如肌养蛋白的产生；或其组合。与受试者的疾病或损伤相关的因素的改善可与肌肉恢复或肌肉功能的测试有关。肌肉恢复的程度可通过对某些肌肉属性的一种或多种测试来评估，这些肌肉属性例如有肌肉质量、如通过对力的抵抗测量的肌肉力量、响应于刺激的收缩量，以及响应于刺激如电击的收缩强度、给定任务的时间表现，或基于肌肉的测试的其他实例。可根据某些肌肉属性改善的量或程度来评估肌肉的恢复。特别是，肌肉属性(例如，肌肉质量、力量等)可改善约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍或300倍或更多。在一些情况下，肌肉属性可改善>1％、>5％、>10％、>15％、>20％、>25％、>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>90％、>95％、>99％、>100％或更多。在一些更具体的情况下，肌肉力量改善>1％、>5％、>10％、>15％、>20％、>25％、>50％、>60％、>70％、>75％、>80％、>90％、>95％、>99％、>100％、>200％或更多。肌肉属性的改善可在某个时间段内发生，如从引入卫星样细胞或卫星细胞的时间起约1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周、3周、4周、1个月、6周、2个月、10周、3个月、3.5个月、4个月、4.5个月、5个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7个月、7.5个月、8个月、8.5个月、9个月、9.5个月、10个月、10.5个月、11个月、11.5个月、12个月、1.5年或2年或更长时间内发生。例如，在一些情况下，肌肉属性(例如，力量、质量等)的改善可为一个月内>1％、一个月内>5％、一个月内>10％、一个月内>15％、一个月内>20％、一个月内>25％、一个月内>50％、一个月内>60％、一个月内>70％、一个月内>75％、一个月内>80％月、>一个月内>90％、一个月内>95％、一个月内>99％、一个月内>100％、一个月内>200％、一个月内>250％、一个月内>300％、一个月内>400％、一个月内>500％，或一个月内甚至更高的百分比。在一些情况下，用卫星细胞或卫星样细胞治疗可导致肌肉退化在某个时间段内停止或减缓。在一些情况下，肌肉退化的速度可在用细胞治疗的一个月内减缓>1％、一个月内减缓>5％、一个月内减缓>10％、一个月内减缓>15％、一个月内减缓>20％、一个月内减缓>25％、一个月内减缓>50％、一个月内减缓>60％、一个月内减缓>70％、一个月内减缓>75％、一个月内减缓>80％、一个月内减缓>90％、一个月内减缓>95％、一个月内减缓>99％、一个月内减缓>100％、一个月内减缓>200％、一个月内减缓>250％、一个月内减缓>300％、一个月内减缓>400％、一个月内减缓>500％或在一个月内减缓甚至更高的百分比。另外，基于使用卫星细胞或卫星样细胞的细胞疗法，肌肉退化可完全停止。肌肉退化可在某个时间段内，如从引入卫星样细胞或卫星细胞的时间起约1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周、3周、4周、1个月、6周、2个月、10周、3个月、3.5个月、4个月、4.5个月、5个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7个月、7.5个月、8个月、8.5个月、9个月、9.5个月、10个月、10.5个月、11个月、11.5个月、12个月、1.5年或2年或更长的时间内完全停止。c.药物筛选除了用于细胞疗法之外，卫星细胞或卫星样细胞还可用于充当药物筛选的平台。特别是，可测定药物以测试对卫星细胞或卫星样细胞的表型，如细胞形态、标志物表达、增殖或分化的影响。在一些情况下，表型与肌肉功能相关。本文提供的细胞还可用于针对这类遗传疾病或病症的药物筛选、疾病建模和疾病研究。在一个实例中，所测试的细胞是由健康多潜能干细胞化学分化的健康的卫星细胞或卫星样细胞。在另一个实例中，所测试的细胞是由病变多潜能干细胞分化的病变的卫星细胞或卫星样细胞。病变多潜能干细胞可包括，具有与遗传疾病如神经肌肉遗传疾病(如肌营养不良)相关的特定遗传突变的多潜能干细胞。在一些情况下，病变多潜能干细胞来源于携带与肌肉退行性疾病相关的遗传突变的受试者。在一些情况下，病变多潜能干细胞被遗传工程化以携带引起或关联于肌肉遗传疾病的突变。该突变可与受试者(例如，人类受试者)携带的突变相同，或可与该突变基本相似。病变的卫星细胞或卫星样细胞可进一步分化为成肌细胞或肌管，以测定药物、测试病变的成肌细胞或肌管的表型、在细胞和组织水平上表征疾病的影响或进行其他评估。对疾病影响的表征可包括成肌细胞或肌管的功能和形态、成肌细胞或肌管的标志物表达、成肌细胞和肌管的增殖和分化、肌管长度、肌管直径、肌管分支化、融合指数或每个肌管的核数。在一些情况下，可对携带一个或多个致病突变的胚胎干细胞系进行遗传修饰以校正该突变。使用本文提供的方法，可使携带致病突变的胚胎干细胞和/或经修饰的、校正的胚胎干细胞分化为卫星样细胞或卫星细胞(或细胞系)。遗传修饰的细胞系可作为受疾病影响的细胞系的等基因对照，这对于药物筛选、疾病建模和疾病研究可能是特别有用的。在另一实例中，在卫星细胞或卫星样细胞上测定药物，以鉴别导致卫星细胞或卫星样细胞增殖增加或导致向成肌细胞的分化增加或增强的药物。可通过本领域已知的任何方法测量这些影响，如用于鉴别增殖中的细胞的edu测定法或针对ki67的免疫荧光染色、细胞计数、用于鉴别肌球蛋白的针对myod或结蛋白的免疫荧光染色。这样的药物可用于增加并激活患者的内源性卫星细胞，从而导致肌肉质量或功能增加。在另一实例中，所测试的细胞是由hla无效多潜能干细胞分化的健康的卫星细胞或卫星样细胞。在另一实例中，所测试的细胞是病变的hla无效多潜能干细胞，其可包括具有与遗传疾病如神经肌肉遗传疾病(如肌营养不良)相关的特定遗传突变的hla无效多潜能干细胞。采用所公开的卫星细胞和卫星样细胞的药物筛选试验和疾病建模试验可被设计用于多种疾病和病症，特别是遗传疾病或病症。示例性疾病或病症包括但不限于：亨廷顿病、1a型分区蛋白缺乏、线状体肌病和脊髓性肌萎缩(sma)以及肌营养不良。肌营养不良的实例包括becker型、先天性、面肩胛肱型(fsh)、肌强直性(i型和ii型)、眼咽型、远端型、杜氏肌营养不良症以及emery-dreifuss型肌营养不良症。杜氏和becker型肌营养不良由位于x染色体上的基因的突变引起，并且主要影响雄性，尽管雌性有时也可能有严重症状。此外，大多数类型的肌营养不良症是在包括心脏、胃肠系统、神经系统、内分泌腺、眼睛和大脑在内的身体系统中有临床表现的多系统疾病。d.避免移植排斥在其他应用中，可使用hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞来移植骨骼肌祖细胞，以便限制移植细胞的排斥。特别地，可将hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞移植至受试者中并与受试者的成肌细胞融合以获得受试者的hla特性(profile)，从而避免hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞被自然杀伤细胞消除。当向有需要的受试者提供hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞时，hla特征的缺乏允许hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞与免疫细胞相互作用，从而避免了免疫细胞与未识别细胞的不利反应。以这种方式，在将所述卫星细胞或卫星样细胞引入所述有需要的受试者之后，有需要的受试者不会对所述卫星细胞或卫星样细胞产生显著的免疫排斥。在实例中，hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞的移植可减少或消除服用免疫抑制药物的必要性。免疫抑制药物的实例包括钙依赖磷酸酶抑制剂如环孢菌素或他克莫司，mtor抑制剂如西罗莫司或依维莫司，嘌呤合成抑制剂或嘌呤类似物如吗替麦考酚酯或硫唑嘌呤，或类固醇如泼尼松。viii.细胞的储存可储存所述细胞、胚胎干细胞、多潜能干细胞、诱导潜多潜能干细胞、hla无效多潜能干细胞、化学分化的卫星细胞或卫星样细胞，和由hla无效多潜能干细胞分化的hla无效卫星细胞或hla无效卫星样细胞，或本文所述的其他细胞。因此，可储存来自所述过程中任一点的细胞或材料，以供将来完成使用的过程修改。储存方法可以是包括本文所述方法在内的任何方法，例如，使用低温保存培养基。一些示例性的低温保存培养基包含1-15％的dmso、甘油、高浓度的碳水化合物如海藻糖、高浓度的血清或白蛋白。优选以控制的冷却速率将细胞冷冻至低于-70℃的温度，并且储存在液氮储存容器中。用于低温保存/融化通过本文所述方法生成的细胞的其他合适的低温保存培养基和方法是在4℃下利用合适的试剂或覆盖有合适的低温保存培养基的贴壁细胞玻璃化、封装、稳定化。ix.一些定义如本文所用的，术语“或”用于指非排他性的“或”，例如“a或b”包括“a而不是b”、“b而不是a”和“a和b”，除非另有说明。如本文所用的，当提及数字或数字范围时，术语“约”是指所提及的数字或数字范围是在实验可变性内(或在统计学实验误差内)的近似值，并且因此该数字或数字范围可例如在所述数字或数字范围的1％至15％之间变化。在实例中，术语“约”是指所述数字或数值的±10％。如本文所用的，术语“治疗”、“处理”和“改善”可互换使用。这些术语是指用于获得有益的或期望的结果的方法，该结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处是指根除或改善正在治疗的根本(underlying)病症。治疗性益处也可如下实现：根除或改善与根本病症相关的一种或多种生理症状，使得在患者中观察到改善，尽管该患者可能仍然患有该根本病症。对于预防性益处，可将卫星细胞或卫星样细胞施用至存在发展出特定疾病的风险的患者，或者报告有疾病的一种或多种生理症状的患者，即使可能尚未对该疾病作出诊断。x.实施例虽然本文已经显示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。应理解，在本发明的实践中可采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。意在用所附权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。实施例1：针对生肌诱导条件的筛选。使用可商购的m2培养基(由geneabiocells制造)和以下标准方案，将人多潜能干细胞(hpsc)在i型胶原蛋白涂覆的表面上无饲养细胞地扩充。该方法在每次传代时将培养物解离为单细胞。按照标准方案将每个细胞系的批次在加有10％dmso的m2培养基中冷冻。对每个批次的活力、形态、无菌性、核型、dna指纹、多潜能性标志物表达(oct4、nanog、ssea-4、tra1-60)和多能测试(pluritest)(müller等人，2011)进行质量控制测试。使用可商购的细胞系genea017和genea020来筛选生肌诱导培养条件。基础培养基如下制备：根据制造商的说明将骨骼肌细胞生长培养基补充剂混合物(由promocell制造)添加至骨骼肌细胞基础培养基(由promocell制造)以产生类似于mcdb120(美国专利号5,143,842)的培养基，还向该培养基中添加rho相关激酶抑制剂y27632(10μm)。在涂覆有i型胶原蛋白(100μg/ml)、h纤连蛋白(10μg/ml)、m层粘连蛋白(5μg/ml)或具有m层粘连蛋白(5μg/ml)的h纤连蛋白(10μg/ml)的384孔光学底部微量滴定板中培养细胞。为了筛选生肌诱导培养条件，将细胞系解离成单细胞，并在384孔板中以8x103个细胞/cm2的密度平板接种于20μl基础培养基中。以两两组合的方式(总共378种组合)将来自表1的化合物以2x最终浓度添加至在384深孔板中的基础培养基中。向培养的细胞添加20μl补充有这种化合物的培养基，以便将细胞在40μl含有最终浓度的化合物的培养基中培养。该细胞在37℃、5％co2和5％o2下培养9天。培养基更换每隔一天进行一次，同时将待筛选化合物的浓度维持在其最终浓度。在培养期结束时，将细胞用4％福尔马林溶液固定，针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫荧光染色，并通过高含量成像进行分析。仅在基础培养基中生长的细胞都未展现出针对卫星细胞标志物的染色。在筛选的378个条件中，34个对细胞具有高度毒性。四个条件产生cd56阳性但pax3和pax7均为阴性的细胞。所测试的条件中有十五个导致超过50％的细胞表现出卫星细胞特征，以及对cd56、pax3和pax7的阳性染色。针对成肌细胞标志物myod将细胞进一步染色，但未观察到阳性细胞，表明卫星细胞未进一步分化为成肌细胞。表1.筛选中使用的化合物。实施例2：生肌条件并不严格依赖于血清、生长因子或特定的基础培养基。使用chir99021和alk5抑制剂，如实施例1所述从genea002、genea019和genea020制备卫星细胞，同时改变基础培养基的组成。将骨骼肌细胞生长培养基补充剂的组分保持在其最终浓度(例如，50μg/ml牛胎球蛋白、10ng/mlegf、1ng/mlbfgf、10μg/ml胰岛素和0.4μg/ml地塞米松)，并将表2中列出的基础培养基和血清以两两组合的方式混合。在所有条件下都获得pax3、pax7和cd56阳性的卫星样细胞。例如，图5、6和7显示了用化合物处理以诱导分化的细胞系genea002、genea019和genea020，并且示出了每种培养基中表达卫星样细胞标志物pax7和pax3的细胞的百分比。然而，在缺乏血清或白蛋白的情况下，细胞活力较差。例如，图8显示了在具有不同血清组分的各种分化培养基中生长的genea002、genea019和genea020。细胞密度取决于所使用的培养基和血清组分，这表明不同条件下的分化都是稳健(robust)的，并且培养基的影响主要在细胞活力上。所有细胞系中阳性细胞的比例、细胞扩充和稳健性都不同。promocell和lonza1基础培养基表现得非常相似，因为它们都基于mcdb120。马血清似乎最一致地支持所有细胞系的分化。表2.所测试的基础培养基和血清组分。接下来，通过使genea019在补充有chir99021和alk5抑制剂的mcdb120样基础培养基中进行分化，测试了对骨骼肌细胞生长培养基补充物的组分的依赖性，但其中骨骼肌细胞生长培养基补充剂(50μg/ml牛胎球蛋白、10ng/mlegf、1ng/mlbfgf、10μg/ml胰岛素和0.4μg/ml地塞米松)中的一种组分已经被省去，或者在5％马血清的情况下已被1.5％albumax(由lifetechnologies制造的牛血清白蛋白)替代。此外，在每种条件下均获得了pax3、pax7和cd56阳性的卫星样细胞，证明没有一种生长因子是生肌诱导所必需的。例如，图9示出了在含有不同血清组分的培养条件下表达pax3、pax7或cd56的细胞的百分比。分化在所有条件下都大致相似，表明一种血清组分对于分化是关键的。实施例3：使用chir99021(3μm)和运铁蛋白(150μg/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和运铁蛋白(150μg/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和运铁蛋白(150μg/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别出阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。表3.生肌诱导和成肌细胞分化的效率。第0天接种人psc(2630个细胞/cm2)约第10天的卫星样细胞的产率(个细胞/cm2)增加比率/倍数平均值144,17954.8最小值45,00017.1最大值248,14394.4实施例4：使用chir99021(3μm)和抗坏血酸(200μg/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和抗坏血酸(200μg/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和抗坏血酸(200μg/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别出阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例5：使用chir99021(3μm)和xav939(2.5μm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和xav939(2.5μm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和xav939(2.5μm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别出阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例6：使用chir99021(3μm)和vegf(25ng/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和vegf(25ng/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，但在补充有chir99021(3μm)和vegf(25ng/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但没有鉴别出阳性细胞，表明细胞没有进一步分化为成肌细胞。实施例7：使用chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例8：使用chir99021(3μm)和sb431542(2μm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和sb431542(2μm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和sb431542(2μm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例9：使用chir99021(3μm)和fgf(20ng/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和fgf(20ng/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和fgf(20ng/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例10：使用chir99021(3μm)和bix01294(1μm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和bix01294(1μm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和bix01294(1μm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例11：使用chir99021(3μm)和igf-1(10ng/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和igf-1(10ng/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和igf-1(10ng/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例12：使用chir99021(3μm)和头蛋白(100ng/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和头蛋白(100ng/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和头蛋白(100ng/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例13：使用chir99021(3μm)和肌酸(1mm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和肌酸(1mm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和肌酸(1mm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例14：使用chir99021(3μm)和pd169316(150μg/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和pd169316(150μg/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和pd169316(150μg/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例15：使用chir99021(3μm)和smo拮抗物(150μg/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和smo拮抗物(150μg/ml)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和smo拮抗物(150μg/ml)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例16：使用chir99021(3μm)和马血清(150μg/ml)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和马血清(5％)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和马血清(5％)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例17：使用chir99021(3μm)和丁酸钠(250μm)作为贡献组分从多潜能干细胞制备卫星细胞。如实施例1所述使hpsc培养物在补充有chir99021(3μm)和丁酸钠(250μm)的基础培养基中生长以诱导分化。将已分化的细胞固定并针对卫星细胞标志物pax3、pax7和cd56进行免疫染色。仅在基础培养基中培养的细胞中没有观察到阳性细胞，而在补充有chir99021(3μm)和丁酸钠(250μm)的基础培养基中培养的那些细胞中>50％的细胞对所述标志物呈阳性染色。在所有测试的细胞外基质中都产生了这些卫星样细胞，但h纤连蛋白产生了最高水平的卫星样细胞。将细胞进一步针对成肌细胞标志物myod进行染色，但未鉴别到阳性细胞，表明细胞未进一步分化为成肌细胞。实施例18：来自不同细胞系的成肌细胞融合形成混合的肌管。使来自一个细胞系的多潜能干细胞分化为成肌细胞，平板接种在培养皿中，并用例如从lifetechnologies(tm)获得的绿色荧光celltracker纳米晶体进行标记。celltracker被细胞吸收并且被动地保持存在，直到被进行中的细胞分裂所稀释。使来自另一细胞系的多潜能干细胞分化为成肌细胞，并在其解离并添加至第一成肌细胞之前用红色荧光celltracker纳米晶体进行标记。使用geneabiocells的肌管培养基诱导肌管形成。在培养约1周后，将细胞固定并用hoechst33242染料进行复染。利用高含量成像检测和量化混合的(绿色和红色荧光)肌管。实施例19：卫星细胞或卫星样细胞的繁殖此外，图10是根据本公开内容的实施方案，卫星细胞或卫星样细胞经三次传代繁殖的图解。pax3阳性细胞的比例在整个三次传代中保持大致恒定，而在后面的传代中发现了更多的pax7阳性细胞。如图10所示，似乎大多数细胞正在增殖(ki67-阳性)。实施例20：卫星细胞的无异种物质、无生长因子的制备。测试了在无异种物质的条件下卫星样细胞的生成。使用以下培养基从人胚胎干细胞系(genea019)制备卫星样细胞：1)对照培养基：补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)。2)mcdbc：补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的mcdb120(2g/l)。3)mcdbfa：不含马血清、胎球蛋白、egf或fgf并且补充有人白蛋白(2.5％)、油酸(100ng)、亚油酸(100ng)、y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的mcdb120(2g/l)。4)mcdbfaits：与mcdbfa(#3)相同，额外具有胰岛素/运铁蛋白/硒(its，100x)。mcdbfa是无异种物质、无生长因子的制剂，而mcdbfaits是无异种物质的制剂。在生肌诱导3天后将细胞固定，并且对细胞核(细胞计数)以及pax3和pax7进行染色。图11a-11c描绘了在所有测试培养基中生肌细胞的稳健诱导，包括增加的细胞计数(图11a)和增加的pax3(图11b)和pax7(图11c)的表达。实施例21：层粘连蛋白上的生肌诱导影响卫星样细胞群体。将genea019人胚胎细胞平板接种于在涂覆有细胞外基质分子i型胶原蛋白、层粘连蛋白111、层粘连蛋白211和层粘连蛋白521的组织培养板上的补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)中。9天后，将细胞固定并且对dna(hoechst)和pax7进行染色。发现层粘连蛋白，特别是层粘连蛋白521促进细胞增殖(图12b)并且有利于pax7阳性的卫星样细胞亚群(图12a)。实施例22：使用lrrk2/dclk抑制剂改善卫星细胞的制备。将genea019人胚胎干细胞平板接种于补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)(具有或不具有lrrk2抑制剂lrrk2-in-1(1μm))中。9天后，将细胞固定并且对dna(hoechst)和pax3进行染色。lrrk2-in-1的添加促进了细胞增殖(图13a)并且增加了pax3的表达(图13b)。使用genea019和genea067人胚胎干细胞系重复了相同的实验。通过相差显微术观察细胞群体。如图14所示，lrrk2-in-1的添加导致更纯的细胞群体，抑制作为污染细胞观察到的具有大细胞质的扁平细胞。实施例23：使用lrrk2/dclk抑制剂改善卫星细胞的制备。将genea002、genea015和genea019人胚胎干细胞系平板接种在涂覆有i型胶原蛋白的培养皿上的以下培养基中：1)mcdbc：补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的mcdb120(2g/l)。2)mcdbmin：不含马血清、胎球蛋白、egf或fgf并且补充有人白蛋白(2.5％)、y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的mcdb120(2g/l)。3)mcdbminfa：不含马血清、胎球蛋白、egf或fgf并且补充有人白蛋白(2.5％)、油酸(100ng)、亚油酸(100ng)、y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的mcdb120(2g/l)基础培养基。4)mcdbfaits：与具有胰岛素/运铁蛋白/硒(its，100x)的mcdbfa相同。任选地向培养基中添加对照化合物，5μmthi(2-乙酰基-4(5)-(1,2,3,4-四羟基丁基)咪唑)或5ng/lfgf2。任选地向mcdbminfa培养基中添加lrrk2抑制剂lrrk2-in-1(1μm)。在4天后将细胞固定并对dna(hoechst)、pax3和pax7进行染色。如图15a-f所示，thi和fgf2都未增强细胞增殖或pax3/7阳性细胞的产率。然而，令人惊讶的是，lrrk2抑制剂lrrk2-in-1导致pax3阳性细胞和pax7阳性细胞比例的大幅增加。利用genea015和genea019人胚胎干细胞，在补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)中重复了相同的试验。除了lrrk2-in-1之外，还在10nm至1μm的剂量范围内测试了各种其他的激酶抑制剂。在4天后将细胞固定并且对dna(hoechst)和pax7进行染色。如图16a和16b所示，lrkk2抑制剂lrrk2-in-1以剂量依赖性方式强烈促进pax7阳性细胞的形成，而其他激酶抑制剂则不然。实施例24：生肌诱导取决于wnt激活/gsk3b抑制。将genea019人胚胎干细胞平板接种于补充有y-27632(10μm)和alk5抑制剂(2μm)以及一系列wnt途径调节剂(包括chir99021(1μm)、azd1080(1μm)、iwp-l6(1μm)、d4476(1μm)和at13148(1μm))的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清(5％)的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)中。培养9天后，将细胞固定并且对dna(hoechst)和pax3进行染色。如图17a和17b所示，在不存在wnt调节的情况下，未观察到生肌诱导。gsk3激酶抑制剂chir99021和azd1080均促进生肌诱导并且导致pax3阳性细胞。通过iwp-l6阻断wnt信号传导阻断了生肌诱导。其他间接wnt途径激活剂不导致生肌诱导。实施例25：rho相关激酶(rock)的抑制在整个分化过程中都是重要的。将genea019和genea067人胚胎干细胞平板接种于在涂覆有i型胶原蛋白的平板上补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)中。使细胞在相同的培养基中进一步分化，每隔一天更换培养基，或者在平板接种后一天并且在细胞已附着后，将细胞更换至并且维持在相同的但没有rock抑制剂y-27632(10μm)的培养基中。令人惊讶的是，没有连续rock抑制的细胞在分化期间形成了高度异质的细胞群体，并且生长显著迟缓(图18；“-rock”表示在细胞已附着后去除y-27632)，表明rock抑制在生肌诱导过程中具有更特异的作用。实施例26：卫星样细胞与小鼠成肌细胞的体外融合。将genea019人胚胎干细胞平板接种于在涂覆有i型胶原蛋白的平板上补充有y-27632(10μm)、chir99021(3μm)和alk5抑制剂(2μm)的、具有骨骼肌细胞生长补充剂(lonza)和马血清的骨骼肌细胞基础培养基(lonza)中。在9天后将细胞传代，并且重新平板接种在geneabiocells成肌细胞培养基(geneabiocells)中。7天后，收获细胞，并且以60,000个细胞/cm2的总细胞密度与永生化小鼠成肌细胞c2c12细胞一起以1:1重新平板接种。第二天，将培养基更换为geneabiocells成肌细胞培养基(geneabiocells)或dmem低葡萄糖+2％马血清。在另外2天后，将细胞固定并对dna(hoechst)、快速mhc和核纤层蛋白a/c进行染色。通过共聚焦荧光显微术对细胞进行分析。如图19所示，肌管内人核纤层蛋白a/c阳性细胞核与小鼠核纤层蛋白a/c阴性核的存在证明了干细胞衍生的genea019成肌细胞与另一成肌细胞群体融合的潜力。实施例27：靶向hlai类基因的指导rna(grna)的选择。位于染色体6p21.3上的hla超基因座具有最高频率的人类基因组多态性，使得难以产生靶向多个hlai类等位基因的一组通用的grna，并且构成了hla区的基因组编辑的主要障碍。6p21.3区的完整切除也是有问题的，因为它包含许多必需基因，包括对维持多潜能性至关重要的pou5f1(也称为oct4)。或者，可单独针对每个靶基因生成更高特异性的grna。理想地，对一个或多个hla组而言为纯合的细胞系可用于基因组编辑。基于在一旦进行分化规程(使用geneabiocellsskeletalmuscledifferentiation试剂盒)时产生“高质量”骨骼肌的效率，为基因组编辑进行了胚胎干细胞系的选择。将选择的细胞系送至通过测序的hlai类分型。该测序提供关于类型(等位基因组)、亚型(特异性hla蛋白)和同义核苷酸置换的信息。表4中示出了三种人胚胎细胞系的hlai类谱，并且可在imgt/hla数据库中评估每个等位基因的特定序列。表4.通过对三种人胚胎干细胞系的测序而进行的代表性hla分型。通过首先比对给定细胞系的所有hlai类基因并且找出所有三种hlai类(a、b和c)等位基因之间的同源性区域来定义“感兴趣区域”。除了多态性之外，i类成员之间还具有较高的序列同源性程度。作为实例，比对人胚胎细胞系genea015的hla-a、hla-b和hla-c的两个等位基因的序列(图20)。研究了超过20个核苷酸长的所有外显子同源区中针对cas9或其他基因组编辑酶的原间隔区邻近基序(pam)序列的存在。如图20所示，序列“gcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggatgg”的长度为43个核苷酸，并且是所有genea015hlai类等位基因的共同序列。在该区域中搜索pam序列返回了6个不同的潜在目标，针对其合成了grna。每个grna均具有固有的特异性(根据来自hsu等人，2013的特异性评分)和效率(根据来自doench等人，2014的活性评分)(参见表5)，并且一般来说，这两个指标的值越高，指导质量越好。如图21所示，靶序列位于hla-a的外显子6上。表5.靶向gen015中hla-a、b和c之间的共有区的grna列表。评分为0-100，评分越高表示更加特异或更加有效。实施例28：人胚胎干细胞系中hla基因座的敲除。例如，如实施例27中所示，一旦鉴别了合适的hla靶序列，则可合成grna，并且将其与核酸或蛋白质形式的rna指导的dna核酸内切酶组合递送至细胞。该递送可经由许多不同的方法(例如，转染、脂质转染、转导、氯化钙、核转染、电穿孔、蛋白质转染)来实现。表面蛋白质如cd4或荧光蛋白表达的诱导可有助于该鉴别以及对成功接受酶的细胞的进一步分选。或者，可引入抗生素抗性盒以允许通过将细胞与合适的抗生素一起温育来选择阳性细胞。将分选/选择的细胞合并在一起并扩展。扩展后，使所合并细胞的样品经受t7核酸内切酶i(或surveyor)以检查编辑效率。简而言之，提取基因组dna并且通过pcr将靶区域扩增。将扩增子纯化、变性、退火并且在t7核酸内切酶i的存在下温育。通过非完美匹配dna的退火生成的异源双链体将会被核酸内切酶切割。停止反应，将产物纯化并通过2％琼脂糖凝胶进行解析。凝胶中可见的条带的数目可用于估计基因修饰的百分比。一旦发现编辑，就将细胞以克隆稀释的方式平板接种，并且一旦该克隆被扩展，就使其进行上文针对合并细胞所述的相同过程，但可替代地，可使扩增的靶标直接经历测序或高分辨率解链(hrm)以对修饰进行概况分析。使发现对该编辑呈阳性的克隆经受内部质量控制(多潜能性、比较基因组杂交、支原体)。最终，使选定的编辑细胞克隆再次进行hla分型并且/或者对其进行全基因组测序。确认了hla-ko细胞系生成卫星样细胞和肌管的能力。确认在卫星细胞、成肌细胞和肌管阶段不存在hla抗原。虽然本文已示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。并不意味着本文实施方案的描述和说明以限制的含义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外，应理解，本发明的所有方面都不限于本文提出的特定描述、配置或相对比例，它们取决于多种条件和变量。应理解，在本发明的实践中可采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。本公开内容包含本领域普通技术人员将会理解的本文示例实施方案的所有改变、替代、变化、更改和修改。意在用以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。当前第1页12