本申请要求于2015年7月7日提交的美国临时专利申请序列号62/189,462的优先权，将其以全文通过引用特此结合。
本发明涉及用于改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。本发明还涉及增加由在诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。
背景技术：
丝状真菌和纤维素分解菌产生细胞外纤维素酶，所述细胞外纤维素酶赋予生物体水解纤维素的β-(1,4)-连接的糖苷键以产生葡萄糖的能力。这些酶为生物体提供了使用纤维素(最丰富的植物多糖)用于生长的能力。
丝状真菌里氏木霉(trichodermareesei)(里氏木霉(t.reesei)；真菌红褐肉座菌(hypocreajecorina)的无性型)是纤维素酶的有效生产者。因此，针对里氏木霉产生这些酶的能力已经对其进行了开发利用，这些酶在这样的商品如燃料乙醇、衣物、洗涤剂、纤维和其他产品的生产中是有价值的。
木霉属中的主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1和egl2的表达和产生取决于可用于生长的碳源。纤维素酶基因被葡萄糖严格抑制，而被纤维素或二糖(例如，槐糖、乳糖或龙胆二糖)诱导数千倍。公开的美国专利7713725披露了将全纤维素酶制剂添加到浓葡萄糖溶液中并进行充分的孵育，所得复合混合物能够不经进一步纯化而诱导纤维素酶产生。
蔗糖，通常被称为食用糖或糖，由甘蔗和甜菜制成。包括蔗糖糖蜜(制糖工业的重要残余物)的蔗糖来源可在世界一些地方，例如巴西、印度、欧盟、中国、泰国和美国大量得到。在蔗糖来源丰富且便宜的这些地方，尤其在需要大量或大体积的这种糖源来生产用于大型商业规模运营的诱导物的情况下，葡萄糖的成本可以被认为相对非常昂贵。因此，存在对包含蔗糖的方便的可溶性底物组合物的需要，所述组合物还提供了在丝状真菌(例如里氏木霉)中纤维素酶诱导的便宜方法，用于位于蔗糖是最丰富并且是成本效益的糖源的地区的商业运营。
技术实现要素：
本发明涉及用于改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。本发明还涉及增加由在诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。
在第一方面，本公开提供了一种产生诱导性饲料组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)生成第一混合物，所述第一混合物包含含有蔗糖和至少一种转化性酶的第一溶液；并且(b)将所述第一混合物在一定温度处孵育足够的时间以产生转化的混合物；并且(c)产生第二混合物，所述第二混合物包含由(b)产生的转化的混合物和至少一种逆转性酶(revertingenzyme)；并且(d)将所述第二混合物在一定温度处孵育足够的时间以产生所述诱导性饲料组合物。
在某些实施例中，第一溶液包含甘蔗汁糖浆(sjs)。
在某些其他实施例中，第一溶液包含非常高纯度蔗糖(vhp)。
在一些实施例中，第一溶液包含糖蜜(mol)。
在某些另外的实施例中，该方面的转化性酶(invertingenzyme)是转化酶(invertase)。
在以上实施例的任一项中，将第一混合物在从约30℃至约100℃范围内的温度处孵育持续1小时与60小时之间的时间段。例如，第一混合物可以在从约50℃至约80℃的温度处孵育持续2小时与30小时之间。
在第一方面所述的方法的以上实施例的任一项中，转化性酶可以是包含β-葡糖苷酶的全纤维素酶组合物。例如，逆转性酶可以是富含β-葡糖苷酶的纤维素酶组合物。
在又另外的实施例中，将该方面所述的方法的第二混合物在落入从约30℃至约100℃范围内的温度处孵育持续2小时与72小时之间的时间段。例如，第二混合物可以在从约30℃至约90℃(例如像约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃等)范围内的温度处孵育持续2小时至65小时之间(例如像2小时与60小时之间、5小时与55小时之间、10小时与50小时之间等)的时间段。
在第二方面，本公开提供了通过应用以上第一方面的实施例的任一项所述的方法产生的诱导性饲料组合物。
在一些实施例中，诱导性饲料组合物包含糖的混合物。
在某些实施例中，诱导性饲料组合物进一步包含槐糖。
在某些另外的实施例中，诱导性饲料组合物可以包含龙胆二糖。
在第三方面，本公开提供了一种用于从细胞培养物产生目的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：首先，按照以下步骤产生诱导性饲料组合物：(i)孵育包含从约50％至约70％蔗糖和至少一种转化性酶的溶液，产生第一混合物；并且(ii)，将所述第一混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以产生转化的混合物；(iii)通过将由(ii)产生的转化性混合物与至少一种逆转性酶进行组合来产生第二混合物；并且(iv)将第二混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以产生诱导性饲料组合物；并且其次，使细胞培养物与通过以上步骤产生的诱导性饲料组合物以有效诱导通过细胞培养表达目的蛋白质的量进行接触，该细胞培养物包含编码目的蛋白质的核苷酸序列的细胞，该核苷酸序列有效地连接至诱导型启动子。
在该方面所述方法的一些实施例中，将第一混合物在从约30℃至约100℃范围的温度处孵育持续1小时与60小时之间的时间段。例如，第一混合物可以在从约30℃至约90℃(例如像约30℃至约80℃、约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃等)范围的温度处孵育持续2小时与60小时之间(例如像2小时与55小时之间、5小时与60小时之间、10小时与50小时之间等)的时间段。
在该方面所述的方法的一些实施例中，将第二混合物在从约30℃至约100℃范围的温度处孵育持续2小时与72小时之间的时间段。例如，可以将第二混合物在落入从约30℃至约90℃(例如像约30℃至约80℃、约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约40℃至约70℃、约50℃至约80℃等)范围内的温度处孵育持续2小时与70小时之间(例如像5小时与65小时之间、10小时与60小时之间、12小时与55小时之间等)的时间段。
在该方面所述的方法的某些实施例中，目的蛋白质是内源性蛋白质。
在某些另外的实施例中，目的蛋白质是异源蛋白质。
在一些实施例中，目的蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：酶、激素、生长因子、细胞因子和抗体。例如，目的蛋白质可以是以下项之一：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。
在一些实施例中，诱导型启动子是槐糖诱导型启动子。
在一些实施例中，诱导型启动子是龙胆二糖诱导型启动子。
在一些实施例中，该启动子是纤维素酶基因启动子。例如，该启动子可以是来自里氏木霉的cbh1启动子。
在一些实施例中，所述细胞培养物的细胞是丝状真菌细胞。例如，该丝状真菌细胞是选自下组的细胞，该组由以下各项组成：木霉属、腐质霉属、镰孢菌属、曲霉属、脉孢菌属、青霉属、头孢霉属、绵霉属(achlya)、柄孢壳菌属(podospora)、内座壳属、毛霉属、旋孢腔菌属、毁丝霉属(myceliophthora)或梨孢属。该真菌可以是木霉属物种、毁丝霉属(myceliophthora)物种、青霉属物种、或曲霉属物种中的一个。
在一些实施例中，细胞培养物的细胞是细菌细胞。例如，该细菌细胞可以是从选自以下项的细菌衍生的细胞：链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属或纤维单胞菌属。
附图说明
图1显示了每种发酵的蛋白质产物的sds-page分析。基于通过改进的biuret方法测量的总蛋白质，将蛋白质样品稀释至5mg/ml。根据标准
具体实施方式
i.概述
本发明涉及用于改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。本发明还涉及增加由在诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。
ii.缩写和首字母缩略词
除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
cdna互补dna
dna脱氧核糖核酸
kda千道尔顿
mw分子量
rna核糖核酸
sds-page十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
sp.物种
tm熔融温度
w/v重量/体积
w/w重量/重量
℃摄氏度
h2o水
g或gm克
μg微克
mg毫克
kg千克
μl和μl微升
ml和ml毫升
mm毫米
μm微米
m摩尔
mm毫摩尔
μm微摩尔
u单位
sec秒
min(s)分钟
hr(s)小时
tris-hcl三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
mops3-(n-吗啉代)丙磺酸
iii.定义
在描述本发明的组合物和方法之前，定义了以下术语和短语。未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。
在提供了一系列值的情况下，应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内，并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内，服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下，排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。
本文提供了某些范围，其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性当量的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中，短语“约6的ph值”是指ph值为从5.4至6.6，除非ph值另有具体定义。
本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此，将说明书作为一个整体参考时，下面即将定义的术语被定义得更全面。
将本文件分为若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被解释为限制。
根据这一详细说明，以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多个这样的酶，并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其当量等。
进一步注意的是，权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语例如“单独”、“仅”等或利用“否定型”限定的前提基础。
进一步注意到，如本文使用的术语“基本上由……组成”是指一种组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总体组合物的以重量计小于30％的总量，并且不会有助于或干扰一种或多种组分的作用或活性。
进一步注意到，如本文所使用的术语“包含”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的组分是必需的或强制性的，但是包含一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或可选择的一种或多种组分。
还要注意的是，如本文所使用的术语“由……组成”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。
如将对于本领域技术人员显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
如本文所使用的，术语“抗体”是指多肽，该多肽包含来自特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而定义了免疫球蛋白种类，分别为igg、igm、iga、igd和ige。典型地，抗体或其功能等效物的抗原结合区在结合的特异性和亲和性方面将是最关键的。参见paul，fundamentalimmunology[基础免疫学]。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50-70kd)。各条链的n-末端限定了大约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗体识别的可变区。术语可变轻链(vl)和可变重链(vh)分别是指这些轻链和重链。
如本文所使用的，术语“纤维素酶(cellulase)”，“纤维素分解酶”或“纤维素酶(cellulaseenzymes)”意指细菌或真菌外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶、和/或内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用来将纤维素及其衍生物转化为葡萄糖。
许多微生物制造水解纤维素的酶，包括木腐真菌木霉菌属、堆肥细菌高温单孢菌属(现在是嗜热双岐菌属(thermobifida))、芽孢杆菌属和纤维单胞菌属；链霉菌属；以及真菌腐质霉属、曲霉属和镰孢菌属。由这些微生物制造的酶是以下具有用于将纤维素转化成葡萄糖的三种作用类型的蛋白质的混合物：内切葡聚糖酶(eg)、纤维二糖水解酶(cbh)和β-葡糖苷酶(bg)。
如本文所使用的，短语“全纤维素酶制剂”和“全纤维素酶组合物”可互换使用，并且都是指天然存在的和非天然存在的组合物。“天然存在的”组合物是由天然存在的来源产生的组合物，并且其包含一种或多种纤维二糖水解酶型、一种或多种内切葡聚糖酶型、以及一种或多种β-葡糖苷酶组分，其中这些组分中的每一种都以该来源产生的比例被发现。天然存在的组合物是由关于纤维素分解酶未修饰的生物体产生的组合物，使得各组分酶的比例与由天然生物体产生的组分的比率不变。
如本文所使用的，“非天然存在的”组合物涵盖通过以下方式产生的那些组合物：(1)以天然存在的比例或非天然存在的(即，改变的)比例组合各组分纤维素分解酶；或(2)修饰生物体以过表达或低表达一种或多种纤维素分解酶；或(3)修饰生物体使得至少一种纤维素分解酶缺失。
用于本发明中的全纤维素酶混合物可以使一种或多种不同的eg和/或cbh缺失。例如，eg1可以单独缺失或者与其他eg和/或cbh组合缺失。相对于原生水平，bg可能被过表达。本文还考虑了bg的异源表达。
如本文所使用的，术语“碳限制”是一种状态，其中微生物具有刚好足以产生所希望的蛋白质产物，但是不足以完全满足生物体的需求的碳，例如维持生长。因此，最大量的碳朝向蛋白质产生。
如本文所使用的，术语“启动子”和“纤维素酶启动子”是指起到引导下游基因转录作用的核酸序列，并且在本文中可互换使用。通常启动子将适合于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起是表达给定的基因所必须的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。在一方面，该启动子是诱导型启动子。在另一方面，该启动子是可被选自下组的诱导物诱导的，该组由以下各项组成：龙胆二糖、纤维素和槐糖。在一方面，该启动子是里氏木霉cbh1启动子，其保藏在基因库中的登录号d86235下。在另一方面，该启动子是来自里氏木霉的cbhii或木聚糖酶启动子。
如本文所使用的，“启动子序列”是出于表达目的而被特定丝状真菌识别的dna序列。“启动子”被定义为引导核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文所使用的，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶ii型启动子的情况下，是tata元件。“组成型”启动子是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。用于本发明的诱导型启动子的实例是里氏木霉cbh1启动子。术语“有效地连接的”启动子是指核酸表达控制序列(如启动子、或大量转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列引导与第二序列相应的核酸序列的转录。
实例包括来自以下项的启动子：泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(nunberg,j.h.等人，(1984)，mol.cell.biol[分子和细胞生物学].4,2306-2315；boel,e.等人，(1984)，emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3,1581-1585)；本文的米黑毛霉羧基蛋白酶基因；里氏木霉纤维二糖水解酶i基因(shoemaker,s.p.等人，(1984)，欧洲专利申请号epo0137280a1)；构巢曲霉trpc基因(yelton,m.等人，(1984)，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]81,1470-1474；mullaney,e.j.等人，(1985)，mol.gen.genet.[分子遗传学和基因组学]199,37-45)；构巢曲霉alca基因(lockington,r.a.等人，(1986)，gene[基因]33,137-149)；构巢曲霉tpia基因(mcknight,g.l.等人，(1986)，cell[细胞]46,143-147)；构巢曲霉amds基因(hynes,m.j.等人，(1983)，mol.cellbiol.[分子和细胞生物学]3,1430-1439)；里氏木霉xln1基因；里氏木霉cbh2基因；里氏木霉eg1基因；里氏木霉eg2基因；里氏木霉eg3基因；以及高等真核生物的启动子，如sv40早期启动子(barclay,s.l.和e.meller，(1983)，molecularandcellularbiology[分子和细胞生物学]3,2117-2130)。
当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果编码分泌性前导子(即信号肽)的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白质，那么所述编码分泌性前导子的dna有效地连接至所述多肽的dna；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子有效地连接至所述序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，那么所述核糖体结合位点有效地连接至编码序列。通常，“有效地连接”意指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌性前导子的情况下，是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则按照常规实践使用这些合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所使用的，术语“基因”意指涉及产生多肽链的dna的区段，该区段可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译区(5’utr)或“前导”序列以及3’utr或“尾部”序列，以及个体编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
该基因可以编码治疗上有意义的蛋白质或肽，如生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂、以及疫苗和抗体。该基因可以编码商业上重要的工业蛋白或肽，如酶，例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂肪酶。目的基因可以是天然存在的基因、突变基因或合成基因。
如本文所使用的，当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语“重组体”指示该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入一种异源核酸或蛋白，或改变一种天然核酸或蛋白而进行修饰，或指示该细胞是从这样修饰的一种细胞衍生的。因此，例如，这些重组细胞表达在细胞的天然形式(非重组)中未发现的基因或表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。
如本文所使用的，术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的dna序列，该多肽作为较大多肽的组分引导较大的多肽通过其中该较大多肽被合成的细胞的分泌途径。较大的肽在通过分泌途径转运期间通常被切割以去除分泌肽。
如本文所使用的，术语“诱导”是指基因的转录增加，这导致响应于“诱导物”的存在以显著增加的速率在细胞或生物体中合成目的蛋白质。为了测量对目的蛋白质的诱导，将用潜在诱导物处理的细胞与没有诱导物的对照样品进行比较。对照样品(未用诱导物处理)被指定相对蛋白质活性值为100％。当活性值相对于对照(未用诱导物处理)大于100％，大于110％，更优选150％，更优选200％-500％(即，相对于对照高出二到五倍)，或更优选地高出1000％-3000％时，实现对多肽的诱导。
如本文所使用的，本发明的术语“丝状真菌”是真核微生物并且包括真菌亚门的所有丝状形式(参见alexopoulos,c.j.，(1962)，introductorymycology[菌物学概论]，纽约，威利出版社(wiley))。这些真菌的特征在于具有由几丁质、纤维素和其他复合多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。酿酒酵母具有显著的非常稳定的二倍体期，而二倍体仅在丝状真菌(例如曲霉和脉孢菌)的减数分裂之前短暂存在。与构巢曲霉和粗糙脉孢菌分别有8条和7条染色体相对，酿酒酵母有17条染色体。对酿酒酵母和丝状真菌之间差异的最近说明包括酿酒酵母不能处理曲霉和木霉内含子，以及不能识别许多丝状真菌的转录调节因子(innis,m.a.等人，(1985)，science[科学]，228,21-26)。
如本文所使用的，术语“葡糖苷酶”是指其终产物是葡萄糖的任何酶。
如本文所使用的，术语“异源的”当关于核酸的部分使用时表明该核酸包含在自然界中未正常发现彼此间的相同关系的两个或更多个子序列。例如，该核酸典型地是重组产生的，具有两个或更多个序列，这些序列例如来自不相关基因，排列成产生一种新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地，异源蛋白将通常是指在自然界中未发现彼此间的相同关系的两个或多个子序列(例如融合蛋白)。
如本文所使用的，术语“孵育产物”是指在升高的温度处被保持或孵育持续特定时间段的溶液。
如本文所使用的，术语“诱导物”是任何导致细胞产生比如果诱导物不存在这些细胞以其他方式产生时更大量酶或其他物质的化合物。
如本文所使用的，术语“诱导性饲料”是指供给微生物的溶液，其导致或诱导产生所希望的蛋白质产物。
如本文所使用的，术语“分离的”或“纯化的”是指从其中去除与其天然相关的至少一种组分的核酸或氨基酸。
iv.使用高浓度糖混合物诱导基因表达
本发明涉及用于改进从细胞培养物产生白质的方法。本发明还涉及增加由在某些诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。具体而言，本发明涉及利用蔗糖或包含蔗糖的其他材料作为碳源或糖源改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。
a.基因表达的诱导
丝状真菌里氏木霉是研究最广泛的纤维素分解的生物体之一(例如由nevalainen和penttila，mycota[真菌界]，303-319，1995综述的)。在工业中，木霉的纤维素分解酶被用于许多目的，包括：生产燃料乙醇、纸、人造丝、玻璃纸、洗涤剂和纤维。纤维素酶还用于提高动物饲料的营养价值，并用于促进从植物细胞提取有价值的组分(mandels，biochem.soc.trans.[生物化学学会会刊]，414-16.1985)。因此，这些酶在许多有用产品的生产中是最重要的。
木霉中纤维素酶的产生取决于碳源。纤维素、乳糖和二糖槐糖通过里氏木霉诱导纤维素酶合成。相反，葡萄糖的存在导致纤维素酶基因表达的严格抑制。事实上，与含有葡萄糖的培养基相比，在含有诱导性碳源(如纤维素或槐糖)的培养基上主要纤维二糖水解酶1(cbh1)的表达水平上被上调数千倍(ilmen等人，app.environ.microbio.[应用与环境微生物学]，1298-1306，1997)。
纤维素酶合成经受了纤维素诱导和葡萄糖抑制两者。因此，影响在诱导型启动子控制下纤维素酶或异源蛋白质产量的关键因素是维持纤维素底物与葡萄糖浓度之间的适当平衡；获得调控基因产物的合理的商业产量是至关重要的。尽管纤维素是一种有效且廉价的诱导物，但是当木霉生长在固体纤维素上时，控制葡萄糖浓度可能是有问题的。在低浓度的纤维素下，葡萄糖产生可能太慢以至于不能满足活性细胞生长和功能的代谢需要。在另一方面，当葡萄糖生成快于消耗时，葡萄糖抑制可以停止纤维素酶合成。因此，需要昂贵的工艺控制方案来提供缓慢的底物添加和葡萄糖浓度的监测(ju和afolabi，biotechnol.prog.[生物技术进展]，91-97，1999)。此外，由于纤维素材料的固体性质，底物的缓慢连续递送可能难以实现。
allen和mortensen(biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]，2641-45,1981)已经示出，来自海枣曲霉(aspergillusphoenicis)的200iu/ml的纯化的β-葡糖苷酶当与50％葡萄糖浆一起孵育时产生当用作碳源时具有诱导纤维素酶产生的能力的溶液。β-葡糖苷酶的纯化既耗时又昂贵。此外，这些作者使用了与目前的工作中使用的相比超过20x的β-葡糖苷酶负荷。
与使用纤维素作为诱导性底物有关的一些问题可以通过使用可溶性底物和诱导物(如乳糖或槐糖)来克服。乳糖必须以高浓度提供以起到诱导物和碳源的作用。(参见seiboth等人，mol.genet.genomics[分子遗传学和基因组学]，124-32，2002)。龙胆二糖也可以作为诱导物。槐糖是比纤维素更有效的诱导物，但是槐糖价格昂贵且难以制造。公开的美国专利7713725披露了当将全纤维素酶制剂添加浓葡萄糖溶液中并将该组合物在约50℃至约75℃处孵育持续至少两天时，产生了含有纤维素酶基因表达的可观量的诱导物的糖混合物，即诱导性饲料组合物。所得混合物不需要任何进一步的纯化，并且有能力按原样诱导纤维素酶产生。
b.包含蔗糖来源的诱导性组合物
蔗糖主要由两种重要的糖料作物制成：甘蔗(甘蔗属(saccharum)的物种)和甜菜(sugarbeets)(甜菜(betavulgaris))。在主要的糖生产国中，包括巴西、印度、欧盟、中国、泰国和美国(联合国粮食及农业组织，2011-11-18日检索)，亚洲在蔗糖生产中占主导地位，来自印度、中国、泰国和其他国家的巨大贡献相结合，占了这样的蔗糖全球产量的40％。南美洲以全球产量的32％排在第二位，巴西是世界上最大的糖输出国或之一，2013年出口约2900万吨，并且欧盟(eu)是世界第二大糖输出国。
包括蔗糖糖蜜(制糖工业的一种重要的残余物)的蔗糖来源在上面列出的世界的这些地方中是大量可得的。因此，具有使用蔗糖作为组分之一的方便的可溶性底物组合物，以及还提供在丝状真菌(例如像里氏木霉)中纤维素酶诱导的廉价方法将是有利的。
在第一方面，本公开提供了一种产生诱导性饲料组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过将蔗糖与至少一种转化性酶混合来生成第一混合物；并且
b)将第一混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以产生转化的混合物；并且
c)通过将步骤b)中产生的转化的混合物与至少一种逆转性酶混合来生成第二混合物；并且
d)将第二混合物在合适的温度处孵育持续足够的时间段以产生诱导性饲料组合物。
本发明提供了一种使用从包含蔗糖的糖源衍生的转化的糖混合物来产生诱导性饲料组合物的方法。
转化的糖混合物是由蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖的等份混合物。包含蔗糖的糖源可以包括甘蔗汁糖浆、非常高纯度的蔗糖、蔗糖糖蜜或包含蔗糖的任何其他糖源。可以通过使用酶转化酶(ec3.2.1.26)转化包含蔗糖的糖源来获得转化的糖混合物，所述酶转化酶催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。可以将蔗糖溶液在落入30℃-100℃范围内(优选在40℃-90℃范围内，如在30℃-90℃范围内、或在40℃-80℃范围内、或在50℃-80℃范围内、或在55℃-75℃范围内)的温度处转化持续1小时与60小时之间(优选2小时与50小时之间，例如像5小时与45小时之间、或10小时与40小时之间、或15小时与35小时之间等)的时间段，同时与转化酶混合。
可以将最终发酵(eof)发酵液(即，全纤维素酶加上细胞)添加到转化的蔗糖溶液中。细胞或细胞碎片的存在不会影响槐糖的形成。因此，在使用发酵液用于产生槐糖诱导物之前，不需要首先从eof发酵液中回收纤维素酶。事实上，发酵运行结束时存在于发酵液中的酶混合物可以直接按原样使用，而无需处理步骤，即使细胞仍然存在于发酵液中。
在一个实施例中，本发明提供了一种包含转化的糖溶液和全纤维素酶制剂的组合物，其可以用作诱导性饲料用于通过丝状真菌产生目的蛋白质。在一个实例中，目的蛋白质是纤维素分解酶。在另一个实例中，目的蛋白质是对丝状真菌宿主而言异源的蛋白质。在一个具体的实施例中，诱导性饲料诱导由里氏木霉产生纤维素酶。
在一个实施例中，将来自里氏木霉的全纤维素酶制剂添加到转化的糖溶液中至终浓度为2g至20g总蛋白/l之间。尽管终浓度的优选范围可以是这样的，但是混合物的最终蛋白质浓度可以在从低至0.5g/l或高达50g/l的范围内。
在一个实例中，转化的糖溶液中的β-葡糖苷酶活性大于1.5iu/ml。在一个实例中，转化的糖溶液中的β-葡糖苷酶活性小于200iu/ml。在另一个实例中，转化的糖溶液的β-葡糖苷酶活性在1.5iu/ml与200iu/ml之间。在另一个实例中，转化的糖溶液的β-葡糖苷酶活性在1.9iu/ml与200iu/ml之间。在另一个实例中，转化的糖溶液的β-葡糖苷酶活性在9.3iu/ml与200iu/ml之间。在另一个实例中，转化的糖溶液的β-葡糖苷酶活性在1.5iu/ml与180iu/ml之间。在另一个实例中，转化的糖溶液的β-葡糖苷酶活性在9.3iu/ml与180iu/ml之间。
可以将全纤维素酶或富含纤维素酶和转化的糖溶液的混合物在落入30℃-100℃范围内的温度处孵育，优选30℃-90℃范围内，例如在40℃-90℃范围内、或在50℃-100℃范围内、或在40℃-80℃范围内、或在50℃-80℃范围内等。
可以将全纤维素酶或富含纤维素酶和转化的糖溶液的混合物孵育持续2小时与7天之间的时间段，例如5小时与6天之间、或10小时与5.5天之间、或15小时与6天之间、或20小时与7天之间等的时间段，同时连续或周期性混合。在一个实例中，孵育期大于约2天，例如2天半、或3天或4天、或者甚至5天或更长。在某些其他实例中，孵育期为2天或短于2天，例如1天半或1天等。在另外的具体实例中，孵育期为约3天。
可以收获来自这样的孵育的无菌终产物溶液并用于发酵补料。
在某些实施例中，通过将全纤维素酶制剂添加到转化的糖溶液中至终浓度为2g总蛋白/l来制备诱导性饲料。
在第二方面，本公开提供了一种用于从细胞培养物产生目的蛋白质的方法，该方法包括：首先，按照以下步骤产生诱导性饲料：(1)将包含约50％至约70％蔗糖的溶液与至少一种转化性酶在合适的温度处孵育持续足够的时间段以产生第一转化的混合物；然后(2)通过将第一转化的混合物与至少一种逆转性酶组合而产生第二混合物，并将该混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以形成诱导性饲料组合物；并且其次，使细胞培养物和该诱导性饲料组合物以足以或有效诱导目的蛋白质表达的量进行接触。合适的细胞培养物包含含有编码目的蛋白质的核苷酸序列的细胞，该核苷酸序列有效地连接至诱导型启动子。
1.分子生物学
在一个实施例中，本发明提供了在里氏木霉的纤维素酶基因启动子控制下异源基因的表达。因此，本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。披露了本发明中使用的一般方法的基本文献包括sambrook等人，molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册](第2版，1989)；kriegler，genetransferandexpression:alaboratorymanual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及ausubel等人编辑，currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学现代方法](1994))。
包含丝状真菌的纤维素酶启动子序列的异源基因在转化到里氏木霉细胞用于复制和/或表达之前通常被克隆到中间载体中。这些中间载体可以是原核载体，例如像质粒或穿梭载体。
为了获得克隆基因的高水平表达，异源基因优选位于与在天然存在的纤维素酶基因中与启动子约相同的距离。可是如本领域已知的，可以调节这个距离方面的一些变化，而不丧失启动子功能。
本领域技术人员清楚的是可以通过置换、取代、添加或消除一个或多个核苷酸而不改变启动子的功能来修饰天然的启动子。本发明的实践涵盖但不受对启动子的这些改变的限制。
表达载体/构建体通常含有转录单元或表达盒，该转录单元或表达盒含有表达异源序列所需的所有附加元件。因此，典型的表达盒含有与异源核酸序列可操作连接的启动子，以及转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。该盒的附加元件可以包括增强子，并且如果使用基因组dna作为结构基因，可以包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
本发明的实践不受遗传构建体中启动子选择的限制。可是，适合的启动子的实例包括里氏木霉cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1、和/或xln2启动子。
除了启动子序列之外，该表达盒还可以含有结构基因的录终止区下游转以提供有效的终止。该终止区可以从与启动子序列相同的基因获得或者可以从不同基因获得。尽管任何真菌终止子在本发明中可能是有功能的，但优选的终止子包括：来自木霉属cbhi基因的终止子，来自构巢曲霉trpc基因(yelton,m.等人，(1984)，pnasusa[美国科学院院刊]81:1470-1474；mullaney,e.j.等人，(1985)，mgg[分子遗传学与基因组学]199:37-45)、泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(nunberg,j.h.等人，(1984)，mol.cellbiol.[分子细胞生物学]4:2306，boel,e.等人，(1984)，emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1581-1585)、和/或米黑毛霉羧基蛋白酶基因(epo公开号0215594)的终止子。
用来将遗传信息运送到细胞中的具体表达载体不是特别关键。可以使用用于在真核细胞或原核细胞中表达的常规载体的任一种。标准的细菌表达载体包括噬菌体λ和m13，以及质粒如基于pbr322的质粒，pskf，pet23d和融合表达系统如mbp、gst和lacz。也可以将表位标签，例如c-myc，添加到重组蛋白中以提供便利的分离方法。
可以包括在表达载体中的元件还可以是复制子，编码允许选择携带重组质粒的细菌的抗生素抗性的基因，或在质粒的非必需区中的允许插入异源序列的独特限制性位点。所选择的特定抗生素抗性基因也不是决定性的，因为本领域已知的许多抗性基因中的任一种都可以是合适的。优选地选择原核序列，使得它们不干扰dna在里氏木霉中的复制或整合。
本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或一部分稳定整合到丝状真菌的基因组中。然而，还考虑了导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。
可以使用许多标准转染方法以产生表达大量异源蛋白质的里氏木霉细胞系。一些用于将dna构建体引入木霉属的产纤维素酶菌株的公开的方法包括：lorito,hayes,dipietro和harman,1993,curr.genet.[现代遗传学]24:349-356；goldman,vanmontagu和herrera-estrella,1990,curr.genet.[现代遗传学]17:169-174；penttila,nevalainen,ratto,salminen和knowles,1987,gene[基因]6:155-164；对于曲霉属：yelton,hamer和timberlake,1984,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474；对于镰孢菌属：bajar,podila和kolattukudy,1991,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88:8202-8212；对于链霉菌属：hopwood等人,1985,thejohninnesfoundation[约翰英纳斯基金会]，诺维奇，英国；以及对于芽孢杆菌属：brigidi,derossi,bertarini,riccardi和matteuzzi,1990,femsmicrobiol.lett.[fems微生物学快报]55:135-138。
用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何已知程序都可以使用。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组dna、cdna、合成dna、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他已知方法(参见例如sambrook等人，同上)。还使用的是农杆菌介导的转染方法，如在美国专利号6,255,115中描述的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达异源基因的宿主细胞中的具体遗传工程化程序。
将表达载体引入细胞后，在有利于表达在纤维素酶基因启动子序列控制下的基因的条件下培养转染的细胞。大批转化细胞可以如本文所述进行培养。最后，使用标准技术从培养物回收产物。
因此，本发明在此提供了表达在纤维素酶基因启动子序列控制下的所希望多肽的表达和增强的分泌，所述纤维素酶基因启动子序列包括天然存在的纤维素酶基因、融合dna序列和各种异源构建体。本发明还提供了用于表达和分泌高水平的这些所希望多肽的方法。
2.丝状真菌
丝状真菌包括真菌亚门和卵菌亚门的所有丝状形式。
丝状真菌的特征在于具有由几丁质、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的细胞壁的营养菌丝体，其中通过菌丝伸长的营养生长和专性需氧的碳分解代谢。
出于本发明的目的，该丝状真菌亲本细胞可以是但不限于以下项物种的细胞：木霉属，例如长枝木霉(里氏木霉)、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉；青霉属物种；腐质霉属物种，包括特异腐质霉；金孢霉属物种，包括卢克诺文思金孢子菌(c.lucknowense)；粘帚霉属物种；曲霉属物种；镰孢菌属物种；脉孢菌属物种；肉座菌属物种；以及翘孢霉属物种。
如本文所使用的，术语“木霉属”或“木霉属物种”是指先前已被分类为木霉属或目前被分类为木霉属的任何真菌菌株。
在某些实施例中，丝状真菌亲本细胞是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉或构巢曲霉细胞。
在某些具体实施例中，丝状真菌亲本细胞是里氏木霉细胞。
3.蛋白质表达
通过培养用表达载体转化的细胞来产生本发明的蛋白质，所述表达载体含有在纤维素酶基因启动子序列控制下表达的基因。本发明对于增强蛋白质的细胞内和/或细胞外产生是特别有用的。该蛋白质可以是同源或异源的。可由本发明产生的蛋白质包括但不限于激素、酶、生长因子、细胞因子、抗体等。
酶包括但不限于各种工业上有用的酶，如蛋白酶，酯酶、脂肪酶、酚氧化酶、通透酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡糖异构酶、漆酶、蛋白质二硫键异构酶等。
目的蛋白质可以包括例如以下项中披露的酶：pct申请公开号wo03/027306、wo200352118_a2、wo200352054_a2、wo200352057_a2、wo200352055_a2、wo200352056_a2、wo200416760_a2、wo9210581_a1、wo200448592_a2、wo200443980_a2、wo200528636_a2、wo200501065_a2、wo2005/001036、wo2005/093050、wo200593073_a1、wo200674005_a2、wo2009/149202、wo2011/038019、wo2010/141779、wo2011/063308、wo2012/125951、wo2012/125925、wo2012125937、wo/2011/153276、wo2014/093275、wo2014/070837、wo2014/070841、wo2014/070844、wo2014/093281、wo2014/093282、wo2014/093287、wo2014/093294、wo2015/084596或wo2016/069541。
激素包括但不限于：卵泡刺激素、黄体生成激素、促皮质素释放因子、生长激素抑制素、促性腺激素、加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。
生长因子是与细胞表面上的受体结合并以活化细胞增殖和/或分化为主要结果的蛋白质。生长因子包括但不限于：血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等。
细胞因子是一个独特的生长因子家族。主要由白细胞分泌的细胞因子刺激体液和细胞免疫应答以及吞噬细胞的活化。细胞因子包括但不限于集落刺激因子、白细胞介素(il-1α和β、il-2到il-13)和干扰素(α、β和γ)。
人白细胞介素-3(il-3)是含有133个氨基酸残基的15kda蛋白质。il-3是一种物种特异性集落刺激因子，该物种特异性集落刺激因子刺激来自骨髓培养物的巨核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成。
抗体包括但不限于来自需要大量生产的任何物种的免疫球蛋白。特别优选的是抗体是人抗体。免疫球蛋白可以来自任何种类，即igg、igm、iga、igd或ige。
本发明中的目的蛋白质也能以一种方式被修饰以形成包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的目的蛋白质的嵌合分子。在一个实施例中，这样的嵌合分子包含目的蛋白质与标签多肽的融合体，该标签多肽提供了抗标签的抗体能选择性结合的表位。表位标签通常位于目的蛋白质的氨基端或羧基末端。
不同的标签多肽和它们各自的抗体是本领域熟知的。实例包括聚-组氨酸(聚-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)标签；his6和金属螯合标签、流感ha标签多肽及其抗体12ca5(field等人，mol.cell.biol.[分子和细胞生物学]8:2159-2165(1988))；c-myc标签及其8f9、3c7、6e10、g4、b7和9e10抗体(evan等人，molecularandcellularbiology[分子和细胞生物学]5:3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白d(gd)标签及其抗体(paborsky等人，proteinengineering[蛋白质工程]3(6):547-553(1990))。其他标签多肽包括flag-肽(hopp等人，biotechnology[生物技术]6:1204-1210(1988))；kt3表位肽(martin等人，science[科学]255:192-194(1992))；微管蛋白表位肽(skinner等人，j.biol.chem.[生物化学杂志]266:15163-15166(1991))；以及t7基因10蛋白肽标签(lutz-freyermuth等人，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]87:6393-6397(1990))。
在一个替代性实施例中，嵌合分子可以包含目的蛋白质与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合体。对于二价形式的嵌合分子，这样的融合可以是与igg分子的fc区域。
适合于表达目的基因的条件可以包括向培养物提供本发明的诱导性饲料组合物。用于产生蛋白质的最佳条件将随宿主细胞的选择以及待表达的蛋白质的选择而变化。本领域技术人员通过常规实验或优化可以容易地确定这样的条件。
目的蛋白质可以在表达后被纯化或分离。目的蛋白质能以本领域技术人员已知的各种方式被分离或纯化，这取决于样品中存在的其他组分。标准纯化方法包括电泳、分子、免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和以及反相hplc色谱和色谱聚焦。例如，目的蛋白质可以使用标准抗目的蛋白质抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术联合蛋白质浓缩也是有用的。对于合适的纯化技术中的一般指导，请参见scopes，proteinpurification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。
4.发酵
本发明依赖发酵程序来培养真菌。用于产生纤维素酶的发酵程序是本领域已知的。例如，纤维素酶可以通过固体培养或浸没培养(包括分批、补料分批和连续流程)来产生。
培养在生长培养基中完成，该生长培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳源和能源材料、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始接种物。
除了碳源和能源、氧气、可同化氮和微生物的接种物外，还有必要以恰当比例供给合适量的矿质营养素来确保适当的微生物生长，使微生物转化过程中细胞对碳源和能源的同化最大化，并且在发酵培养基中获得最大细胞产量和最大细胞密度。
含水矿质培养基的组成可在宽泛的范围内变化，这部分取决于所使用的微生物和底物，正如本领域所已知的。除了氮以外，该矿质培养基还应该包括处于合适的可溶性可同化离子形式和化合形式的合适量的磷、镁、钙、钾、硫和钠，并且还优选应存在也处于适合的可溶性可同化形式的某些痕量元素如酮、锰、钼、锌、铁、硼和碘以及其他，这些全部如本领域所已知的。
该发酵反应是一需氧过程，其中所需的分子氧通过含分子氧气体如空气、富氧空气或甚至基本上纯的分子氧供给，只要维持发酵容器的内容物具有可有效用于帮助微生物物种以旺盛方式生长的合适的氧分压。实际上，通过使用氧合烃底物，微生物生长的氧需求得以减少。然而，必须提供分子氧用于生长，因为底物的同化以及微生物的相应生长部分是燃烧过程。
尽管通气速率可在相当大的范围内变化，但通气通常以如下速率进行，该速率的范围是约0.5至10，优选地约0.5至7体积(在所采用的压力处以及在25℃处)的含氧气体/发酵罐中的液体体积/分钟。该量基于提供给反应器的正常氧含量的空气，并且就纯氧而言，相应的范围将会是约0.1至1.7，或优选约0.1至1.3体积(在所采用的压力处以及在25℃处)的氧/发酵罐中的液体体积/分钟。
微生物转化过程所采用的压力范围广泛。压力通常在约0至50psig的范围内，现在优选约0至30psig，更优选至少稍高于大气压，作为设备和操作耗费与所实现的氧溶解度的平衡。高于大气压是有利的，因为这种压力的确趋于增加含水发酵物中的溶解氧浓度，其进而可以帮助增加细胞生长速率。同时，通过以下事实进行平衡：高大气压的确会增加设备和操作费用。
发酵温度可以稍微变化，但对于丝状真菌如里氏木霉，温度通常将会在约20℃至40℃的范围内，一般优选在约25℃至34℃的范围内，这取决于所选择的微生物菌株。
微生物还需要可同化氮源。可同化氮源可以是任何含氮化合物或能够释放适于微生物进行代谢利用的形式的氮。虽然可采用多种有机氮源化合物如蛋白质水解产物，但通常可以利用廉价的含氮化合物，如氨、氢氧化铵、尿素和多种铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或多种其他氨化合物)。氨气本身便于大规模操作，并且能以合适的量通过鼓泡穿过含水发酵物(发酵培养基)而使用。同时，还可采用这种氨来帮助进行ph控制。
含水微生物发酵物(发酵混合物)中的ph范围应该是在约2.0至8.0的示例性范围内。在丝状真菌的情况下，ph通常在约2.5至8.0的范围内；在里氏木霉的情况下，ph通常在约3.0至7.0的范围内。微生物ph范围的偏好在一定程度上取决于所采用的培养基以及特定的微生物，并因而随着培养基的变化而稍微改变，如可以通过本领域技术人员容易地确定的。
虽然发酵罐中的发酵混合物的平均保持时间可以相当大地变化，这部分取决于所采用的发酵温度和培养物，但一般而言其将在约24至500小时，现在优选约24至400小时的范围内。
优选地，发酵以使得含碳底物可被控制为限制性因素的方式进行，从而为细胞提供了含碳底物的良好转化并避免这些细胞被相当量的未转化底物污染。后一种情况对水溶性底物而言不是问题，因为任何剩余的痕量物质均可容易地洗掉。然而，在非水溶性底物的情况下这可能是个问题，并且需要增加的产物处理步骤如合适的洗涤步骤。
如上所述，达到该水平的时间不是关键的，并且可随特定的微生物和所进行的发酵过程而变化。然而，本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及所需的碳源水平是否已经达到。
尽管发酵可以分批或连续操作进行，但为了易于控制、产生均一量的产物以及最经济地使用所有设备，分批补料操作是更为优选的。
如果需要，在将含水矿质培养基进料至发酵罐之前，可以将碳源和能源材料的部分或全部和/或可同化氮源(如氨)的部分添加至该含水矿质培养基。
优选以预定的速率，或者响应可通过监测例如碳和能量底物的浓度、ph、溶解氧、来自发酵罐的废气中的氧或二氧化碳、通过干细胞重量可测量的细胞密度、光透射比等而确定的需求来控制引入反应器的每一种料流。多种材料的进料速度可以变化以便获得与碳源和能源的有效利用相一致的尽可能快的细胞生长速率，以获得相对于底物变化尽可能高的微生物细胞产量。
在分批操作或优选的补料分批操作中，一开始对所有的设备、反应器或发酵装置、器皿或容器、管道、附带的循环或冷却设备等进行灭菌，通常通过采用蒸汽例如在约121℃持续至少约15分钟。然后在存在所有所需的营养物，包括氧和含碳底物的情况下，用所选微生物的培养物接种灭菌过的反应器。所采用的发酵罐的类型不是关键的，尽管现在优选的是在15lbiolafitte(圣日耳曼昂莱公司(saint-germain-en-laye)，法国)下操作。
从发酵液收集和纯化纤维素酶还可以通过本领域本身已知的程序进行。发酵液将通常含有细胞碎片，包括细胞、多种悬浮固体和其他生物质污染物(优选将它们通过本领域已知的手段从发酵液去除)、以及所希望的纤维素酶产物。
适用于这样的去除的方法包括常规的固体-液体分离技术，例如像离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或其他已知的方法，以产生无细胞滤液。可以优选的是使用技术如超滤、蒸发或沉淀在结晶之前进一步浓缩发酵液或无细胞滤液。
沉淀上清液或滤液的蛋白质组分可以借助于盐(例如硫酸铵)来完成，然后通过各种层析程序(例如离子交换层析、亲和层析或类似的本领域公认的方法)进行纯化。
实例
提供以下实例以说明但不限制要求保护的本发明。
这些实验的目的是测试作为木霉发酵的底物的蔗糖来源。评价和比较了使用各种蔗糖饲料的里氏木霉菌株的纤维素酶表达。蔗糖饲料包括甘蔗汁糖浆(sjs)、非常高纯度蔗糖(vhp)和糖蜜(mol)。
实例1
葡萄糖/槐糖(g/s)对照发酵
如先前在例如美国专利号7,713,725中所述制备用于诱导对照里氏木霉蛋白质生产发酵的葡萄糖/槐糖溶液。将葡萄糖/槐糖制剂稀释以匹配蔗糖进料的糖固体含量。固体含量为55％。
典型的工业规模里氏木霉发酵过程包括两个阶段。第一阶段是生物质生长阶段，几乎没有蛋白质产生；随后是蛋白质生产阶段，几乎没有生物质生长。在第二阶段期间，在正常情况下，蛋白质生产的速率是线性的。蛋白质生产率是从生产阶段开始到运行结束的平均速率。产量计算是在蛋白质生产阶段期间产生的蛋白质的量除以在同一时间段期间消耗的糖的量。使用如由weichselbaum和gornall改进的biuret方法，使用牛血清白蛋白作为校准物测量发酵样品中的总蛋白质(weichselbaum,t.amer.，j.clin.path.[临床病理学杂志]1960,16:40；gornall,a.等人，j.biol.chem.[生物化学杂志]1949,177:752)。
相同的计算将用于本文所述的蔗糖发酵。在每种情况下，蛋白质生产阶段范围从160到170小时。表1中的结果表示为g/s对照发酵的百分数。
实例2
甘蔗汁糖浆(sjs)发酵
将甘蔗汁糖浆(蔗糖)进行转化并还原，并将所得糖浆供给至里氏木霉蛋白质生产发酵。将结果与供给葡萄糖/槐糖的相同菌株的对照发酵进行比较。
使用转化并还原的甘蔗汁糖浆进行三次重复的发酵。转化在75℃和ph2.0处进行持续4小时，随后在ph4.0和60℃处用以64,000u/kg糖浆浓度包括的里氏木霉β-葡糖苷酶(bgl1)还原持续48小时。可替代地，可以采用合适的转化酶来进行转化，例如从黑曲霉(unipro登录号：q0zr36)、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉或其他曲霉属物种衍生的转化酶，或者从尖孢镰孢菌或其他类似的真菌物种、以及从各种细菌甚至植物来源衍生的转化酶。转化反应可以在合适的条件下进行，如在乙酸盐缓冲液中，在ph5-5.5以及30℃与40℃之间的温度处持续1小时与48小时之间的孵育(伴随混合)期。
甘蔗汁糖浆的总固体含量为53％。
对于基于糖的总蛋白质生产和蛋白质的产量，转化并还原的甘蔗汁糖浆表现为相当于葡萄糖/槐糖(表1)。
实例3
非常高纯度蔗糖(vhp)发酵
将非常高纯度(vhp)蔗糖进行转化并还原，并且将所得糖供给至里氏木霉蛋白质生产发酵。将结果与供给葡萄糖/槐糖的相同菌株的对照发酵进行比较。
使用转化并还原的vhp蔗糖饲料进行里氏木霉的重复发酵。转化在75℃和ph2.0处进行持续4小时，随后在ph4.0和60℃处用以64,000u/kg糖浆浓度包括的里氏木霉β-葡糖苷酶(bgl1)还原持续48小时。
vhp饲料的总固体含量为55％。运行对照发酵，其中进行vhp转化，但是省略还原。
vhp重复发酵中的一个在最后两个时间点样品中显示出污染。这似乎对性能没有重大影响。相对于未污染的运行，产量减少了3％，并且速率降低了7％。转化后省略还原导致了蛋白质产量大大降低(表1)。
还原的酸性条件不足以制造所需的槐糖用于最佳蛋白质生产。
实例4
蔗糖糖蜜(mol)发酵
将蔗糖糖蜜进行转化并还原，并且将所得糖供给至里氏木霉蛋白质生产发酵。将结果与供给葡萄糖/槐糖的相同菌株的对照发酵进行比较。
使用转化并还原的蔗糖糖蜜饲料进行重复的里氏木霉发酵。转化在75℃和ph2.0处进行持续4小时，随后在ph4.0和60℃处用以64,000u/kg糖浆的里氏木霉β-葡糖苷酶(bgl1)还原持续48小时。第三次发酵使用仅蔗糖糖蜜转化的饲料。
没有还原，蛋白质产量大大降低，再次表明单独的酸性条件不足以用于足够的槐糖生产。
测量出由转化并还原的糖蜜进行的蛋白质生产大于g/s对照27％-38％。在基于糖的总蛋白的产量中也观察到了相同的结果(表1)。
然而，碳和氮平衡显示产物(细胞团块、蛋白质和co2)中的元素多于底物(糖和nh4oh)中的元素，这表明可能存在蛋白质测量误差。
表1.与葡萄糖/槐糖(g/s)对照相比，基于来自每个测试的蔗糖底物的糖的蛋白质生产和产量的结果。
基于通过改进的biuret方法测量的总蛋白质，将每种上述发酵的蛋白质产物各自稀释至5mg/ml。根据标准
在糖化测定中使用每种上述发酵的蛋白质产物来证明有效的酶组合物是通过各种转化并还原的蔗糖饲料产生的。没有测试补料仅还原的蔗糖的发酵的蛋白质产物的糖化性能。
实例5
糖化性能
如本文所述，用每种所述发酵的蛋白质产物进行稀氨水预处理的玉米秸秆的糖化。将结果以与糖化测定中的葡聚糖含量相比的葡聚糖转化百分比进行报道。表2中显示的结果来自14mg蛋白质/g葡聚糖+木聚糖剂量和72小时孵育(其他剂量和时间点一致)。
5.1通过hplc的糖分析
通过将100μl的糖化水解产物稀释到900μl的0.01nh2so4中来制备来自糖化测定的样品。然后使用milliporemultiscreenhtsgvmsgvn2250真空滤板过滤这些稀释液。然后将滤液转移到nunctm96孔聚丙烯板(型号#267245)中并使用nunctm96孔盖垫(型号#276011)密封。
然后将该板加载到安捷伦g1377a自动进样器中用于使用agilent1200hplc进行单体糖分析。
通过使用具有两个bio-radmicro-guard阳离子-h保护住(30x4.6mm)的bio-radaminextmhpx-87h(300x7.8mm，9μm粒度，8％交联)离子交换柱的hplc来确定单体糖。使用的溶剂是0.01nh2so4，并以0.6ml/min的等度流速进行色谱运行。使用安捷伦g1316a恒温色谱柱室将柱温保持在65℃。使用安捷伦g1362a折射率检测器在50℃内部温度处进行分析物检测。分析时间为约18分钟，样品注射体积为20μl。
在样品分析之前，针对葡萄糖、木糖和阿拉伯糖峰面积对浓度生成线性校准曲线。使用安捷伦化学工作站从葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的该校准曲线计算浓度对峰面积的响应因子。然后使用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的各自响应因子来计算制备的样品中每种糖的滴度。
5.2生物质糖化测定
将根据例如公开的美国专利申请20070031918中提供的方法制备的稀氨水预处理的玉米秸秆用作糖化测定中的底物。在玻璃闪烁小瓶中进行所述测定。将最终的反应物质固定在5g和18％总固体上。
使用sartoriusma45红外水分分析仪(nrel/tp-510-42621中描述的国家可再生能源实验室(nrel)实验室分析程序(lap)中详述的方法)测量预处理的玉米秸秆的含水量。使用该值，将适量的生物质底物(例如稀氨水预处理的玉米秸秆)添加到每个小瓶中，以给出18％固体的最终值。使用硫酸将反应ph调节至5.30的ph。每天监测反应ph，并根据需要使用硫酸或氢氧化钠调节。使用如在nrel/tp-510-42618中所描述的nrellap测量出，反应中结构性糖类的组成为6.3％葡聚糖和3.9％木聚糖(参见，http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf)。
在将ph调节至ph5.30之后，将纤维素酶样品(如下所述)添加到反应小瓶中。酶剂量为10、12或14mg总蛋白/g葡聚糖和木聚糖。使用eppendorf
使用innova44摇床培养箱将反应小瓶在50℃和200rpm处孵育持续72小时。在72小时孵育结束时，使用eppendorf
5.3arbocel糖化测定
在玻璃闪烁小瓶中进行
使用该值，将适量的生物质底物添加到每个小瓶中，以给出15％固体的最终值。使用50mm乙酸钠缓冲液(ph5.0)维持反应ph。使用在nrel/tp-510-42618中所描述的nrellap测量出，反应中结构性糖类的组成为10.86％葡聚糖和3.1％木聚糖。在将ph调节至ph5.30之后，将纤维素酶样品(如下所述)添加到反应小瓶中。酶剂量为10、12或14mg总蛋白/g葡聚糖和木聚糖。使用eppendorf
使用innova44摇床培养箱将反应小瓶在50℃和200rpm处孵育持续17小时。在17小时孵育结束时，使用eppendorf
表2.与葡萄糖/槐糖(g/s)对照相比，每种发酵产物的生物质糖化结果。