包含蜕皮激素受体的基因开关的制作方法

专利名称：包含蜕皮激素受体的基因开关的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自鳞翅目烟芽夜蛾(Lepidoptera Heliothis virescens)的昆虫类固醇受体及其编码核酸的鉴定和特征描绘。本发明还涉及这种受体和这种核酸的应用，特别是，但不限于，用于筛选方法，以及用于基因开关的应用。我们所述基因开关是指对所应用的外源化学诱导物具应答性(responsive)一种基因序列，该化学诱导物能够外部控制受所述序列控制的该基因的表达。
亲脂性激素如类固醇诱导基因表达的改变以引发对生长，细胞分化和体内平衡的深刻效应。这些激素识别享有共同模块结构的细胞内受体，这些共同模块结构包括3个主要功能域包含反式激活域的可变氨基末端区，DNA结合域，分子羧基侧的配体结合域。该DNA结合域包含9个不变半胱氨酸，其中8个参与锌配位体以形成双指状结构。在核中该激素受体复合体结合于称为激素反应元件(HREs)的特异性增强子样序列以调节靶基因的转录。
由于第一类固醇受体成员基因的克隆和初步特征描绘，在最近3年昆虫类固醇研究领域已发生了一场革命。这些发展提示，试图使用这些知识以改进我们在针对昆虫害虫的长期斗争中的工具的时间已经成熟。针对类固醇受体超家族的分子生物学进行的大多数研究基于黄猩猩果蝇(双翅目)上，参见国际专利出版物第WO 91/13167号，一些研究针对天蛾和蜡螟(鳞翅目)。
自20-羟蜕皮激素首次被分离并显示参与昆虫发育的调节至今已30年。自那以后，进行了许多工作以试图阐明此憎水小分子调节多种活性的途径。到20世纪70年代早期，通过Clever和Ashburner的研究，已明确至少在3龄果蝇幼虫的唾液腺中，应用蜕皮激素导致一百种以上基因的可重复性激活。此途径中的蜕皮激素受体参与调节两组基因一小组(早期基因)，被蜕皮激素受体诱导和一大组(晚期基因)，被蜕皮激素受体阻遏。早期基因被认为具有两种与蜕皮激素受体的功能互补的功能；早期转录的抑制和晚期基因转染的诱导。迄今已分离和特征描绘的早期基因成员属于具有类似于已知转录因子的特性的一组分子。因此预测它们能象蜕皮激素作用模型所预期的那样发生作用(Ashburner，1991)。更近期，早期基因E74和E75已显示结合两种类型的蜕皮激素可诱导基因(Thummel等，1990；Segraves和Hogness，1991)，因此支持他们推测的双重活性。然而应识别到，基因层次(gene hierachy)的激活不限于第三龄幼虫唾液腺，而是在许多其它组织中观察到在幼虫生活末期对蜕皮激素峰的反应，这些组织如器官芽(即转变为成虫结构的那些组织)和其它在幼虫生活末期组织溶解的幼虫组织(如幼虫脂肪体)。通过研究第3龄染色体疏松块推断的蜕皮激素作用模型不能应用于成虫中蜕皮激素调节基因的激活。换而言之，为了正确的发育表达，还需要除活性蜕皮激素受体以外的其它因子(例如，成虫中果蝇卵黄蛋白基因表达是在“两性”的控制下，即性别决定基因层次中的最后基因)。
脱皮激素受体和早期基因E75属于类固醇受体超家族。其它果蝇基因，包括超呼吸孔(ultraspiracle)、无尾(tailless)、七上(Sevenup)和FTZ-FI，也属于此超家族。然而，所有这些基因中只有蜕皮激素受体已知具有一个配体，因此其它的被称为“孤儿受体”(orphanreceptors)。有趣地，虽然超呼吸孔蛋白配体结合区与脊椎动物视黄X受体(RXR)配体蛋白享有49％共有性(Oro等，1990)，它们却不享有相同的配体(即，RXR配体是9-顺视黄酸(Heymann等，1992和Mangelsdorf等，1992)。上述所有果蝇基因与发育有关，例如超呼吸孔，为胚胎和幼虫腹部发育所需要。这些基因的蛋白产物均符合类固醇受体超家族的主要特征(Evans，1988；Green和Chambon，1988，Beato，1989)即，它们具有参与配体独立反式激活的可变N末端区域(区域A和B)，与DNA在特定位点结合有关的高度保守66-68氨基酸区(区域C)，被认为含有一个核转位信号的铰链区(区域D)，以及包含配体结合区，反式激活序列和二聚作用相的高度保守区(区域E)。最后一个区，域F，也非常可变异并且其功能未知。
类固醇受体作用在脊椎动物系统中在细胞和分子水平均已得到相当详细的阐明。在缺乏配体情况下，受体分子存在于胞浆中，在那里它被Hsp90，Hsp70和P59结合以形成无活性复合体(Evans，1988)。在配体分子被受体结合时即发生了构型改变，释放出Hsp90，Hsp70和P59分子，同时暴露出受体中的核转位信号。配体依赖性构型改变可见于孕酮和视黄酸受体的配体结合域(Allan等，1992a)。这种构型改变已在孕酮受体中被进一步进行特征描绘，并发现它是基因反式激活所必需的(Allan等，1992b)。一旦进入核中，该受体二聚体就在DNA上的特异位点结合于受体反应元件，导致靶基因的激活或阻遏。该受体反应元件通常包含简并同向重复(degenerate direct repeat)，在1和5核苷酸之间有一个间隔区，它通过DNA结合区(区域C)被一个受体二聚体结合。
虽然一些类固醇激素作为同二聚体有活性，其它的则以异二聚体起作用。例如，在脊椎动物中，视黄酸受体(RAR)与视黄X受体(RXR)形成异二聚体。RXR也可与甲状腺受体，维生素P受体(Yu等，1991；Leid等，1992)和过氧化物酶体激活受体(Kliewer等，1992)形成异二聚体。功能上，同二聚体和异二聚体间的主要区别是对具体反应元件的结合的特异性增加。这表明不同途径可被连接，协调和调节，并且更重要的是，这一观察结果开始阐明视黄酸在脊椎动物发育中的多效性分子基础(Leid等，1992b)。类似地，最近的研究显示果蝇超呼吸孔基因产物能够与视黄酸、甲状腺、维生素D和过氧化物酶体激活因子受体形成异二聚体并刺激这些受体对它们的靶反应元件的结合(Yao等，1993)。更重要的是，超呼吸孔基因产物还显示能与蜕皮激素受体形成异二聚体，导致对蜕皮激素反应元件的合作结合并能够表达哺乳动物细胞蜕皮激素反应(Yao等，1992)。后一点的重要性在于，单独蜕皮激素基因的反式激活在哺乳动物细胞中不能引起蜕皮激素反应(Koelle等，1991)，因此提示超呼吸孔基因产物是功能性蜕皮激素受体的组成部分(Yao等，1992)。有可能超呼吸孔产物与其它类固醇受体或因子竞争与蜕皮激素受体形成异二聚体。更进一步，是否超呼吸孔基因在果蝇幼虫的所有组织中表达尚有待研究。尽管超呼吸孔基因产物对产生功能性蜕皮激素受体是必须的，但此种激活发生的机制尚未被确定。
我们已分离并描述来自烟芽夜蛾(后文称为HEcR)的蜕皮激素类固醇受体。我们发现，与迄今的报告中果蝇蜕皮激素(后文称为DEcR)意外的不同，HEcR可被已知的非类固醇诱导物诱导。应认识到这提供了该系统的许多优点。
制造类固醇困难而且昂贵。而且，使用非类固醇作为诱导物允许该系统用于农业化肥的药品应用，至少因为它避免了应用一种已存在于昆虫和/或哺乳类中的类固醇。例如，在哺乳动物细胞中使用一种被天然存在的诱导物诱导的基因开关是不可行的。还应认识到由于环境原因，避免使用类固醇作为诱导物是有利的。
按照本发明的一个方面，提供了具有显示于Seq ID NO2中的序列的DNA，其中Seq ID NO2给出HEcR的序列。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR配体结合域。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，它编码HFcR DNA结合域。
按照本发明的还有另一方面，提供了具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR反式激活域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR铰链域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR羧基末端区。
按照本发明的一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的DNA，其中Seq ID NO3给出HEcR序列。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR配体结合域。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR DNA结合域。
按照本发明的还有另一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR反式激活域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR铰链域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR羧基末端区。
按照本发明的一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的DNA，其中Seq ID NO4给出HEcR的序列。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR配体结合域。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR DNA结合域。
按照本发明的还有另一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR反式激活域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR铰链域。
按照本发明的再一方面，提供了具有Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，它编码HEcR羧基末端区。
如上所述，类固醇受体为真核转录调节因子，它应答类固醇激素结合，据信能结合于特异DNA元件并激活转录。使用基于与类固醇激素受体超家族的其它成员共享同源性的排列技术，该类固醇受体可分为6个区，称为A至F。Krust等鉴定了受体中的两个主要区，C和E。C区是亲水的并且不寻常地富含半胱氨酸，赖氨酸和精氨酸。它对应于DNA结合域，有时被称为“锌指”。是DNA结合域结合于反应基因的上游DNA。E区是憎水的并被确定为激素(或配体)结合域。E区可进一步被再分为E，E2和E3区。
D区，它分开C区域和E区域，高度憎水并可弯曲。据信E和C区域间的信息交流涉及它们通过D区的直接接触。D区提供了两个区域间的一个铰链。D区因此被称为铰链域。
受体的机制表现为除需要其与激素和激素反应元件的相互作用外，还需要其与转录机器的一些元件相互作用。N-末端区A和B行使这种功能，并合称为反式激活域。羧基末端区被称为F。
HEcR的区域边界可被定义如下
DNA结合域被很好地确定，长度为66个氨基酸，因此提供了好的边界。上述间隔就蜕皮激素受体进行多排列而被确定(图5)。
本发明还包括显示与本发明的序列同源的DNA。典型地，当60％或更多核苷酸共有时显示同源性，更典型地65％，优选70％，更优选75％，还更优选80％或85％，特别优选的是90％、95％、98％或99％或更高同源性。
本发明还包括与本发明的DNA杂交和编码夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域，DNA结合域，铰链域，配体结合域和/或羧基末端区的至少一部分的DNA。优选这种杂交发生于，或介于，低和高严格性条件之间。一般地说，低严格性条件可被定义为3×SSC，在约环境温度至约65℃，而高严格性条件为0.1×SSC，在约65℃。SSC是0.5M NaCl，0.015M枸橼酸三钠缓冲液的名称，3×SSC是指SSC强度的3倍。依此类推。
本发明还包括作为遗传密码的结果与本发明的DNA简并的DNA和编码至少是夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域、DNA结合域、铰链域、配体结合域和/或羧基末端区域的一部分的多肽的DNA。
本发明的DNA可以是分离形式的DNA或cDNA。
按照本发明的另一方面，提供了包含夜蛾属蜕皮激素受体或其片段的多肽，其中所述多肽基本不含通常与其相关的其它蛋白，并且它是由本发明的任何DNA编码。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的多肽，其中Seq ID NO4给出HEcR多肽的氨基酸序列。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的部分的多肽，该序列提供HEcR配体结合域。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的部分的多肽，该序列提供HEcRDNA结合域。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的部分的多肽，该序列提供HEcR反式激活域。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的部分的多肽，该序列提供HEcR铰链域。
按照本发明的另一方面，提供了一种具有Seq ID NO4或其任意等位基因变异体或衍生物的氨基酸序列的部分的多肽，该序列提供HEcR羧基末端区。
为避免疑问，本发明的氨基酸序列的剪接变异体被包括在本发明中。
优选地，所述衍生物是具有保守氨基酸改变的同源变异体。保守氨基酸改变意指，用来自相同组的一种氨基酸置换来自一个氨基酸组的氨基酸，这种氨基酸组可为憎水的，极性的，酸性的或碱性的。这种改变的一个实例是用蛋氨酸置换缬氨酸反之亦然。
按照本发明的另一方面，提供了一种融合多肽，它包含至少一种本发明的多肽，具有功能地连接于一种适当的非-夜蛾属蜕皮激素受体域。
按照本发明的特别优选实施方案，本发明的HEcR配体结合域被融合于DNA结合域和反式激活域。
按照本发明的另一实施方案，DNA结合域被融合于配体结合区和反式激活域。
按照本发明的还有另一实施方案，反式激活域被融合于配体结合域和DNA结合域。
本发明还提供了编码这些融合多肽的重组体DNA。
按照本发明的特别优选实施方案，提供了一种重组体核酸，它包含编码HEcR配体结合域的DNA序列，具有功能地连接于编码来自糖皮质激素受体的DNA结合域和反式激活域的DNA。
按照本发明的还有另一方面，提供了一种重组体核酸，它包含一个包含可操作地连接于启动子序列的报告基因的DNA序列和一个激素反应元件，该激素反应元件对本发明的DNA编码的DNA结合域具应答性。
按照本发明的另一方面，提供了一种用本发明的核酸，重组DNA，多肽或融合多肽转化的构建物。这种构建物包括适合转化感兴趣细胞的质粒和噬菌体。这种构建物对本领域技术人员是公知的。
按照本发明的另一方面，提供了一种用本发明的核酸，重组体DNA，多肽，或融合多肽转化的细胞。
优选地该细胞为植物，真菌或哺乳动物细胞。
为避免疑问，真菌包括酵母。
本发明因此提供可操作地连接于一种外来基因或一系列外来基因的基因开关，借此所述外源基因或所述外来基因系列的表达可通过应用有效的外源诱导物而被控制。
蜕皮激素类似物，如Muristerone A，在植物中被发现并能破坏昆虫的发育。因此提出本发明的受体可作为一种昆虫控制机制用于用其转化的植物中。昆虫损伤产物的产生被一种外源性诱导物控制。昆虫损伤产物可为蜕皮激素或另一种适当的蛋白。
第1个非类固醇性蜕皮类固醇(ecdysteroid)促效剂(agonist)，二苯甲酰肼，其代表为RH-5849〔1，2-二苯甲酰，1-叔丁基肼〕，作为一种杀昆虫剂可商购自Rohm和Haas，详述于1988年。此系列的另一种可商购化合物为RH-5992〔tebufenozide。3，5-二甲基苯甲酸，1-1(1，1-二甲基乙基)-2(4-乙基苯甲酰)肼〕。这些化合物在烟草天蛾和黄猩猩果蝇中都模拟20-羟蜕皮激素(20E)。这些化合物的优点在于它们能够通过使用非类固醇性蜕皮类固醇促效剂而防治昆虫。这种二苯甲酰肼的其它实例见于美国专利No.5117057，Rohm和Haas，和Oilawa等，农药科学(Pestic Sci)，41，139-148(1994)。而且，应理解本发明的基因开关的任何诱导物均可被应用，不管它是类固醇性还是非类固醇性的，也不管是已经或将要可得的。
因此，本发明的基因开关，当连接于外源或外来基因并通过转化导入植物中时，提供了一种外部调节该外来基因表达的方法。该植物细胞的转化所采用的方法对本发明不是特别关系密切的，任何适合靶植物的方法均可被采用。转基因植物通过再生从被转化细胞获得。多种转化方法见于文献，如使用根瘤土壤杆菌或其Ti质粒进行农杆菌感染，电穿孔，微注射或植物细胞和原生质体，微粒转化，不胜枚举。已知方法的详情可参阅文献。
没有一种被插入化学可诱导序列的植物物种对本发明特别关系密切。双子叶和单子叶植物可被转化。本发明可应用于转化技术已经或正在成熟的任何植物。本发明因此可用于在许多遗传学上改良的植物中控制基因表达。这些植物包括大田作物如canola、向日葵、烟草、制糖甜菜、和棉花；谷类如小麦、大麦、稻、玉米和高粱；水果如番茄、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉和甜瓜；和蔬菜如胡萝卜、莴苣、卷心菜和洋葱。该开关也适合用于许多组织中，包括根、叶、茎和繁殖组织。
在本发明的特别优选实施方案中，本发明的基因开关被用于控制一些基因的表达，这些基因传递对植物的除草剂抗性和/或昆虫耐性。
植物生物技术中的最近进步导致产生了对除草剂应用抗性的转基因植物，和对昆虫抗性的转基因植物。除草剂耐性已通过使用多种不同转基因方法获得。一个除草剂领域很好地记录在案的实例是使用来自Streptomyces hydroscopicus的细菌异生解毒基因phosphnothricin乙酰转移酶(PAT)。植物来源的突变基因，例如编码来自拟南芥属的乙酰乳酸合酶(ALS)的改变的目标位点基因，已被成功地用于产生对杀虫剂应用抗性的转基因植物。PAT和ALS基因已在强的组成型启动子的控制下被表达。在杀昆虫剂领域，迄今最普通的实例为Bt基因的使用。
我们提供一种系统，该系统中传递除草剂和/或昆虫耐性的基因将以可诱导方式在应用特定激活化合物时被表达。这种方式对于农场主具有许多益处，包括下列1.除草剂和/或昆虫耐性的可诱导控制将降低与除草剂和/或昆虫抗性基因的高水平组成表达相关的任何减产危险。在生长的早期这可成为一个特别的问题，因为高水平的转基因产物可直接妨碍正常发育。换而言之，杀虫剂和/或昆虫抗性基因的高水平表达可引起植物资源的代谢性消耗。2.除草剂抗性基因以可诱导方式的表达允许被研究除草剂被用于控制自生自长的植物，如果激活化合物在治疗中被忽略的话。3.使用可诱导启动子以启动除草剂和/或昆虫抗性基因将降低正成为一个大问题的抗性的危险。如果抗基因从相关作物被传递到杂草，在缺乏诱导化合物情况下仍能通过除草剂获得控制。如果耐药性基因证实对全部蔬草控制除草剂具抗性则这一点将特别重要。这样的除草剂可在播种作物前和可能在作物被收获后使用(不加诱导化合物)。例如，可以设想除草剂抗性谷类，如小麦，可异型杂交入杂草野生燕麦，从而将除草剂抗性传递入这种已经很讨厌的杂草。另一实例是制糖甜菜中除草剂抗性的可诱导表达将降低野生制糖甜菜成为问题的危险性。类似地，在昆虫控制领域，如果耐性基因被组成型地表达，昆虫抗性也可成为一个问题。可诱导启动子的使用将允许采用大范围的昆虫抗性控制机制。
除草剂抗性的可诱导表达这种策略可通过化学激活剂的预喷洒获得，或者在慢作用除草剂情况下，例如N-膦酰基甲基-甘氨酸(通称为草甘膦)，让化学诱导剂可作为罐定量配料与除草剂同时加入。类似策略可用于昆虫控制。
该策略可用于已经或正变为可能的任何抗性传递基因/对应除草剂组合。例如，本发明的基因可与下列物质同时应用1.玉米谷胱甘肽S-转移酶(GST-27)基因(见我们的国际专利申请第WO 90/08826号)，该基因传递对乙酰氯苯胺杀虫剂如acetochlor，metolachlor和alachlor的抗性。2.膦基麦黄酮乙酰转移酶(PAT)，它传递对通称为glufosmate的除草剂的抗性。3.来自玉米的乙酰乳酸合酶基因突变体(见我们的国际专利公开NoWO 90/14000)和其它基因，它们传递对磺酰脲和咪唑啉酮的耐药性。4.传递对草甘膦的耐药性的基因。这种基因包括草甘膦氧化还原酶基因(GOX)(见国际专利公开No.WO 92/00377)；编码5-烯醇丙酮基-3-磷酰莽草酸合酶(EPSPS)的基因，包括I型和II型EPSPS，编码突变体EPSPS的基因，和编码EPSPS融合肽的基因，这种融合肽可包含一个叶绿体运送肽和EPSPS(参见EP 218571，EP293358，WO 91/04323，WO 92/04449和WO 92/06201)；以及在CPLyase的表达中所涉及的基因。
类似地，昆虫抗性的可诱导性表达策略可被用于已经或即将获得的任何耐性传递基因。
本发明的基因开关可用于控制外来蛋白在酵母和哺乳动物细胞中的表达。供多种用途的很多种异源蛋白通过遗传操纵的细菌，酵母细胞和其它真核细胞如哺乳动物细胞中的表达而被生产。
除了对这些细胞中外来蛋白的表达提供控制这一明显优点外，本发明的开关的另一优点在于，在酵母或哺乳动物细胞中当大量异源蛋白的积累可损伤细胞，或当异源蛋白是损伤性的时，需要短时间的表达以维持细胞生存。
这种可诱导基因也可用于基因治疗，使被治疗的基因的表达被计时控制。本发明因此不仅可应用于转化的哺乳动物细胞，也可用于哺乳动物本身。
在哺乳动物中，本发明的可诱导系统的另一项优点是，由于其来自昆虫，因此被影响天然哺乳动物类固醇受体的诱导物影响的机会较小。
在本发明的另一方面，该基因开关被用于打开产生潜在损害或致死蛋白的基因。这一系统可被用于癌症的治疗中，在这种癌症中细胞被表达对癌致死性的蛋白的基因所转化。这种蛋白对癌细胞的作用的计时可使用本发明的开关控制。
本发明的基因开关也可象打开基因一样被用于关闭基因。这在疾病模型中有用。在这种模型中允许细胞生长直至使用本发明关闭一种特异基因。这种模型易化了某一种特异基因的效果的研究。
再一次指出，产生这种转基因细胞方法对于本发明不是特别关系密切，适合靶细胞的任何方法均可被使用，这种方法在本领域是公知的，包括细胞特异转化。
如前所述，在系统中基因表达的调节响应HEcR对一种特殊控制，或调节DNA元件的结合。HEcR基因开关的示意图显示于图6。为易于说明，该示意图只显示HEcR的3个主要区域，即反式激活域，DNA结合域和配体结合域。配体对配体结合域的结合使DNA结合域能够结合于HRE，导致靶基因的表达(或实际上是阻遏)。
本发明的基因开关因此可视为具有两个组成部分。第一个组成部分包含HEcR，第2个组成部分包含适当的HRE和靶基因。实际上，该开关可方便地采用1或2个序列DNA的形式。至少一个序列的一部分，或一对中的一个序列，编码HEcR蛋白。另外，编码HEcR的核酸可被蛋白/多肽本身取代。
不仅本发明的开关具有2个组成部分，该受体的1或多个区域也可改变而产生嵌合基因开关。本发明的开关具有很大的柔性，并可使用不同组合以改变结果，从而优化该系统。这种嵌合系统的唯一要求是DNA结合域应结合至激素反应元件以产生期望的效应。
糖皮质激素受体已被很好地进行特性描述并已发现可在植物中很好地工作。此受体的另一优点在于它是作为同二聚体起作用。这意谓着不需要表达象超呼吸孔那样的第2种蛋白以产生一种有功能受体。糖皮质激素类固醇受体的问题是用于激活它的配体不适合农艺学实践。
在本发明的一个优选方面，该受体包含糖皮质激素受体DNA结合域和带有本发明的夜蛾属配体结合域的反式激活域。反应单位优选包含糖皮质激素反应元件和所期望的效应基因。在实施例中，为方便起见，此效应基因采取报道基因的形式。然而，在非检测或非筛选情况时，该基因将为产生所期望效应，例如产生所期望蛋白的基因。此蛋白可为天然或外源蛋白。我们希望此嵌合开关将糖皮质激素系统的最佳特点结合在一起，而克服只被类固醇诱导的不利之处。
在另一项优选实施方案中，夜蛾属配体结合域被改变，并优选被非夜蛾属蜕皮激素受体配体结合区置换。例如，我们已从甜菜夜蛾分离了适当的序列。
因此，按照本发明的一方面，提供了具有Seq ID NO6中所示序列的DNA。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO6所示序列的一部分的DNA，它编码斜纹夜蛾蜕皮激素配体结合域。
按照本发明的另一方面，提供了具有Seq ID NO6所示序列的一部分的DNA，它编码斜纹夜蛾蜕皮激素铰链域。
本发明还提供了由上述Seq ID NO6的DNA序列编码的多肽。
这种嵌合系统的另一优点是它们允许按照所期望的最终结果选择用于驱动效应基因的启动子。例如，将外源基因置于细胞特异启动子的控制下，在当你希望不仅控制表达的计时而且控制表达在何种细胞发生时，可以是特别有利。这种双重控制在基因治疗领域和细胞毒性蛋白的使用中可以是特别重要。
改变启动子还使基因表达能按需要被上或下调。
任何方便的启动子可用于本发明，很多在本领域中是公知的。
任何方便的反式激活域也可被使用，反式激活域16是1个得自基因技术股份有限公司(Genetech Inc.)的强激活物，常被用于在植物中表达糖皮质激素受体。其它例如来自植物或酵母的反式激活域也可被应用。
在本发明的一项实施方案中，该DNA结合域是糖皮质激素DNA结合域。此区域通常是一个人类糖皮质激素受体DNA结合域。然而，该区域可从任何其它方便的来源，如大鼠获得。
按照本发明的另一方面，提供了选择能够结合于昆虫类固醇受体超家族成员的化合物的一种方法，它包含筛选结合于本发明的多肽或融合多肽的化合物，和选择表现所述结合的所述化合物。
按照本发明的另一方面，提供了使用本发明的方法而选择的一种化合物。
按照本发明的另一方面，提供了包含本发明的化合物的农用或药物组合物。
按照本发明的还有另一方面提供了本发明的化合物作为杀虫剂，药物和/或开关的诱导物的应用。应理解到，这种诱导物本身即可很好地用作杀昆虫剂。
按照本发明的另一方面，提供了一种生产蛋白或肽或多肽的方法，该方法包含向本发明的细胞中导入一种结合于所述细胞中配体结合域的化合物。
本发明的各种优选特点和实施方案将通过非限制性实施例的方法被描述，参阅相关的实施例和附图，图中

图1(序列ID NO1)显示从由分离自烟芽夜蛾第4龄幼虫的mRNA制备的第一链cDNA扩增的DNA序列。下划线序列指简并寡核苷酸的位置。在5′末端该序列与寡核苷酸序列一致，而在3′末端观察(observed)到原始的寡核苷酸的12个核苷酸；图2(序列ID NO2)显示从由分离自随机引物cDNA烟芽夜蛾文库的克隆pSK19R中的DNA序列；该序列两侧有EcoRI位点；图3(序列ID NO3)显示包含在分离自随机引物cDNA烟芽夜蛾文库的克隆pSK16.1中的DNA序列；图4(序列ID NO4)融合于克隆pSK16.1的5′RACE产物(粗体)的DNA序列。产生烟芽夜蛾蜕皮激素受体蛋白序列的ORF(开放阅读框)显示于相应的DNA序列下面；图5(序列ID NO5)显示蜕皮激素受体DmEcR(黄猩猩果蝇)，CtEcR(摇蚊属tentans)，BmEcR(家蚕)，MsEcR(烟芽夜蛾)，AaEcR(埃及伊蚊)和HvEcR(烟芽夜蛾)的蛋白序列排列。“*”表示保存的氨基酸残基。“·”表示保守的氨基酸交换；图6显示可用作基因开关的糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素嵌合受体实施方案的一个模型；图7显示克隆pcDNA319R的质粒图谱。三种其它哺乳动物表达载体以相同方式被构建并且除插入的大小外看起来很相似；
图8显示用于分析烟芽夜蛾蜕皮激素受体活性的报道构建物的质粒图谱；图9是显示MuristeronA和RH5992对单用pcDNA3H3KHEcR(填充的柱)或与αRXR一起(条纹柱)共转染的HEK293细胞中报道活性的影响的图。
图10显示含有糖皮质激素受体(HG1或pMF6HG1PAT)的玉米表达载体的质粒图谱；图11显示含有嵌合糖皮质激素/果蝇蜕皮激素受体pMF6GREcRS的玉米表达载体的质粒图谱；图12显示含有嵌合糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素受体pMF6GRHcR的玉米表达载体的质粒图谱；图13显示含有与融合于GUS，p221.9GRE6的-60S35CaMV启动子的糖皮质激素反应元件的植物报道质粒的质粒图谱；图14显示含有与融合于GUS p221.10GRE6的-46S35CaMV启动子的糖皮质激素反应元件的植物报道质粒的质粒图谱；图15显示一个图，该图显示Muristerone A和地基米松在用pMF6HG1PAT(GR)和p221.1GRE6(报道)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图16显示一个图，该图显示Muristerone A和地塞米松在用pMF6HGEcRS(效应基因)和p221.9GRE6(报道)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图17显示一个图，该图显示Muristerone A和地塞米松在用pMF6GRHEcR(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图18显示一个图，该图显示RH5849在用pMF6GRHEcRS(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图19显示一个图，该图显示RH5992在用pMF6GRHEcRS(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图20显示一个图，该图显示RH5992在用pMF6GRHEcR(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图21显示一个图，该图显示RH5992在用pMF6GRHEcR(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的剂量反应效应；图22显示含有嵌合糖皮质激素/果蝇属蜕皮激素受体的烟草表达载体pMF7GREcRS的质粒图谱；图23显示含有嵌合糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素受体的烟草表达载体pMF7GREcRS的质粒图谱；图24显示一个图，该图显示RH5992在用pMF6GRHEcR(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的烟草叶肉原生质体中的效应；图25显示含有嵌合糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素受体的哺乳动物表达载体pcDNA3GREcRS的质粒图谱；图26显示报道基因质粒pSWGRE4的质粒图谱；图27显示一个图，它显示用pcDNA3GRHEcR和pSWGRE4转染的CHO细胞的RH5992剂量反应曲线；图28显示一个图，它显示Muristerone A和RH5992对用pcDNA3GRHEcR和pSWGRE4共转染的HEK293细胞的效应；图29显示二元载体ES1的质粒图谱；图30显示二元载体ES2的质粒图谱；图31显示二元载体ES3的质粒图谱；图32显示二元载体ES4的质粒图谱；图33显示为在酵母中表达HEcR配体结合域而制造的效应基因构建物TEV-B112的质粒图谱；图34显示为在酵母中表达HEcR配体结合域而制造的效应基因构建物TEV8的质粒图谱；图35显示为在酵母中表达HEcR配体结合域而制造的效应基因构建物TEVVP16-3的质粒图谱；图36显示含有嵌合糖皮质激素VP16/夜蛾属蜕皮激素受体的哺乳动物表达载体pcDNA3GRVP16HEcR的质粒图谱；图37显示含有嵌合糖皮质激素VP16/夜蛾属蜕皮激素受体的玉米表达载体pMF6GRVP16HEcR的质粒图谱；图38显示含有嵌合糖皮质激素VP16/夜蛾属蜕皮激素受体的哺乳动物表达载体pMF7GRVP16HEcR的质粒图谱；图39显示一个图，该图显示RH5592在用pMF6GRVP16HEcR(效应基因)和p221.9GRE6(报道基因)转化的玉米AXB原生质体中的效应；图40(序列ID NO6)显示甜菜夜蛾蜕皮激素受体的铰链和配体结合域的DNA序列。
图41(序列ID NO7)显示夜蛾属19R和斜纹夜蛾SEcR Taq克隆铰链和配体结合域的蛋白序列排列“*”指保守的氨基酸序列，“·”指保守的氨基酸交换；图42显示一个图，该图显示RH5992对用pMF7GRHEcR(效应基因)和p221.9GRE6(水平斜纹)或p221.10GRE6(垂直斜纹)之一转化的烟草叶肉原生质体的效应。
实施例I-夜蛾属蜕皮激素受体的克隆A.探针产生产生分离类固醇/甲状腺受体超家族成员的夜蛾属同源染色体的探针的合理性是基于比较发育调节类固醇/甲状腺受体超家族成员的序列。可获得的序列显示了RAR的DNA结合域和THR(甲状腺)受体的DNA结合域中的高度保守基序。该基序被用于设计用于cDNA模板衍生序列之PCR扩增的简并寡核苷酸，该cDNA模板产生自期望将表达发育调节类固醇/甲状腺受体超家族成员组织(即幼虫组织)。
有意义寡核苷酸是基于肽序列CEGCKGFF，该肽序列在DNA水平产生具有如下所示的32的简并性的寡核苷酸ZnFA5′ 5′TGC GAG GGI TGC AAG GAI TTC TT 3′T A T A T反义寡核苷酸是基于来自肽CQECRLKKS R的反向互补核苷酸序列；为该肽制备了4套简并寡核苷酸，即ZnFA3′ 5′TTC TTI AGI CGG CAC TCT TGG CA 3′T A T C AZnFB3′ 5′TTC TTI AAI CGG CAC TCT TGG CA 3′T A T C A
ZnFC3′ 5′TTC TTI AGI CTG CAC TCT TGG CA 3′T A T C AZnFD3′ 5′TTC TTI AAI CTG CAC TCT TGG CA 3′T A T C APCR扩增使用从分离自第4和5龄烟芽夜蛾幼虫的mRNA制备的随机引物cDNA文库进行。该扩增的实施使用50mM KCl。20mMTrisHCl pH8.4，15mM MgCl2，200mM dNTPs(dCTP，dATP，dGTP和dTTP的等摩尔混合物)。100ng ZnFA5′和ZnF3′混合物中的108pfus(噬斑形成单位)。反应中使用的条件按照热起始程序，按此程序将反应混合物加热至94℃5分钟，随后加1U Taq多聚酶并将反应继续93℃50秒，40℃1分钟和73℃1分30秒的35个循环。PCR产物在2％(w/v)琼脂糖凝胶上分级，分离100～200bp标记用迁移的片段，并亚克隆入载体pCRII(Invitrogen)。插入物的序列使用Sequenase(USB)确定。
产生的序列被翻译并进行数据库搜索。该搜索发现了果蝇蜕皮激素受体，视黄酸受体和甲状腺受体的DNA结合域匹配的序列。因此，此质粒中插入物的序列，称为pCRIIZnf，是一种夜蛾属蜕皮激素同源序列(图1)并被用于筛选cDNA文库以分离完整开放阅读框。B. 文库筛选随机引物cDNA第4/5龄烟芽夜蛾文库被平板接种并从板上制备复制滤膜。被种植的噬斑数目是500000。pCRIIZnf的插入片段被再扩增，并将50ng使用T4多核苷酸激酶标记(如Sambrook等1990年所述)。
滤膜使用0.25％(w/v)Marvel，5×SSPE和0.1％(w/v)SDS在40℃预杂交4小时。滤膜中的溶液用新鲜溶液置换10次并加入变性探针。杂交在42℃进行过夜，随后在42℃6×SSC+0.1％(w/v)SDS中洗涤滤膜，之后再在55℃洗涤1次。在用照相版影印前将滤膜暴露于X-线胶片(柯达)48小时。
冲洗出的胶片表明存在一种强阳性信号，随后对其进行噬斑提纯并进一步确定特性。λZAPII噬菌体被体内剪切(见Stratagene手册)并确定所产生的质粒DNA的序列。称为pSK19R(或19R)的克隆含有一个带有467个氨基酸的开放阅读框的1.933kb cDNA片段(图2)。pSK19R于1995年6月20日保存于NCIMB，保存号为No.NCIMB 40743。
对pSK19R的进一步分析揭示了绘于pSK19 5′末端的340bp EcoRI片段与编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的果蝇cDNA具有强而显著的相似性。为分离属于夜蛾属的正确5′末端序列，使用含有属于夜蛾属蜕皮激素受体的pSK19R 5′末端的探针再筛选该随机引物文库。该探针通过PCR使用有意义寡核苷酸HecRH3C(5′aattaagcttccaccatgccgttaccaatgccaccgaca3′)和反义寡核苷酸HecrNde I(5′cttcaaccgacactcctgac 3′)制备。PCR按照Hirst等，1992年所述进行，其中用于标记的放射性同位素量为50μCi的32P-dCTP，且PCR以94℃1分钟60℃1分钟和72℃1分钟的循环循环19次。所产生的353bp放射标记的DNA片段被变性并被加至预杂交的滤膜，如pSK19R的分离中所述。文库滤膜从15个各含50000pfus的板制备。该文库滤膜在65℃杂交并在65℃在3×SSPE+0.1％SDS中洗涤两次，每次各30分钟。该滤膜再用1×SSPE+0.1％SDS洗涤30分钟并暴露于X-线胶片(柯达)过夜。冲涤胶片并拾取16个推定的阳性噬斑。这些噬斑被再接种并在与初次筛选完全相同条件下进行杂交，只产生一个强阳性噬斑。该强阳性噬斑终始如一地被探针识别，并将该噬斑提纯和体内剪切。所产生的质粒pSK16.1被测序(Seq ID NO3)，显示克隆的5′末端延伸205bp，3′末端延伸653bp，并导致了一段2.5kb的DNA插入物。此205bp的概念性翻译了与蜕皮激素受体B1异构型的果蝇，埃及伊蚊、天蛾属和蚕属序列具有高度相似性的73个氨基酸。然而，整个5′末端序列是不完全的，因为未发现蛋氨酸起始位点，带有蛋氨酸框5′中的终止密码子。为分离5′未端编码序列的其余部分，使用BRL-GIBCO 5′RACE试剂盒实施5′RACE程序(cDNA末端的快速扩增)。两种类型的cDNA被合成，其中第一种使用特异寡核苷酸16PCR2A 5′cagctccaggccgccgatctcg 3′)而第2类型使用随机六聚体(寡核苷酸含有6个随机核苷酸)。每种cDNA被PCR扩增，使用寡核苷酸锚着引物BRL-GIBCO5′cuacuacuacuaggccacgcgtcgactagtacgggiigggiigggiig 3′和16PCR2A，并以94℃1分钟，60℃1分钟和72℃1分钟循环35次。反应条件是20mMTris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，锚着和16PCR2A引物各400nM，200mM dNTPs(dCTP，dATP，dGTP和dTTP)和0.02U/ml Taq DNA多聚酶。对第一轮PCR反应物进行1∶50稀释并将1ml用于使用寡核苷酸UAP(通用扩增引物5′caucaucaucauggccacgcgtcgactagtac 3′)和16RACE2(5′acgtcacctcagacgagctctccattc 3′)的第2轮PCR中。
条件和循环与第一次PCR所采用的相同。每一PCR的样本被泳动，并进行Southern印迹，用5′特异引物(16PCR1 5′cgctggtataacaacggaccattc 3′)进行探查。
该引物对pSK16.1的5′多数序列特异，并在55℃使用标准杂交缓冲液杂交。滤膜在55℃在3×SSPE+0.1％SDS中洗涤3次并暴露于X-线胶片达6小时。冲洗的胶片显示被在100bp和500bp(相对于标记物)迁移的寡核苷酸识别。PCR反应的样本(总共4份)被克隆入TA克隆试剂盒(Invitrogen)的pCRII载体中。从4个独立PCR的15个克隆的分析产生了pSK16.1上游的序列(图4)。
ORF的翻译产生了575个氨基酸的蛋白，与果蝇，埃及伊蚊，摇蚊属，烟草夜蛾和家蚕的蜕皮激素受体序列相比较，在DNA和配体结合域具有高度相似性。有趣地，夜蛾属序列N-末端具有一个框内蛋氨酸起始点，它比已报告的果蝇，埃及伊蚊和烟草夜蛾的起始点长20个氨基酸。然而，夜蛾属EcR中延长的N-末端与家蚕的不具有相似性。最后，不同B1异构型蜕皮激素受体序列的C-末端趋异而不具有显著相似性。C. Northern印迹分析通过筛查文库确定的序列预期可在正在发生发育改变的组织中表达，因此来自烟草夜蛾不同发育阶段的mRNA被分离并产生Northern印迹。该mRNA被从卵，第1，2，3，4和5龄幼虫，蛹和成虫分离。该Northern印迹与包含DNA结合域的3′末端至配基结合域的末端的pSK19R的Nde I/Xho I DNA片段杂交。杂交在1％(w/v)Marvel，5×SSPE，0.1％(w/v)SDS中在65℃进行18至24小时。滤膜在65℃在3×SSPE+0.1％(w/v)SDS和1×SSPE+0.1％(w/v)SDS中洗涤。滤膜被印迹干燥并暴露1至7天。该基因识别两个转录本(6.0和6.5kb)它们在所有被检测阶段中均被表达，然而，表达的水平在不同阶段不同。应指出，相同的两个转录本被对DNA结合域和配体结合域特异的探针识别，表明两个转录本产生自相同的基因，或通过任选剪接或通过任选使用多腺苷酸化位点。
总之，成虫和第5龄幼虫具有低水平的表达而所有其它组织具有高水平的表达。实施例II.夜蛾属蜕皮激素受体在哺乳动物细胞中的表达为证实该cDNA编码一种功能性蜕皮激素受体，在CMV(巨细胞病毒)启动子的控制下产生效应基因结构，并将DNA在哺乳动物细胞中表达。效应基因结构第1哺乳动物表达质粒的构建是通过将一个Hind III/Not I pSK19R片段置入pcDNA3 Hind III/Not I载体中产生pcDNA319R(图7)。
第2效应基因质粒被构建，其中cDNA19R的非编码区被删除并导入一个共有的Kozak序列。该突变发生的进行是通过PCR扩增带有含有单一Hind III限制性酶识别位点的寡HecRH3C5′aattaagcttccaccatgccgttaccaatgccaccgaca 3′继以哺乳动物Kozak共有序列，以及HecRNdeI5′cttcaaccgacactcctgac 3′所产生的353bp PCR片段用Hind III和Nde I进行限制性酶消化，凝胶提纯，与19R Nde I/Not I片段连接入pcDNA3 Hind III/Not I载体，产生pcDNA3HecR。
第3效应基因结构通过PCR使用pSK16.1的5′未端序列制造。PCR方法涉及PCR扩增5′末端序列，使用含有Hind III限制性克隆位点的5′寡核苷酸，Kozak共有序列继以编码蛋氨酸起始点和将被加至被扩增片段(16H3K 5′attaagcttgccgccatgcgccgacgctggtataacaacggaccattc 3′)，的5′末端的2个精氨酸核苷酸序列，使用的3′寡核苷酸是NecrNdeI。所产生的片段被限制性酶消化，凝胶提纯并与NdeI/NotI 19R片段亚克隆入pcDNA3 NdeI/NotI载体。该质粒被称为pcDNA3H3KHEcR。
第4效应基因结构被产生，它含有获自5′RACE实验的延伸N末端序列。因此，采用一种PCR方法以便除共有Kozak序列和Hind III独特克隆序列外导入新的5′末端序列。使用的有意义寡核苷酸是RACEH3H5′attaagcttgccgccatgtccctcggcgctcgtggatac 3′，而反义引物与以前所用相同(HecrNdeI)。克隆策略与用于pcDNA3KHEcR的策略相同以产生pcDNA3RACEH3KHEcR。
PCR突变发生反应对于所有结构以相同方式进行。使用的PCR条件为94℃1分钟，60℃1分钟和72℃1分钟，循环15次。反应条件为50mM Tris-HCl(pH8.4)，25mM KCl，200mM dNTPs(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，200nM各种寡核苷酸和2.5U/反应的Taq DNA多聚酶。对每一结构，至少进行5次独立PCR反应，并对数个克隆测序以保证至少一个是不带有突变的。报道基因结构将与表达载体共转染的报道基因质粒含有4拷贝的融合于B-珠蛋白启动子和B-半乳糖苷酶基因的Hsp27蜕皮激素反应元件(Riddihough和Pelham，1987)。蜕皮激素反应元件的串联重复作为两个互补寡核苷酸被合成，其在退火时产生一条在5′末端有SpeI位点而在3′末端有ClaI位点的双链DNA分子Recr3A5′ctagtagacaagggttcaatgcacttgtccaataagcttagacaagggttcaatgcacttgtccaatgaattcagacaagggttcaatgcacttgtccaatctgcagagacaagggttcaatgcacttgtccaatat 3′Recr3B5′cgatattggacaagtgcattgaacccttgtctctgcagattggacaagtgcattgaacccttgtctgaattcattggacaagtgcattgaacccttgtctaagcttattggacaagtgcattgaacccttgtcta 3′所产生的135bp DNA片段被连接于载体pSWBGAL SpeI/ClaI，产生pSWREcR4(图8)。两种质粒的共转染将导致在配基存在情况下的半乳糖苷酶活性。本实验依赖于哺乳动物细胞中供形成活性蜕皮激素受体的RXR(超呼吸孔的同系物)存在。哺乳动物转染方法哺乳动物细胞系(CHO-K1中国仓鼠卵巢)-ATCC号CCL61或COS-1(猴细胞系)的转染使用磷酸钙沉淀法(Gorman，DNA克隆实用方法Vol 2D.M.Glover编/.(1985)IRL出版社，牛津，第6章)或使用bipofectAMINE(Gibco BRL批号18324-012，按照制造商的指示)进行。人类肾脏上皮293细胞使用类似方法转染。结果-天然HEcR驱动哺乳动物细胞中瞬时的报道基因表达在NuristeronoA或RH5992存在下将pcDNA3H3KHEcR(效应基因)和报道基因结构共转染至人类肾脏上皮293细胞(HEK293)导致与无化合物对照组相比2-3倍报道基因活性诱导(图9)。使用HEK293细胞是因为已经它们具有已被证实为果蝇EcR被NuristeronoA激活所需要的基本水平αRXR(Yao等，1993)。而且，为进一步研究RXR相互反应的需要，αRXR被共转染入HEK293细胞(与效应基因和报道基因一起)，与未处理细胞相比产生9倍报道基因活性诱导(图9)。αRXR与报道基因和效应基因共转染与单用效应基因和报道基因转染的细胞相比报道基因活性增加4倍。在存在NuristeronoA或RH5992的两种情况下均观察到诱导。这些资料清楚证实cDNA HEcR编码一个功能性蜕皮激素受体，而且，HEcR与αRXR复合并结合NuristeronoA或RH5992的能力提供了整个HEcR作为哺乳动物基因开关的一个成分的用途的证据。特别地，由于蜕皮激素受体和效应元件不存在于哺乳动物细胞中，它提供了降低目标基因的非诱导表达的优点。实施例III-玉米原生质体中的嵌合结构和配体确证为将蜕皮激素受体用作一种可诱导系统，必须通过避免异二聚体形成以获得活性复合物的需要来简化系统需求。已知糖皮质激素受体形成同二聚体，并且糖皮质激素受体反式激活和DNA结合域融合于蜕皮激素受体铰链和配体结合域的嵌合结构已在哺乳动物细胞中在NuristeronoA(一种蜕皮激素促效剂)存在下显示具有同二聚体活性(hristopherson等，1992)，然而，该嵌合受体对20-羟蜕皮激素不具应答性(hristopherson等，1992)。
糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素嵌合受体的激活的分析需要两种其它控制效应基因结构的产生。第一种结构含有完整的糖皮质激素受体而第2种含有1个糖皮质激素/果蝇蜕皮激素嵌合受体。效应基因结构(i)糖皮质激素受体玉米表达结构用于玉米瞬时表达结构的糖皮质激素受体DNA通过人类纤维肉瘤cDNA(HT1080细胞系，ATCC#CC1121)文库(Clontech)的多聚酶链反应(PCR)产生(见Hollenberg等，1985)。所采用的PCR方法是两个阶段来拉增编码糖皮质激素受体的2.7kb片段。第一阶段包含N-末端直至并包括DNA结合域，而第2片段从铰链域(氨基酸500)开始直至阅读框末端。因此，N-末端阶段PCR引物被设计为含有-个EcoRI位点和用于翻译起始的Kozak共有序列GREcoRI 5′attgaattccaccatggactccaaagaatcattaactc 3′。
3′末端引物含有1个框内XhoI位点，阅读框在发表的序列GRXhoI 5′gagactcctgtagtggcctcgagcattccttttatttttttc 3′的氨基酸500处。
糖皮质激素受体的第2片段使用含有一个框内XhoI位点的5′末端寡核苷酸产生，开放阅读框在铰链域的开始处(氨基酸500)GTHinge 5′attctcgagattcagcaggccactacaggag 3′而3′末端寡核苷酸在终止密码子后400bp含有1个EcoRI位点GRStop 5′attgaattcaatgctatcgtaactatacaggg 3′糖皮质激素受体PCR使用Vent多聚酶(Biolabs)在热起始条件下进行，继以变性(94℃1分钟)，退火(66℃1分钟)和DNA合成(72℃3分钟)的15个循环。模板通过按TA克隆试剂盒(Invitrogen)中所述制造第一链cDNA而生产。随后，PCR在10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM TRIS-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％(v/v)Triton X-100，200mM dNTPs，每种引物各100ng和2UVent多聚酶中进行。PCR产物用EcoRI和XhoI进行限制性酶消化并亚克隆入pBluscript SK(pSK)EcoRI。所产生的质粒pSKHGI被测序并发现它与已发表的序列比较无任何突变(除去那些在PCR引物中导入者)(Hollenberg等，1985)。
该2.7kb EcoRI片段被亚克隆入载体pMF6PAT EcoRI产生pMF6HGIPAT(图10)。(ii)含有糖皮质激素/果蝇蜕皮激素嵌合受体的玉米表达构建物嵌合受体的糖皮质激素受体部分通过产生一个含有N-末端直至并包括DNA结合域的1.5kb BamHI/XhoI限制性片段而分离自pSKHGI。
果蝇蜕皮激素受体部分通过从果蝇成虫mRNA制备的第1链cDNA的PCR而分离。PCR使用含有1个SalI位点的5′寡核苷酸进行(即，果蝇蜕皮激素受体在配体结合域的末端含有一个XhoI位点)，该位点起始于铰链区的开始处氨基酸330，Ecr8 attgtcgacaacggccggaatggctcgtcccggag 3′。
3′末端寡核苷酸含有一个BamHI位点，邻接终止密码子EcRstop 5′tcgggctttgttaggatcctaagccgtggtcgaatgctccgacttaac 3′。
在关于糖皮质激素受体的扩增所述的条件下进行PCR并产生1个1.6kb片段。该片段被导入pSK SalI/BamHI并被测定序列并与已发表的序列(Koelle等，1991)进行比较。
玉米瞬时表达质粒的产生是通过将1.5kb BamHI/XhoI糖皮质激素受体片段和1.6kb SalI/BamHI果蝇受体部分导入pMF6 BamHI载体以产生嵌合质粒pMF6GREcRS(图9)。(iii)糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素受体玉米瞬时表达质粒的构建嵌合体的糖皮质激素受体部分按照实施例II(ii)中所述产生。夜蛾属蜕皮激素受体部分的产生涉及在DNA结合/铰链域结合部(氨基酸229)导入1个SaII识别位点。SalI位点Hecrsal 5′attgtcgacaaaggcccgagtgcgtggtgccggag 3′的加入通过PCR突变发生而获得，使用连接点(或相对于Seq ID NO4 1007bp)下游107bp的一个单一AccI位点。
PCR使用Taq多聚酶(2.5单位)在含有100ng模板DNA(pSK19R)，100ng Hecrsal和Hecracc，20mM Tris-HCl pH8.4，50mM KCl，10mM MgCl2，200mM dNTPs的反应缓冲液中进行。反应从3分钟的起始变性开始进行，继以15个循环的变性(94℃1分钟)，退火(60℃1分钟)和DNA合成(72℃ 1分钟)。该DNA被限制性酶消化并亚克隆入带有1.2kb AccI/SacI 3′末端HecR片段的pSK SalI/SacI以产生pSKHeCRDEF(或含有夜蛾属受体的铰链和配体结合域)。含有糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素嵌合受体的玉米瞬时表达质粒的构建涉及将pMF6 EcoRI/SacI与糖皮质激素受体N-末端的1.5kb EcoRI/XhoI片段和pSK HEcRDEF的1.2kb SalI/SacI片段连接以产生pMF6GRHEcR(图10)。报道基因质粒两个报道基因质粒通过将两对或含有6拷贝糖皮质激素反应元件(GRE)寡核苷酸插入p221.9或p221.10 BamHI/HindIII载体而制备。两套寡核苷酸用限制性酶识别位点识别以保证两对以正确方向插入。第一寡核苷酸对GRE1A/B长82个核苷酸，当退火时导致1段两侧为5′末端HindIII位点和3′末端SalI位点的DNA片段GRE1A5′agcttcgactgtacaggatgttctagctactcgagtagctagaacatcctgtacagtcgagtagctagaacatcctgtacag 3′GRF1B5′tcgactgtacaggatgttctagctactcgactgtacaggatgttctagctactcgagtcgctagaacatcctgta cagtcga 3′第2对寡核苷酸两侧为5′末端SalI位点和3′末端BamHI位点GRE2A5′tcgactagctagaacatcctgtacagtcgagtagctagaacatcctgtacagtcgagtagctagaacatcctgtacag 3′GRE2B5′gatcctgtacaggatgttctagctactcgactgtacaggatgttctagctactcgactgtacaggatgttctagctag 3′所产生的质粒被称为p221.9GRE6(图13)和p221.10GRE6(图14)(用于以后实施例中)。p221.9和p221.10质粒间的区别是p221.9含有-60 35sCaMV最小启动子，而p221.10(p221.10GRE6)含有-46 35SCaMV最小启动子。方法原生质体分离自来自BE70×A188胚胎发生愈伤组织材料的玉米悬液培养，它通过在MS 0.5mod(MS培养基，补充以3％蔗糖，690mg/l脯氨酸，1g/l肌醇，0.2g/l酪素酸水解产物，0.5mg/l 2，4-D，pH5.6)每周两次再次培养来维持。并且再次培养后两天悬液的细胞在酶混合物中被消化(2.0％纤维素酶RS，0.2％果胶酶Y23，0.5M甘露醇，5mM CaCl2·2H2O，0.5％MES，pH5.6，～660mmol/kg)使用～10ml/g细胞，在25℃温育，微暗光线，轻柔转动约2小时。消化混合物顺序通过250μm和38μm筛网筛过，滤过液以700rpm离心3.5分钟弃去上清液。原生质体再悬溶于洗涤缓冲液(0.358M KCl，1.0mMNH4NO3，5.0CaCl2·2H2O，0.5mM KH2PO4，pH4.8～670mmol/kg)并如前离心成团块。此洗涤步骤被重复。团块被再悬溶于洗涤缓冲液中并计数原生质体。使用基于Negrutiu等的聚乙二醇方法获得转化。原生质体以2×106/ml被再悬溶于MaMg培养液(0.4M甘露醇，15mM MgCl2，0.1％MES，pH5.6，～450mmol/kg)，等分0.5ml/处理(即1×106原生质体/处理)。样本在45℃热休克5分钟并随后冷却至室温。每处理中加入p221.9GRE6和pMF6HR1PAT(GR)(1mg/ml)各10μg，并轻柔混合，随后立即加入0.5ml热的(约45℃)PEG溶液(40％PEG3，350MW，在0.4M甘露醇，0.1M Ca(NO3)2中，pH8.0)，彻底但轻柔地混合。各处理在室温温育20-25分钟，随后分步加入5ml 0.292M KCl(pH5.6，约530mmol/kg)，每次1ml，同时混合。在如前通过离心使原生质体成为团块前将各处理再温育10-15分钟。每一原生质体处理被再悬溶于1.5ml培养液(MS培养液，2％蔗糖，2mg/l 2，4-D，9％甘露醇，pH5.6，约700mmol/kg)+/-0.0001M地塞米松(糖皮质激素)。各样本在收获前在25℃黑暗中，在3cm培养皿中温育24-48小时。GUS活性的荧光测定使用Perkin-Elmer LS-35荧光计以底物4-甲基umbelliferyl-D-葡糖苷酸进行(Jefferson等，1987)。组织匀浆物的蛋白浓度通过Bio-Rad蛋白测定法确定(Bradford，1976)。该方便重复用于每一效应基因构建物。结果报道基因测定含有GUs报道基因的报道基因构建物(p221.9GRE6)在带有6拷贝糖皮质激素反应元件的-60CaMV35S启动子的控制下产生。为测试此构建物在玉米原生质体中是功能性的，用报道基因构建物p221.9GRE6和含有整个糖皮质激素受体的效应基因构建物pMF6HR1PAT(GR)构建物进行共转化测定。
图15图示单独报道基因p221.9GRE6或报道基因加效应基因pMF6HR1PAT(GR)而激活化合物不引起显著表达。当在0.0001M地塞米松(糖皮质激素)存在下报道基因加效应基因被共转化入玉米原生质体时，观察到标记基因活性显著升高(图15)。该反应对糖皮质激素特异，因为类固醇Munsterone A不导致诱导水平的表达。这些研究清楚显示报道基因构建物p221.9GRE6能够监测效应基因/配体调节的基因表达。嵌合蜕皮激素效应基因构建物调节玉米瞬时原生质体测定中的可诱导表达嵌合效应基因质粒pMF6GREcRS被构建，它含有来自果蝇蜕皮激素受体的配体结合域和来自糖皮质激素受体的DNA结合和反式激活域。为证实报道基因构建物p221.9GRE6能对嵌合蜕皮激素效应基因构建物起反应，向玉米原生质体内的一系列共转化被实施。
图16显示单独报道基因(p221.9GRE6)或报道基因加效应基因(pMF6GREcRS)而无激活化合物，在玉米原生质体中不产生显著表达。当在100μM Muristerone A存在下报道基因加效应基因被共转化入玉米原生质体时，观察到标记基因活性的显著升高。该反应对Muristerone A特异，因为类固醇地塞米松不导致诱导水平的表达。这些研究清楚显示报道基因构建物p221.9GRE6能够监测嵌合蜕皮激素效应基因/配体调节的基因表达。
含有来自夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的第2嵌合效应基因构建物pMF6GRHEcR被产生。当它与报道基因质粒p221.9GRE6被共转化入到玉米原生质体时，未观察到对100μM Muristerone A或100μM地基米松的反应(图17)。这些资料清楚地显示果蝇和夜蛾属配体结合域表现不同特性。
当含有来自果蝇的配体结合域的效应基因质粒pMF6GREcRS在非类固醇性蜕皮激素促效剂RH5899或RH5992(mimic)存在下用4报道基因p221.9GRE6测试时，未观察到化学物质诱导的报道基因活性(图18和19)。
当含有来自夜蛾属的配体结合域的效应基因质粒pMF6GRHEcR在非类固醇性蜕皮激素促效剂RH5992(mimic)的存在下用报道基因p221.9GRE6测试时，观察到显著的化学物质诱导的报道基因活性(图20)。这些资料证实来自夜蛾属的配体结合域具有与果蝇受体不同的特性，不同处在于前者对非类固醇性蜕皮激素促效性RH5992有反应。图21证实，效应基因质粒pMF6GRHEcR以剂量反应方式传递对报道基因p221.9GRE6的RH5992依赖性诱导能力。在1μM-100μM RH5992的范围内观察到诱导。实施例IV-烟草原生质体中效应基因载体的测试以前实施例中进行的实验证实RH5992(mimic)对玉米原生质体中pMF6GRHEcR的特殊效果。本实施例的目的是显示糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素嵌合受体开关系统对植物的一般应用。烟草抽枝培养CVSamsum，在控制的环境室中(16小时日/8小时夜，25℃，55％相对湿度)被维持于固化的MS培养基+3％蔗糖，被用作原生质体的来源材料。树叶平行于中脉切成薄片，弃去任何大的叶脉并将切片置于CPW13M(13％甘露醇，pH5.6，～860mmol/kg)约1小时以使细胞预先原浆分离。该溶液被置于酶混合物(0.2％纤维素酶R10，0.05％Macerozyme R10于CPW9M(CPW 13M但为9％甘露醇)，pH5.6，～600mmol/kg)中并在黑暗中25℃温育过夜(～16小时)。消化后，用镊子梳理开组织并弃去任何大的未消化碎片。使该酶混合物通过75μm筛，并将滤过液在600rpm离心3.5分钟，弃去上清液。团块再悬溶于0.6M蔗糖溶液中并在600rpm离心10分钟。原生质体的流动层使用pasteur移液吸管去除并用CPW9M(pH5.6，～560mmol/kg)稀释。原生质体通过在600rpm离心3.5分钟再次沉淀为团块，再悬溶于CPW9M并计数。实施上述PEG介导的转化的经改良版。原生质体以2×106/ml再悬溶于MaMg培养液，并使用200μl/处理进行等分(即4×105原生质体/处理)。加入pMF6GRHEcRS和p221.9GRE6 DNA(1mg/ml)各20μg，继以200μl PEG溶液并将溶液轻柔混合。留下原生质体在室温温育10分钟，然后加入5ml MSP19M培养液(MS培养液，3％蔗糖，9％甘露醇，2mg/l NAA，0.5mg/l BAP，pH5.6，～700mmol/kg)+/-10μMRH5992。在轻柔混合后，原生质体在试管中培养，在25℃，光亮中，水平横放。在约24小时后收获原生质体用于GUS测定。效应基因构建物(i)双子叶植物表达载体的构建所产生的载体是pMF6衍生物。pMF6GREcRS用PstI进行限制性酶消化以产生3个片段，即3，4(Adh无内含子pMF6)，3.2(GREcRS)和0.5(Adh内含子I)kb)。3.4和3.2kb片段的分离和再连接导致pMF7GREcRS(图22)。pMF7GREcRS用EcoRI/SacI进行限制性酶消化，产生3.4kb pMF7 EcoRI/SacI载体，该载体在分离和提纯时被连接于糖皮质激素受体的1.5kb EcoRI/XhoI N-末端和1.2kb SalI/SacI夜蛾属蜕皮激素C-末端序列以产生pMF7GRHEcR(图23)。报道基因质粒用于玉米瞬时实验的报道基因质粒构建物与烟草叶原生质体瞬时表达实验中未改变即使用者是相同的。结果-嵌合蜕皮激素效应基因构建物调节烟草瞬时原生质体测定中的可诱导表达。
进行实验以证实效应基因质粒pMF6GRHEcR能在烟草叶肉原生质体中传递对报道基因p221.9GRE6的化学物质依赖性可诱导表达。
图24显示单独报道基因(p221.9GRE6)或报道基因加效应基因(pMF7GRHEcR)而无激活化学物质，不在烟草原生质中产生显著表达。当在10μM RH5992存在下报道基因加效应基因被共转化入烟草原生质体中时，观察到标记基因活性的显著升高。这些资料显示含夜蛾属配体结合域的嵌合蜕皮激素效应基因构建物可在单子叶植物和双子叶植物两种种属中传递对报道基因构建物的非类固醇性蜕皮激素依赖性表达。实施例V-哺乳动物细胞中的嵌合活性效应基因构建物(i)糖皮质激素/夜蛾属蜕皮激素嵌合受体的构建用于此实验的哺乳动物表达载体是pcDNA3(Invitrogen)。GRHEcR 2.7kb BamHI DNA片段(分离自pMF6GRHEcR)被导入pcDNA3 BamHI载体。该重组体通过限制性酶绘图被定位。这些接点的DNA序列被确定以保证正确的排列和插入(pcDNA3GRHEcR，图25)。报道基因构建物哺乳动物细胞系统的报道基因质粒的生产采用pSWBGAL质粒并置换CRESW SpeI/ClaI片段为一个合成的105bp DNA片段。这种DNA片段含有4拷贝的糖皮质激素反应元件(GRE)并在两侧有5′末端的SpeI和3′末端的AfIII。
该寡核苷酸的合成使用序列GREspeI5′ctagttgtacaggatgttctagctactcgagtagctagaacatcctgtacagtcgagtagctagaacatcctgtacagtcgagtagctagaacatcctgtacac 3′GREafl25′ttaagtgtacaggatgttctagctactcgactgtacaggatgttctagctactcgactgtacaggatgttctagctactcgagtagctagaacatcctgtacaa 3′这两种核苷酸被提纯退火并连接于pSWBGAL SpeI/AflII以产生pSWGRE4(图26)。结果-哺乳动物细胞中嵌合HEcR驱动瞬时报道基因表达当报道基因构建物pSWGRE4被导入CHO细胞时未检测到表达，该pSWGRE4包含融合于β-半乳糖苷酶报道基因的含有4拷贝糖皮质激素反应元件的最小β-球蛋白启动子。类似地，当pSWGRE4和含有来自糖皮质激素受体的反式激活和DNA构建物区域和来自夜蛾属蜕皮激素受体的配体结合域的效应基因质粒pcDAN3GRHEcR在CMV启动子控制下被共转化入CHO-K1或HEK293细胞时，未检测到表达。当共转化的CHO(图27)和HEK293细胞(图28)在非类固醇性蜕皮激素促效剂RH5992(mimic)的存在下温育时，观察到显著的化学物质诱导的报道基因活性。同样，当用pcDAN3GRHEcR转染的HEK293细胞和报道基因被用Muristerone A处理时，观察到报道基因活性的诱导(图28)。实施例VI-允许新的化学物质激活剂和经改变配体结合域在哺乳动物细胞中被测试的筛选系统在证实嵌合受体在RH5992存在下被激活后，筛选系统的基础被认定。使用用pSWGRE4(报道基因)和pcDAN3GRHEcR(效应基因)构建物两者瞬时转染的CHO细胞进行筛选。在第1种情况，RH5992的20种衍生物被筛选。发现与未处理的细胞相比，20种化合物的7种产生增加的报道基因活性。进行第2种筛选，在该筛选中1000种随机选择的化合物被应用于被瞬时转染的CHO细胞。发现两种化合物激活报道基因活性高于来自未处理对照组者。第2种筛选提示这种基于细胞的测定是筛选的小文库的有力而快速的方法，每周可完成1000种化合物。实施例VII-稳定转化的烟草植物稳定烟草载体稳定烟草载体的成分在传递入二价载体中前与pBluescript放在一起。生产稳定转化的植物需要生产一种载体，其中开关系统的两种成分(即效应基因和报道基因)被置于相同的构建物中以随后导入植物。
下述方法学被用于生产4种不同的稳定烟草载体。该方法涉及3个步骤1. pBluescript SK HindIII/EcoRI载体被连接于GRE64635SCaMVGUSNOS HindIII/EcoRI(来自p221.10GRE6)或GRE66035SCaMVGUSNOS HindIII/EcoRI(来自p221.9GRE6)，产生质粒pSK-46和pSK-60。2.本步骤涉及向pSK-60或pSK-46加入嵌合受体(35SGRHEcRNOS或35SGRVp16HEcRNOS)。因此pSK-60(或pSK-46)XbaI载体被连接于3.4kb 35SGRHcRNOS XbaI或3.0kb35SGRVP16HEcRNOS XbaI DNA片段以产生pSKES1(pSKGRE6-6035SCaMVGUSNOS-35SGRHEcRNOS)，pSKES2(pSKGRE64635SCaMVGUSNOS-35SGRHEcRNOS)，pSKES3(pSKGRE6-6035SCaMVGUSNOS-35SGRVP16HEcRNOS)和pSKES4(pSKGRE6-4635SCaMVGUSNOS-35SGRVP16HEcRNOS)。3.从基于pBlHescript的载体向二价载体的传送。ES1(图29)，ES2(图30)，ES3(图31)或ES4(图32)DNA片段向二价载体JR1的传送涉及5个步骤(i)用ApaI和NotI对pSKES1(ES2，ES3和ES4)进行限制性酶消化以从载体pBluescript释放插入物。(ii)两个DNA片段在37℃TRIS-HCl，MgCl，80μM SAM(S-腺苷甲硫氨酸)和20U BamHI甲基化酶中被BamHI甲基化2小时。(iii)将ApaI/NotI连接子连接在该片段上。此连接子被设计为具有一个内部BamHI位点ApaBNot1 5′cattggatccttagc 3′和ApaBNot2 5′ggccgctaaggatccaatgggcc 3′。(iv)用BamHI对被保护和连接的片段进行限制性酶消化并在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分级该产物。此被保护的DNA片段(5.5kb)从凝胶上被切下并被提纯。(v)进行JRI BamHI载体与被保护带的连接以产生JRIES1(JRIES2，JRIES3或JRJES4)。重组体的DNA通过限制性图谱进行特征描绘并确定各连接点的序列。
含有嵌合蜕皮激素受体和报道基因盒的植物转化构建物pES1，使用Holsters等(1978)描述的冻/融方法被传递入根瘤土壤杆菌LBA4404。烟草(烟草CV.Samsum)转化体通过寸盘方法(Bevan，1984)生产。抽枝在含有100mg/l卡那霉素的培养基上再生。生根后，幼苗被转至暖房并在16小时光照/8小时黑暗条件下生长。结果-嵌合蜕皮激素效应基因构建物调节稳定烟草植物中的可诱导表达转基因烟草植物在细胞培养基中通过向MS培养基加入100μMRH5992进行处理。此外，在存在或缺乏RH5992情况下对幼苗进行溶液培养。在另外的实验中，5mM RH5992以经叶应用的方式应用于8周龄的暖房生长烟草植物。在所述3种方法中GUS活性的未诱导水平与野生对照组可比，而RH5992水平显著升高。蜕皮激素开关调节和优化实施例VIII-用于化学物质库的初步筛选的酵母指示物株系一套酵母指示物株系被生产以用作原发筛选来发现可在基因开关中使用的化学物质。所期望的化学物质的特性应包括导致高度激活的高亲和性，但却有不同的生理化学特性以便增加本技术的应用范围。而且，这种株系的产生也证实了本开关系统的一般特性。效应基因载体酵母YCp15Gal-TEV-112的基本载体被产生，含有骨架-pRS315的改良版(Sikorski和Hieter(1989)遗传学122，19-27)一种用于酵母的带有LHU2可选择标记的穿梭载体；ADH1启动子(BamHI-HindIII片段)和ADH1终止子(NotI-BamHI片段)，来自pADNS(Colicelli等，PNAS 86，3599-3603)；来自pSG424(Sadowski和Ptashne(1989)核酸研究17，7539)的GAL4的DNA结合域(氨基酸1-147；GAL4序列是Laughon和Gesteland 91984)分子细胞生物学4，260-267)。激活区域-对应于获自质粒pB112的激活区域B112的氨基酸1-107的酸性激活区域(Ruden等(1991)自然350，250-252)。
该质粒在DNA结合域和激活区域间含有单一EcoRI，NcoI和XbaI位点。
向此载体中插入一个含有铰链，配体结合域和C末端的夜蛾属蜕皮激素受体的PCR DNA片段。5′寡核苷酸侧翼为一个NcoI限制性识别位点并始于氨基酸259HecrNcoI 5′aattccatggtacgacgacagtagacgatcac 3′3′寡核苷酸侧翼为XbaI位点并编码上至氨基酸571HecrXbaI 5′ctgaggtctagagacggtggcgggcggcc 3′PCR使用Vent多聚酶用实施例IA中描述的条件进行。该片段用NcoI和XbaI进行限制性酶消化，提纯并连接入YCp15GALTEVI12NcoI/XbaI载体以产生YGALHeCRB112或TEVB112(图34)。为降低YGALHeCRB112质粒的基本活性，生产一种B112激活因子被删除的YGALHeCR质粒，这种删除是通过用XbaI/SpeI进行YALHeCRB112的限制性酶消化随后连接所产生的载体(即SpeIXbaI位点当被消化时产生相容末端)(TEV-8，图33)。通过用XbaI从YGalHecRB112切除B112反式激活域并用VP16反式激活域DNA片段(编码包括终止密码子的氨基酸411和490)置换而构建一种效应基因质粒。所产生的载体被称为YGalHecRVP16或TEVVP16-3(图35)。用于酵母的报道基因构建物S.cerevisiae株系GGY1∷171(Gill and Ptashne(1987)细胞51，121-126)，YT6∷171(Himmelfarb等(1990)细胞63，1299-1309)两者都含有报道基因质粒，这些报道基因质粒含有驱动到大肠埃希杆菌B-半乳糖苷酶基因的GAL4-反应GAL1启动子。这些质粒在URA3位点合并。报道基因株系YT6∷185含有在YT6的URA3位点(Himmelfarb等)合并的报道基因质粒pJP185(驱动B-半乳糖苷酶基因的两种合成GAL4位点)。(注亲本株系YT6和GGY1在GAL4和GAL80基因中具有突变，所以报道基因在缺乏任何表达GAL4融合的质粒情况下是活性的)。酵母测定标准转化方法(醋酸锂方法)和通过在选择性培养基(对于YCp15Gal-TEV-112质粒来说是亮氨酸培养基)上培养细胞的菌落选择-如Guthrie和Fink(1991)(酵母遗传学和分子生物学指南酶学方法Vol.194，学术出版社)中所述。报道基因测定法是Ausabel等(1993)(分子生物学的现有方法(Wiley)第13章)中所述的改良方法。结果-允许新的化学激活剂和经改变的配体结合域在酵母中被检测的自动筛选系统效应基因载体pYGALHEcTB112已被产生，含有1个GAL4 DNA结合域，一个B112激活区域和一个来自烟芽夜蛾的配体结合域。pYGALHEcRB112和GAL报道基因载体结合，形成一种运转成本低的快速，高能力测定法的基础。这种在酵母(酿酒酵母)中的基于细胞的测定法将用于筛选新的非类固醇性蜕皮激素促效剂，这些促效剂作为杀虫剂或蜕皮激素基因开关系统强有力激活因子可具有商业意义。以化学物质依赖方式控制基因表达的有效系统的证实，形成了供酵母中肽生产的可诱导系统的基础。
该酵母筛选系统形成了使用LacZ报道基因载体以定量测定突变在配体结合域中的贡献来筛选增强的配体结合的基础。另外，增强的配体结合能力或与选择盒一起，其中LacZ报道基因被可选择性标记的尿嘧啶(URA3)，色氨酸(Trp1)或亮氨酸(Leu2)，和组氨酸(His)置换。在配体结合域中有改变的基于pYGALHEcRB112的构建物在损害含有野生型配体结合域的酵母的生长的选择性条件下被培养。在诱导因子存在下生存者再测定并随后被测序以确定传递抗性的突变。实施例IX-使用强反式激活区进行嵌合受体的最优化带有含有单纯疱疹VP16蛋白序列的嵌合受体的哺乳动物表达质粒的构建此嵌合受体的构建是基于将编码糖皮质激素受体反式激活域的序列用属于单纯疱疹的VP16蛋白者置换。用PCR产生3种均将被装配以产生嵌合受体的片段。PCR如实施例IIiii中所述进行。第1片段包括Kozak序列和糖皮质激素受体的蛋氨酸起始位点至糖皮质激素受体的氨基酸152。用于产生此片段的寡核苷酸包括5′末端的一个EcoRI位点GR1A 5′atatgaattccaccatggactccaaagaatc 3′和3′末端的1个NheI限制性酶识别位点GR1B 5′atatgctagctgtgggggcagcagacacagcagtgg 3′。
第2片段也属于糖皮质激素受体并开始于1个框内NheI位点，始于氨基酸406GR2A 5′atatgctagctccagctcctcaacagcaacaac 3′并在氨基酸500终止于一个XhoI位点GR2B 5′atatctcgagcaattccttttatttttttc 3′此两个片段在含有GR1A/B EcoRI/NheI，GR2A/B NheI/XhoI和HEcR SalI/SacI(来自pSKHEcRDEF)的连接中被导入pSKEcoRI/ScaI以产生pSKGRDHEcRGR。该GR序列和连接的接点被发现不含突变。
被扩增的第3片段为一条位于单纯疱疹VP16蛋白的氨基酸411至490间的序列。此被扩增片段侧翼为SpeI识别位点。SpeI产生NheI位点的末端的相容末端。所使用的寡核苷酸VP16C 5′attactagttctgcggcccccccgaccgat 3′和VP16E 5′aattactagtcccaccgtactcgtcaattcc 3′产生一条180bp片段，它被SpeI进行限制性酶消化并被导入pSKGRΔHEcR NheI载体以产生pSKGRVP16HEcR。来自后者的DNA被测序并发现不含突变，连接点也显示是在糖皮质激素受体的框内，2.2kb EcoRV/NotI GRVP16HEcR片段被导入pcDNA3 EcoRV/NotI载体，产生pcDNA3GRVP16HEcR(图36)。含有带VP16序列的嵌合受体的植物瞬时表达效应基因质粒的构建进行相同的步骤以将GRVP16HeCR DNA片段克隆入烟草(pMF7b)和玉米(pMF6)表达载体。2.2kb BamHI DNA片段被从pcDNA3GRVP16HeCR分离并连接入pMF6 BamHI(或pMF7bBamHI)载体以产生pMF6GRVP16HeCR(图37)(或pMF7GRVPHeCR)(图38)。结果-增加强激活区域增强蜕皮激素开关系统来自单纯疱疹病毒的CP16反式激活域已被加至玉米原生质体载体pMF6GRHEcR以产生载体pMF6GRVP16HEcR。当在100μM RH5992存在下共转化入带有报道基因构建物p221.1GRE6的玉米原生质体时，在pMF6GRHEcR上见到增强水平的表达。图39，显示RH5992能够诱导能与阳性对照(p35SCaMVGUS)中观察到的GUS水平相比的GUS水平，而且，观察到剂量反应效应。
VP16增强的载体(pES3和pES4)已为烟草的稳定转化而产生。在转化后，含有pES3和pES4的转基因后代，在用RH5992处理后产生升高的GUS水平，与含有非VP16增强的载体pES1和pES2的类似转基因植物相关。
增强的哺乳动物载体pcDNA3GRCVP16HEcR被制备用于哺乳动物细胞系的瞬时转化。关于不带有VP16的效应基因构建物(pcDNA3GRHEcR)观察到升高的报道基因活性。
“酸性”激活区域显然在真核细胞中是“通用的”激活因子(Ptashne(1988)自然335，683-689)。已用于融合中的其它适当酸性激活区域为GAL4本身的激活因子区域(区域I和区域II)；Ma和Ptashne(细胞(1987)48，847-853)，酵母激活因子GCN4(Hope和Struhl(1986)细胞46，885-894)和单纯疱疹病毒VP16蛋白(Triezenberg等(1988)基因发展2，718-729和730-742)。
其它酸性和非酸性转染增强因子序列例如来自真菌和哺乳动物种属者，可被加至嵌合蜕皮激素受体以增加诱导的基因表达水平。
嵌合或合成的激活因子区域可被产生以增加诱导的基因表达水平。实施例X-通过嵌合效应基因中用夜蛾属配体结合域置换其它种属的蜕皮激素配体结合域而进行最优化。
蜕皮激素配体结合域的突变发生导致嵌合受体对激活化学物质的增高的具应答性。这可通过配体结合域中的缺失获得，使用易发生错误的PCR(Caldwell等，PCR Meth.Applic 2，28-33，1992)，和体个DNA推移(Shuffling)PCR(Stemmer，自然370，389-391，1994)。为增加所列技术的有效性，我们研制了一种用于增加诱导的表达水平的筛选系统(见下)。
除已知配体结合域的突变以外的另一策略是鉴定对蜕皮激素促效剂特别具应答性的昆虫种属。例如甜菜夜蛾对RH5992特别具应答性。为研究蜕皮激素受体配体结合域在对RH5992增加的具应答性中的作用，我们从甜菜夜蛾分离了相应的DNA序列(图40，序列ID NO6)。图41，序列ID NO7显示烟芽夜蛾和甜菜夜蛾蜕皮激素受体铰链和配体结合域的蛋白排列。两种种属间的蛋白序列是高度保守的。结果-配体结合域的操纵导致增强的诱导表达蜕皮激素配体结合域从其它鳞翅目种属的分离的实施是通过使用简并寡核苷酸和所选择种属第1链cDNA的PCR(Perkin Elmer，cDNA合成试剂盒)。5′末端的简并寡核苷酸是HingXho A和B，而在3′末端是配体A/BHingxhoA 5′ attgctcgagaaagiccigagtgcgtigticc 3′a tHingxhoB 5′ attgctcgagaacgiccigagtgtgtigticc 3′a c配体A5′ttactcgagiacgtcccaiatctcttciaggaa 3′a t c a配体B5′ttactcgagiacgtcccaiatctcctciaagaa 3′a t t aRNA从甜菜夜蛾的第4龄幼虫提取，因为甜菜夜蛾显示比夜蛾属对RH5992更具应答性(Smagghe和Degheele，1994)。第1链cDNA在下列条件下被用于PCR反应，20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mMKCl，1.5mM MgCl2，200mM dNTPs(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)和0.02U/ml Taq DNA多聚酶，以及铰链(5′3′)和配体(5′3′)寡核苷酸各1μg存在下。PCR循环条件为94℃1分钟，60℃2分钟和72℃1分钟，共进行35次循环。完成的反应的样本在1％琼脂糖(w/v)1×TBE凝胶中分级。并将所产生的900bp片段亚克隆入PCRII载体(Invitrogen)。所产生的克隆(pSKSEcR 1-10)被进一步特征描绘和测序。实施例X-报道基因启动子区域的操作可调节化学物质诱导的表达效应基因反应元件在报道基因启动子中的前后关系可被用于调节基础的和诱导水平的基因表达。6拷贝的糖皮质激素反应元件被融合于46bp或60bp的CaMV35S启动子的报道基因构建物产生相对于60bp报道基因构建物降低的基础和诱导水平GUS表达(图42)。
用于植物转化的构建物(pES1和pES2)已被产生以证实可用于调节植物中基础和诱导水平的基因表达的最小启动子大小。
报道基因启动子中反应元件的数目和间隔可被调节以增加诱导的转基因表达水平。
使用两个组成系统(效应基因和报道基因盒)允许被诱导表达的空间控制。转基因表达可以组织特异性，器官特异性或发育控制的方式被调节。这可通过从空间和瞬时调节驱动效应基因构建物来获得。
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序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名ENECA有限公司(B)街道15 STANHOPE GATE(C)城市伦敦(E)国家英国(F)邮政编码(ZIP)W1Y 6LN(ii)发明题目基因开关(iii)序列数目7(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容PC(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)在先申请日期(A)申请号GB 9510759.5(B)提交日26-MAY-1995(vi)在先申请日期(A)申请号GB 9513882.3(B)提交日07-JUL-1995(vi)在先申请日期(A)申请号GB 9517316.7(B)提交日24-AUG-1995(vi)在先申请日期(A)申请号GB 9605656.9(B)提交日18-MAR-1996(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度116碱基对(B)类型核苷酸(C)链形单链
(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA to mRNA(vi)原始来源(A)微生物烟芽夜蛾(xi)序列描述SEQ ID NO1TGCGAGGGGT GCAAGGAGTT CTTCAGGCGG AGTGTAACCA AAAATGCAGT GTACATATGC60AAATTCGGCC ATGCTTGCGA AATGGATATG TATATGCGGA GAAAATGCCA AGAGTA 1162)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1934碱基对(B)类型核苷酸(C)链形双链(D)拓扑学环形(ii)分子类型cDNA(vi)原始来源(A)微生物烟芽夜蛾(vii)直接来源(B)克隆pSK19R(xi)序列描述SEQ ID NO2TCCACTGGTG TTTTCACCAC CACAGAAAAG GCCTCTGCTC ATTTAGAGGG TGGTGCTAAG60AAGGTCATCA TCTCCTGCTG CCCAGCGCTG ACCCATGTTC GTCGTTGGTG TCAACCTTGA 120AGCAGTATGA CCCCTCTTAC AAGGTCATCT CCAACGCCTC CTGCACAACC AACTGCCTCG 180CTCCTCTCGC TAAGGTCATC CATGACAACT TCGAGATCAT TGAAGGTCTG ATGACCACTG 240TACACGCCAC CACTGCCACC CAGAAGACAG TGGATGGACC CTCTGGTAAA CTGTGGCGTG 300ATGGCCGTGG TGCTCAGCAG AATATCATTC CCGCGGAATT CCCCAGCCGC AGCTAGCTAA 360CCTGCAGCAG ACACAACCCC TACCTTCCAT GCCGTTACCA ATGCCACCGA CAACACCCAA 420ATCAGAAAAC GAGTCAATGT CATCAGGTCG TGAGGAACTG TCTCCAGCTT CGAGTGTAAA 480CGGCTGCAGC ACAGATGGCG AGGCGAGGCG GCAGAAGAAA GGCCCAGCGC CGAGGCAGCA 540AGAAGAGCTA TGTCTTGTCT GCGGCGACAG AGCCTCCGGA TATCACTACA ACGCGCTCAC 600ATGTGAAGGG TGTAAAGGTT TCTTCAGGCG GAGTGTAACC AAAAATGCAG TGTACATATG 660CAAATTCGGC CATGCTTGCG AAATGGATAT CTATATGCGG AGAAAATGTC AGGAGTGTCG 720GTTGAAGAAA TGTCTTGCGG TGGGCATGAG GCCCGAGTGC GTGGTGCCGG AGAACCAGTG 780TGCAATGAAA CGGAAAGAGA AAAAGGCGCA GAGGGAAAAA GACAAATTGC CCGTCAGTAC 840GACGACAGTA GACGATCACA TGCCTCCCAT CATGCAATGT GACCCTCCGC CCCCAGAGGC 900CGCTAGAATT CTGGAATGTG TGCAGCACGA GGTGGTGCCA CGATTCCTGA ATGAGAAGCT 960AATGGAACAG AACAGATTGA AGAACGTGCC CCCCCTCACT GCCAATCAGA AGTCGTTGAT 1020CGCAAGGCTC GTGTGGTACC AGGAAGGCTA TGAACAACCT TCCGAGGAAG ACCTGAAGAG 1080GGTTACACAG TCGGACGAGG ACGACGAAGA CTCGGATATG CCGTTCCGTC AGATTACCGA 1140GATGACGATT CTCACAGTGC AGCTCATCGT AGAATTCGCT AAGGGCCTCC CGGGCTTCGC 1200CAAGATCTCG CAGTCGGACC AGATCACGTT ATTAAAGGCG TGCTCAAGTG AGGTGATGAT 1260GCTCCGAGTG GCTCGGCGGT ATGACGCGGC CACCGACAGC GTACTGTTCG CGAACAACCA 1320GGCGTACACT CGCGACAACT ACCGCAAGGC AGGCATGGCG TACGTCATCG AGGACCTGCT 1380GCACTTCTGT CGGTGCATGT ACTCCATGAT GATGGATAAC GTGCATTATG CGCTGCTTAC 1440AGCCATTGTC ATCTTCTCAG ACCGGCCCGG GCTTGAGCAA CCCCTGTTGG TGGAGGACAT 1500CCAGAGATAT TACCTGAACA CGCTACGGGT GTACATCCTG AACCAGAACA GCGCGTCGCC 1560CCGCGGCGCC GTCATCTTCG GCGAGATCCT GGGCATACTG ACGGAGATCC GCACGCTGGG 1620CATGCAGAAC TCCAACATGT GCATCTCCCT CAAGCTGAAG AACAGGAAGC TGCCGCCGTT 1680CCTCGAGGAG ATCTGGGACG TGGCGGACGT GGCGACGACG GCGACGCCGG TGGCGGCGGA 1740GGCGCCGGCG CCTCTAGCCC CCGCCCCGCC CGCCCGGCCG CCCGCCACCG TCTAGCGCGC 1800CTCAGGAGAG AACGCTCATA GACTGGCTAG TTTTAGTGAA GTGCACGGAC ACTGACGTCG 1860ACGTGATCAA CCTATTTATA AGGACTGCGA ATTTTACCAC TTAAGAGGGC ACACCCGTAC 1920CCGATTTCGT ACGG1934(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度2464碱基对(B)类型核苷酸(C)链形双链(D)拓扑学环形(ii)分子类型cDNA(vi)原始来源
(A)微生物烟芽夜蛾(vii)直接来源(B)克隆pSK16.1(xi)序列描述SEQ ID NO3CGCTGGTATA ACAACGGACC ATTCCAGACG CTGCGAATGC TCGAGGAGAG CTCGTCTGAG60GTGACGTCGT CTTCAGCACT GGGCCTGCCG CCGGCTATGG TGATGTCCCC GGAATCGCTC 120GCGTCGCCCG AGATCGGCGG CCTGGAGCTG TGGGGCTACG ACGATGGCAT CACTTACAGC 180ATGGCACAGT CGCTGGGCAC CTGCACCATG GAGCAGCAGC AGCCCCAGCC GCAGCAGCAG 240CCGCAGCAGA CACAACCCCT ACCTTCCATG CCGTTACCAA TGCCACCGAC AACACCCAAA 300TCAGAAAACG AGTCAATGTC ATCAGGTCGT GAGGAACTGT CTCCAGCTTC GAGTGTAAAC 360GGCTGCAGCA CAGATGGCGA GGCGAGGCGG CAGAAGAAAG GCCCAGCGCC GAGGCAGCAA 420GAAGAGCTAT GTCTTGTCTG CGGCGACAGA GCCTCCGGAT ATCACTACAA CGCGCTCACA 480TGTGAAGGGT GTAAAGGTTT CTTCAGGCGG AGTGTAACCA AAAATGCAGT GTACATATGC 540AAATTCGGCC ATGCTTGCGA AATGGATATC TATATGCGGA GAAAATGTCA GGAGTGTCGG 600TTGAAGAAAT GTCTTGCGGT GGGCATGAGG CCCGAGTGCG TGGTGCCGGA GAACCAGTGT 660GCAATGAAAC GGAAAGAGAA AAAGGCGCAG AGGGAAAAAG ACAAATTGCC CGTCAGTACG 720ACGACAGTAG ACGATCACAT GCCTCCCATC ATGCAATGTG ACCCTCCGCC CCCAGAGGCC 780GCTAGAATTC TGGAATGTGT GCAGCACGAG GTGGTGCCAC GATTCCTGAA 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NO4的信息(i)序列特征(A)长度2745碱基对(B)类型核苷酸(C)链形双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)姓名/KEYCDS(B)位置225..1955(D)其它信息/密码起始＝225产物＝“夜蛾属蜕皮激素受体”(xi)序列描述SEQ ID NO4ACTCGCGTGC TCTTCTCACC TGTTGCTCGG ATTGTGTTGT ACTAGAAAAA AGTTGTCGCC60GCTCGAACGA GACTTCCGAG TCCTATTGGA TTGCACGAAA GTCGAGACAG TGGATAGCGA 120TTCGGTTTCG TTTGAACGTT GCGTAGACGA GTGGTGCATG TCCATGAGTC GCGTTTAGAT 180AGTTTAGTGC GAGGAAAAAG TGAAGTGAAA GCCTTCCTCG GAGGATGTCC CTCGGCGCTC 240GTGGATACCG GAGGTGTGAC ACGCTCGCCG ACATGAGACG CCGCTGGTAT AACAACGGAC 300CATTCCAGAC GCTGCGAATG CTCGAGGAGA GCTCGTCTGA GGTGACGTCG TCTTCAGCAC 360TGGGCCTGCC GCCGGCTATG GTGATGTCCC CGGAATCGCT CGCGTCGCCC GAGATCGGCG 420GCCTGGAGCT GTGGGGCTAC GACGATGGCA TCACTTACAG CATGGCACAG TCGCTGGGCA 480CCTGCACCAT GGAGCAGCAG CAGCCCCAGC CGCAGCAGCA GCCGCAGCAG ACACAACCCC 540TACCTTCCAT GCCGTTACCA ATGCCACCGA CAACACCCAA ATCAGAAAAC GAGTCAATGT 600CATCAGGTCG TGAGGAACTG TCTCCAGCTT CGAGTGTAAA CGGCTGCAGC ACAGATGGCG 660AGGCGAGGCG GCAGAAGAAA GGCCCAGCGC CGAGGCAGCA AGAAGAGCTA TGTCTTGTCT 720GCGGCGACAG AGCCTCCGGA TATCACTACA 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2460GTGATGAGTC GTCCGCTGTC CACGTCGCCG TCACATGTTT GTTTCTGATG CACACGTGAG 2520GNGCGTTATC GTGTTTCATG GTTCCATCGT CCTGTGCCCG CGACCCTCGA CTAAATGAGT 2580AATTTAATTT ATTGCTGTGA TTACATTTTA ATGTGTTGAT TATCTACCAT AGGGTGATAT 2640AAGTGTGTCT TATTACAATA CAAAGTGTGT GTCGTCGATA GCTTCCACAC GAGCAAGCCT 2700TTTGTTTAAG TGATTTACTG ACATGGACAC TCGACCCGGA ACTTC 2745(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度575氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Ser Leu Gly Ala Arg Gly Tyr Arg Arg Cys Asp Thr Leu Ala Asp1 5 10 15Met Arg Arg Arg Trp Tyr Asn Asn Gly Gly Phe Gln Thr Leu Arg Mer20 25 30Leu Glu Glu Ser Ser Ser Glu Val Thr Ser Ser Ser Ala Leu Gly Leu35 40 45Pro Pro Ala Met Val Met Ser Pro Glu Ser Leu Ala Ser Pro Glu Ile50 55 60Gly Gly Leu Glu Leu Trp Gly Tyr Asp Asp Gly Ile Thr Tyr Ser Met65 70 75 80Ala Gln Ser Leu Gly Thr Cys Thr Met Glu Gln Gln Gln Pro Gln Pro85 90 95Gln Gln Gln Pro Gln Gln Thr Gln Pro Leu Pro Ser Met Pro Leu Pro100 105 110Met Pro Pro Thr Thr Pro Lys Ser Glu Asn Glu Ser Met Ser Ser Gly115 120 125Arg Glu Glu Leu Ser Pro Ala Ser Ser Val Asn Gly Cys Ser Thr Asp130 135 140Gly Glu Ala Arg Arg Gln Lys Lys Gly Pro Ala Pro Arg Gln Gln Glu145 150 155 160Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn165 170 175Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val Thr180 185 190Lys Asn Ala Val Tyr Ile Cys Lys Phe Gly His Ala Cys Glu Met Asp195 200 205Ile Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys Leu210 215 220Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys Ala225 230 235 240Met Lys Arg Lys Glu Lys Lys Ala Gln Arg Glu Lys Asp Lys Leu Pro245 250 255Val Ser Thr Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys260 265 270Asp Pro Pro Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile Leu Glu Cys Val Gln His275 280 285Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Asn Glu Lys Leu Met Glu Gln Asn Arg290 295 300Leu Lys Asn Val Pro Pro Leu Thr Ala Ash Gln Lys Ser Leu Ile Ala305 310 315 320Arg Leu Val Trp Tyr Gln Glu Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp325 330 335Leu Lys Arg Val Thr Gln Ser Asp Glu Asp Asp Glu Asp Ser Asp Met340 345 350Pro Phe Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile355 360 365Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Ser370 375 380Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu385 390 395 400Arg Val Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Ser Val Leu Phe Ala405 410 415Asn Asn Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala420 425 430Tyr Val Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met435 440 445Met Met Asp Asn Val His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe450 455 460Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Leu Leu Val Glu Asp Ile Gln465 470 475 480Arg Tyr Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Val Tyr Ile Leu Asn Gln Asn Ser485 490 495Ala Ser Pro Arg Gly Ala Val Ile Phe Gly Glu Ile Leu Gly Ile Leu500 505 510Thr Glu Ile Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser515 520 525Leu Lys Leu Lys Lys Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp530 535 540Asp Val Ala Asp Val Ala Thr Thr Ala Thr Pro Val Ala Ala Glu Ala545 550 555 560Pro Ala Pro Leu Ala Pro Ala Pro Pro Ala Arg Pro Ala Thr Val565 570 575(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度948碱基对(B)类型核苷酸(C)链形双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(vi)原始来源(A)微生物甜菜夜蛾(xi)序列描述SEQ ID NO6AGGCCGGAGT GCGTGGTGCC AGAAAACCAG TGTGCAATGA AAAGGAAAGA GAAAAAGGCA60CAAAGGGAAA AAGACAAGTT GCCAGTCAGT ACAACGACAG TGGATGATCA CATGCCTCCC 120ATTATGCAGT GTGATCCACC GCCTCCAGAG GCCGCAAGAA TTCACGAGGT GGTGCCACGA 180TTCCTGAATG AAAAGCTAAT GGACAGGACA AGGCTCAAGA ATGTGCCCCC TCACTGCCAA 240CCAGAAGTCC TTAATAGCGA GGCTGGTCTG GTACCAAGAA GGCTATGAAC AGCCATCAGA 300AGAGGATCTA AAAAGAGTCA CACAGTCGGA TGAAGACGAA GAAGAGTCGG ACATGCCGTT 360CCGTCAGATC ACCGAGATGA CGATCCTCAC AGTGCAGCTC ATTGTTGAAT TCGCTAAGGG 420CCTACCAGCG TTCGCAAAGA TCTCACAGTC GGATCAGATC ACATTATTAA AGGCCTGTTC 480GAGTGAGGTG ATGATGTTGC GAGTAGCTCG GCGGTACGAC GCGGCGACAG ACAGCGTGTT 540GTTCGCCAAC AACCAGGCGT ACACCCGCGA CAACTACCGC AAGGCAGGCA TGGCCTACGT 600CATCGAGGAC CTGCTGCACT TCTGCCGGTG CATGTACTCC ATGATGATGG ATAACGTCCA 660CTATGCACTG CTCACTGCCA TCGTCATTTT CTCAGACCGA CCCGGGCTTG AGCTAACCCT 720GTTGGTGGAG GAGATCCAGA GATATTACCT GAACACGCTG CGGGTGTACA TCCTGAACCA 780GAACAGTCGG TCGCCGTGCT GCCCTGTCAT CTACGCTAAG ATCCTCGGCA TCCTGACGGA 840GCTGCGGACC CTGGGCATGC AGAACTCCAA CATGTGCATC TCACTCAAGC TGAAGAACAG 900GAACGTGCCG CCGTTCTTCG AGGATATCTG GGACGTCCTC GAGTAAAA948(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度319氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO7Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys1 5 10 15Glu Lys Lys Ala Gln Arg Glu Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr20 25 30Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys Asp Pro Pro Pro35 40 45Pro Glu Ala Ala Arg Ile Leu Glu Cys Val Gln His Glu Val Val Pro50 55 60Arg Phe Leu Asn Glu Lys Leu Met Glu Gln Asn Arg Leu Lys Asn Val65 70 75 80Pro Pro Leu Thr Ala Asn Gln Lys Ser Leu Ile Ala Arg Leu Val Trp85 90 95Tyr Gln Glu Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Lys Arg Val100 105 110Thr Gln Ser Asp Glu Asp Asp Glu Asp Ser Asp Met Pro Phe Arg Gln115 120 125Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala130 135 140Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Ser Asp Gln Ile Thr145 150 155 160Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg165 170 175Arg Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Ser Val Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala180 185 190Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Tyr Val Ile Glu195 200 205Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Met Met Asp Asn210 215 220Val His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro225 230 235 240Gly Leu Glu Gln Pro Leu Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu245 250 255Asn Thr Leu Arg Val Tyr Ile Leu Asn Gln Asn Ser Ala Ser Pro Arg260 265 270Gly Ala Val Ile Phe Gly Glu Ile Leu Gly Ile Leu Thr Glu Ile Arg275 280 285Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys290 295 300Lys Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Asp Trp Asp Val305 310 31权利要求
1.包含Seq ID NO2中所示序列的DNA。
2.包含Seq ID NO3中所示序列的DNA。
3.包含Seq ID NO4中所示序列的DNA。
4.包含与Seq ID NO1，2或3中所示序列显示65％或更多同源性的序列的DNA。
5.按照权利要求4的DNA，其中所述同源性范围为65％～99％。
6.与Seq ID NO2，3或4中所示序列杂交，并编码夜蛾属蜕皮激素受体的至少一部分的DNA。
7.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求1至6的任意一项的DNA，并且它编码至少为夜蛾属(Heliothis)蜕皮激素受体的一部分的多肽。
8.一种DNA，它包含Seq ID NO2中所示序列的一部分，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
9.一种DNA，它包含Seq ID NO3中所示序列的一部分，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
10.一种DNA，它包含Seq ID NO4中所示序列的一部分，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
11.一种DNA，它包含与权利要求8，9或10的序列显示60％或更多同源性的序列。
12.按照权利要求11的DNA，其中所述同源性在65％～99％。
13.与权利要求8至12的任何一项的DNA杂交的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
14.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求8至12的任意一项的DNA，并且它编码至少为夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域的一部分的多肽。
15.包含Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域的至少一部分。
16.包含Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域的至少一部分。
17.包含Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域的至少一部分。
18.一种DNA，它包含与权利要求15，16或17的序列显示60％或更多同源性的序列。
19.按照权利要求18的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
20.与权利要求15至19的任何一项的DNA杂交的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域的至少一部分。
21.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求15至19的任意一项的DNA，并且它编码至少为夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域的一部分的多肽。
22.包含Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域的至少一部分。
23.包含Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域的至少一部分。
24.包含Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域的至少一部分。
25.一种DNA，它包含与权利要求22，23或24的序列显示60％或更多同源性的序列。
26.按照权利要求25的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
27.与权利要求22至26的任何一项的DNA杂交的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域的至少一部分。
28.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求22至26的任意一项的DNA，并且它编码至少为夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域的一部分的多肽。
29.包含Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
30.包含Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
31.包含Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
32.一种DNA，它包含与权利要求29，30或31的序列显示60％或更多同源性的序列。
33.按照权利要求32的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
34.一种DNA，它与权利要求29至33的任意一项的DNA杂交，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
35.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求29至33的任意一项的DNA，并且它编码至少为夜蛾属蜕皮激素受体铰链域的一部分的多肽。
36.具有Seq ID NO2中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域的至少一部分。
37.具有Seq ID NO3中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域的至少一部分。
38.包含Seq ID NO4中所示序列的一部分的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域的至少一部分。
39.一种DNA，它包含与权利要求36，37或38的序列显示60％或更多同源性的序列。
40.按照权利要求39的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
41.一种DNA，它与权利要求36至40的任意一项的DNA杂交，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域的至少一部分。
42.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求36至40的任意一项的DNA，并且它编码夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域的至少一部分。
43.一种多肽，它包含夜蛾属蜕皮激素受体或其片段，其中所述多肽基本不含通常与其相联的其它蛋白，并且它被任何前述权利要求的DNA所编码。
44.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列或任何其等位基因变异体或衍生物。
45.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列的一部分或任何其等位基因变异体或衍生物，该序列提供夜蛾属蜕皮激素受体配体结合域。
46.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列的一部分或任何其等位基因变异体或衍生物，该序列提供夜蛾属蜕皮激素受体DNA结合域。
47.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列的一部分或任何其等位基因变异体或衍生物，该序列提供夜蛾属蜕皮激素受体反式激活域。
48.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列的一部分或任何其等位基因变异体或衍生物，该序列提供夜蛾属蜕皮激素受体铰链域。
49.一种多肽，它包含Seq ID NO4中所示氨基酸序列的一部分或任何其等位基因变异体或衍生物，该序列提供夜蛾属蜕皮激素受体羧基末端区域。
50.按照权利要求44至49的任意一项的多肽，其中所述微生物是包括保守氨基酸改变的同源变异体。
51.包含Seq ID NO6中所示序列的DNA。
52.一种DNA，它包含Seq ID NO6中所示序列显示60％或更多同源性的序列。
53按照权利要求52的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
54.一种DNA，它与Seq ID NO6中所示DNA序列杂交，并且它编码斜纹夜蛾(Spodoptera)蜕皮激素受体的至少一部分。
55.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于权利要求51至54的任意一项的DNA。
56.一种DNA，它与Seq ID NO6中所示DNA序列的一部分，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
57.一种DNA，它包含与权利要求56的序列显示60％或更多同源性的序列。
58.按照权利要求57的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
59.一种DNA，它与权利要求56至58的任意一项的DNA杂交，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
60.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于与权利要求56至58的任意一项的DNA，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体配体结合域的至少一部分。
61.一种DNA，它包含Seq ID NO6中所示序列的一部分，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
62.一种DNA，它包含与权利要求61的序列显示60％或更多同源性的序列。
63.按照权利要求62的DNA，其中所述同源性在65％至99％。
64.一种DNA，它与权利要求61至63的任意一项DNA杂交，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
65.一种DNA，它作为遗传密码的结果简并于与权利要求61至63的任意一项的DNA，并且它编码斜纹夜蛾蜕皮激素受体铰链域的至少一部分。
66.一种多肽，它由权利要求51至65的任意一项的DNA编码。
67.一种融合多肽，它包含权利要求45或50的多肽(由权利要求45决定)并且功能性地连接于DNA结合域和反式激活域。
68.包含权利要求8至14的任意一项的DNA的重组体DNA，它功能性地连接于编码DNA结合域和反式激活域的DNA。
69.按照权利要求67的融合多肽或按照权利要求68的重组体DNA，其中DNA结合域和/或反式激活域是真菌，细菌，植物或哺乳动物的。
70.按照权利要求69的融合多肽或重组体DNA，其中DNA结合域是GAL4或AICR/A。
71.按照权利要求69或70的融合多肽或重组体DNA，其中反式激活域是VP16。
72.按照权利要求69的融合多肽或重组体DNA，其中DNA结合域和/或反式激活域来自类固醇受体超家族成员。
73.按照权利要求72的融合多肽或重组体DNA，其中DNA结合域和/或反式激活域来自糖皮质激素或斜纹夜蛾蜕皮激素受体。
74.包含权利要求68至73的任意一项的重组体DNA的重组体DNA构建物；以及编码可操作地连接于启动子序列和激素反应元件的基因的DNA，它对由所述重组体DNA编码的DNA结合域具应答性。
75.一种融合多肽，它包含权利要求46或50的多肽(由权利要求45决定)并且功能性地连接于配体结合域和反式激活域。
76.一种重组体DNA，它包含权利要求15至21的任意一项的DNA，功能地连接于编码配体结合域和反式激活域的DNA。
77.按照权利要求75的融合多肽或按照权利要求76的重组体DNA，其中配体结合域和/或反式激活域是真菌，细菌，植物或哺乳动物的。
78.按照权利要求77的融合多肽或重组体DNA，其中反式激活域是VP16。
79.按照权利要求77的融合多肽或重组体DNA，其中配体结合域和/或反式激活域来自类固醇受体超家族成员。
80.按照权利要求79的融合多肽或重组体DNA，其中配体结合域和/或反式激活域来自糖皮质激素或斜纹夜蛾蜕皮激素受体。
81.一种重组DNA构建物，它包含权利要求76至80的任意一项的重组体DNA；以及编码可操作地连接于启动子序列和激素反应元件的基因的DNA，它对由所述重组体DNA编码的DNA结合域具应答性。
82.一种融合多肽，它包含权利要求47或50的多肽(由权利要求47决定)并且功能性地连接于配体结合域和DNA结合域。
83.包含权利要求22至28的任意一项的DNA的重组体DNA，它功能性地连接于编码配体构建物区域和DNA结合域的DNA。
84.按照权利要求82的融合多肽或按照权利要求83的重组体DNA，其中配体结合域和/或DNA结合域是真菌、细菌、植物或哺乳动物的。
85.按照权利要求84的融合多肽或重组体DNA，其中DNA结合域是GAL4或AICR/A。
86.按照权利要求84的融合多肽或重组体DNA，其中配体结合域和/或DNA结合域来自类固醇受体超家族成员。
87.按照权利要求86的融合多肽或重组体DNA，其中配体结合域和/或DNA结合域来自糖皮质激素或斜纹夜蛾蜕皮激素受体。
88.一种重组体DNA构建物，它包含权利要求82至87的任意一项的重组体DNA；以及编码可操作地连接于启动子序列和激素反应元件的基因的DNA，它对由所述重组体DNA编码的DNA结合域具应答性。
89.一种重组体DNA构建物，它包含按照权利要求1至7的任意一项的DNA；以及包含编码可操作地连接于启动子序列和至少一种激素反应元件的基因的序列的DNA，它对由所述权利要求1至7的任意一项的DNA编码的DNA结合域具应答性。
90.按照权利要求74、81、88和89的任意一项的一种重组体DNA构建物，其中所述启动子序列编码组成型的，空间的或时序的调节启动子。
91.按照权利要求74、81、88和89的任意一项的重组体DNA构建物，其中有多于一拷贝的激素反应元件。
92.用权利要求1至42，和51至56的任意一项的DNA转化的细胞；权利要求43至50的任意一项的多肽；权利要求67、70至73，75、77至80，82和84至87的任意一项的融合多肽；权利要求68至73，76至80和85至87的任意一项的重组体核酸；或权利要求74、81、88和89的任意一项的重组体DNA构建物。
93.按照权利要求92的细胞，其中所述细胞是植物、真菌或哺乳动物细胞。
94.包含权利要求74，81，88和89的任意一项的重组体DNA构建物的植物、真菌或哺乳动物。
95.一种方法，用于选择能够结合于昆虫类固醇受体超家族成员的化合物，它包含筛选供结合于权利要求43至50的任意一项的所述多肽或权利要求67、70至73，75，77至80，82和84至87的任意一项的融合多肽的化合物，以及选择表现所述结合的所述化合物。
96.使用权利要求95的方法选择的化合物。
97.一种农业或药物组合物，它包含权利要求96的化合物。
98.权利要求96的化合物作为农业化肥或药物的应用。
99.生产蛋白质，肽类或多肽的一种方法，包含向权利要求92的细胞中导入结合于所述细胞中的配体结合域的一种化合物。
全文摘要
本发明涉及能够作为基因开关的一种昆虫类固醇受体蛋白,它对能够外部控制该基因的化学诱导物具应答性。
文档编号C12N15/85GK1191568SQ96195739
公开日1998年8月26日 申请日期1996年5月20日 优先权日1995年5月26日
发明者I·耶普森, A·马尔蒂内茨, A·J·格林兰德 申请人:曾尼卡有限公司