用于检测骨髓增殖性疾病中CALR突变的方法和组合物与流程

发明领域

本申请要求于2015年4月23日提交的美国临时申请号62/151742的优先权，其内容在此通过引用整体并入。

发明背景

慢性骨髓增殖性肿瘤(mpn)是克隆性造血干细胞恶性肿瘤，其特征在于血细胞过度产生。真性红细胞增多症(pv)、特发性血小板增多症(et)和特发性骨髓纤维化(mf)是三种最常见的bcr/abl1阴性mpn，与血栓形成和出血、脾肿大以及转化为急性髓系白血病的风险有关。

骨髓增殖性肿瘤(mpn)的分类主要聚焦在特定的疾病定义、在关键的生长调节基因中互相排斥的易位和突变。这些遗传学改变中的一些与在先的临床定义的实体紧密相关，如慢性粒细胞白血病(cml)中的bcr-abl1重排和真性红细胞增多症(pv)中的jak2外显子12突变。还发现其他突变与mpn相关，如jak2v617f、骨髓增殖性白血病基因(mpl)突变和集落刺激因子3受体(csf3r)突变(cazzola等.blood2014年6月12日；123(24):3714-9)。

已经在特发性血小板增多症(et)和原发性骨髓纤维化(pmf)中鉴定了伴侣分子基因钙网织蛋白(calr)中的体细胞突变，并且与jak2和mpl突变基本上互斥(klampfl等.nengljmed2013年12月19日；369(25):2379-90；lundberg等.blood2014年4月3日；123(14):2220-8；nangalia等.nengljmed2013年12月19日；369(25):2391-405；tefferi等.leukemia2014年7月；28(7):1568-70；vannucchi等.leukemia2014年9月；28(9):1811-8)。这些calr突变定位于所述calr基因的外显子9，对et和pmf具有很高的特异性，仅在骨髓发育不良的病例中有少量发现。正常和突变的calr蛋白可以差异性地影响jak-stat信号组分的亚细胞运输(rampal等.blood2014年5月29日；123(22):e123-e133)。et和pmf中两种最常见的与疾病相关的calr突变是在密码子367(类型1)的52-碱基对(bp)缺失和在密码子385(类型2)的5-bpttgtc插入。两者均产生+1bp移码，其产生新的c-末端蛋白质序列，伴随着从酸性到碱性氨基酸残基的转变，其被认为影响伴侣分子的活性(rizvi等molcell2004年9月24日；15(6):913-23)。其他+1bp移码突变(类型3-30)和3个框内外显子9缺失(ensembltmp_esp_19_13054649e393_e395del3和tmp_esp_19_13054685和cosm3355757(p.e405_d408)也已被描述(klampfl等nengljmed2013年12月19日；369(25):2379-90)。

发明概述

在某些实施方案中，本文提供用于检测calr基因的外显子9中的框内缺失突变(indel)的方法。在一些实施方案中，所述突变选自p.e381_a382>a缺失、p.d397_d400>d缺失和p.e405_v409>v缺失。所述检测方法可用于例如骨髓增殖性疾病的诊断、确定患有骨髓增殖性疾病的可能性、确定骨髓增殖性疾病的预后、监测骨髓增殖性疾病、选择用于治疗骨髓增殖性疾病的受试者和/或确定在与骨髓增殖性疾病相关的额外基因中具有或发生突变的可能性。在一些实施方案中，所述方法进一步包含检测一种或多种与骨髓增殖性疾病相关的额外的突变。

在某些实施方案中，本文提供一种用于检测钙网织蛋白(calr)基因的外显子9中的框内缺失突变(indel)的方法，其包括：对患者样品进行核酸检测测定以检测calr外显子9indel突变，其中所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。在一些实施方案中，所述框内缺失突变对应于选自chr19:g.13054615_13054617、chr19:g.13054664_13054672和chr19:g.13054687_13054698的基因组缺失。

在某些实施方案中，本文提供用于检测受试者中钙网织蛋白(calr)基因的外显子9中的框内缺失突变(indel)的方法，其中所述受试者怀疑患有calr相关疾病或jak2相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述calr相关的或jak2相关的疾病或病况是骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，骨髓增殖性疾病选自真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。在一些实施方案中，框内缺失突变对应于选自chr19:g.13054615_13054617、chr19:g.13054664_13054672和chr19:g.13054687_13054698的基因组缺失。

在某些实施方案中，本文提供用于检测受试者中钙网织蛋白(calr)基因的外显子9中的框内缺失突变(indel)的方法，其中所述受试者已经接受了针对calr相关的疾病或病况或jak2相关的疾病或病况的一种或多种治疗。在一些实施方案中，所述calr相关的或jak2相关的疾病或病况是骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况选自真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗包括静脉切开术、血小板单采术、输血治疗、化疗、放疗、手术、生物治疗、靶向治疗、高剂量或干细胞移植。在一些实施方案中，所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。在一些实施方案中，所述框内缺失突变对应于选自chr19:g.13054615_13054617、chr19:g.13054664_13054672和chr19:g.13054687_13054698的基因组缺失。

在某些实施方案中，本文提供用于诊断患者中造血系统疾病的方法，其包含：对包含来自患者的calr核酸的样品进行核酸检测测定，以确定所述核酸是否包含calr外显子9indel突变，其中所述突变选自下组p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v；以及在检测到所述calr外显子9indel突变时将该患者诊断为患有造血系统疾病。在一些实施方案中，所述框内缺失突变对应于选自chr19:g.13054615_13054617、chr19:g.13054664_13054672和chr19:g.13054687_13054698的基因组缺失。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果存在所述calr突变外显子9indel突变，则治疗所述患者。在一些实施方案中，所述造血系统疾病是骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述骨髓增殖性疾病是真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。

在一些实施方案中，所述检测calr外显子9indel突变的方法包括核酸扩增，例如使用引物对，所述引物对包含在所述缺失突变侧翼的正向引物和反向引物。在一些实施方案中，所述核酸扩增方法包括聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、实时pcr(qpcr)或巢式pcr(nestedpcr)。在一些实施方案中，所述方法包括将rna逆转录成cdna。在一些实施方案中，所述方法包括使用标记的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述标记的探针与具有所述缺失的核酸杂交，并且不与野生型序列杂交。在一些实施方案中，所述标记的探针包含序列seqidno:1的约10至30个连续核苷酸并且包含所述calr外显子9缺失位点。在一些实施方案中，所述方法包括测序包含含所述缺失的calr外显子9的全部或部分的扩增子。在一些实施方案中，所述方法包括通过电泳检测包含含的缺失的calr外显子9的全部或部分的扩增子。在一些实施方案中，所述扩增子使用标记的寡核苷酸探针检测。在一些实施方案中，所述核酸在检测之前从样品中分离。用于检测的示例性探针或引物包括具有seqidno:10、11、12和13中的任一个的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述方法包括使用一个或多个引物对扩增包含所述缺失的calr外显子9的一部分。在一些实施方案中，引物对包含选自seqidno:10或12的正向引物。在一些实施方案中，引物对包含选自seqidno:11或13的反向引物。在一些实施方案中，引物对包含选自seqidno:10或12的正向引物和选自seqidno:11或13的反向引物。

在一些实施方案中，所述calr外显子9突变在含有dna或rna的核酸样品中检测。在一些实施方案中，所述核酸是基因组dna。在一些实施方案中，所述核酸是cdna。在一些实施方案中，所述核酸来自从患者获得的生物样品。在一些实施方案中，所述患者样品是流体样品或组织样品。在一些实施方案中，所述患者样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述患者样品是活检样品。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述患者获得所述患者样品。在一些实施方案中，所述患者患有骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述骨髓增殖性疾病选自真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测与骨髓增殖性疾病相关的一种或多种额外的基因中的一个或多个额外的突变。在一些实施方案中，所述一个或多个额外的基因是jak-stat通路基因。在一些实施方案中，所述一种或多种额外的基因是jak2、mpl、csfr3r、asxl1或zrsr2。在一些实施方案中，所述一个或多个额外的突变是单核苷酸多态性、插入、缺失、复制或易位。在一些实施方案中，所述一个或多个额外的突变选自jak2的外显子12、jak2的外显子14、mpl的外显子10或外显子14或外显子17csfr3r中的突变。在一些实施方案中，所述一种或多种额外的突变选自jak2v617f、mplw515l、csfr3ra470t、asxl1d954fs*26或zrsr2s449_r450du。在一些实施方案中，检测jak2v617f。在一些实施方案中，所述额外的突变是美国专利号8,512,948的表2中公开的jak2中的突变。

在一些实施方案中，检测本文提供的突变进一步包含使用分析装置进行分析。在一些实施方案中，所述分析装置包括计算机。在一些实施方案中，所述分析装置包括序列分析器。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果所述患者具有本文提供的calr外显子9突变，则向所述患者施用治疗。在一些实施方案中，所述治疗包含静脉切开术、血小板单采术、输血治疗、化疗、放疗、手术、生物治疗、靶向治疗、高剂量或干细胞移植。在一些实施方案中，所述治疗包括施用三氧化二砷、阿扎胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、盐酸多柔比星、甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼、鲁索替尼磷酸盐和硫酸长春新碱。

在某些实施方案中，本文提供用于确定患者会在jak-stat通路基因中发生突变的可能性的方法，其包括：对包含来自患者的calr核酸的样品进行核酸检测测定，以确定所述核酸是否包含calr外显子9indel突变，其中所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v；以及如果检测到所述calr外显子9indel突变，则诊断所述个体在jak-stat通路基因中发生突变的可能性增加。在一些实施方案中，所述jak-stat通路基因是jak2、mpl、csfr3r、asxl1或zrsr2。在一些实施方案中，所述突变选自jak2的外显子12、jak2的外显子14、mpl的外显子10或csfr3r的外显子14或外显子17中的突变。在一些实施方案中，所述一种或多种额外的突变选自jak2v617f、mplw515l、csfr3ra470t、asxl1d954fs*26或zrsr2s449_r450du。在一些实施方案中，所述患者患有骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述骨髓增殖性疾病选自真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对样品进行核酸检测测定以检测jak-stat通路基因中的突变。在一些实施方案中，所述jak-stat通路基因是jak2、mpl、csfr3r、asxl1或zrsr2。

在某些实施方案中，本文提供用于确定患有骨髓增殖性疾病的患者的预后的方法，其包括：对包含来自患者的calr核酸的样品进行核酸检测测定以确定所述核酸是否包含calr外显子9indel突变，其中所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v；以及当检测到calr外显子9indel突变时诊断患者具有较差的预后。在一些实施方案中，骨髓增殖性疾病选自真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。

在某些实施方案中，本文提供包含引物或探针的试剂盒，所述引物或探针与核酸样品中包含calr外显子9indel突变的靶核酸互补并特异性杂交，其中所述突变选自下组：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括适合于扩增calr核酸的酶。在一些实施方案中，所述引物或探针包含序列seqidno:1的约10至30个连续核苷酸并且包含所述calr外显子9缺失位点(例如跨越所述缺失的断点位点)。在一些实施方案中，所述引物或探针在所述缺失断点的两侧含有约至少一个核苷酸)。在一些实施方案中，所述引物或探针用一种或多种放射性同位素、荧光团、发色团、染料、酶或飞行时间(tof)(timeofflight(tof))载体标记。在一些实施方案中，将所述引物或探针配置为指示通过聚合酶链式反应(pcr)、逆转录pcr(rt-pcr)、荧光共振能量转移(fret)、化学发光、酶促信号放大、电子密度颗粒、磁性粒子、电容耦合或质谱等的杂交或结合。在一些实施方式中，所述探针以微阵列的形式固定在基底上。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含指示参考calr序列的对照引物或探针。

在某些实施方案中，本文提供分离的calr蛋白，其包含选自下组的外显子9框内氨基酸缺失突变：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。

在某些实施方案中，本文提供具有编码calr蛋白的核苷酸序列的分离的核酸分子，其包含选自下组的外显子9框内氨基酸缺失突变：p.e381_a382>a、p.d397_d400>d、p.e405_v409>v。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子可操作地连接至启动子。在某些实施方案中，本文提供包含本文提供的任何分离的核酸分子的克隆或表达载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。

在某些实施方案中，本文提供细胞，例如包含本文提供的任何分离的核酸分子或载体的哺乳动物细胞。

在某些实施方案中，本文提供包含本文提供的任何所述分离的核酸分子或载体的非人转基因动物。

在某些实施方案中，本文提供包含序列seqidno:1的约10至30个连续核苷酸并包含所述calr外显子9缺失位点的寡核苷酸探针或引物。示例性的探针或引物包括具有seqidnos:10、11、12和13中任何一个的序列的核酸分子。

在一些实施方案中，除了本文提供的calr外显子9indel突变之外，用于检测的额外的变体选自asxl1、calr、cbl、cebpa、csf3r、ddx41、dnmt3a、ezh2、flt3、gata1、idh1、idh2、jak2、kdm6a、kit、kras、mll、mpl、npm1、nras、ptpn11、runx1、setbp1、sf3b1、srsf2、tet2、tp53、u2af1、wt1和zrsr2基因中的变体。

在一些实施方案中，除了本文提供的calr外显子9indel突变外，用于检测的额外的变体选自abl1、asxl1、atrx、bcor、bcorl1、braf、calr、cbl、cblb、cblc、cdkn2a、cebpa、csf3r、cux1、ddx41、dnmt3a、etv6/tel、ezh2、fbxw7、flt3、gata1、gata2、gnas、hras、idh1、idh2、ikzf1、jak2、jak3、kdm6a、kit、kras、mll、mpl、myd88、notch1、npm1、nras、pdgfra、phf6、ptpn11、raf21、runx1、setbp1、sf3b1、smc1a、smc3、srsf2、stag2、tet2、tp53、u2af1、wt1和zrsr2基因中的变体。

附图简述

图1显示用于检测变体的miseq测序方法的概况。

图2显示(a)产生c末端修饰蛋白的示例性外显子9calr框内缺失(indel)的代表性序列(p.d397_d400>d)和(b)来自不同物种的野生型calr蛋白c端的代表性比对。参考序列来源于np_004334(智人)(seqidno:2)、xp_003316194(黑猩猩)(seqidno:4)、np_001248060(猕猴)(seqidno:5)、xp_867310.2(家犬)(seqidno:6)、np_031617.1(小家鼠)(seqidno:8)以及np_071794.1(褐家鼠)(seqidno:9)。最常见的框内缺失是保守的(下划线)。

图3显示(a)产生c-末端修饰蛋白的示例性外显子9calr框内缺失(indel)的代表性序列(p.e405_v409>v)。

图4显示(a)产生c-末端修饰蛋白(p.e381_a382>a)的示例性外显子9calr框内缺失(indel)的代表性序列。

图5显示所述calr蛋白的结构域，具有受到移码突变影响的区域和最常见的框内c-末端大小多态性高亮标识。在内质网运输期间，n结构域和c结构域是相互作用蛋白结合的主要位点。et/pmf中的p.l367fs*46+1-bp突变导致所述c-末端序列从酸性主导转变到碱性氨基酸且内质网滞留基序kdel丧失。

发明详述

本发明以对诊断患有骨髓增殖性肿瘤的患者中calr基因的外显子9中数个框内缺失(indel)突变的鉴定为基础。所述突变包括p.e381_a382>a缺失、p.d397_d400>d缺失和p.e405_v409>v缺失。因此，本发明提供了具有这些基因突变并导致突变蛋白的变体核酸、用于检测本文公开的变体的方法和试剂、这些变体用于开发检测试剂的用途以及利用这些试剂的测定法或试剂盒。本发明进一步提供用于造血系统疾病(包括例如骨髓增殖性疾病)的诊断、预后和监测的组合物和方法。

一些术语

本说明书中使用的一些术语具有以下定义的含义。未定义的术语具有其领域认可的含义。也就是说，除非额外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

除另有说明外，本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数的表述。因此，例如“寡核苷酸”的表述包括多个寡核苷酸分子，标记物的表述意指一个或多个标记物，探针的表述意指一个或多个探针，而“核酸”的表述意指一个或多个核酸。

如本文所使用的，当在数值(例如温度、时间、量和浓度，包括范围)之前使用时，术语“约”指示可以变化大约±10％、5％或1％的近似值。

如本文所用，术语“分离的”，“纯化的”或“基本上纯化的”意指从其天然环境中移出，分离或分离的(separated)分子，如核酸分子或多肽，并且至少60％没有，优选75％没有，最优选90％没有与其天然结合的其它组分。因此分离的分子是基本纯化的分子。

在基因片段或染色体片段语境中的“片段”意指核苷酸残基序列，其为至少或约10个核苷酸、至少或约20个核苷酸、至少或约25个核苷酸、至少或约30个核苷酸、至少或约40个核苷酸、至少或约50个核苷酸、至少或约100个核苷酸、至少或约250个核苷酸、至少或约500个核苷酸，至少或约1000个核苷酸、至少或约2000个核苷酸。

术语“同一性”和“相同的”意指序列之间的同一性程度。可以有部分同一性或完全同一性。部分同一性的序列是与另一个序列小于100％相同的序列。部分相同的序列可具有至少70％或至少75％，至少80％或至少85％，或至少90％或至少95％的总体同一性。

如本文所用的术语“可检测标记”意指与探针相关的分子或化合物或一组分子或一组化合物，并用于鉴定与核酸分子杂交的探针，例如基因组核酸分子、rna核酸分子、cdna分子或参照核酸。

如本文所使用的，术语“检测”意指观察来自可检测标记的信号以指示靶标的存在。更具体而言，检测是用在检测靶核酸分子的特定序列的语境中。在检测来自可检测标记的信号以指示样品中靶核酸存在的语境中，所述术语“检测”不需要该方法提供100％灵敏度和/或100％特异性。优选为至少50％的灵敏度，尽管至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的灵敏度是更优选的。优选为至少50％的特异性，尽管至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和至少99％的特异性是更优选的。检测还涵盖了产生假阳性和假阴性的测定法。假阴性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。假阳性率可以是1％、5％、10％、15％、20％或甚至更高。

如本文所用，术语“扩增”和“进行扩增(amplify)”涵盖用于复制或再生具有特定序列的靶核酸分子的所有方法，由此增加样品中核酸序列的拷贝数或量。所述扩增可以是指数性或线性的。靶核酸可以是dna或rna。以这种方式扩增的靶核酸在本文中被称为“扩增子”。虽然本文描述的说明性方法涉及使用聚合酶链式反应(pcr)的扩增，本领域还已知大量其他方法用于扩增核酸例如但不限于等温方法、滚环方法等。技术人员理解，这些其他方法可以用于代替pcr方法或与其结合使用。参见例如saiki,“amplificationofgenomicdna”inpcrprotocols,innis等,eds.,academicpress,sandiego,ca1990,pp13-20；wharam等,nucleicacidsres.2001jun1；29(11):e54-e54；hafner等,biotechniques2001apr；30(4):852-860；zhong等,biotechniques2001apr；30(4):852-6,858,860。

如本文所用的，术语“寡核苷酸”意指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合组成的短的核酸聚合体。寡核苷酸通常长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30至约150个核苷酸(nt)，更优选地长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30至约70nt。根据本文描述的及本领域公知的方法，寡核苷酸可用作引物或探针。

如本文所用的，“特异性”针对核酸的寡核苷酸是这样的寡核苷酸：在合适的杂交或洗涤条件下，其能与感兴趣的靶标杂交而基本不与不感兴趣的核酸杂交。较高水平的序列同一性是优选的，且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和更优选为至少98％序列同一性。序列同一性可以用市售的计算机程序，按照采用本领域熟知算法的初始设定来确定。在一些实施方案中，寡核苷酸针对在编码靶缺失突变的所述calr序列侧翼的calr基因组序列是特异性的。在一些实施方案中，寡核苷酸针对calr缺失突变是特异性的(例如等位基因特异性)并且不与野生型calr序列杂交。例如，在一些实施方案中，特异性针对所述calr缺失突变的寡核苷酸跨越缺失的5'末端和3'末端之间的交接处。在一些实施方案中，寡核苷酸特异性针对外显子9内的calr序列。在一些实施方案中，将寡核苷酸设计为仅在缺失突变存在时扩增calr编码区。

用于核酸扩增的“引物”是与靶核苷酸序列特异性退火并在dna或rna聚合酶的存在下引起向引物的3’末端添加核苷酸的寡核苷酸。本领域已知，引物的3’核苷酸通常应与靶核酸序列在对应的核苷酸位置处相同，以用于最佳的表达和扩增。本文所用的术语“引物”包括可合成的所有形式的引物，包括但不限于肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物，等等。引物可以是天然存在的，如从生物样品或从限制性消化中纯化，或合成产生。在一些实施方案中，引物的长度可以是大约15-100个核苷酸，通常是15-25个核苷酸的长度。引物的确切长度取决于许多因素，包括杂交和聚合的温度，引物来源和所使用的方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可以含有更少或更多的核苷酸。涉及确定引物的适当长度的因素是本领域普通技术人员容易知晓的。本领域技术人员了解术语“正向引物”和“反向引物”通常意指与在靶核酸侧翼的序列互补并用于扩增所述靶核酸的引物。通常，“正向引物”是与dna的反义链互补的引物，“反向引物”与dna的正义链互补。

如本文所用，“探针”意指具有或包含与另一多核苷酸(例如靶多核苷酸或另一寡核苷酸)互补的序列的寡核苷酸类型。用于本文所描述的方法的探针理想地长度为小于或等于500个核苷酸，通常在约10个核苷酸至约100个之间，例如，约15个核苷酸至约40个核苷酸。用于本文所描述的方法的探针通常用于通过与靶核酸特异性杂交来检测靶核酸序列。所述靶核酸包括，例如如本文所描述的基因组核酸、表达的核酸、反转录的核酸、重组核酸、合成的核酸、扩增产物或延伸产物。

如本文所用的术语“多重pcr”意指在同一反应容器内同时提供两个或更多个扩增子的核酸扩增和检测的测定法。每个靶核酸使用不同的引物对进行引导。多重反应可以进一步包括特异性针对每个扩增子的探针，将该探针用可检测部分可检测地标记用于区分扩增子。在一些实施方案中，将针对每个扩增子的探针用不同的可检测部分可检测地标记。在一些实施方案中，将针对每个扩增子的探针用相同的可检测部分可检测地标记。在一些实施方案中，所述可检测部分以允许选择性除去可检测部分的方式与特异性探针连接。

术语“巢式聚合酶链式反应”是对聚合酶链式反应的修改，其涉及两组引物，用于聚合酶链式反应的两次连续运行，第二组打算用于扩增来自第一次运行产物的靶标。

本文所用于指代多核苷酸(例如核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补”、“互补的”或“互补性”意指标准沃森/克里克(watson/crick)配对规则。核酸序列的互补是按照“反向平行结合”的，如一个序列的5’末端与另一序列的3’末端序列配对。例如，序列“5’-a-g-t-3’”与序列“3’-t-c-a-5’”是互补的。可以在本文所述的核酸中包含一些天然核酸中不常见的碱基；其包括，例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)、锁核酸(lna)、和肽核酸(pna)。互补性不需要是完美的；稳定的双螺旋可以含有错配的碱基对、简并的或不匹配的碱基。核酸技术领域技术人员能按经验考虑一些变量来确定双螺旋稳定性，所述变量包括，例如寡核苷酸长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对发生率。

如本文所用的，检测基因或蛋白质中的突变可以通过进行合适的分析来完成。为了检测生物样品中基因或蛋白质中的突变，测定生物样品以确定突变基因或突变蛋白质的存在或缺乏。该测定可以包括从样品中提取核酸(例如总基因组dna和/或rna)，并通过本领域已知的方法分析提取的核酸。测定可涉及从生物样品中分离蛋白质并分析蛋白质。然而，测定不需要涉及提取核酸或分离蛋白质。也就是说，可以采用一些分析法直接分析生物样品而不提取或分离核酸或蛋白质。

如本文所用的，术语“受试者”或“个体”意指哺乳动物，例如人，但也可以是另一种动物，如家畜(例如，狗，猫等)，农场动物(例如，牛，绵羊，猪，马等)或实验动物(例如猴，大鼠，小鼠，兔，豚鼠等)。

如本文所用的，术语“样品”或“测试样品”意指可用于测试核酸存在的任何液体或固体(或两者)材料。在一些实施方案中，测试样品是生物样品，如细胞或组织，或其部分或碎片。生物样品可以包含临床样品(即直接从患者获得)或分离的核酸。在一些实施方案中，样品是从来自受试者的组织或体液中获得的。样品来源包括但不限于体液，例如但不限于全血或任何类型的分离的血细胞(例如骨髓细胞、淋巴细胞)、血浆、血清、痰(加工的或未加工的)、脑脊液(csf)、胸膜液、泪液、乳管导管液、淋巴液、尿液、唾液、羊水、或精液、支气管肺泡灌洗液(bal)、支气管洗液(bw)或组织(例如活检材料)。样品可以是细胞(即含有全细胞)或无细胞(即不含全细胞)的液体和/或组织(例如活检)样品。“无细胞体液”包括小于约1％(w/w)的全细胞材料。血浆或血清是无细胞体液的例子。样品可以包括天然或合成来源的样品。示例性的样品组织包括但不限于骨髓或组织(例如活检材料)。获得测试样品和参照样品的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于抽吸、组织切片、血液或其他流体的抽取、外科手术或穿刺活检、石蜡包埋的组织的收集、体液收集、粪便收集等。在本文中，所述生物学样品优选地是血液、血清或血浆样品。如本文所用，术语“患者样品”意指从寻求疾病诊断和/或治疗的人获得的样品，特别是骨髓增殖性疾病。在一些实施方案中，所述样品来源于患有或怀疑患有calr相关疾病或病况的受试者。在一些实施方案中，所述样品来源于患有或怀疑患有jak2相关疾病或病况的受试者。在一些实施方案中，所述样品来源于已经接受jak2相关疾病或病况或calr相关疾病或病况的一种或多种治疗的受试者。在一些实施方案中，所述calr相关的或jak2相关的疾病或病况是骨髓增殖性疾病。

如本文所用的，术语“calr基因”意指钙网织蛋白基因，其编码钙网织蛋白。如本文所用的，该术语可以指编码calr蛋白的任何核酸，例如基因组dna、mrna、cdna或其他工程化的/重组的核酸或其部分。该术语包括ncbi登录号nm_004343.3(seqidno:3)或其编码区(seqidno:1)所示的核酸序列，以及天然的和工程化的异构体和变体。该术语包括rna转录物，包括seqidno:1的全部或一部分，编码seqidno:1的基因组序列，以及所有未翻译的calr基因组序列，例如内含子，非翻译前导区和聚腺苷酸化信号。该术语所涵盖的说明性核酸序列可在马里兰州贝塞斯达生物技术信息国家中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)和英国hugo基因命名委员会(www.genenames.org)公开获得。

如本文所用，术语“calr蛋白”通常意指钙网织蛋白，在本领域中也称为sicca综合征抗原a、自身抗原ro、内质网滞留蛋白60(erp60)、crp55、hacbp、grp60、hel-s-99n、cc1qr、钙调蛋白或附睾分泌性精子结合蛋白li99n。如本文所用，该术语可以指任何calr蛋白、多肽或其部分。该术语包括ncbi登录号np_004334.1(seqidno:2)中所示并由seqidno:1编码的氨基酸序列、以及天然的和工程化的异构体和变体。示例性calr蛋白包括但不限于np_004334(智人)(seqidno:2)、xp_003316194(黑猩猩)(seqidno:4)、np_001248060(猕猴)(seqidno:5)、xp_867310.2(家犬)(seqidno:6)、np_776425.1(欧洲牛)(seqidno:7)、np_031617.1(小家鼠))(seqidno:8)以及np_071794.1(褐家鼠)(seqidno:9)。

如本文所用，术语“calr突变体”通常意指与野生型序列不同的calr核酸或氨基酸序列，例如如seqidno:1和seqidno:2所示的序列。该术语包括本领域已知的所有方式的突变，包括但不限于插入、缺失、取代和染色体倒位，涵盖沉默突变和改变calr功能的突变，并且涵盖功能获得和功能失去突变。在本文所描述的一些实施方案中，calr突变包含p.e381_a382>a、p.d397_d400>d或p.e405_v409>v缺失。

本文所描述的calr核酸和蛋白质序列可以从任何来源分离，包括但不限于人类患者、实验室动物或兽医动物(例如狗、猪、牛、马、大鼠、小鼠等)、来自其的样品(例如组织或体液，或其提取物)、或来自其的细胞(例如，原代细胞或细胞系，或其提取物)。

术语“p.e381_a382>a缺失”意指calr基因中的突变，其中删除对应基因组位置chr19:g.13054615_13054617(参照grch37/hg19)处的核苷酸agg(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1142-1144)的核苷酸。这种框内插入/缺失(indel)突变导致calr蛋白中的p.e381_a382>a缺失突变，其中将seqidno:2的氨基酸位置381-382处的谷氨酸-丙氨酸(ea)二肽删除并由丙氨酸(a)取代。

术语“p.d397_d400>d缺失”意指calr基因中的突变，其中删除对应基因组位置chr19:g.13054664_13054672(参照grch37/hg19)处的核苷酸tgaggagga(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1182-1190)的核苷酸。这种框内插入/缺失(indel)突变导致所述calr蛋白中的p.d397_d400>d缺失突变，其中将seqidno:2的氨基酸位置397-400处的四肽deed删除并由天冬氨酸(d)取代。

术语“p.e405_v409>v缺失”意指calr基因中的突变，其中删除对应基因组位置chr19:g.13054687_13054698(参照grch37/hg19)处的核苷酸aggaggaagatg(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1214-1225)的核苷酸。这种框内插入/缺失(indel)突变导致calr蛋白中的p.e405_v409>v缺失突变，其中将seqidno:2的氨基酸位置405-409上的五肽eeedv删除并由缬氨酸(v)取代。

如本文所用的术语“接合状态”意指个体对于基因或基因突变是纯合的，即两个等位基因具有相同的基因或基因突变拷贝，或者对于基因或基因突变是杂合的，即仅一个等位基因具有该基因或基因突变的拷贝。

术语“骨髓增殖性疾病(mpd)”和“骨髓增殖性肿瘤(mpn)”或“骨髓增殖性异常”在本文中互换使用，意指由造血干细胞或其后代引起的非淋巴性发育不良或肿瘤病况。骨髓增殖性疾病通常表现为异常细胞分裂，导致具体的血液细胞群的异常水平。以增殖性血液异常为基础的异常细胞分裂通常是细胞固有的，而不是对感染或炎症的正常生理反应。示例性骨髓增殖性疾病包括但不限于真性红细胞增多症(pv)、特发性血小板增多症(et)和特发性骨髓纤维化(imf)。本文所用的定义还包括急性髓系白血病(aml)，骨髓增生异常综合征(mds)、慢性骨髓性白血病(cml)、嗜酸性粒细胞增多综合征(hes)、慢性嗜中性白血病(cnl)、伴有髓样化生的骨髓纤维化(mmm)、慢性骨髓单核细胞白血病(cmml)、青少年骨髓单核细胞白血病、慢性嗜碱性白血病、慢性嗜酸细胞性白血病、系统性肥大细胞增多症(sm)和未分类的骨髓增殖性疾病(umpd或mpd-nc)。

如本文所用的术语“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosis)”或“诊断(diagnosing)”意指区分或鉴定疾病、综合征或病况或区分或鉴定患有具体的疾病、综合征或病况的人。通常，疾病或异常的诊断基于评估指示疾病的一种或多种因素和/或症状。也就是说，诊断可以基于指示所述疾病或病况的存在或缺乏的因素的存在、缺乏或量。被认为是对具体疾病的诊断具有指示性的每个因素或症状不需要唯一地与所述具体疾病有关；即可以从诊断因素或症状中推断出不同的诊断。同样地，可能有指示具体疾病的因素或症状存在于没有该具体疾病的个体中的情况。

如本文所用的术语“预后”意指预测临床病况或疾病的可能过程和结果。患者的预后通常通过评估指示疾病的有利或不利过程或结果的疾病的因素或症状来进行。

如本文所用的短语“确定预后”意指这样的过程，通过该过程本领域技术人员能够预测患者病况的病程或结果。术语“预后”并不意指能够以100％的准确度预测病情的病程或结果。相反，本领域技术人员会理解，术语“预后”意指某一过程或结果将发生的升高的可能性；也就是说，与未表现出所述病况的个体相比，过程和结果更可能发生在表现出给定病况的患者中。预后可以表示为患者可被期望生存的时间量。或者，预后可以指疾病缓解的可能性或疾病可被期望停留在缓解期的时间量。预后可以用各种方式来表示；例如预后可以表示为患者在一年、五年、十年等之后会存活的百分比机会。或者，预后可以表示为患者可以期望的作为病况或疾病的结果的存活的平均年数。患者的预后可以被认为是相对主义的表示，很多因素影响最终结果。例如，对于有某些病况的患者，预后可以适当地表示为病况可治疗或可治愈的可能性，或疾病会缓解的可能性，而对于具有更严重病况的患者，预后可以更适当地表达为在特定时间段内生存的可能性。

如本文所用的术语“不良预后”意指在患者患有骨髓增殖性疾病且有calr基因突变的情况下，相对于患有相同疾病但没有所述突变的患者，所述患者会有一个在临床病况中更坏的结果升高的可能性。不良预后可以用任何相关的预后术语来表示，并且可以包括例如减少的缓解持续时间、降低的存活率以及缩短的生存期的期望。

如本文所用的，当修饰结合部分时，术语“特异性结合”意味着该部分能够区分各种靶序列。例如，与突变靶序列特异性结合的寡核苷酸(例如，引物或探针)相对于其他序列变体(例如突变体和多态性序列)优先与靶序列(例如所述野生型序列)杂交。优选地，寡核苷酸在高度严格杂交条件下与其靶序列特异性结合。

如本文所用的“杂交(hybridization)”或“进行杂交(hybridizing)”意指这样的过程：通过该过程寡核苷酸单链在限定的杂交条件下与互补链经碱基配对而退火。这是两个互补的多核苷酸之间的特异性的，即非随机的相互作用。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性以及形成的杂交体的tm等因素的影响。

如本文所用的，术语“严格性”用于修饰进行核酸杂交的温度、离子强度和存在其他化合物的条件。在高度严格性条件下，核酸碱基配对将仅发生在具有足够长的带有高频互补碱基序列的片段之间。

示例性的杂交条件如下。高严格性通常意指允许仅那些在65℃下在0.018mnacl中形成稳定杂交体的核酸序列杂交的条件。高严格性的杂交条件可以，例如，由在42℃下在50％甲酰胺、5×denhardt's溶液、5×ssc(盐水柠檬酸钠)、0.2％sds(十二烷基硫酸钠)中杂交，然后在65℃下在0.1×ssc和0.1％sds中洗涤提供。中严格性意指相当于在42℃下在50％甲酰胺、5×denhardt's溶液、5×ssc、0.2％sds中杂交，然后在65℃下在0.2×ssc、0.2％sds中洗涤的条件。低严格性意指相当于在10％甲酰胺，5×denhardt's溶液、6×ssc、0.2％sds中杂交，然后在50℃下在1×ssc、0.2％sds中洗涤的条件。

calrindel突变

本文提供用于检测所述calr基因的外显子9中的框内缺失突变的方法。在一些实施方案中，所述calr基因包含在基因组位置chr19:g.13054615_13054617(参照grch37/hg19)处的核酸缺失(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1142-1144)。例如，在一个实施方案中，所述突变导致一种calr蛋白，其中seqidno:2的e381和a382由丙氨酸(a)单独取代。在一些实施方案中，所述calr基因包含在基因组位置chr19:g.13054664_13054672(参照grch37/hg19)处的核酸缺失(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1182-1190)。例如，在一个实施方案中，所述突变导致一种calr蛋白，其中seqidno:2的d397、e398、e399和d400由天冬氨酸(d)单独取代。在一些实施方案中，所述calr基因包含在基因组位置chr19:g.13054687_13054698(参照grch37/hg19)处核酸缺失(对应calr核苷酸编码序列seqidno:1的核苷酸1214-1225)。例如，在一个实施方案中，所述突变导致一种calr蛋白，其中seqidno:2的e405、e406、e407、d408和v409由缬氨酸(v)单独取代。在一些实施方案中，所述方法进一步包含检测所述calr基因中的一个或多个额外的突变。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述一种或多种额外的基因中的一个或多个额外的突变。在一些实施方案中，所述一种或多种额外的基因与骨髓增殖性异常相关。

p.e381_a382>a缺失突变

在本文提供的一些实施方案中，calr基因中的p.e381_a382>aindel突变在含有calr核酸的样品中检测。calr核酸通过任何合适的方法进行评估，包括例如通过核酸测序或寡核苷酸杂交。例如，p.e381_a382>aindel突变可以通过扩增含有全部或部分所述突变的calr核酸(例如，基因组dna、rna或cdna)的靶序列来评估。相关地，p.e381_a382>aindel突变的检测可以涉及使用能够与突变位点特异性杂交的探针和/或引物。来自calr基因的用于评估此突变的存在的一个合适的靶核酸序列包含calr的外显子9的全部或部分。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19.13054525-13054728处的核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19:g.13054615_13054617处的核酸。靶序列(包括涵盖此突变的引物和探针序列)可以具有任何合适的长度(例如长度为20、25、30、35、40、50、100、200、300或更多个核苷酸)。核酸可以是dna和/或rna。

或者，p.e381_a382>aindel突变的存在可以通过评价患者样品中calr蛋白的存在来评估，例如通过特异性检测p.e381_a382>acalr蛋白变体。calr蛋白评估可以通过任何适当的方法进行，包括氨基酸测序或通过使用突变的calr特异性抗体(例如使用elisa)。突变的calr蛋白可以通过对包含该变体的calr蛋白的全部或部分进行氨基酸测序来评估。任选地，抗体(多克隆或单克隆)可以针对具有包含该变体的calr蛋白的全部或部分的序列的多肽表位产生。

用于检测突变核酸和/或编码的突变蛋白的额外的方法在本文其他地方提供，并且可以用于检测p.e381_a382>aindel突变。

p.d397_d400>d缺失突变

在本文提供的一些实施方案中，calr基因中的p.d397_d400>dindel突变在含有calr核酸的样品中检测。calr核酸通过任何合适的方法进行评估，包括例如通过核酸测序或寡核苷酸杂交。例如，p.d397_d400>dindel突变可以通过扩增含有全部或部分所述突变的calr核酸(例如，基因组dna、rna或cdna)的靶序列来评估。相关地，p.d397_d400>dindel突变的检测可以涉及使用能够与突变位点特异性杂交的探针和/或引物。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19.13054525-13054728处的核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19:g.13054664_13054672的核酸。靶序列(包括涵盖此突变的引物和探针序列)可以具有任何合适的长度(例如长度为20、25、30、35、40、50、100、200、300或更多个核苷酸)。核酸可以是dna和/或rna。

或者，p.d397_d400>dindel突变的存在可以通过评价患者样品中calr蛋白的存在来评估，例如通过特异性检测p.d397_d400>dcalr蛋白变体。calr蛋白评估可以通过任何适当的方法进行，包括氨基酸测序或通过使用突变的calr特异性抗体(例如使用elisa)。突变的calr蛋白可以通过对包含该变体的calr蛋白的全部或部分进行氨基酸测序来评估。任选地，抗体(多克隆或单克隆)可以针对具有包含该变体的calr蛋白的全部或部分的序列的多肽表位产生。

用于检测突变核酸和/或编码的突变蛋白的额外的方法在本文其他地方提供，并且可以用于检测p.d397_d400>dindel突变。

p.e405_v409>v缺失突变

在本文提供的一些实施方案中，calr基因中的p.e405_v409>vindel突变在含有calr核酸的样品中检测。calr核酸通过任何合适的方法进行评估，包括例如通过核酸测序或寡核苷酸杂交。例如，p.e405_v409>vindel突变可以通过扩增含有全部或部分所述突变的calr核酸(例如，基因组dna，rna或cdna)的靶序列来评估。相关地，p.e405_v409>vindel突变的检测可以涉及使用能够与突变位点特异性杂交的探针和/或引物。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19.13054525-13054728处的核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸序列包含对应基因组位置chr19:g.13054687_13054698处的核酸。靶序列(包括涵盖此突变的引物和探针序列)可以具有任何合适的长度(例如长度为20、25、30、35、40、50、100、200、300或更多个核苷酸)。核酸可以是dna和/或rna。

或者，p.e405_v409>vindel突变的存在可以通过评价患者样品中calr蛋白的存在来评估，例如通过特异性检测p.e405_v409>vcalr蛋白变体。calr蛋白评估可以通过任何适当的方法进行，包括氨基酸测序或通过使用突变的calr特异性抗体(例如使用elisa)。突变的calr蛋白可以通过对包含该变体的calr蛋白的全部或部分进行氨基酸测序来评估。任选地，抗体(多克隆或单克隆)可以针对具有包含该变体的calr蛋白的全部或部分的序列的多肽表位产生。

用于检测突变核酸和/或编码的突变蛋白的额外的方法在本文其他地方提供，并且可以用于检测p.e405_v409>vindel突变。

jak-stat通路突变

如本文所述，calr外显子9中的indel突变与编码参与jak-stat通路的蛋白质的基因(特别是在患有骨髓增殖性疾病的患者中)中体细胞突变的频率较高有关。在本文提供的一些实施方案中，受试者中calrindel外显子9突变的检测表明受试者将在编码涉及骨髓增殖性疾病的蛋白质的基因中发生体细胞突变的可能性较高。在具体情况下，所述体细胞突变发生在编码jak-stat通路蛋白的基因中。在一些实施方案中，突变的所述基因是jak2，mpl、csfr3r、asxl1或zrsr2。在一些实施方案中，突变位于jak2的外显子12、mpl的外显子10或外显子14或外显子17csfr3r中。在一些实施方案中，所述突变是jak2v617f、mplw515l、csfr3ra470t、asxl1d954fs*26或zrsr2s449_r450du(c.1338_1343dupggccg)。

因此，本文提供用于检测一种或多种与骨髓增殖性异常相关的额外的基因中的一种或多种额外的突变的方法。在一些实施方案中，所述基因编码jak-stat通路蛋白。在一些实施方案中，检测jak2、mpl、csfr3r、asxl1、或zrsr2中的突变。在一些实施方案中，检测jak2的外显子12、mpl的外显子10或外显子14或外显子17csfr3r中的突变。在一些实施方案中，检测bcr-abl1易位。在一些实施方案中，检测jak2v617f,mplw515l、csfr3ra470t、asxl1d954fs*26或zrsr2s449_r450du的突变。(c.1338_1343dupggccg)。在一些实施方案中，检测涉及fgfr1、pdgfra或pdgfrb的易位。在一些实施方案中，所述额外的突变是美国专利号8,512,948的表2中公开的jak2中的突变。

在一些实施方案中，本文所描述的用calr突变体检测的额外的变体选自选自下组基因中的变体：asxl1、calr、cbl、cebpa、csf3r、ddx41、dnmt3a、ezh2、flt3、gata1、idh1、idh2、jak2、kdm6a、kit、kras、mll、mpl、npm1、nras、ptpn11、runx1、setbp1、sf3b1、srsf2、tet2、tp53、u2af1、wt1和zrsr2的基因中的变体。在一些实施方案中，用本文所描述的calr突变体检测的额外的变体选自表1中公开的外显子中的变体。

在一些实施方案中，用本文所述的calr突变体检测的额外的变体选自选自下组基因中的变体：abl1、asxl1、atrx、bcor、bcorl1、braf、calr、cbl、cblb、cblc、cdkn2a、cebpa、csf3r、cux1、ddx41、dnmt3a、etv6/tel、ezh2、fbxw7、flt3、gata1、gata2、gnas、hras、idh1、idh2、ikzf1、jak2、jak3、kdm6a、kit、kras、mll、mpl、myd88、notch1、npm1、nras、pdgfra、phf6、ptpn11、raf21、runx1、setbp1、sf3b1、smc1a、smc3、srsf2、stag2、tet2、tp53、u2af1、wt1和zrsr2。

在一些实施方案中，检测在calr基因中的额外的突变。在一些实施方案中，所述额外的突变是在calr基因的外显子9中的额外的突变。在一些实施方案中，所述额外的突变是calr基因中的+1移码突变。

在一些实施方案中，所述方法包括监测calr外显子9中具有indel突变的患者在涉及骨髓增殖性疾病的基因中发生体细胞突变。在一些实施方案中，所述基因编码jak-stat通路蛋白。在一些实施方案中，所述患者患有骨髓增殖性疾病。

在一些实施方案中，所述方法包括监测正在接受骨髓增殖性疾病治疗的患者在calr外显子9中发生indel突变。在一些实施方案中，所述方法包括监测正在接受骨髓增殖性疾病治疗的患者在calr外显子9中发生indel突变以及在jak-stat通路基因(包括但不限于jak2、mpl、csfr3r、asxl1或zrsr2)中的一个或多个突变。因此，所述方法可以用作伴随诊断，用于检测在已经接受一种或多种骨髓增殖性疾病(例如真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病)治疗的受试者中的calr外显子9indel突变。

样品收集和准备

本发明的方法和组合物可用于使用从个体获得的生物样品检测calr基因中的突变和本文所述的其他突变。样品可以从怀疑具有突变的核酸序列的患者中获得，例如从含有肿瘤细胞或癌细胞的流体样品的组织中获得。提供的所述方法可以使用任何含有核酸的样品进行。在一些实施方案中，所述核酸是脱氧核糖核酸(dna)。在一些实施方案中，所述核酸是核糖核酸(rna)。如本文所述，可以处理所述样品以释放或以其他方式使核酸可用于检测。所述核酸(例如dna或rna)可以根据本领域技术人员公知的任何方法从所述样品中分离。这种处理可以包括核酸操作的步骤，例如通过逆转录来自生物样品中的rna来制备cdna。因此，通过本发明的方法测定的核酸可以是基因组dna、cdna、单链dna或mrna。

生物样品的例子包括组织样品或任何含有细胞或无细胞的体液。生物样品可以通过标准程序获得，并且可以在适合于生物样品类型的条件下立即使用或储存，以备后用。

在一些实施方案中，本文提供的方法可以应用于来自患者的任何类型的组织。这样的组织来源包括但不限于神经系统、甲状腺、皮肤、胃肠道、大肠、胆道、卵巢、眼睛、前列腺、中枢神经系统、肝脏、小肠、乳房、胰腺、软组织、消化道、肾上腺、自主神经节、造血和淋巴组织、肺、食道、脑垂体和胃。

在一些实施方案中，所述方法可以应用于广泛范围的肿瘤类型。在一些实施方案中，本发明的方法应用于来自患有骨髓增殖性肿瘤的患者的样品。在一些实施方案中，本发明的方法应用于来自患有骨髓增殖性肿瘤的患者的血液样品。

获得测试样品的方法是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于抽吸、组织切片、血液或其他流体的抽取，外科手术或穿刺活检等。所述测试样品可以从诊断为患有骨髓增殖性异常或怀疑受骨髓增殖性异常折磨的个体或患者中获得。在一些实施方案中，所述测试样品从已经接受一种或多种骨髓增殖性异常治疗的个体或患者获得。所述测试样品可以是含有细胞的液体或组织。样品可以包括但不限于羊水、活检、血液、血细胞、骨髓、细针穿刺活检样品、腹膜液、羊水、血浆、胸膜液、唾液、精液、血清、组织或组织匀浆、组织的冷冻或石蜡切片。样品也可以加工，如组织切片、分段分离、纯化或细胞器分离。

如果必要，所述样品可以通过离心等收集或浓缩。所述样品的细胞可以经受裂解，例如用酶、加热、表面活性剂，超声破碎法或其组合进行处理。进行裂解处理是为了获得足够量的来源于所述个体细胞的核酸，以使用核酸测定法检测，例如，使用pcr的检测测定法。

血浆和血清制备方法在本领域中是公知的。可以使用“新鲜的”血浆或血清，或者冷冻的(储存的)并随后解冻的血浆或血清。冷冻(储存的)血浆或血清应最佳地保持在-20℃至-70℃的储存条件下直至解冻和使用。“新鲜的”血浆或血清可以冷藏或保持在冰上，直到使用，尽可能快地进行核酸(例如rna、dna或总核酸)提取。以下描述示例性方法。

血液可以通过标准方法抽取到采集管中，通常采用硅化玻璃，无需采用抗凝血剂来制备血清，或者采用(orwith)edta、柠檬酸钠、肝素或类似的抗凝血剂来制备血浆。如果制备血浆或血清用于储存，血浆或血清可以在冷冻之前首先从全血中第一次分段分离。这减少了从冻融细胞中裂解释放的外来的细胞内rna的负担，其可能降低扩增测定的灵敏度、或者通过释放抑制剂例如抑制核酸扩增(例如pcr)的卟啉和血红素来干扰所述扩增测定。可以通过离心分离来自全血的“新鲜”血浆或血清，使用300-800倍重力温和地离心5-10分钟，或通过其他标准方法分段分离。通常避免能够分段分离出凋亡小体的高离心率。由于肝素可干扰逆转录和核酸扩增，因此使用肝素化血液需要用乙酰肝素酶进行预处理，然后在逆转录或扩增之前除去钙。imai,h.等.j.virol.methods36:181-184,(1992)。在一些实施方案中，edta是对随后进行核酸扩增(例如pcr)的血液样品合适的抗凝血剂。

核酸提取和扩增

待测定的核酸可以直接从生物样品中测定或者在检测之前从所述生物样品中提取。如本文所描述的，所述生物样品可以是含有核酸分子的任何样品，如流体样品、组织样品或细胞样品。所述生物样品可以来自包括任何动物的受试者，优选哺乳动物。优选的受试者是人，其可以是用于疾病的诊断或治疗的作为(presentingto)医疗提供者的患者。提取中使用的血浆或血清的体积可以根据临床意图而变化，但是100μl到1毫升血浆或血清的体积通常是充足的。

多种提取方法适用于分离dna或rna。通常，目的是将存在于所述细胞的细胞核中的dna与其他细胞成分分开。核酸的分离通常涉及组织或细胞的裂解。这个过程对于蛋白质结构的破坏是必不可少的，并允许从该核中释放核酸。裂解通常在盐溶液中进行，所述盐溶液含有使蛋白质或蛋白酶(消化蛋白质的酶)变性的去污剂，例如蛋白酶k，或者在一些情况下包含这两种。它导致细胞分解(breakdown)和膜溶解。dna分离方法包括但不限于苯酚：氯仿提取、高盐沉淀、碱性变性、离子交换柱层析、树脂结合和顺磁珠结合。见，例如maniatis等,molecularcloning,alaboratorymanual,2d,coldspringharborlaboratorypress,page16.54(1989)。产生合适的dna和rna的多种商业试剂盒包括但不限于qiaamp^tm小量(mini)血液试剂盒、agencourtgenfind^tm、罗氏罗氏magna或者使用eppendorfphaselock(梅里埃,研发制造中心,法国)的酚：氯仿提取和nuclisens提取试剂盒。

也利用本领域技术人员已知的rna分离方法。rna可以通过多种方法分离并制备以用于杂交，所述方法包括但不限于和硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。rna分离的原理是基于细胞/组织溶解，然后提取、沉淀和洗涤。在其他方法中，mrna可以使用适合mrna提取的商业试剂盒(例如血液样品)从患者生物样品(例如血液样品)中提取，例如magnapurelcmrnahskit和magnapurelcinstrument(罗氏诊断公司，罗氏应用科学，印第安纳波利斯，印度)。

从组织、细胞、血浆或血清中提取的核酸可以用本领域公知的核酸扩增技术扩增。这些扩增方法中的许多方法也可用于检测突变的存在，仅仅通过设计寡核苷酸引物或探针以特定方式与具体的靶序列相互作用或杂交(例如等位基因特异性引物和/或在靶核酸序列侧翼的探针或引物)。作为示例而非限制，这些技术可以包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)、实时pcr(qpcr)、巢式pcr、连接酶链式反应(lca)(见abravaya,k.等,nucleicacidsresearch,23:675-682,(1995)),brancheddnasignalamplification(urdea,m.s.,etal.,aids,7(suppl2):s11-s14,(1993))、可扩增的rna报告子、q-β复制、基于转录的扩增系统(tas)、回飞镖dna(boomerangdna)扩增、链置换激活(sda)、循环探针技术、基于等温核酸序列的扩增(nasba)(参见kievits,t.等,jvirologicalmethods,35:273-286,(1991))、入侵者技术、解旋酶依赖性扩增(hda)扩增阻碍突变系统(arms)和其它基于序列的复制测定法或信号放大测定法。放大的示例性方法在下文简要描述并且是本领域公知的。

在一些实施方案中，本文提供的方法将从受试者获得的rna逆转录为cdna。逆转录和扩增的方法在本领域中是公知的。可以使用的示例性逆转录酶包括但不限于mmlvrt、mmlvrt的rna酶h突变体如superscript和superscriptii(lifetechnologies，gibcobrl，gaithersburg，md)，amvrt和来自thermusthermophilus的热稳定性逆转录酶。例如，一种可用于将从血浆或血清提取的rna转化成cdna的示例性方法是从superscriptiipreamplification系统改编的方案(lifetechnologies,gibcobrl,gaithersburg,md.；catalogno.18089-011)，如rashtchian,a.,pcrmethodsapplic.,4:s83-s91,(1994)所描述的。在一些实施方案中，然后所述cdna用作核酸扩增反应的模板用于扩增编码突变的核酸。

各种扩增酶在本领域中是公知的，包括例如dna聚合酶、rna聚合酶、逆转录酶、q-β复制酶、热稳定dna和rna聚合酶。由于这些和其他扩增反应是由酶催化的，所以在单步测定中，如果最终检测是基于扩增的，则所述核酸释放试剂和检测试剂不应该是扩增酶的潜在抑制剂。

pcr是指数地产生特定模板dna序列的大量拷贝的技术。所述反应由多个扩增循环(即热循环)组成，并使用一对与待复制序列的5'和3'末端杂交的引物序列启动。扩增循环通常包括所述靶核酸的初始变性(即链分离)，通常在约95℃下随后多达50个循环或更多的(1)变性，(2)在引物和靶标之间的同源性区域的熔点(tm)确定的温度下将引物退火至靶核酸，和(3)在取决于聚合酶的温度下延伸，最常见地72℃。延长的延长时期通常在循环结束时进行。在每个反应循环中，复制引物之间的dna序列。引物可以结合复制的dna以及原始的模板序列，因此拷贝总数随着时间呈指数增长。pcr可以按照whelan等,jofclinmicro,33(3):556-561(1995)进行。示例性pcr反应混合物包括两种特异性引物，dntp，约0.25u热稳定聚合酶，如taq聚合酶，和1×pcr缓冲液，通常含有缓冲液(例如tris)、盐(例如kcl)和镁(mgcl2)。引物的tm根据长度、g+c含量和缓冲条件等因素而变化。如本文所用，tm意指用于感兴趣的反应的缓冲液中的tm。

用于扩增的循环参数可以变化，取决于待延伸的核酸的长度。鉴于本公开内容，技术人员能够设计和制备适于扩增靶序列的引物。用于本发明的扩增引物的长度取决于几个因素，包括所述核苷酸序列同一性和这些核酸杂交所在的温度或在体外核酸扩增期间使用的温度。确定具有特定序列同一性的扩增引物的优选长度所需的考虑是本领域普通技术人员所熟知的。例如，短核酸或寡核苷酸的长度可与其杂交特异性或选择性有关。

lcr是与pcr类似的dna扩增方法，除了它使用四个引物而不是两个并使用酶连接酶连接或合并两段dna。lcr可以根据moore等,jclinmicro,36(4):1028-1031(1998)进行。简言之，lcr反应混合物含有两对引物、dntp、dna连接酶和代表约90μl的dna聚合酶，向其中加入100μl来自靶生物的分离的核酸。扩增在热循环仪(例如，lcxofabbottlabs,chicago,ill.)中进行。

tas是核酸扩增系统，其中每个循环由cdna合成步骤和rna转录步骤组成。在cdna合成步骤中，使用双结构域寡核苷酸引物将由dna依赖的rna聚合酶(即，聚合酶结合序列或pbs)鉴定的序列插入待扩增的靶标或标识物序列的cdna拷贝下游。在第二步中，使用rna聚合酶从cdna模板合成多个rna拷贝。使用tas的扩增只需要几个循环，因为dna依赖的rna转录可以为cdna模板的每个拷贝产生10-1000个拷贝。tas可以根据kwoh等,pnas,86:1173-7(1989)进行。简而言之，将提取的rna与tas扩增缓冲液和牛血清白蛋白、dntp、ntp和两种寡核苷酸引物(其中一种含有pbs)组合。加热所述样品以使rna模板变性并冷却至引物退火温度。将逆转录酶(rt)加入在适当温度下温育的样品以允许cdna延长。随后加入t7rna聚合酶并将样品在37℃下温育约25分钟以合成rna。然后重复上述步骤。或者，在最初的cdna合成后，在1分钟100℃变性之后加入rt和rna聚合酶，然后在37℃下rna延长约30分钟。根据wylie等,jclinmicro,36(12):3488-3491(1998)，tas也可以在固相上进行。在该方法中，用含有特异性捕获引物的磁珠捕获核酸靶标。在加入含有扩增引物、dntp、ntp、2500u的逆转录酶和2500u的t7rna聚合酶的扩增试剂之前，将具有被捕获的靶标的珠子洗涤并包衣(pelleted)。将100μatma反应混合物置于管中，加入200μa油试剂，通过在42℃水浴中温育1小时完成扩增。

nasba是基于转录的扩增方法，其扩增来自rna或dna靶标的rna。nasba是用于在一个温度下在单个混合物中连续扩增核酸的方法。例如，对于rna扩增，使用禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶、rnaseh和t7rna聚合酶。该方法可以根据heim,等,nucleicacidsres.,26(9):2250-2251(1998)进行。简言之，nasba反应混合物含有两种特异性引物、dntp、ntp、6.4uamv逆转录酶、0.08u大肠杆菌rna酶h和32ut7rna聚合酶。所述扩增在总体积为20μl中、41℃下进行120分钟，。

在相关的方法中，靶dna或rna序列在体外的自我维持的序列复制(3sr)反应、等温扩增使用三种酶活性：逆转录酶，dna依赖性rna聚合酶和大肠杆菌核糖核酸酶h。可以通过使用人免疫缺陷病毒(hiv)-1逆转录酶而非禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶将该方法从3-酶系统修改成2-酶系统以允许用t7rna聚合酶但不用大肠杆菌核糖核酸酶h的扩增。在2-酶3sr中，与3-酶3sr相比，扩增的rna以更纯的形式获得(gebinoga&oehlenschlagereurjbiochem,235:256-261(1996))。

sda是等温核酸扩增方法。含有限制性位点的引物与模板退火。然后将扩增引物与5'相邻序列退火(形成切口)，并在固定温度下开始扩增。新合成的dna链被限制性内切酶切割，且聚合酶扩增再次开始，取代新合成的链。可根据walker等,pnas,89:392-6(1992)进行sda。简而言之，sda反应混合物含有四种sda引物、dgtp、dctp、ttp、datp、150uhincii和5u大肠杆菌dna聚合酶i的大片段的外切核酸酶缺陷型(exo-klenow聚合酶)。将所述样品混合物在95℃下加热4分钟以在加入所述酶之前使目标dna变性。加入所述两种酶后，扩增在37℃下，总体积为50μl中进行120分钟。然后，所述反应在95℃下通过加热2分钟终止反应。

所述q-β复制系统使用rna作为模板。q-β复制酶合成大肠杆菌噬菌体qβ的单链rna基因组。当rna被q-β复制酶复制时，切割rna并连接在感兴趣的核酸中允许该序列的复制(kramer&lizardi,trendsbiotechnol.19919(2):53-8,1991)。

在一些实施方案中，使用pcr来扩增感兴趣的靶标或标识物序列。本领域技术人员能够设计和制备适合于扩增靶标或标识物序列的引物。扩增引物的长度取决于几个因素，包括所述核苷酸序列同一性和这些核酸杂交所在的温度或在体外核酸扩增期间使用的温度。确定具有特定序列同一性的扩增引物的优选长度所需的考虑是本领域普通技术人员所熟知的。例如，短核酸或寡核苷酸的长度可与其杂交特异性或选择性有关

为了分析突变和其他变体核酸，可以使用对可替代的等位基因特异性的寡核苷酸。检测靶序列中的单核苷酸变异(例如单核苷酸多态性(snp))，插入或缺失的此类寡核苷酸可以通过诸如“等位基因特异性探针”或“等位基因特异性引物”的术语来指称。等位基因特异性探针用于分析核苷酸变异的设计和用途在例如mutationdetectionapracticalapproach,ed.cottonetal.oxforduniversitypress,1998；saiki等,nature,324:163-166(1986)；dattagupta,ep235,726；和saiki,wo89/11548中描述。在一个实施方案中，其中所述变体是一种缺失，可以设计探针或引物与靶dna的区段杂交，使得探针或引物跨越所述缺失的5'至3'连接处。在一个实施方案中，其中所述变体是一种插入，可以设计探针或引物与靶dna的区段杂交，使得探针或引物包括所述被插入的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中，其中所述变体是snp，可以设计探针或引物与靶dna的片段杂交，使得snp与探针或引物的5'最末端或3'末端对齐。通常，将等位基因特异性探针和引物设计成以高严格性与突变、插入或缺失特异性杂交。

所述测定法中测定对照可以用于检测突变的核酸序列。在一些实施方案中，利用寡核苷酸引物和/或探针，内部阳性扩增对照可以包含在样品中。

在一些实施方案中，来自两个或更多个感兴趣区域的序列在相同的反应容器中扩增。

在一些实施方案中，所述核酸扩增包括标记的引物，由此允许检测该引物的扩增产物。在具体的实施方案中，所述核酸扩增包括多重的标记的引物；通常，这样的引物被可区分地标记，允许同时检测多种扩增产物。在一些实施方案中，具有不同序列的引物用不同的可检测部分标记。在其他实施方案中，具有不同序列的引物用相同的可检测部分进行标记，并通过将标签附接于引物的不同可切割接头进行区分。可以利用涉及在扩增步骤中使用的标记引物的方法，使得扩增产物用可检测标识物标记并且将扩增产物与用可检测标记物标记的寡核苷酸探针杂交。可检标识物包括但不限于发光标签，荧光标签和放射性标签。标记的扩增产物可以使用对应于根据本领域技术人员已知的方法使用的标记的类型的方法直接测量。标记的探针可以根据本领域技术人员已知的方法与扩增产物杂交。

在基于pcr测定的一种类型中，等位基因特异性引物与靶核酸分子上的区域杂交，所述区域与具有靶缺失的核酸序列重叠，并且所述引物仅对等位基因形式的引物扩增展现完美的互补性。该引物与在远端位点杂交的第二引物结合使用。扩增从所述两个引物进行，产生可检测的产物，其指示所述测试样品中存在哪种等位基因形式。

在基于pcr测定的另一种类型中，等位基因特异性引物与靶核酸分子上的区域杂交，所述区域与snp位置或缺失断点位点重叠，并且所述引物仅对等位基因形式的引物扩增展现完美的互补性(gibbs,1989,nucleicacidres.,17:2427-2448)。通常，所述引物的最3'核苷酸与所述靶核酸分子的snp位置或缺失断点位点对齐并互补。该引物与在远端位点杂交的第二引物conjunction结合使用。扩增从所述两个引物前进，产生可检测的产物，其指示测试样品中存在哪种等位基因形式。通常用第二对引物进行对照，其中一个在多态性位点显示单碱基错配，而另一个与远端位点展示完美的互补性。单碱基错配防止扩增或基本上降低扩增效率，从而不能形成可检测的产物，或形成量较少或速度较慢的可检测产物。当所述错配位于所述寡核苷酸的最3'位置(即，寡核苷酸的最3’位置与靶突变位置对齐)时，该方法通常最有效地起作用，因为该位置对于从所述引物的延伸最不稳定(参见例如wo93/22456)。

在一个特定的实施方案中，引物含有与含有靶突变的核酸分子的片段基本上互补的序列，只是所述引物在所述引物的3'最末端的三个核苷酸位置之一上具有错配的核苷酸，使得所述错配的核苷酸不与突变位点处的具体等位基因碱基配对。在一个实施方案中，所述引物中错配的核苷酸是从所述引物的最3'位置上的最后一个核苷酸起的第二个核苷酸。在另一个实施方案中，所述引物中的错配核苷酸是引物的最3'位置上的最后一个核苷酸。

在一个实施方案中，引物或探针用发射可检测信号的荧光报告染料标记。虽然合适的报告染料是荧光染料，但是可以附接至检测试剂的任何报告染料如寡核苷酸探针或引物均适用于本发明。这样的染料包括但不限于吖啶、amca、bodipy、级联蓝、cy2、cy3、cy5、cy7、苯甲酸(dabcyl)、精氨酸谷氨酸(edans)、伊红、赤藓红、荧光素、6-fam、tet、joe、hex、俄勒冈绿、若丹明、rhodol绿、tamra、rox和德克萨斯红。

本发明还涵盖不含(或互补于)本文鉴定的突变的核苷酸序列但是用于测定本文公开的一个或多个突变的试剂。例如，在本文提供的靶位置侧翼但不与其直接杂交的引物可用于引物延伸反应，其中所述引物与靶位置相邻的区域(即在距靶标突变位点(例如snp、插入或删除)一个或多个核苷酸内)杂交。在引物延伸反应期间，如果特定核苷酸(等位基因)存在于靶位点，则引物通常不能延伸经过该靶突变位点，并且可以容易地检测引物延伸产物以确定哪个等位基因(即，野生型或突变体)存在。例如，一旦将ddntp并入所述延伸产物中，具体的的ddntp通常用在引物延伸反应中来终止引物延伸。因此，即使结合序列不一定包括突变位点本身，与突变位点相邻的区域中的核酸分子结合的试剂也包括在本发明中。

检测变体序列。

变体核酸可以在检测之前扩增，或者可以在扩增步骤期间直接检测(即“实时”方法)。在一些实施方案中，扩增所述靶序列，并且通过电泳检测所得到的扩增子。在一些实施方案中，特定的突变或变体通过测序扩增的核酸检测，例如sanger测序或下一代测序(ngs)。下一代测序技术降低了成本，并大大提高了工业标准染料终止子方法的速度。ngs的实例包括但不限于大规模平行签名测序(massivelyparallelsignaturesequencing)(mpss)，用乳液pcr与体外配对标签文库结合的polony测序、454焦磷酸测序、solexa测序、solid技术、dna纳米球、heliscope单分子、单分子实时(smrt)和离子半导体测序。

在一些实施方案中，使用标记的引物扩增靶序列，从而使得到的扩增子可检测地标记。在一些实施方案中，所述引物是荧光标记的。在一些实施方案中，使用至少一个等位基因特异性引物(例如，跨越缺失断点位点的引物，即跨越由缺失的5'和3'末端形成的连接处)。

对于本文提供的方法，单个引物可以用于检测，例如在单个苷酸引物延伸或含有所述突变的核酸的等位基因特异性检测中，或者可以用第二引物，其可以在等位基因特异性引物的上游或下游。所用的一种或多种引物可以是等位基因特异性引物。优选地，所述等位基因特异性引物含有野生型序列的一部分，更优选地，野生型序列的至少约3-40个连续核苷酸。

在一个实施方案中，变体核酸的检测用rt-pcr测定法来进行，例如测定法，也称为5'核酸酶测定法(美国专利号5,210,015和5,538,848)或分子信标探针(美国专利号5,118,801和5,312,728)或其他无干(stemless)或线性信标探针(livak等,1995,pcrmethodappl.,4:357-362；tyagi等,1996,naturebiotechnology,14:303-308；nazarenko等,1997,nucl.acidsres.,25:2516-2521；美国专利号5,866,336和6,117,635)。分析检测pcr期间特定扩增产物的积累。测定利用标记有荧光报告染料和猝灭剂染料的寡核苷酸探针。所述报告染料通过适当波长的照射激发，通过称为荧光共振能量转移(fret)的过程将能量传递给同一探针中的猝灭剂染料。当附接至所述探针时，所述激发的报告染料不发射信号。所述猝灭剂染料与所述完整探针中的报告染料的接近维持报告基因减弱的荧光。所述报告染料和猝灭剂染料可以分别位于5'最末端和3'最末端，反之亦然。二者择一地，所述报告染料可以在5'或3'最末端，而猝灭染料附接至内部核苷酸上，反之亦然。在又一个实施方案中，所述报告子和猝灭剂两者可以彼此相距一定距离连接至内部核苷酸，使得报告子的荧光降低。

在pcr期间，dna聚合酶的5'核酸酶活性切割所述探针，由此分离所述报告染料和所述猝灭剂染料并导致报告子的荧光增加。pcr产物的积累通过监测所述报告染料荧光的增加直接检测。只有所述探针与在pcr过程中扩增的含有目标突变的模板杂交，dna聚合酶才能在报告染料和猝灭剂染料之间切割所述探针，并且将所述探针设计为只有在特定突变等位基因(例如，snp、插入或删除)存在时与所述靶突变位点杂交。

引物和探针序列可以使用本文提供的变体和相关的核酸序列信息容易地确定。许多计算机程序，例如(primerexpressappliedbiosystems,fostercity,calif.)可以用来快速获得最适的引物/探针组。对于本领域技术人员显而易见的是，用于检测本发明变体的这种引物和探针可用于骨髓增殖性异常和相关病理学的诊断测定，并且可以容易地并入试剂盒形式。本发明还包括本领域众所周知的taqman测定的修饰，例如使用分子信标探针(美国专利号5,118,801和5,312,728)和其他变体形式(美国专利号5,866,336和6,117,635)。

在说明性实施方案中，实时pcr使用探针与合适的扩增/分析仪例如abi7900ht序列检测系统组合进行。abi7900ht序列检测系统是一种高通量实时pcr系统，其检测和定量核酸序列。简言之，pcr扩增反应中包括对扩增的靶标或标识物序列特异性的探针。这些探针在5'末端含有报告染料且在3'末端含有猝灭剂染料。与不同靶标或标识物序列杂交的探针与不同的荧光报告染料缀合。在pcr期间，所述荧光标记的探针特异性结合其各自的靶标或标识物序列；taq聚合酶的5'核酸酶活性从所述探针切割所述报告染料并产生荧光信号。只有所述靶标或标识物序列与所述探针互补并且在pcr期间扩增，荧光信号的增加才被检测。探针和靶标之间的错配大大降低了探针杂交和切割的效率。abiprism7700ht或7900ht序列检测系统测量pcr热循环过程中荧光的增加，提供pcr产物积累的“实时”检测。abiprism7900ht或7900ht序列检测器上的实时检测监测荧光，并计算每个pcr循环中的rn。阈值周期或ct值，是荧光与阈值相交的周期。所述阈值由序列检测系统软件或人工确定。

实时检测的探针杂交的其他方法可以用于检测对串联重复区域侧翼的靶标或标识物序列的扩增。例如，可以使用市售mgbeclipse^tm探针(epochbiosciences)，其不依赖探针降解。mgbeclipse^tm探针通过杂交触发的荧光机制起作用。mgbeclipse^tm探针具有位于探针的5'端的eclipse^tmdarkquencher和mgb。所述荧光团位于探针的3'末端。当所述探针处于溶液中且没有杂交时，三维构象使所述猝灭剂靠近所述荧光团，并且猝灭荧光。然而，当所述探针与靶标或标识物序列退火时，所述探针展开，所述猝灭剂从所述荧光团移开，并且可以检测所得的荧光。

扩增片段可以用标准凝胶电泳方法检测。例如，在优选的实施方案中，扩增的片段在琼脂糖凝胶上分离并用本领域已知的溴化乙锭染色以检测扩增的片段。

在一些实施方案中，扩增的核酸通过与突变特异性探针杂交来检测。与扩增的靶序列的一部分互补的探针寡核苷酸可用于检测扩增的片段。每个靶序列的扩增的核酸可以同时(即在相同的反应容器中)或单独地(即在分开的反应容器中)检测。在一些实施方案中，同时检测所述扩增的dna，使用两种可区分标记的、基因特异性的寡核苷酸探针，其中一种与第一靶序列杂交，另一种与第二靶序列杂交。可以设计寡核苷酸探针，其长度在约10至约100个核苷酸之间，并与所述扩增的区域杂交。寡核苷酸探针优选12至70个核苷酸；更优选地长度为15-60个核苷酸；最优选地长度为15-25个核苷酸。可以标记所述探针。

另一种合适的检测方法学涉及设计和使用诸如scorpion^tm探针的二分式引物/探针组合。这些探针进行序列特异性引导(priming)，且使用单个分子实现pcr产物检测。scorpion^tm探针包含具有5'延伸探针尾的3'引物，所述5'延伸探针尾包含拥有荧光团/猝灭剂对的发夹结构。通过包含阻止所述聚合酶复制所述探针的己二醇(heg)，所述探针尾部在5'至3'方向上被“保护”免于复制。所述荧光团附接至5'末端，并被偶联到3'末端的部分淬灭。scorpion^tm引物延伸后，所述特异性探针序列能够在延伸的扩增子内与其补体序列结合，从而打开所述发夹环。这可以防止荧光淬灭并观察到信号。特定的靶标通过scorpion^tm的所述反向引物和所述引物部分扩增，产生延伸产物。由于scorpion^tm的探针元件与延伸产物的结合所导致的所述荧光团与所述猝灭剂的分离而产生荧光信号。whitcombe等在naturebiotech17：804-807(1999)中描述了这样的探针。

在一些实施方案中，进行两种或更多种测定法以检测本文所描述的任何变体。在一些实施方案中，本文所描述的任何变体的鉴定通过核酸测序来确认。

calr蛋白的分离

本文描述的具有和没有缺失突变(例如，p.e381_a382>a缺失，p.d397_d400>d缺失和p.e405_v409>v缺失)和/或其他突变的calr蛋白可以从来自个体、培养基或来自宿主细胞裂解物的生物样品中回收。如果是膜结合的，则可以用合适的洗涤剂溶液(例如triton-x100)或通过酶裂解将其从膜上释放。用于表达calr蛋白的细胞可以通过各种物理或化学手段如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂来破坏。

在一些实施方案中，在将携带着感兴趣的编码序列的哺乳动物表达系统表达编码序列引入哺乳动物细胞之后，突变型或野生型calr蛋白的所述编码序列在所述哺乳动物细胞中通过使用所述哺乳动物表达系统可诱导的或组成性地表达。哺乳动物细胞的例子包括但不限于cos-7细胞，hek-293细胞，u20s细胞和hela。

可能需要从重组细胞蛋白或多肽中纯化calr蛋白。以下程序是合适的纯化程序的示例：通过在离子交换柱上分段分离；乙醇沉淀；反相hplc；在二氧化硅或阳离子交换树脂如deae上的层析；色谱聚焦；sds-page；硫酸铵沉淀；使用例如sephadexg-75进行凝胶过滤；蛋白质a琼脂糖柱以去除污染物如igg；以及金属螯合柱以结合calr的表位标记形式。可以采用各种蛋白质纯化方法，并且这些方法是本领域已知的，且在例如deutscher,methodsinenzymology(1990),182:83-89；scopes,proteinpurification:principlesandpractice,springer-verlag,newyork(1982)中描述。选择的纯化步骤将取决于例如生产过程的性质，所使用的calr的来源以及所产生的具体的calr。

calr蛋白的检测

几种检测蛋白质的方法是本领域众所周知的。蛋白质的检测可涉及通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)的蛋白质分辨，然后用合适的染色剂染色蛋白质，例如考马斯蓝。通过使用突变特异性抗体的蛋白质印迹分析，具有和不具有突变的calr蛋白可以彼此分开，也可以与其他蛋白分开。用于进行蛋白质印迹的方法在本领域中是公知的，并且在例如w.burnettew.n.anal.biochem.1981；112(2):195-203中描述。

可替换地，可应用流式细胞术来检测所述突变体和野生型calr蛋白。针对所述突变体或野生型蛋白质特异性的抗体可以偶联到珠子上，并且可以用于流式细胞术分析。

在一些实施方案中，可以应用蛋白质微阵列来鉴定各种calr蛋白变体。蛋白质阵列的方法在本领域中是公知的。在一个实例中，可将针对每种蛋白质特异性的抗体固定在固体表面上，如玻璃或尼龙膜。然后可以通过特异性抗体的结合将所述蛋白质固定在所述固体表面上。可以应用特异性结合calr蛋白的第二表位(例如，突变体和野生型共有的表位)的抗体。然后可以使用可检测标记的第二抗体检测第一抗体/蛋白质/第二抗体复合物。如本文针对多核苷酸所提供的以及如本领域已知的那样检测可检测的标记物。

在一些实施方案中，可以将重组calr蛋白工程化为含有所述缺失突变。在一些实施方案中，所述重组calr蛋白含有表位标签(例如肽标签，如myc或ha标签)。在一些实施方案中，在表达和/或纯化重组蛋白质之后，所述表位标签可以从所述蛋白中去除。

抗体生产和筛选

本领域已知的各种程序可用于产生可用于区分蛋白质变体的calr蛋白表位的抗体。此类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、fab片段和由fab表达文库产生的片段。

可以将抗体放射性标记，允许人们在注射后跟随它们在体内的定位和分布。附以放射性标签的抗体可以用作对肿瘤和转移癌的原发细胞进行成像的非侵入性诊断工具。

还可以设计将细胞毒性剂靶向身体特定部位的免疫毒素。例如，高亲和力的calr特异性单克隆抗体可以与细菌或植物毒素如白喉毒素、相思豆毒蛋白或蓖麻毒素共价络合。制备抗体/杂合分子的通用方法可以涉及使用硫醇交联试剂例如spdp，其攻击所抗体上的主要氨基基团并通过二硫键交换，将毒素附接至抗体上。所杂合抗体可用于特异性消除突变的calr蛋白表达细胞。

为了产生抗体，可以通过注射包括但不限于兔、小鼠、大鼠等的calr蛋白的全长或片段来免疫各种宿主动物。可以使用各种佐剂来增加免疫应答，取决于宿主种类，包括但不限于freund的(完全的和不完全的)，矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚和潜在有用的人类佐剂如bcg(卡介苗)和小棒状杆菌。

calr蛋白的单克隆抗体可以通过使用任何技术来制备，该技术提供(providesfor)通过培养中的传代细胞系产生抗体分子。这些包括但不限于最初由kohler和milstein(nature(1975),256:495-497)描述的杂交瘤技术，人b细胞杂交瘤技术(kosbor等,immunologytoday(1983),4:72；cote等,proc.natl.acad.sci.(1983),80:2026-2030)和ebv-杂交瘤技术(cole等,monoclonalantibodiesandcancertherapy(1985),alanr.liss,inc.,pp.77-96)。另外，可以使用针对通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起来产生“嵌合抗体”的二开发的技术(morrison等,proc.natl.acad.sci.usa(1984),81:6851-6855；neuberger等,nature(1984),312:604-608；takeda等,nature(1985),314:452-454)。二者择一地，可以调整描述用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)以产生calr蛋白特异性单链抗体。

抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这样的片段包括但不限于：可以通过胃蛋白酶消化所述抗体分子产生的f(ab')2片段以及可以通过还原f(ab')2的二硫键产生的所述fab片段。二者择一地，可以构建fab表达文库(huse等,science,1989；246:1275-1281)以允许快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆fab片段。

治疗方法

本文还提供了治疗骨髓增殖性异常的方法，并且其可以与提供用于检测和监测所述calr突变的诊断和预后方法组合使用(例如，p.e381_a382>a缺失，p.d397_d400>d缺失，和p.e405_v409>v缺失)。在一些实施方案中，提供用于检测calr突变的方法用于治疗、诊断、提供预后和/或管理与骨髓增殖性异常相关的疾病或病况。在一些实施方案中，提供用于检测calr突变的方法用于治疗与calr突变相关的癌症或疾病或病况，与(inconjunctionwith)有效治疗癌症或疾病的一种或多种治疗相结合，所述治疗包括但不限于药物治疗(例如化疗药物)、放疗(例如x射线、γ射线，或电子、质子、中子或粒子束)、高温加热(例如微波、超声波、射频消融)、疫苗治疗、基因治疗、光动力学治疗、手术、和骨髓或干细胞移植。

用于骨髓增殖性肿瘤的示例性治疗包括但不限于用静脉切开术、血小板单采术、输血治疗、化疗、放疗(例如使用放射性物质的外部或内部放疗)、其他药物治疗(例如泼尼松、达那唑、阿那格雷、小剂量阿司匹林、沙利度胺、来那度胺和pomolidomide)、手术(例如脾切除术)、生物治疗(例如免疫治疗剂，例如干扰素α、聚乙二醇化干扰素α和促红细胞生长因子)、靶向治疗(例如酪氨酸激酶抑制剂如ruxolotinib)、高剂量化疗。

在一些实施方案中，提供用于检测和鉴定calr突变的方法，用于通过向受试者施用有效量的组合物，该组合物包括一种或多种合适的化疗剂，来治疗受试者中与疾病或病状或癌症(例如骨髓增殖性肿瘤)有关的calr突变。在一些实施方案中，所述一种或多种合适的化疗剂选自烷化剂，包括但不限于阿多来新(adozelesin)、六甲蜜胺、比折来新(bizelesin)、二甲磺酸丁酯、卡铂、卡波醌、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、雌莫司汀、福莫司汀、hepsulfam、异环磷酰胺、英丙舒凡、伊洛福芬、环己亚硝脲、二氯甲基二乙胺、美法仑、奥沙利铂、嗪消安、甲基环己亚硝脲、链脲菌素、替莫唑胺、噻替派和苏消安；抗生素，包括但不限于博来霉素、更生霉素、柔毛霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、马诺加林、丝裂霉素、米托蒽醌、新制癌菌素、喷司他丁和普卡霉素；抗代谢药，包括但不限于阿扎胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、甲氨喋呤、奈拉滨、培美曲塞、雷替曲塞、硫鸟嘌呤和三甲曲沙；免疫疗法，包括但不限于阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗和90y替伊莫单抗；激素或激素拮抗剂，包括但不限于阿那曲唑、雄激素、乙烯酰胺、己烯雌酚、依西美坦、氟他胺、氟维司群、戈舍瑞林、艾多昔芬、来曲唑、亮丙瑞林、magestrol、雷洛昔芬、它莫昔芬和托瑞米芬；紫杉烷，包括但不限于、dj-927、多西他赛、tpi287、紫杉醇和dha-紫杉醇；类黄醇类，包括但不限于阿利维a酸、贝沙罗汀、芬维a胺、异维a酸和维a酸；生物碱，包括但不限于依托泊苷、高三尖杉酯碱、替尼泊苷、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；抗血管生成剂，包括但不限于ae-941(gw786034、neovastat)、abt-510、2-甲氧雌二醇、来那度胺和萨利多胺；拓扑异构酶抑制剂，包括但不限于安吖啶、艾杜卡因(edotecarin)、伊利替康(exatecan)、伊立替康(也是活性代谢物sn-38(7-乙基-10-羟基喜树碱))、鲁替康、拓扑替康和9-氨基喜树碱；激酶抑制剂，包括但不限于厄洛替尼、吉非替尼、夫拉平度(flavopiridol)、甲磺酸伊马替尼、拉帕替尼、索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、aee-788、ag-013736、amg706、amn107、bms-354825、bms-599626、ucn-01(7-羟基星孢菌素)和瓦他拉尼；靶向的信号转导抑制剂，包括但不限于硼替佐米、格尔德霉素和雷帕霉素；生物应答调节剂，包括但不限于咪喹莫特、干扰素-α和白细胞介素-2；以及其他化学疗法，包括但不限于3-ap(3-氨基-2-甲醛缩氨基硫脲(carboxyaldehydethiosemicarbazone))、氨鲁米特、天冬酰胺酶、苔藓抑素-1、西仑吉肽、e7389、伊沙匹隆、丙卡巴肼、舒林酸、西罗莫司脂化物、替比法尼等化疗药物。常用于治疗骨髓增殖性肿瘤的化疗剂包括但不限于三氧化二砷、阿扎胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、盐酸多柔比星、甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼、鲁索替尼磷酸盐和硫酸长春新碱。

本文公开的治疗剂的给药路径和频率以及剂量，会随着个体以及所选择的药物而变化，并且其可以使用标准技术容易地建立。通常，所述药物组合物可以通过注射(例如皮内、肿瘤内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)或口服来施用。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物经口服给药。在一个实例中，可以在超过52周期间施用1至10个剂量。优选地，每隔1个月，施用6个剂量，并且随后可以定期给予加强治疗。可替代的方案可适用于个体患者。在一个实施方案中，相隔10天施用2次组合物的皮内注射。

“固体口服剂型”，“口服剂型”，“单位剂量形式”，“口服给药的剂型”等可互换使用，意指片剂、胶囊、囊片、明胶胶囊、凝胶片、丸剂等形式的药物组合物。

剂型通常包括“赋形剂”，其如本文所用的“赋形剂”是非api的剂型的任何组分。赋形剂包括粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、涂层、阻隔层组分、助流剂和其它组分。赋形剂在本领域中是已知的(见handbookofpharmaceuticalexcipients,fifthedition,2005,rowe等编著,mcgrawhill)。一些赋形剂有多种功能，或者是所谓的高功能赋形剂。例如，滑石粉可以作为润滑剂、防粘剂和助流剂。见pifferi等,2005,"qualityandfunctionalityofexcipients"farmaco.54:1-14；andzeleznikandrenak,businessbriefing:pharmagenerics2004。

合适的剂量是一种化合物的量，当如上所述施用时，能够促进抗癌治疗应答，并且比基础(即，未治疗)水平高至少10-50％。这种应答可以使用常规方法进行监测。一般而言，对于药物组合物，每种药物的量以每公斤宿主大约100μg至5mg的范围内的剂量存在，但是本领域技术人员将意识到，特定的剂量取决于待施用的药物，而不是必然局限于这个一般范围。同样，每次给药的合适体积将随着患者体型而变化。

在治疗的语境中，药物的“治疗有效量”是一种量或其药学上可接受的盐，其消除、减轻或缓解其所施用的症状。公开的组合物以任何合适的方式施用，经常与药学上可接受的载体一起。在本发明的上下文中向受试者施用治疗的合适方法是可用的，并且，尽管可以使用多于一种路径来施用具体的组合物，但是一种具体的路径通常可以提供比另一种通路更即时和更有效的反应。在本发明的上下文中，给予患者的剂量应该足以随着时间的过去对患者产生有益的治疗反应，或抑制疾病进展。因此，所述组合物以足以引发有效应答和/或减轻、减少、治愈或至少部分阻止所述疾病的症状和/或并发症的量施用于受试者。将适于完成此事的量定义为“治疗有效剂量”。

通常，合适的剂量和治疗方案涉及以足以提供治疗和/或预防益处的量施用活性化合物。与未治疗的患者相比，这种反应可以通过一种建立改善的临床结果(例如更频繁的缓解，完全或部分的、或更长时间的无病存活)来监测。

试剂盒

本发明还涵盖了试剂盒形式的诊断系统。在一些实施方案中，试剂盒可以用于进行本文所描述的诊断、预后或治疗方法。在一些实施方案中，试剂盒可用作伴随诊断，用于检测受试者中的calr外显子9indel突变，所述受试者已接受一种或多种calr相关疾病或病况或jak2相关疾病或病况的治疗。在一些实施方案中，所述calr相关疾病或病况或jak2相关疾病或病况是骨髓增殖性疾病，如真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化和未分类的骨髓增殖性疾病。通常，所述试剂盒应含有，在载体或分室化容器中，用于所述方法的任何一个上述实施例中的试剂。

本文提供的诊断系统可包括试剂盒，其在包装材料中含有，以足以用于至少一种测定法的量的，所述任何杂交测定探针和扩增引物，其用于检测calr野生型和突变核酸、和/或针对calr野生型和突变蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步含有用于检测一种或多种涉及骨髓增殖性疾病的基因(例如编码jak-stat通路蛋白的基因)中的额外突变的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括适合扩增和/或测序的一种或多种引物或探针。示例性引物包括选自seqidno:10-13的引物。所述引物可以用可检测的标识物如放射性同位素或荧光标记进行标记。

通常，所述试剂盒还将包括以有形形式(例如含在纸或电子介质中)记录的说明书，用于在检测测定中使用所述包装的探针、引物和/或抗体以确定测试样品中的突变核酸或蛋白质的存在和量。

诊断系统的各种成分可以以各种形式提供。例如，所需的酶，所述三磷酸核苷酸，所述探针、引物和/或抗体可以以冻干试剂提供。这些冻干试剂可以在冻干之前预先混合，以便当重组时它们形成完全的混合物，该混合物具有准备用于测定中使用的每种组分的适当比例。另外，本发明的诊断系统可以含有用于重构试剂盒的冻干试剂的重构试剂。在优选的试剂盒中，所述酶、三磷酸核苷酸和酶所需的辅因子作为单一的冻干试剂提供，当被重构时，形成用于本扩增方法的合适试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括合适的缓冲液、用于分离核酸的试剂，用于使用的说明书。试剂盒还可以包括微阵列，所述微阵列含有分别用于检测所述突变体基因或编码蛋白质的核酸或肽探针。

在一些实施方案中，试剂盒可以进一步含有用于将感兴趣的核酸或蛋白质锚定在固体支持物上的固体支持物。在一些实施方案中，所述靶核酸可以通过锚定到固体支持物上并且能够与感兴趣的核酸杂交的捕获探针直接或间接地锚定到所述固体支持物上。这种固体支持物的实例包括但不限于，珠子、微粒(例如金和其他纳米颗粒)、微阵列、微孔、多孔板。所述固体表面可以包含所述结合对的第一成员，并且所述捕获探针或所述靶核酸可以包含所述结合对的第二成员。所述结合对成员的结合将所述捕获探针或所述靶核酸固定到所述固体表面。这样的结合对的实例包括但不限于生物素/链霉亲和素、激素/受体、配体/受体、抗原/抗体。

用于所述试剂盒的示例性包装可以包括，例如以例如袋、盒子、管、架子的形式的容器或支撑物，并且被随意地分室。在装运和存储期间，所述包装可以为了安全目的而限定封闭的限制。

以下实施例用于说明本发明。这些例子绝不是为了限制本发明的范围。

实施例

实施例1.鉴定calr外显子9框内缺失

我们确定了用于排除/怀疑具有骨髓增殖性肿瘤(rompn)的所提交的样品中calr外显子9框内蛋白质改变的频率，。我们还评估了框内calr改变是否与+1bpcalr移码突变或与jak2v617f或mpn相关基因中的其他体细胞突变差异相关。

在最初针对rompn提交的1394jak2v617f阴性血液(n＝1253)和骨髓(n＝141)样品中评估了calr突变。还针对calr突变测试了额外一组94个jak2v671f阳性样品。

calr外显子9的突变分析是使用sanger测序分析从血液、骨髓穿刺液或固定的骨髓活检切片的样品中提取的基因组dna进行的，具有至少为15％(最小检测限)的分析灵敏度。以使用iontorrent测序组的突变定量进一步评估病例亚组以评估calr的外显子9、csf3r的外显子14和外显子17，jak2的外显子12或外显子14和外显子10mpl，；第二组评估asxl1(附加的sexcombslike1)、ezh2(zeste同系物2的增强子)，idh1(异柠檬酸脱氢酶1)，idh2(异柠檬酸脱氢酶2)，kras(kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物)，nras(成神经细胞瘤ras病毒(v-ras)癌基因同源物)和tet2(tet甲基胞嘧啶双加氧酶2)；或illuminatruseq扩展组评估这些基因和额外的18种mpn相关基因(即asxl1、calr、cbl、cebpa、csf3r、ddx41、dnmt3a、ezh2、flt3、gata1、idh1、idh2、jak2、kdm6a、kit、kras、mpl、npm1、nras、ptpn11、runx1、setbp1、sf3b1、srsf2、tet2、tp53、u2af1、wt1和zrsr2)。还进行了一次分筛测定(mllptd分筛测定)。表1中列出了通过miseq测序(417个扩增子)测定的29个基因和相应外显子。该测序组包括aml、mds和mpn/mds中几乎所有当前已知的重要预后突变标识物(或差异突变基因)。这些测定具有大约5％的灵敏度。使用焦磷酸测序测定法定量jak2v617f突变，具有为1％的分析灵敏度。

表1：每个基因的外显子以及部分或全部外显子覆盖在该组中

illuminamiseq测序采用基于可逆荧光染料终止子的方法通过检测在dna合成期间单个碱基的并入来并行测序数百万个dna分子。所述dna文库制备基于illuminatruseq定制的扩增子(tsca)方法，该方法包括使用dna探针汇集物与所述靶区域特异性杂交，然后通过探针延伸和连接形成双链dna，将其顺序扩增以对dna模板进行测序。该方案涉及以下步骤：1)dna提取；2)dna探针杂交和清理；3)用索引添加的pcr；4)在illuminamiseq系统上的簇生成和测序。

简而言之，dna是从全血、骨髓穿刺液或固定细胞团块中提取的。将寡核苷酸探针汇聚到单个定制的扩增子管(cat)中，其含有需要与靶区域杂交的所有探针。将所述定制的探针加入到每个样品中，并且通过在80分钟内将温度从95℃缓慢降低至40℃使其与所述特定的靶基因组区域杂交，然后进行纯化步骤以去除任何未结合的探针。接下来，通过加入dna聚合酶和dna连接酶来进行延伸-连接步骤以产生侧接pcr扩增所需的共同序列的双链dna片段。然后使用包括在所述探针和索引pcr引物中的共同序列通过pcr将样品特异性多重复合索引序列添加到每个文库。然后使用实时pcr将pcr产物纯化和定量。将多达24个特定索引的个体文库等量混合，变性并稀释以制备浓度为20pm的汇集的文库。将这个汇集的文库在加入miseq试剂筒之前进一步加热变性，然后装载到所述miseq上进行测序。图1中提供的所述测序方法的概述。

使用illuminabasecaller软件基础-调用(base-called)所述测序数据，使用用用grch37/hg19作为参照序列的seqnext软件(jsi医学系统)或gatk/bwa软件比对所述测序数据，并通过seqnext或alamut软件调用和注释突变(参见chamo.061)。这个定性检测报告将测序组以及mllptd分筛测定中29个基因的突变报告为“阳性”或“阴性”。其可用于检测诊断时存在于骨髓或相关肿瘤中的突变的范围，并用于通过与初始样品中的突变读数水平相比较来监测患者的复发或治疗响应。以下表2中显示了用于calr变体检测的示例性引物。

表2

在针对rompn提交的1394个样品中评估了calr外显子9的突变状态，其针对jak2v617f突变为阴性。其中264个(18.9％)具有典型的+1移码突变，包括150个带有l367fs*46(类型1)，71个带有k385fs*47，43个带有涉及密码子367-379、373-374和384-385的其他的+1个移码。2个病例(0.1％)具有点突变(e381a和d373n)。9个病例(0.6％)具有框内缺失，包括p.d397_d400>d(n＝6，图2)，p.e381_a382>a(n＝2)和p.e405_v409>v(n＝1)。所有e9框内缺失都存在于大约50％的读数中，显示种系多态性(表3)。这些框内indel的临床诊断是血细胞减少/bm纤维化、et、血小板增多症/贫血和未指定的rompn。

表3.框内calr外显子9indel序列改变

在94个jak2v617f阳性mpn样品平行的组中，仅在2个样品中注意到有calr突变：在具有28％jak2v617f突变的一个et病例中检测到所述p.d397_d400>d框内缺失，以及在具有低水平(4.2％)jak2v617f的一个病例中以杂合水平检测到k385fs*47calr突变。在185个诊断为急性髓细胞性白血病(aml)或骨髓增生异常综合征(mds)的病例中，在一例全血细胞减少症病例中注意到所述p.d397_d400>d框内缺失。

钙网织蛋白的c-末端区域在钙结合中起作用，从mpn中看到的从野生型到突变蛋白的等电点(pi)的变化可能影响钙结合的程度(shivarov等bloodcancerjournal20144:e185)。所述calr基因是高度保守的，其松散的酸性c-末端序列在许多物种中是相同的。然而，共有的黑猩猩序列显示与其他蛋白质相比涉及密码子493-497的酸性残基的相似的缺失(图2b)。在上述变体中一些酸性残基的丢失将改变pi，可能影响伴侣功能(villamil等jbiolchem2010feb12；285(7):4544-53；jorgensenetal.proteinpeptlett2005oct；12(7):687-93

为了评估含有这些变体的所述样品的其他特征，我们测试了额外28个mpn相关基因中的突变(表1)。在10个框内calrindel病例中的5个(50％)中检测到确定的体突变，包括mpl(w515l,40％；d163y,12％)、csf3r(a470t46％)、asxl1(d954fs*26,45％)和zrsr2(s449_r450dup,27％)。csf3r和mpl突变频率高于所有类型的rompn样品。

总之，发现calr外显子9框内缺失出现在0.6％的提交的用于髓样肿瘤病情检查的样品中，并且总是以杂合水平存在，有利于分类为正常序列变体。还发现这些变体的50％在另一个mpn相关基因中具有额外的突变。p.d397_d400>d框内缺失是最常见的变化，但是观察到涉及c端酸性区的其他框内缺失。calr中这些相对常见的大小多态性表明用于诊断致病性+1移码突变的分筛测定可能需要通过确定的dna测序来补充以鉴定缺失突变。具有calr框内缺失的rompn样品可以与更高频率的致病性jak-stat通路突变相关联。

应该理解的是，尽管本发明已通过本发明优选的实施方案和任选的特征具体公开，但是本领域技术人员可以采取其中所公开的本发明的修饰、改进和变化，且这些修饰、改进和变化视为在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实例是具体的实施方案的代表，是示例性的，且并不意在限制本发明的范围。

本发明已在本文广泛和一般地描述。落入一般性公开内的每个较窄种类和亚类也形成本发明的部分。其包括使用从属(genus)去除任何主题的限定或反面限制来对本发明的一般性描述，无论排除的材料是否具体记载在本文中。

此外，其中本发明的特征或方面采取马库什组描述时，本领域的技术人员将认可本发明由此还对马库什组的任何单独的成员或成员的亚群而言进行了描述。

本文提及的全部的出版物、专利申请、专利和其他参考文献明确通过提述以其整体并入，其达到与每一篇通过单独提述并入相同的程度。在冲突的情况中，以本发明的说明书(包括定义)为准。

说明性地描述的本发明可在本文未具体公开的任何元素或多种元素、限制或多种限制不存在下适当地实践。因此，例如，术语“包含”，“包括”，“含有”等应当被广义地理解而没有限制。此外，本文使用的术语和表达已经被用作描述性的术语而不是限制性的，并且不意图使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征的任何等同物或者其部分，但是它是认识到在本发明要求保护的范围内可以进行各种修改。

其他实施方案在所附的权利要求书内阐述。

序列表

>seqidno:1

>calr核苷酸编码序列

atgctgctatccgtgccgctgctgctcggcctcctcggcctggccgtcgccgagcctgccgtctacttcaaggagcagtttctggacggagacgggtggacttcccgctggatcgaatccaaacacaagtcagattttggcaaattcgttctcagttccggcaagttctacggtgacgaggagaaagataaaggtttgcagacaagccaggatgcacgcttttatgctctgtcggccagtttcgagcctttcagcaacaaaggccagacgctggtggtgcagttcacggtgaaacatgagcagaacatcgactgtgggggcggctatgtgaagctgtttcctaatagtttggaccagacagacatgcacggagactcagaatacaacatcatgtttggtcccgacatctgtggccctggcaccaagaaggttcatgtcatcttcaactacaagggcaagaacgtgctgatcaacaaggacatccgttgcaaggatgatgagtttacacacctgtacacactgattgtgcggccagacaacacctatgaggtgaagattgacaacagccaggtggagtccggctccttggaagacgattgggacttcctgccacccaagaagataaaggatcctgatgcttcaaaaccggaagactgggatgagcgggccaagatcgatgatcccacagactccaagcctgaggactgggacaagcccgagcatatccctgaccctgatgctaagaagcccgaggactgggatgaagagatggacggagagtgggaacccccagtgattcagaaccctgagtacaagggtgagtggaagccccggcagatcgacaacccagattacaagggcacttggatccacccagaaattgacaaccccgagtattctcccgatcccagtatctatgcctatgataactttggcgtgctgggcctggacctctggcaggtcaagtctggcaccatctttgacaacttcctcatcaccaacgatgaggcatacgctgaggagtttggcaacgagacgtggggcgtaacaaaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggcttaaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggaggcagaggacaaggaggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggaggacaaggaggaagatgaggaggaagatgtccccggccaggccaaggacgagctg

>seqidno:2

>gi|4757900|ref|np_004334.1|钙网织蛋白前体[智人(homosapiens)]

mllsvplllgllglavaepavyfkeqfldgdgwtsrwieskhksdfgkfvlssgkfygdeekdkglqtsqdarfyalsasfepfsnkgqtlvvqftvkheqnidcgggyvklfpnsldqtdmhgdseynimfgpdicgpgtkkvhvifnykgknvlinkdirckddefthlytlivrpdntyevkidnsqvesgsleddwdflppkkikdpdaskpedwderakiddptdskpedwdkpehipdpdakkpedwdeemdgeweppviqnpeykgewkprqidnpdykgtwihpeidnpeyspdpsiyaydnfgvlgldlwqvksgtifdnflitndeayaeefgnetwgvtkaaekqmkdkqdeeqrlkeeeedkkrkeeeeaedkeddedkdedeedeedkeedeeedvpgqakdel

>seqidno:3

>gi|209862753|ref|nm_004343.3|智人(homosapiens)钙网织蛋白(calr),mrna

gcggcgtccgtccgtactgcagagccgctgccggagggtcgttttaaagggcccgcgcgttgccgccccctcggcccgccatgctgctatccgtgccgctgctgctcggcctcctcggcctggccgtcgccgagcctgccgtctacttcaaggagcagtttctggacggagacgggtggacttcccgctggatcgaatccaaacacaagtcagattttggcaaattcgttctcagttccggcaagttctacggtgacgaggagaaagataaaggtttgcagacaagccaggatgcacgcttttatgctctgtcggccagtttcgagcctttcagcaacaaaggccagacgctggtggtgcagttcacggtgaaacatgagcagaacatcgactgtgggggcggctatgtgaagctgtttcctaatagtttggaccagacagacatgcacggagactcagaatacaacatcatgtttggtcccgacatctgtggccctggcaccaagaaggttcatgtcatcttcaactacaagggcaagaacgtgctgatcaacaaggacatccgttgcaaggatgatgagtttacacacctgtacacactgattgtgcggccagacaacacctatgaggtgaagattgacaacagccaggtggagtccggctccttggaagacgattgggacttcctgccacccaagaagataaaggatcctgatgcttcaaaaccggaagactgggatgagcgggccaagatcgatgatcccacagactccaagcctgaggactgggacaagcccgagcatatccctgaccctgatgctaagaagcccgaggactgggatgaagagatggacggagagtgggaacccccagtgattcagaaccctgagtacaagggtgagtggaagccccggcagatcgacaacccagattacaagggcacttggatccacccagaaattgacaaccccgagtattctcccgatcccagtatctatgcctatgataactttggcgtgctgggcctggacctctggcaggtcaagtctggcaccatctttgacaacttcctcatcaccaacgatgaggcatacgctgaggagtttggcaacgagacgtggggcgtaacaaaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggcttaaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggaggcagaggacaaggaggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggaggacaaggaggaagatgaggaggaagatgtccccggccaggccaaggacgagctgtagagaggcctgcctccagggctggactgaggcctgagcgctcctgccgcagagctggccgcgccaaataatgtctctgtgagactcgagaactttcatttttttccaggctggttcggatttggggtggattttggttttgttcccctcctccactctcccccaccccctccccgcccttttttttttttttttttaaactggtattttatctttgattctccttcagccctcacccctggttctcatctttcttgatcaacatcttttcttgcctctgtccccttctctcatctcttagctcccctccaacctggggggcagtggtgtggagaagccacaggcctgagatttcatctgctctccttcctggagcccagaggagggcagcagaagggggtggtgtctccaaccccccagcactgaggaagaacggggctcttctcatttcacccctccctttctcccctgcccccaggactgggccacttctgggtggggcagtgggtcccagattggctcacactgagaatgtaagaactacaaacaaaatttctattaaattaaattttgtgtctccaaaaaaaaaaaaaaaaaa

>seqidno:4

>gi|332853291|ref|xp_003316194.1|predicted:钙网织蛋白[黑猩猩(pantroglodytes)]

mllsvplllgllglavaepavyfkeqfldgdgwtsrwieskhksdfgkfvlssgkfygdeekdkglqtsqdarfyalsasfepfsnkgqtlvvqftvkheqnidcgggyvklfpnsldqtdmhgdseynimfgpdicgpgtkkvhvifnykgknvlinkdirckddefthlytlivrpdntyevkidnsqvesgsleddwdflppkkikdpdaskpedwderakiddptdskpedwdkpehipdpdakkpedwdeemdgeweppviqnpeykgewkprqidnpdykgtwihpeidnpeyspdpsiyaydnfgvlgldlwqvksgtifdnflitndeayaeefgnetwgvtkaaekqmkdkqdeeqrlkeeeedkkrkeeeeaedkeddedkdedeedkeedeeedvpgqakdel

>seqidno:5

>gi|386780961|ref|np_001248060.1|钙网织蛋白前体[猕猴(macacamulatta)]mllsvplllgllglaaaepavyfkeqfldgdgwtsrwieskhksdfgkfvlssgkfygdeekdkglqtsqdarfyalsasfepfsnkgqtlvvqftvkheqnidcgggyvklfpnsldqtdmhgdseynimfgpdicgpgtkkvhvifnykgknvlinkdirckddefthlytlivrpdntyevkidnsqvesgsleddwdflppkkikdpdaskpedwderakiddptdskpedwdkpehipdpdakkpedwdeemdgeweppviqnpeykgewkprqidnpdykgtwihpeidnpeyspdpsiyaydnfgvlgldlwqvksgtifdnflitndeayaeefgnetwgvtkaaekqmkdkqdeeqrlkeeeedkkrkeeeeaedkeddedkdedeedeedkeedeeedvpgqakdel

>seqidno:6

>gi|345787749|ref|xp_867310.2|predicted:钙网织蛋白异构体4[家犬(canislupusfamiliaris)]

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>seqidno:7

>gi|27806723|ref|np_776425.1|钙网织蛋白前体[家牛(bostaurus)]

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>seqidno:8

>gi|6680836|ref|np_031617.1|钙网织蛋白前体[小家鼠(musmusculus)]

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>seqidno:9

>gi|11693172|ref|np_071794.1|钙网织蛋白前体[褐家鼠(rattusnorvegicus)]mllsvplllgllglaaadpaiyfkeqfldgdawtnrwveskhksdfgkfvlssgkfygdqekdkglqtsqdarfyalsarfepfsnkgqtlvvqftvkheqnidcgggyvklfpggldqkdmhgdseynimfgpdicgpgtkkvhvifnykgknvlinkdirckddefthlytlivrpdntyevkidnsqvesgsleddwdflppkkikdpdaakpedwderakiddptdskpedwdkpehipdpdakkpedwdeemdgeweppviqnpeykgewkprqidnpdykgtwihpeidnpeyspdaniyaydsfavlgldlwqvksgtifdnflitndeayaeefgnetwgvtkaaekqmkdkqdeeqrlkeeeedkkrkeeeeaedkededdrdededeedekeedeedatgqakdel

>seqidno:10

>合成的核苷酸引物或探针

aggagcgctcaggcctcagtccagcc

>seqidno:11

>合成的核苷酸引物或探针

caggcagagcacacacctcagg

>seqidno:12

>合成的核苷酸引物或探针

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>seqidno:13

>合成的核苷酸引物或探针

tatctttgattctccttcagccctcac