转录控制序列和方法

专利名称：转录控制序列和方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，尤其涉及到转录调节元件植物组织中定性的调节元件和定量的调节元件，前者正调节其下游基因对于侵入病原微生物，释放素和其它诱导性化学信号物质等的胁迫的反应；后者增加相应基因的转录表达。
背景技术：
植物体对于病原性真菌，细菌和病毒的抗病性和一种叫超敏反应(HR)的植物反应相联系。超敏反应的结果，被潜在的植物病原菌侵入的部位发生定点细胞死亡，据推测HR带来的定点植物细胞死亡包含入侵的微生物或病毒，这样使得其邻近组织细胞免于感染。另外一些植物防御反应包括产生能阻止病原菌侵入的植物抗毒素(抗生素)和/或溶菌酶和/或修饰细胞壁，修饰细胞壁可增强其抵抗病原菌产生的物理性和/或酶的破坏。
植物包括烟草的超敏反应能产生植物抗毒素作为抵抗病原微生物侵染的反应之一。抗微生物倍半萜是烟草(Nicotiana tabacum)对病原微生物入侵反应过程中形成的一类化合物。
细胞悬浮培养提供了关于萜烯生物合成调节的有用信息。类异戊二烯在自然界广泛存在，它们和其它类异戊二烯化合物如甾醇，类胡萝卜素，多萜醇，泛醌和植物生长调节物质(如赤霉素)等具有共同的早期生物合成途径，植物生长调节物质被称为初生代谢物质，被称为次生代谢物质的类异戊二烯化合物不为生长所必需，它们包括单萜，倍半萜，二萜。这些次生代谢物-类异戊二烯是植物和其环境相互作用过程中的重要介导者。
许多化合物可以作为释放素诱导植物抗毒素合成。他们包括但不限于一种或多种毒性离子，如汞离子，其它化学上明确的成分，代谢抑制剂，细胞壁聚糖，一些糖蛋白，一些酶，真菌孢子，脱乙酰几丁质，一些脂肪酸，一些来自植物细胞壁的寡糖[参看Sequeira L，(1983)微生物学年评(Annu.Rev Microbiol.)3751-79，以及所引用的参考文献]。一些疫霉的细胞壁碎片和绿色木霉纤维素酶能增强表-5-马兜铃烯(aristolochene)合酶活性，但日本曲霉果胶酶却不能[Chappell等，(1991)，植物生理学(Plant Phyiol.)97693-698]。受到其它植物病原菌或相似的无毒菌株的攻击，烟草也会诱导合成植物抗毒素，例如，流泪假单胞菌诱导烟草倍半萜的生物合成[Guedes等，(1982)植物化学(Phytochemistry)212987-2988]。
释放蛋白是由植物病原菌或潜在的植物病原菌产生的一种蛋白质，该蛋白能诱发烟草的超敏反应。寄生疫霉释放蛋白的氨基酸和核苷酸编码序列已经公布[Kamoun等，(1993)植物-微生物相互作用分子生物学(Mol.Plant-Microbe Interactions)，6573-581]。植物病原病毒，包括但不限于烟草花叶病毒(TMV)，诱导被感染植物超敏反应。感染植物的细菌也能诱导超敏反应，从而诱导抗病性；刺激超敏反应形成的代表性细菌包括但不限于土壤杆菌属的种类，黄单胞菌属的种类，丁香假单胞菌等。植物病原真菌(也包括一些无毒菌株)也能诱导植物超敏反应，这些真菌包括但不限于寄生疫霉和烟草霜霉。
用一种释放素处理烟草悬浮培养细胞，鲨烯合成酶就受到抑制，于是阻止了正常途径中生物合成的前体物质形成甾醇，同时伴随着倍半萜环化酶基因的表达，导致这些前体物质合成倍半萜。释放素处理烟草组织中，从法呢醇二磷酸合成倍半萜植物抗毒素Capsidiol的第一步反应是由5-表-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)所催化的，EAS是一种倍半萜环化酶。烟草EAS基因家族中的一种已被克隆，其基因序列和推测的氨基酸序列已经公布[Facchini and Chappell，(1992)，美国科学院院刊(Proc.Natl Acad Sci.USA)，8911088-11092]。释放素诱导EAS家族的一个或几个成员的转录表达。
本领域长期以来一直想得到保护植物，尤其是农作物免于受植物病原菌侵害的方法，这些病原菌包括但不限于植物病原性病毒，真菌和细菌。从经济学和环境保护的角度来看，生物防治或自然防治显得尤其重要的，而不是靠给农作物施加化学药品的化学防治。本领域长期以来也一直想得到用于控制转基因植物中异源DNA表达的植物转录调节序列。
发明概述总的来说，本发明的特色是一种包含可诱导的植物抗病调节元件的重组核酸分子。总的说来，这种重组的核酸分子和天然存在的可诱导的植物抗病调节元件至少有80％的同源性，即是说，标准DNA序列中高达20％的碱基对可以被其它碱基对替换(如G-C替换成A-T，T-A或C-G)，只要改造的序列促进转录的活性和标准序列相同或更高即可。在优选实施方案中，本发明的重组核酸分子来源于一种编码萜环化酶(如一种倍半萜环化酶)的基因，例如，本发明的重组调节元件来源于一种表-5-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)基因，该基因包含一段如图3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)或由此产生的一种可诱导的植物抗病片段。在优选实施方案中，本发明的重组核酸分子的核苷酸序列如图3A所示(SEQ ID NO14)。
在其它的优选实施方案中，本发明的核酸分子包含下列任何序列SEQ ID NO2中核苷酸463-473；SEQ ID NO2中核苷酸406-486；SEQ ID NO2中核苷酸463-572；SEQ ID NO2中核苷酸371-463；SEQ ID NO2中核苷酸411-457。
在优选实施方案中，本发明的重组核酸分子来源于一种双子叶植物(如茄科植物的一个成员，如烟草属)。在其它的优选实施方案中，本发明的核酸分子来源于一种单子叶植物，裸子植物，或松柏类植物。
在另外的其它优选实施方案中，本发明的核酸分子是基因组DNA，化学合成DNA，或者是基因组DNA和化学合成DNA的组合；基因组DNA和cDNA的组合；化学合成DNA和cDNA的组合；或者基因组DNA，cDNA和化学合成DNA的组合。
在优选实施方案中，本发明的核酸分子的诱导受植物病原菌的介导，这些植物病原菌如本文所述的真菌(如疫霉属)，细菌(如假单胞菌属)或者病毒(如烟草花叶病毒)。在其它的优选实施方案中，这种诱导是由释放素(如真菌或细菌释放素)介导的。
在另一方面，本发明的核酸分子与编码异源多肽的核苷酸序列可操纵地连接并调节其可诱导的转录。优选该异源多肽能使植物具有抗病性。例如，异源多肽可以是释放蛋白(如疫霉属ParA1多肽等真菌释放蛋白，harpin等细菌释放蛋白或者是纤溶酶原激活物等药物多肽)。这种异源多肽的表达受一种或几种外源介质(如乙烯或甲基茉莉酮酸酯)的介导。在另外的一些实施方案中，本发明的核酸分子能以细胞特异性方式表达异源多肽。
在另一方面，本发明的特色是一种含本发明的核酸分子的载体，一种通过将该载体导入细胞(如一种转基因植物细胞)而指导多肽表达的方法，一种含该载体的细胞。
在另一方面，本发明的特色是一种向转基因植物提供抗病性的方法，这种方法的步骤包括(a)产生本发明的核酸整合到其基因组中的转基因植物细胞；及(b)由该植物细胞培养转基因植物，其中本发明的核酸分子的表达使转基因植物具有抗病性。
在优选实施方案中，根据本发明的方法的转基因植物是双子叶植物(如茄科的一个成员，如烟草属)，单子叶植物，裸子植物，或松柏类植物。
在另一方面，本发明的特色是一种增加转基因植物细胞中位于下游的DNA序列的转录表达的方法，这种方法的步骤包括(a)产生包含本发明核酸分子的转基因植物细胞，其中核酸整合到转基因植物细胞的基因组上，其插入的位置能增加下游DNA序列的转录；及(b)培养转基因植物细胞得到转基因植株。
除了上述特色之外，本发明还提供了定性的转录调节序列(可诱导的转录调节序列)，在植物组织中调节其下游基因对下列因子发生反应的表达一种或多种释放素，其它明确的诱导化合物，或者入侵的植物病原菌的胁迫，和定量的转录调节序列(转录增强序列)，它能增加其下游序列的转录。正如本文举例具体说明的，这些转录调节序列在自然界中被发现位于烟草表-5-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS4)基因的上游，并操纵性地和该基因连接；当和一段编码序列(并且存在操纵性连接的启动子元件，该启动子元件来源于EAS4基因或一个异源的可以在植物中表达的基因)操纵性地连接时，植物体或植物组织受到潜在植物病原菌(如病毒，真菌或细菌)的入侵，或者受到绿色木霉纤维素酶等释放素刺激，或者植物，植物组织和/或植物悬浮培养细胞受到植物或真菌细胞壁碎片刺激，这些序列介导该编码序列可诱导地转录表达。这种潜在的植物病原菌可以是病毒，包括但不限于烟草花叶病毒或烟草叶脉斑驳病毒；细菌，包括但不限于丁香假单胞菌，野油菜黄单胞菌或根癌农杆菌；真菌，包括但不限于疫霉属之一种(如寄生疫霉)或霜霉之一种(如烟草霜霉)。EAS4启动子包含可诱导的转录调节元件和转录增强序列，它们在本文SEQ ID NO2中列出。在SEQ ID NO2中，EAS4启动子的CAAT同源序列位于第513到516核苷酸，TATA-序列基元位于第540到543核苷酸。
烟草EAS4基因上游区可诱导转录调节元件的实例是SEQ ID NO2中458位到473位核苷酸，454位到473位核苷酸和413位到473位核苷酸。
本发明的另一方面是来自EAS4启动子和启动子相关序列的转录增强元件。该序列操纵性地连接到一个起始序列和需要表达的异源DNA序列的上游。
本发明的另一方面是经过遗传改造含有并表达目的核苷酸序列的转基因植物细胞，植物组织，植株，优选编码序列，反义序列，及其它在可诱导的转录调节元件调节之下的序列。本发明的目的之一是提供一些核苷酸序列，它们能在植物受到释放素刺激，潜在植物病原菌侵入或一些其它的外源诱导信号如甲基茉莉酮酸酯和乙烯作用时介导其下游编码序列的诱导表达。释放素可诱导的转录调节元件的实例之一来自烟草EAS4基因的5’侧翼序列；正如本文举例具体说明的，这段序列在SEQID NO2的第410位核苷酸到473位核苷酸列出。和这段示例的核苷酸序列等价的序列是那些能类似指导其下游核苷酸序列诱导表达的序列。优选该可诱导转录调节元件和EAS4启动子和启动子相关序列(如两者的组合如SEQ ID NO2中410位到573位核苷酸所示，优选SEQ IDNO2中361位到573位核苷酸，更优选SEQ ID NO2中1位到573位核苷酸)相关联。
“抗病调节元件”指的是一种能调节与植物防御反应(如超敏反应)相关的基因产物表达的DNA序列，对于自然界中的植物体而言，这种植物的防御反应用来对付病原菌。该术语也包括足以开启疾病相关的外源信号或介质(如本文所述的病原菌或释放素诱导信号或介质)诱导的基因表达的调节元件(以及如下文所述的，调节元件的片段)。总的来说，抗病调节元件位于一个基因的5’区，但并不仅限于此。
“可诱导”指一种调节元件在植物细胞和病原菌或释放素相互作用时能介导提高的基因表达(如mRNA或多肽形成)。本发明也包括以细胞或组织特异性方式指导可诱导基因表达的抗病调节元件。
“来源于一个基因”是指调节元件的核苷酸序列基于天然存在的植物基因(如烟草EAS4基因)中包括的序列信息。一旦确定，本发明的调节元件既可以从天然资源中取得，也可以通过任何标准方法(如通过重组方法或化学合成方法)制备。总的来讲，这种重组的核酸分子与天然存在的可诱导植物抗病调节元件至少有80％的同源性，即是说，标准DNA序列中高达20％的碱基对可以被其它碱基对置换(如G-C可用T-A，A-T或C-G代替)，只要改造后的序列促进转录的活性和标准序列相同或更高即可。
“可诱导的植物抗病片段”是指任何长度的核苷酸，在植物细胞和病原菌或释放素相互作用中足以指导增高的基因表达(如mRNA或蛋白质形成)。“片段”优选长度为6-10核苷酸。然而，本发明的DNA调节元件长度范围在10-100核苷酸，100-300核苷酸，甚至超过300核苷酸。这种片段通过常规方法制备(如适当的限制性内切酶消化或化学合成得到该片段)。基因中可诱导的植物抗病DNA片段的鉴定可以采用本领域的标准方法进行(如本文所述的方法)。在一个具体实例中，可诱导的植物抗病片段的鉴定可以采用标准的启动子缺失分析完成。含与报导基因可操纵地连接并使报导基因病原菌诱导转录的抗病启动子的构建体可以自5’，3’逐步缺失和/或巢式缺失，直到病原菌对于报导基因的作用减弱或消失。为了确证这种病原菌诱导性元件的鉴定，可以向该元件中引入点突变。测定转录变化的另一种方法是将推测的基因调节元件连接到报导基因上。检测完整启动子，可将该DNA片段直接置于缺少内源启动子活性的报导基因之前。通过上述技术，可鉴定任何可诱导的植物抗病调节元件片段。
“组织特异性的”指相对于另外的组织(如韧皮部)，在一种组织(如木质部)中能优先增加某种基因产物(如mRNA或多肽)的表达。
“细胞特异性的”是指相对于其它细胞(如表皮细胞)，在一种细胞(如薄壁细胞)中能优先增加某种基因产物(mRNA或多肽)的表达。
“表-5-马兜铃烯(aristocholene)合酶”或“EAS”是一种催化反，反法尼基二磷酸环化成二环中间物表-5-马兜铃烯(aristocholene)的酶。
“病原菌”是指一种侵染活的植物组织细胞，刺激该组织产生抗病反应的生物。
“释放素”指任何一种能引发植物防御反应的分子。释放素的实例包括但不限于一种或多种毒性离子如汞离子，其它化学上明确的成分，代谢抑制剂，细胞壁聚糖，某些糖蛋白，某些酶，真菌孢子，脱乙酰壳多糖，某些脂肪酸，某些植物细胞壁来源的寡糖和释放蛋白(如harpin，cryptogein，pariscein)。
“释放蛋白”是指一种蛋白质释放素。
“可操纵地连接”是指调节序列和基因以这样一种方式连接，在这种方式下，当适当的分子(如转录活化蛋白)结合到调节序列上时，调节序列允许基因表达。
“异源多肽”指任何在转基因植物细胞中由相对于转基因植物细胞部分或全部是外源的(即不是天然存在的)基因表达的多肽。
“多肽”指任何氨基酸链，可以是任意长度，可以经过翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。
“转化的植物细胞”指通过重组DNA技术(如本文所述的技术)已向其中(或其上代细胞中)导入重组的核苷酸序列(如EAS4启动子(-1147到+67)GUS报导基因或gEAS4600(环化酶)启动子parA1成熟释放蛋白基因)的细胞。
“植物细胞”指任一由半透膜包围自我增殖并含有质体的细胞。其进一步增殖也需要细胞壁。本文中植物细胞包括但不限于藻类，蓝细菌，种子，悬浮培养物，胚胎，分生区，愈伤组织，叶片，根，芽，配子体，孢子体，花粉和小孢子。
“转基因的”指任何含有人工插入其中并且成为由其发育成的机体基因组一部分的一段DNA序列的细胞。在本文中，转基因有机体一般指转基因植物，人工导入DNA到有机体的基因组中。
“基本上纯的DNA”是指没有在提供本发明DNA的有机体的天然基因组中位于该基因或调节元件侧翼的基因或辅助核苷酸的DNA。该术语因而包括如插入载体的重组DNA；插入自主复制的质粒或病毒的重组DNA；或插入原核或真核生物基因组的重组DNA；或作为独立的分子(如由PCR扩增的或限制性内切酶切割得到的cDNA，基因组DNA片段或cDNA片段)不依赖于其它序列存在的重组DNA。它也包括作为编码另外的多肽序列的杂合基因或调节元件的一部分的重组DNA。
本发明的其它特色和优点由下面的优选实施方案和权利要求的叙述中可以体现出来。
附图简述

图1所示为受EAS3和EAS4启动子区序列调节的GUS的瞬时表达数据，对照为CaMV 35S-GUS构建体(花椰菜花叶病毒35S启动子-β-葡糖醛酸酶报导基因)。通过电击法将DNA构建体导入烟草原生质体进行以上实验。“没有诱导的”EAS-GUS构建体的表达水平相对较高，这是因为在制备原生质体时用到了消化植物细胞壁的真菌酶。y轴表示GUS活性单位，EAS上游5’端中止的位置列在图中每一条块的下面。其上，标有相对于EAS4的自然转录起点(或相对应的EAS3碱基)的数目；EAS4(SEQ ID NO2)起点在核苷酸573，EAS3(SEQ IDNO2)可能的起点在核苷酸489处。
图2A-B所示为本发明的瞬时可诱导转录调节元件控制报导基因表达的信息。图2A图解说明EAS4启动子区控制GUS报导基因在稳定转化的转基因植物中表达的实验。图2B所示为EAS4启动子相关序列通过CaMV 35S最小化启动子控制GUS报导基因表达的“功能获得”方法分析结果，。在图2A和2B中，EAS4上游区核苷酸位置序数为相对于EAS4基因天然转录起始位点(也可参看SEQ ID NO2，其中转录起点对应于核苷酸573)的数目。2A和2B两图中，GUS表达活性用每毫克蛋白质的荧光单位表示。
图3A-B图解EAS4基因5’上游区DNA序列和带有EAS4启动子(-1148到+67)的GUS报导基因的结构。图3A所示为为EAS4启动子(-1148到+67)5’上游区核苷酸序列。CAAT和TATA盒用粗体表示，+1标记为转录起点。图3B图解说明EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的结构。双元载体pBI101.1中EAS4启动子(-1148到+67)5’侧翼序列和GUS报导基因按正确的阅读框连接。
图4A-B所示为在含EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草植株根，茎，叶中释放素诱导的GUS报导基因表达的数据。图4A曲线图所示为释放素诱导烟草叶片GUS报导基因在18个小时中的表达。06i，08r和09p分别代表不同的含EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草转化系。水(作为对照)和25nM cryptogein同时对称地渗入叶片(远轴部位)，然后在18个小时内取下叶片渗透区测定GUS活性。给出的实验数据为两个独立实验的平均结果。图4B是一条形图，所示为在含EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草茎和根中释放素诱导的GUS活性。03f和09p代表两个独立的转基因烟草转化系。C-0(空框)代表没有释放素处理的根段和茎段GUS活性；C-18(阴影框)和E-18(实框)分别表示用水或100nM释放素cryptogein温育18小时后的根段和茎段的GUS活性。每个转基因系取5个独立的植株计算。
图5条形图所示为转基因烟草中寄生疫霉烟草变种的生理小种0和生理小种1的病原菌诱导的GUS活性。一个含EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草系(09p)离体叶片以培养2天的寄生疫霉烟草变种菌丝药栓接种，在27℃，24小时连续荧光下培养。对照叶片以无菌的燕麦片琼脂药栓接种。测定叶片组织感染区GUS活性。每条的数值是三次独立实验的平均值和标准误(n＝5)。
图6是一条形图，所示为病原菌和释放素诱导的转基因植物GUS活性的比较，病原菌是丁香假单胞菌丁香致病变种61和它的hrpH突变体，释放素是纯化的细菌释放素harpin。含有EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草系(09-P)叶片，渗透50μg/mL纯化的解淀粉欧文氏菌释放素harpin，或丁香假单胞菌丁香致病变种61野生型或它的hrpH突变体的细胞悬液(A600＝0.05)。温育12个小时，随后检测叶片渗透区GUS活性。对照值为观测到的用水渗透处理的叶组织样品GUS活性。图中每条上的数值为5株植物所得结果的平均值。
图7A-B所示为烟草植物组织中5-表-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)诱导的Western印迹分析。蛋白样品分别从对照和释放素处理的烟草叶片，茎和根中提取。等量蛋白样品(每泳道取叶片和茎的样品25ug，取根的样品15ug)经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜。转移条带和EAS抗血清反应，然后用偶联于碱性磷酸酶的羊抗小鼠抗体显色。图7A所示为叶和茎组织样品Western印迹分析。图7B所示为根组织样品Western印迹分析。
图8A-L的彩图所示为含EAS4启动子(-1147到+67)GUS报导基因的转基因烟草中释放素诱导的GUS活性的组织化学定位。一个典型转基因烟草系叶片组织经25或50nM cryptogein释放素渗透。经过大约8小时温育后，组织切片用1mM X-gluc(5-溴4-氯3-吲哚β-葡糖苷酸)染色分析GUS活性。茎和根段经水或100nM释放素cryptogein渗透约12小时后显色。图8A彩图为含EAS4启动子(-1147到+67)GUS报导基因的转基因烟草叶片中释放素诱导的GUS活性，诱导剂为两种释放素制品cryptogein和parasicein，两者作用浓度为25nM和50nM(图中分别表示为C25，C50，P25和P50)。图8B彩图为叶片横切片图，显示cryptogein处理后释放素诱导的GUS活性(放大75X)。图8C彩图为茎横切片图，显示用cryptogein处理后释放素诱导的GUS活性(放大75X)。图8D-F三个彩图所示为图8C茎GUS染色的横切片逐步放大(分别放大15X，60X和75X)。图8G彩图所示为根尖经水处理并染色的GUS活性(放大60X)。图8H彩图为根尖纵切片，显示经cryptogein处理后释放素诱导的GUS活性(放大60X)。图8I彩图为根纵切片，显示经水处理并染色的GUS活性(放大75X)。图8J彩图所示为根经cryptogein处理后GUS活性染色的纵切片(放大75X)。图8K彩图所示为根经水处理后GUS活性染色横切片(放大95X)。图8L彩图所示为根经cryptogeoin处理后GUS活性染色横切片(放大95X)。C代表cryptogein，P代表parasicein，c代表皮层，ca代表形成层，e代表表皮，p代表栅栏薄壁组织，pe代表周皮，ph代表韧皮部，pi代表髓薄壁组织，s代表海绵薄壁组织，t代表表皮毛，x代表木质部，vc代表维管柱。
图9图示说明得到抗病植株的遗传工程操作过程。用PCR技术分离ParA1释放蛋白的编码序列，得到具有BamHI和SstI末端的序列。gEAS4600-GUS-pBI101在EAS启动子的调控下指导GUS报导基因的表达，将其用BamHI和SstI双酶切后，释放GUS片段。然后将BamHI/SstI酶切的parA1扩增引物连接到gEAS4600-GUS-pBI101消化后产生的大片段上形成gEAS4600-parA1-pBI101。经适当的释放素诱导后，植物细胞或组织通过gEAS4600-parA1-pBI101合成ParA1释放蛋白。
图10是一条形图，说明含有gEAS4600(环化酶)启动子控制的parA1成熟释放蛋白基因的转基因烟草(Nicotiana tabacum cv.KY160)的不同转基因系经离体叶片接种寄生疫霉烟草变种生理小种0或生理小种1的发病率。y轴为72小时后叶片坏死斑数目(每片叶坏死斑点数)。x轴为用于检测抗病能力的对照和不同的转基因烟草系。KY160代表没有转基因的Nicotiana tabacum cv.KY160，G代表独立的Nicotianatabacum cv.KY160转基因系，以含gEAS4600(环化酶)启动子与GUS融合的构建体转化；M代表独立的Nicotiana tabacum cv.KY160转基因系，以含gEAS4600(环化酶)启动子与成熟parA1释放蛋白编码序列融合的构建体转化；S代表独立的Nicotiana tabacum cv. KY160转基因系，以含gEAS4600(环化酶)启动子与含有一段信号肽序列的成熟parA1释放蛋白编码序列融合的构建体转化。阴影框表示以寄生疫霉烟草变种生理小种0接种离体叶片，实框表示以寄生疫霉烟草变种生理小种1接种离体叶片。
发明详述5-表-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)是诸如茄科植物中倍半萜植物抗毒素合成途径中的一个关键酶，这些植物包括但不限于烟草属的种类(如烟草)，辣椒和钝天仙子。EAS催化法呢基二磷酸形成(+)gemacrene A，生成桉叶烷碳正离子，最后形成5-表-马兜铃烯(aristolochene)，其它一些植物如松柏类植物体内也有倍半萜环化酶。
诱导植物组织或植物细胞合成植物抗毒素的宿主防御反应的物质包括疫霉属细胞壁碎片和绿色木霉纤维素酶。然而日本曲霉果胶酶不能作为烟草细胞培养物的释放素。诱导倍半萜植物抗毒素合成的释放素是在控制生物合成的关键酶转录水平上起作用的〔Vogeli和Chappell(1990).植物生理学941860-1866〕。类似的情况在其它植物中也观察到了，但是一直没有这种介导对植物病原菌胁迫的基因诱导的转录控制序列的描述。
烟草(N.tabacum)EAS家族有12-15个成员，EAS4的编码序列已经发表〔Facchini和Chappell(1992)同上〕。然而，从那时起，发明人注意到EAS3的表达似乎并不受释放素的诱导，让人感到奇怪的是，在转基因细胞培养物中EAS3上游核苷酸序列似乎不能介导嵌合基因构建体的GUS报导基因对释放素的诱导反应。要说明的是1992年Facchini和Chappell发表的文章中对于转录起点的指定并不正确。如同Facchini和Chappell(1992)上文中出现的一样，EAS4基因组克隆的核苷酸序列列出在SEQ ID NO7，推断的氨基酸序列列出在SEQ IDNO8。
植物对植物病原微生物的侵入和感染的防御的其它方面包括超敏反应，其标志是组织坏死，即植物病原菌感染处的植物细胞发生程序性细胞死亡。上面所描述的释放素处理也能诱导坏死反应。
释放蛋白是植物病原真菌产生的一种蛋白质，能诱导被侵染的植物发生超敏反应。通常，但并不是必然地，定点细胞死亡是在被感染(或胁迫)的植物组织中释放蛋白诱导反应的结果。这些反应介导对入侵的，潜在植物病原微生物破坏性感染的完全或部分抗性。从本发明的目的来看，在入侵植物组织或在植物组织中表达其编码序列后诱导超敏反应的植物病原菌或潜在植物病原菌的蛋白质，属于释放蛋白的广义定义之列。
了解相对清楚的植物病原真菌释放蛋白是寄生疫霉的ParA1蛋白。parA1基因座是一种基因家族中的一员[Ricci等，1989欧洲生物化学杂志(Eur J.Biochem.)183555-563]。parA1基因产物的核苷酸序列和氨基酸序列由Kamoun等人(1993)在植物-微生物相互作用分子生物学(Mol. Plant-Microbe Interact.)4423-432上公布，在本文SEQID NO12和SEQ ID NO13中列出。
其它具有潜在释放蛋白活性的植物病原菌蛋白的氨基酸序列和其它性质已经鉴定[参见，如Nespoulous等(1992)植物(Planta)186551-557；Huet等(1992)植物化学(Phytochemistry)311471-1476；Huet和Pernollet(1992)FEBS通讯(FEBS Lett)257302-306；Kamoun等(1993)植物-微生物相互作用分子生物学(Mol Plant-Microbe Interact)522-33]。一些具有释放蛋白反应活性的病原细菌的无毒基因也被鉴定，例如Keen N.T.(1990)在植物病理学年评[(Annu.Rev. Phytopathol.)24447-463]中描述了Fulva fulvia的一个无毒基因。Hammond-Kosack等(1994)在美国科学院院刊(Proc.NatlAcad.Sci USA)9110445-10449中报导了暗黄枝霉的avr基因，其功能与寄生疫霉释放蛋白相同。
一些细菌性植物病原菌也表达对超敏反应的效应类似于寄生疫霉ParA1释放蛋白的蛋白质。从本发明的目的来看，这些蛋白质属于“释放蛋白”范围。野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种无毒基因avr Bs3的多个同源物也存在于其它的野油菜黄单胞菌致病变种[Bonas等(1989)分子发生遗传学(Mol.Gen.Genet.)218127-136；Knoop等(1991)细菌学杂志(J.Bacteriol.)1737142-7150]和黄单胞菌属的其它种类中[De Feyter和Gabriel(1991)植物-微生物相互作用分子生物学(Mol.Plant-Microbe Interact.) 4423-432；Hopkins等(1992)植物-微生物相互作用分子生物学(Mol.Plant-MicrobeInteract)5451-459]。丁香假单胞菌番茄致病变种的avrD具有无毒基因作用；丁香假单胞菌大豆致病变种表达一个改变的avrD产物[Kobayashi等(1990)植物-微生物相互作用分子生物学(Mol.Plant-Microbe Interact.)3103-111]。
可以理解，使用病原菌反应性转录调节元件(并具有在这些植物中有功能的最小化启动子)调控之下表达的释放蛋白编码序列产生具有提高的抗病性的转基因植物时，释放蛋白必须能够促进这些植物中防御基因(包括但不限于那些控制植物抗毒素合成的基因，控制超敏反应的基因和/或控制定点组织坏死的基因)的表达才对本发明有用。本领域中已发现植物和植物病原菌的许多功能性组合，本领域的技术人员知道如何检测特定释放蛋白在特定的植物组织(或细胞)中启动程序性细胞死亡或植物抗毒素合成或类似过程中的功能。也可以理解，用某些真菌纤维素酶或植物多糖片段等成分处理植物细胞或组织能诱导宿主防御反应(即超敏反应)。这些处理已经作为研究实际病原菌攻击或入侵的模型。
非自然产生的重组核酸分子，如重组DNA分子，是一种自然界没有的分子，即是说，它是经过本领域已知的方法由天然过程产生的，但是在人为控制之下以产生所需结果或其是由来源于异源体的部分人工产生的，这些部分可以是自然产生的，或是化学合成的分子或由此产生的分子的一部分，并且这些部分通过连接或本领域中已知的其它方法组合。
转基因植物是一种被遗传改造的植物，它含有并表达异源DNA分子，或者作为调节RNA分子或者作为蛋白质分子。正如本文举例说明的，转基因植物经过遗传工程改造，含有并表达异源DNA分子，该异源DNA分子可操纵地连接到正常情况下不调节该异源DNA分子的转录调控序列的下面并受其调控，即处于烟草EAS4基因的可诱导转录控制序列的调节控制下。在本文中，转基因植物也指由原始转基因植物产生的后代，原始转基因植物带有异源编码序列并能在本文所描述的定性的和/或定量的转录调节序列的调节控制下表达该序列。带有转基因胚胎的种子也包括在该定义之中。
当目的异源基因或编码序列需要在可能的病原菌入侵或诱导剂(如释放素)处理时表达，这种编码序列就要以有义方向可操纵地连上适合的启动子，同时由与启动子作用方向相同的可诱导调节序列调控，有义(即具有翻译功能)mRNA才能产生。在植物细胞内作用的转录终止信号可以置于编码序列的下游，在植物中表达的选择性标记可共价连接于可诱导的表达单元，使得该DNA分子转化到植物细胞或组织，其存在可以被筛选出来，没有转化外源DNA的植物细胞或组织就会被杀死或出现生长障碍。同样地，转基因植物细胞悬浮培养物中，异源编码序列可以在可诱导的转录调节元件或转录增强元件的调控下表达，加入释放素到细胞培养基中会诱导这种表达。
要在植物受到微生物病原菌，如植物病原真菌，入侵时抑制一个基因的表达，可以将该基因部分或全部编码序列或cDNA序列可操纵地连接于能在植物细胞中作用的启动子，其方向和启动子方向相反(即按反义方向连接)，这样转录RNA序列和mRNA互补，病原菌入侵诱导表达反义分子。另外，可在指导反义RNA合成的核苷酸序列下游处加上转录终止信号。
发明人已分离到一段DNA序列，在植物细胞受到潜在植物病原菌入侵和/或释放素或其它化学信号处理时，介导其下游基因的诱导表达。例如，乙烯和甲基茉莉酮酸酯联合作用可以通过定性的转录调节元件诱导其下游基因表达。现在已经很清楚，在该调节序列中可能存在多个序列基元，每个基元对应于一个或几个不同的环境信号。如本文举例具体说明的，该转录控制序列来源于烟草EAS4基因座，在SEQ ID NO7中列出。推测的EAS蛋白氨基酸序列在SEQ ID NO8中列出。EAS4基因的开放阅读框在SEQ ID NO7中列出，它包含有6个内含子。
用计算机在Genbank中检索，没有发现和SEQ ID NO2明显同源的序列。
Facchini和Chappell(1992，同上)用EAS探针和Southern杂交实验鉴定了烟草EAS基因的组织结构。在严格杂交条件下，出现了多个杂交片段，显示出烟草基因组中EAS是有12-16个成员的家族。但是，在这些实验中，用作探针的片段包括EAS编码序列，而不包括启动子或启动子相关序列。
用判断核苷酸序列同源性显著程度的方法，能在烟草以外的植物中鉴定并分离EAS同源基因，即是说，在中等至严格杂交条件下，和烟草EAS编码序列探针进行DNADNA杂交即可鉴定其它植物种类中的相应基因。对杂交条件的讨论见Hames和Higgins(1985)核酸杂交(Nucleic Acid Hybrdization，IRL Press，Oxfbrd U.K.)。一般来说，在中等杂交条件下能检测到的杂交，说明两序列之间至少有70％的核苷酸同源性。在这些情况下，一般优选至少100个碱基的序列作为探针。本实验条件下，最优选探针来源于EAS4编码序列的一部分。对于杂交探针的标记可包括但不限于同位素基团，萤光基团，结合有特异结合的配偶体(其也被标记)的配体如生物素。正是通过标记可以检测到结合到靶核酸分子上的探针。或者，熟知的广泛采用的聚合酶链反应(PCR)技术可以方便地扩增和靶序列有高度同源性的序列。
现在已经知道，除SEQ ID NO7中列出的EAS编码序列以外，还存在其它的核酸序列，其编码序列和EAS4编码序列是功能上同义的。如果核酸序列编码的蛋白质氨基酸序列相同，这两个核酸序列是同义序列。遗传密码的简并性是本领域所熟知的，即许多氨基酸，不止有一个编码它的核苷酸三联体。在蛋白质序列中一些氨基酸的替换并不影响该蛋白质的功能，这也是生物学领域所熟知的。总的来说，保守氨基酸替换或相似氨基酸替换在不影响蛋白质功能时是可以忍受的。相似氨基酸指氨基酸具有相近的大小和/或电荷性质，如，天冬氨酸和谷氨酸，异亮氨酸和缬氨酸都是相似的氨基酸对。本领域中两个氨基酸之间的相似性可以用多种方法进行分析。例如，在此引作参考的Dayhoff等(1978)的《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of Protein Sequence and StructureVol. 5 Suppl.，3pp345-352)中提供了一个氨基酸替换频率表，利用表中数据可以判断氨基酸之间的相似性。Dayhoff等的频率表是通过比较多种不同进化来源的相同功能的蛋白质的氨基酸序列得到的。
萜烯环化酶基因存在于茄科植物，包括本文公开的烟草和钝天仙子，也存在于唇形科(Labitaceae)和大戟科植物，包括但不限于那些被证明含有高度同源序列的植物，也存在于绝大多数植物。优选EAS4同源物选自茄科。这些序列的鉴定可以通过下列方法进行核酸分子杂交，或在待测序列克隆到表达载体中时，通过与烟草EAS特异抗体交叉反应，或采用本领域已知的其它方法，包括使用相应于SEQ ID NO7中的寡核苷酸序列进行PCR，优选采用EAS编码序列。采用Vogeli等[1990，植物生理学(Plant Physiol).93182-187]的方法纯化出EAS免疫实验动物可以制备抗体，或使用肽结合物制备抗体，其中该肽的氨基酸序列来自EAS氨基酸序列(SEQ ID NO8)的亲水部分。在本领域中单克隆抗体和多克隆抗体制备技术方便可行[参见Campbell(1994)，单克隆抗体技术，生物化学和分子生物学的实验室技术(Monoclonal AntibodyTechnology.Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology)，第十三卷Burdon和Knippenberg编Elsevier，Amsterdam；Harlow和Lane(1988)，抗体实验室手册(AntibodiesA LaboratoryManual)，冷泉港实验室，冷泉港(纽约)]。
或者，cDNA文库(在表达载体中)可以用EAS特异性抗体筛选，或者EAS肽特异性抗体可使用EAS蛋白的亲水区的肽序列(SEQ IDNO8)和本领域中相关的成熟技术制备。
专业技术人员知道可诱导的转录调节序列可以可操纵地连接于任何能在植物中作用的启动子；其中调节元件和启动子偶联，通常所用启动子为截短的(或最小化)启动子，例如截短的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。截短形式的其它组成性启动子也用来提供CAAT和TATA同源区；这些启动子序列可由一些基因衍生而来，如根癌农杆菌TDNA基因(如nos，ocs和mas)和植物病毒基因如CaMV19S基因。可以理解专业技术人员的目的是确定用于可诱导转录调节序列的特定启动子。也可以理解当一个能诱导细胞死亡反应的蛋白的要表达时，优选在没有诱导因子存在时，没有基本转录(和翻译)表达。可诱导基因产物对于产生它的植物细胞没有明显的毒性时，在应用这种基因表达时，尽量减少基本表达量就不是很重要。
最小化启动子含有RNA聚合酶结合和转录起始必需的DNA序列信号。对于RNA聚合酶II启动子，它有一个TATA同源序列基元位于转录起点上游约20-50bp处，一个CAAT同源序列基元位于转录起点上游约50-120bp处。专业人员习惯于用核苷酸数目表示位置，即从转录起点开始向上游(5’方向)逐渐增加。通常，最小化启动子控制的转录水平比较低，对于植物组织受到的环境信号或发育信息没有正的或负的反应。一个适合于植物的最小化启动子的实例是截短的CaMV 35S启动子，它由35S基因的-90到+8区段组成。
可诱导转录调节序列(定性的转录调节序列)位于EAS4基因相对于转录起点的-167到-100区段(在SEQ ID NO2中的核苷酸406-473，转录起点位于573核苷酸处)。可以理解，可能有多个序列基元能对特定的刺激发生反应。将该序列可操纵地置于在植物细胞中有功能的最小化启动子的上游，就可使可操纵地融合于启动子下游的编码序列，如异源编码序列可诱导地表达。专业技术人员懂得编码序列翻译表达必要的空间及其它条件。这种异源编码序列优选是植物病原微生物(如病毒，细菌或真菌)释放蛋白样的蛋白质编码序列，如寄生疫霉parA1基因产物(释放蛋白)的编码序列，其中需要通过对入侵的潜在植物病原菌的超敏反应的抗病性。一些植物病原细菌的harpin蛋白也能作为EAS4衍生的可诱导转录调节序列介导的表达的诱导物，加入EAS4基因另外的5’侧翼序列能增加下游基因的表达水平。优选使用EAS4序列-266到+1区(SEQ ID NO2核苷酸307到573)，更优选的序列包括-567到+1(SEQ ID NO2核苷酸1到573)。
和融合EAS4转录调节序列和异源最小化启动子等效的方法是使用与上游的启动子相关调节元件结合的EAS4启动子区。这样应用时，可用核苷酸307到463，为更大程度地调节下游序列的转录，更优选SEQID NO2中核苷酸371到463，311到462，10到573。
象烟草这样的植物中，瞬时的可诱导转录调节元件在植物病原菌入侵或一些成分如真菌纤维素酶和一些植物和真菌细胞壁碎片处理时介导下游基因表达的诱导。能开启这种表达的植物病原菌包括但不限于黄单胞菌属，丁香假单胞菌，疫霉属的种类包括寄生疫霉，和霜霉属的种类(如烟草霜霉)。
将适合于植物中表达的编码序列可操纵地置于调节启动子构建体下游。可用嵌合基因构建转基因植株，嵌合基因基本上由调节启动子，任何其它的转录增强序列，带有翻译必需信号序列的所需编码序列。其中抗病性最好在转基因植物组织受到潜在植物病原菌侵害或用释放素或其它能诱导EAS4基因表达的化学信号处理时诱生。编码序列优选编码植物病原微生物的释放蛋白，如寄生疫霉的parA1基因产物[如同Kamoun等所述(1993)，同上]。其它释放蛋白样蛋白在普通科学文献中有报导，包括来源于疫霉属，霜霉属和黄单胞菌属的种类以及其它种类的蛋白。
其它可以在目前的可诱导转录序列调控下表达从而增强(转基因)植物或植物组织对于植物病原病毒，细菌和真菌的抗性的编码序列包括但不限于几丁质酶，TMV壳蛋白或其它植物病毒壳蛋白，NIa病毒基因等。
另外，或可选择地，调节性构建体的诱导性可以被诱导，例如用释放蛋白或病毒，细菌或真菌(优选不是宿主植物病原菌)处理转基因植物或组织，这些处理物质能通过不能开启HR的编码序列的可诱导转录调节元件诱导表达，或者直接获得抗病性状。这些可以优先表达的编码序列包括杀虫蛋白如苏云金芽胞杆菌晶体蛋白之一种，其表达能使植物免于有害昆虫的伤害。
由天然EAS4基因合成植物抗毒素或由本发明的调节性EAS4启动子或可诱导转录调节元件与至少一种外源最小化启动子结合介导的基因表达诱导合成植物抗毒素，可通过使用多种明确的化学品、粗真菌培养物滤液、真菌细胞壁提取物和来自植物或真菌细胞壁的寡糖处理植物组织或细胞来诱导〔Albersheim和Valent(1978)细胞生物学杂志78627-643〕。能够诱导HR的其它化合物包括某些纤维素酶，如绿色木霉纤维素酶和某些植物或真菌细胞壁的碎片等。
转基因植物可以由本领域已知的任何方法得到，这些方法包括但不限于根癌农杆菌介导的DNA转移，优选用没有攻击力的T-DNA载体，电击法，DNA直接转移和粒子轰击法[参见Davey等(1989)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，13275，Walden和Schell(1990)，欧洲生物化学杂志(Eur J.Biochem.)，192563，Joersbo和Burnstedt(1991)，植物生理学(Physiol.Plant)，81256；Potrykus(1991)，植物生理学及植物分子生物学年评(Annu.Rev Plant Physiol Plant Mol.Biol.)，42205；Gasser和Fraley(1989)，科学(Sci.)，2441293；Leemans(1993)，生物技术(Bio/Technology)，11522；Beck等(1993)，生物技术(Bio/Technology)111524；Koziel等(1993)生物技术(Bio/Technology)，11194；和Vasil等(1993)生物技术(Bio/Technology)，111533]。将DNA导入双子叶和单子叶植物的技术在本领域中已经比较成熟，同样培养和再生这些植物组织的技术也十分成熟。包括小麦，玉米，大麦，水稻和天门冬属植物的单子叶植物已经成功地转化和再生。例如美国专利号5,350,689(1994，Shillito等)描述了转基因玉米由原生质体和原生质体衍生细胞的再生。为了有效地产生转基因植物，用具有较高再生能力的植物组织来转化是十分重要的。转基因山杨组织已经获得并再生出转基因植株(Devellard等(1992)C.R.Acad.Sci.Ser VIE 314291-298K；Nilsson等(1992)转基因研究(Transgenic Res.)1209-220；Tsai等(1994)植物细胞报告(Plant Cell Rep.)1494-97)。杨树也已经转化成功[Wilde等(1992)，植物生理学(Plant Physiol)98114-120]。实验室操作，转化和再生裸子植物的技术也已成功。例如美国专利号5,122,466(1992，Stomp等)描述了松柏类植物的生物导弹法转化，优选的靶组织为分生组织，子叶和下胚轴。美国专利号5,041,382(1991，Gupta等)描述了松树胚性细胞的富集方法。
转化外源DNA到植物细胞和/或组织和筛选阳性群体的技术及试剂已广为人知。筛选植物细胞中外源DNA的遗传标记已众所周知，如带有抗生素抗性的基因，抗生素如卡那霉素，潮霉素，庆大霉素或博来霉素等。这些标记使得筛选在含有适当抗生素的培养基上正常生长的转化植物细胞成为可能，因为它们带有相应的抗性基因。
其它采用表达盒的植物细胞和/或组织遗传操作方法包括以下步骤先融合可诱导启动子或嵌合启动子和异源编码序列以及转录终止序列，将融合基因通过农杆菌介导，电击，微注射，粒子轰击法或其它本领域中已知的方法转化到植物细胞或组织。表达盒最好还包括在植物细胞中选择异源DNA的标记，如带有抗生素抗性的基因，抗生素如卡那霉素，潮霉素，庆大霉素或博来霉素。
转录调节序列，尤其是可诱导的转录调节序列(或具有可诱导的和优选转录增强序列的EAS4启动子)对于控制悬浮培养的转基因植物细胞基因表达是十分有用的，植物细胞悬浮培养物表达作为转基因植物体表达的替代物。例如，含有转录起始信号，可诱导的转录调节元件和转录增强元件的EAS4启动子可用于介导一个或几个异源编码序列在悬浮培养的转基因植物细胞中的表达。需要时，可以加入释放素或其它诱导性化学信号物质到培养物中诱导目的编码序列表达。悬浮培养细胞对于释放素的反应确实可以同完整植株相比较。异源编码序列编码的蛋白质能介导药物化合物的合成，如聚β-羟基丁酸合成或其它次生代谢物，纤维素，淀粉，糖，油脂，或者该异源序列也编码药物蛋白，杀虫毒蛋白，抗真菌蛋白，抗病毒蛋白(如调节抗病毒感染的壳蛋白)，Nla蛋白，几丁质酶，葡聚糖酶，雄性不育蛋白或序列，改善营养成分质量或含量的蛋白，或涉及发育和/或组织特异程序或型式的蛋白。可以理解，转基因植物和转基因植物细胞一样可以用于表达异源编码序列。
转基因植物被诱导合成植物抗毒素或表达处于EAS4启动子或由EAS4启动子衍生而来的可诱导转录调节元件和/或EAS4启动子衍生的转录增强序列调控之下的异源编码序列时，释放素必须穿过植物角质层才能发挥作用。或者使植物组织形成伤口，从而易于或允许吸收释放素到其内部。各种各样的诱导成分，包括释放素和其它化学信号，如乙烯和甲基茉莉酮酸酯组合，都能有效地吸收到转基因植物悬浮细胞培养物内，这种培养物对于释放素的吸收和/或感受很少有障碍。乙烯和甲基茉莉酮酸酯诱导基因表达时，乙烯的使用浓度为约1-50ppm，甲基茉莉酮酸酯使用浓度为约0.1mM到1mM。
下述实施例运用了多种技术，这些技术对分子生物学，在植物组织中进行重组DNA操作和转基因植株再生培养领域的技术人员是熟知易行的。所用的酶均是商业化产品，根据生产者的说明或作一些本领域所熟知的修改后使用。试剂，缓冲液和培养条件均是本领域已知的。提供标准的分子生物学操作指南的参考书有Sambrook等(1989)分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港实验室，Plainview；NY；R Wu编辑(1993)酶学方法(Methods in Enzymology)，218；Wu等编辑酶学方法(Methods in Enzymology)，100和101；Glover编辑(1985)DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和II，IRL出版社Oxford，UK；Hames和Higgins编辑(1985)核酸杂交(Nuceic Acid Hybridization)，IRL出版社Oxford，UK。有关操作，转化植物组织的参考资料有R.A.Dixon(1985)编辑植物细胞培养实践方法(Plant Cell CultureA Practical Approach)，IRL出版社，Oxford，UK，Schuler and Zielinski(1989)植物分子生物学方法(Methods in Plant Molecular Biology)，Academic出版社，San Diego，CA；Weissbach and Weissbach(1988)编辑植物分子生物学方法(Methods in Plant Molecular Biology)，Academic出版社，San Diego，CA；I Potrykus(1991)植物生理学及植物分子生物学年评(Annu RevPlant Physiol.Plant Mol.Biol.)，42205；Weising等(1988)遗传学年评(Annu.Rev.Genet.)22421；van Wordragen等(1992)植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Rep)1912；Davey等(1989)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)13273；Walden and Schell(1990)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)192563；Joersbo and Brunstedt(1991)植物生理学(Physiol.Plant)81256和其它前面所提到的文献。所采用缩写和名称均被本领域视为标准用法并普遍地用于所引用的专业期刊上。
本申请所有引用的文献在此引作参考。
下述的实施例只是对本发明加以说明，并非有意限制本发明的权利要求范围。专业技术人员对列举的成分和方法的任何变动都在本发明的范围之列。
实施例实施例1 EAS特异抗体烟草EAS特异性单克隆和多克隆抗体按Vogeli等(1990)[植物生理学(Plant Physiol.)93182-187]所述方法制备。另一种制备多克隆抗体的方法是利用纯化的EAS作为抗原或用众所周知的方法将多肽序列接上一个载体蛋白作为抗原。用于抗体制备的氨基酸序列选自蛋白质上一段特异的亲水区(关于抗体制备技术，可以参看Campbell(1994)，单克隆抗体技术，生物化学及分子生物学实验室技术(MonoclonalAntibody Technology，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology)，Vol.13 Burdon和Rnippenberg编辑Elsevier，Amsterdam；Harlow和Lane(1988)抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港NY)。
实施例2 DNA和蛋白质序列测定单链和双链DNA序列测定使用双脱氧链中止法[Sanger等(1977)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)748073-8077]，采用美国生物化学公司(Cleveland，OH)测序试剂盒或荧光自动测序系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
实施例3全长EAS克隆的构建终浓度0.5ug/mL的绿色木霉纤维素酶(Type RS，Onozuka)处理处于快速生长期的N.tabacumL.cv.KY14细胞悬浮培养物，诱导EAS表达。设置同样的细胞悬浮培养物，不加纤维素酶作为对照。加入纤维素酶释放素到诱导的培养物中4小时后，用温和真空过滤法收集细胞。
由释放素处理4小时后的烟草细胞提取PolyA+RNA，用pcDNAII(Invitrogen，San Diego，CA)构建cDNA文库。采用示差杂交法使用由诱导和对照材料提取的PolyA+RNA筛选文库。进一步用筛选杂交选择-体外翻译-免疫沉淀法分析所得阳性克隆，该方法见Alwine等(1979)酶学方法(Methods in Enzymol)，68220-242。
推测的阳性EAS cDNA克隆作为杂交探针分离其它cDNA和基因组克隆。所筛选的基因组文库是用N.tabacumL.cv.NK326下胚轴DNA经MboI部分酶切后在λEMBL3中构建(Clonetech Palo Alto，CA)。这样筛选出8个独立克隆，每个分别代表一个不同的染色体基因座。EAS4和EAS3基因组克隆由Facchini和Chappell(1992，同上)发表，现在知道它并不是完整序列。
Facchini和Chappell(1992，同上)当时错误地鉴定此处所述的基因组克隆中EAS3和EAS4编码序列的起点。EAS3和EAS4编码序列正确的翻译起点被确定为位于原先鉴定的起点ATG上游165bp处的蛋氨酸密码子。EAS4的正确起点是用鉴定转录起点的引物延伸法和如上述的纯化酶的额外N-端氨基酸序列信息共同得到的。
通过聚合酶链反应制备110bp扩增引物，以提供对应于EAS4蛋白56-92位氨基酸[见SEQ ID NO12和Facchini和Chappell(1992)同上]的DNA序列。此扩增引物作为杂交探针在pcdNAII(Invitrogen，San Diego，CA)中筛选cDNA文库，该文库来自于释放素(绿色木霉纤维素酶)处理4小时的烟草细胞培养物的PolyA+RNA。获得该扩增引物所用的引物为有义引物(ATGCTGTTAGCAACCGGAAGG，SEQ ID NO3)；反向引物(ATCCAAAATCTCATCAATTTC；SEQ ID NO4)；扩增模板为基因组EAS4，进行标准PCR扩增[Saiki等(1988)科学(Science)239487-491]，110bp扩增引物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后用DE-81滤纸(Whatman International，Inc.Clifton，NJ)分离。分离的片段随后采用随机引物标记试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)以[α-32P]-dCTP标记，作为杂交探针筛选上述cDNA文库粗筛克隆[Hanahan和Meselson(1980)，基因(Gene)1063-67]。这些实验所得的最长的片段似乎也缺少5’端编码区的80bp。
为了得到全长的克隆，采用RT/PCR方法。由经释放素诱导后的烟草细胞制备的PolyA+RNA合成第一链cDNA[Facchini和Chappell(1992)，同上]，采用的反向引物为ATGAGTCCTTACATGTGA(SEQ ID NO5)。该序列对应于翻译起点下游的459-477核苷酸。逆转录反应体积为10ul(1ug PolyA+RNA，25pmol反向引物，10mM DTT，dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mM，8单位RNase Block[(Stratagene，La Jolla，CA)，根据商家(Stratagene)提供的说明使用第一链合成缓冲液，37℃反应1小时。99℃处理5分钟终止反应。加入40μl主PCR混合物到第一链反应中，主PCR混合物含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％Tween-20，0.01％(W/V)明胶，0.01％NP-40，2.5mM各种dNTP，1单位TaqI聚合酶，25pmol正向引 物(GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGCAGTTGCAAACTAT，SEQ ID NO6，EcoRI和NcoI识别位点用下划线标出，ATG转录起点用粗体标出)。PCR反应在标准条件下进行[Back等(1994)，生物化学和生物物理杂志(Arch.Biochem.Biophys)315523-532]。
492 bp扩增产物用EcoRI和HindIII消化后，亚克隆到同样消化的载体pBluescript SK(Stratagene)上。来自另一个部分消化的cDNA克隆的HindIII/XhoI片段克隆到5’端序列克隆的相应位点，形成一个全长cDNA克隆，命名为pBSK-TEAS。用pBSK-TEAS DNA使用CaCl2法〔Sambrook等(1989)同上〕转化大肠杆菌TB1。插入片段的序列分析证实该质粒具有预期和期望的结构(双脱氧链终止法，美国生物化学公司，Cleveland，OH)。
实施例4 EAS同源序列的鉴定。
按Murray和Thompson(1980)所述的方法[核酸研究(NucleicAcids Research)84321-4325]分离烟叶基因组DNA。用适当限制酶消化样品后，消化的DNA样品采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，按大小分离的DNA分子转移至尼龙膜上。用随机引物放射标记的cEAS1对DNA印迹进行杂交，cEAS1在编码序列的5’端截断[按Sambrook等(1989，同上)方法制备]，杂交在60℃下进行，杂交体系为0.25M磷酸钠缓冲液pH8.0，0.7％SDS，1％牛血清白蛋白，1mM EDTA。杂交膜在45℃下以2 X SSC，0.1％SDS洗两次，；在0.2XSSC，0.1％SDS中洗两次，(1 X SSC为0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠pH7.0)。相对杂交水平用图像测密计(MilliGen/Biosearch，Ann Arbor，MI)测定放射自显影图确定。
Facchini和Chappell(1992，同上)曾报导Southern杂交显示烟草基因组EAS同源体有12-16拷贝。为了证实大量的烟草EAS同源序列的存在，和这些序列在每个基因组的表观数目，使用从其它植物中分离的DNA进行Southern杂交分析。
经限制性内切酶消化后基因组DNA经琼脂糖电泳(0.8％琼脂糖)分离后，转移至Hybond-N+膜(Amersham Corp，Arlington Heights，IL)上。含EAS编码序列的探针经同位素标记，杂交基本上按Sambrook等(1989，同上)方法进行。采用中等强度杂交条件(4×SSC，65℃)，最后一次漂洗用1×SSC，65℃。
或者，采用熟知的方法进行PCR，用靶DNA作为模板，反应引物来自EAS4编码序列中高度保守区(见SEQ ID NO7)。
实施例5 EAS蛋白的检测采用Facchini和Chappell(1992，同上)和Back等(1994)[生物化学和生物物理杂志(Arch.Biochem.Biophys.)315527-532]的方法可以鉴定表达产物是否有酶的活性。
检测EAS交叉反应蛋白的存在，先提取总蛋白质，100ul细菌培养物于微量离心机上离心2分钟收获并浓缩。去掉上清液，菌体沉淀重新悬浮于100ul 50mM Tris-HCl，pH6.8，10mM二硫苏糖醇，2％十二烷基硫酸钠，0.01％溴酚兰，10％甘油，取15ul样品经11.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行免疫测定。35ul样品同样电泳后用于考马斯亮蓝染色。对可溶性蛋白样品分析，细胞如测定酶活性的方法同样处理(见Back等(1995)，同上或Facchini和Chappell(1992)同上)。取10ul按上述方法电泳后作免疫测定，10-50ul样品电泳后进行考马斯亮蓝染色。
样品电泳后蛋白以考马斯亮蓝色，或如文献〔见Towbin和Gordon(1984)免疫方法杂志72313-340〕所述将蛋白转移至硝酸纤维素膜，进行免疫测定。5％低脂牛奶(用lXTBS配制，TBS20mMTris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠)温育30分钟，硝酸纤维素膜在含抗烟草EAS的单克隆抗体[1∶1000稀释，Vogeli等(1990)植物生理学93182-187]的同样缓冲液中温育过夜，羊抗小鼠抗体连接于碱性磷酸酶，专门的显色剂随后进行温育以显示EAS特异抗体与固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的结合[Leary等，1983，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci USA)，804045-4049]。
实施例6基因组EAS4克隆。
Facchini和Chappell(1992，同上)所述的5’截短的cDNA克隆cEAS1作为杂交探针，筛选用λEMBL3载体(Clontech，Palo Alto，CA)构建的N.tabacumcv.NK326基因组文库，采用常规亚克隆和DNA序列分析方法测定DNA序列。
EAS4基因组克隆DNA序列和由此推出的氨基酸序列列于SEQ IDNO7-8。
实施例7转基因植物的产生为了分析EAS4基因上游非翻译区部分的功能，DNA上游HindIII/Bam HI片段克隆到质粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)中，这样能监视转基因植物细胞中β-葡糖醛酸酶(GUS)报导基因的表达。EAS3基因的5’侧翼序列列出在SEQ ID NO1中，EAS4基因的5’侧翼序列列出在SEQ ID NO2中。上述这些序列中翻译起始位点(ATG)是最后三个核苷酸。通过引物延伸技术，EAS4转录起点估计在SEQ ID NO2的573核苷酸处，CAAT盒和TATA盒基元分别标记在SEQ ID NO1的429到432和456到459核苷酸处(EAS3)，在SEQ ID NO2的513到516和540到543核苷酸处(EAS4)。
采用修改的根癌农杆菌转化技术转化得到转基因植物细胞系。含有待导入植物组织的DNA的重组质粒通过和大肠杆菌TB1(pBK2013)进行三亲交配，转移至根癌农杆菌菌株GV3850。处于不同生长阶段的烟草叶片切成1cm2大小，浸入农杆菌悬液中(大约104到105细菌/ml)。3-10分钟后，用无菌水漂洗小叶片，除去多余的农杆菌，以减少在处理叶片中由于多余细菌生长带来的问题。经过短暂干燥(30-60秒)后，处理叶片放在没有加抗生素的植物组织培养基上，促进叶片感染和DNA从细菌到植物组织的转移。每升植物组织培养基含有4.31gMurashige和Skoog基础盐混合物(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)，2.5mg苄胺基嘌呤(溶于1N NaOH)，10ml 0.1mg/mL吲哚乙酸溶液，30g蔗糖，2mL Gamborg's维生素溶液(Sigma Chermical Co，St.Lousis，MO)和8g琼脂。pH用NaOH调节在5.5到5.9之间，两天后，叶片转移至含有300ug/mL卡那霉素，500ug/mL噻吩甲氧头孢菌素(Merck，Rahway，NJ)的植物组织培养基上，卡那霉素用于筛选转化植物组织，噻吩甲氧头孢菌素用于抑制农杆菌生长。
转化过程中尽量减少外植物接触农杆菌的时间，从而避免在产生转基因植物细胞过程中调节性parA1编码序列诱导表达，一旦ParA1表达，会导致细胞死亡反应。相应地，将含可诱导的转录调节元件控制下的细胞自杀基因的异源DNA导入到植物细胞的生物导弹法，是另一种很实用的转化技术，因为它不需要用农杆菌细胞或真菌细胞壁降解酶(它们用于产生原生质体，供电击转化)，这两者可以诱导在调节元件控制下的编码序列。
转基因植物的再生基本上按Horsch等(1985)[科学(Science)2271229-1231]所述方法进行。
得到的转基因植株在没有诱导(对照)和诱导处理条件下，如Jefferson等[1987，EMBO J.63901-3907]所述，用5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸来检测β-葡糖醛酸酶(GUS)报导基因的表达。诱导条件是在转基因烟草组织胞外施用绿色木霉纤维素酶[用自动加样器加入50-100ul或10-100nM蛋白(如cryptogein)诱导成分至间质组织]，对照不用纤维酶释放素，但要进行同样操作。在一些实验中，用刀片划开烟草组织，以利于诱导化合物进入细胞。
实施例8启动子和启动子相关区的缺失分析在其它反应中，包含于相对于转录起点-567到+67序列(SEQ IDNO2 EAS4核苷酸6到642)的EAS4衍生DNA序列替换GUS报导基因载体pBI221(Clonetech，Palo Alto，CA)中的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子〔Benfey等(1990 EMBO Journal)，91677-1684〕。EAS4上游区的缺失突变体用限制性内切酶处理后分离。在电转移的烟草细胞原生质体(图1)和稳定的烟草转化系(图2A和表1)中对gEAS启动子-GUS构建体进行了分析。瞬时表达的初步数据表明SEQ ID NO1对释放素诱导性没有作用，SEQ ID NO2在调节基因表达中起作用。
各种EAS3和EAD4启动子-GUS报导基因构建体导入烟草原生质体，基因瞬时表达数据列出在图1。从EAS4启动子5′端逐步缺失导致表达水平的降低，但-262，-202和-110构建体(相对于SEQ IDNO2转录起点573核苷酸处)保持诱导性。这些数据表明用两种EAS3启动子区构建体，GUS表达水平很低。同样，只用CaMV 35S启动子时，释放素处理没有诱导效果。
图2A-2B的数据显示，缺失-567到-160区段遗传物质能降低下游基因表达水平，但并不能破坏表达的诱导性。因此，-567到-160之间DNA片段似乎有转录增强活性。大多数转录增强活性表现在-567到-212区段，但也有一些增强活性受相对于转录起点-212到-160区段介导(在SEQ ID NO2中，转录起点是核苷酸573，-567是核苷酸1，-212是核苷酸361，-160是核苷酸413)图2B所示的功能获得试验数据显示，介导对释放素处理的诱导反应必需的DNA序列在相对于EAS4转录起点-160到-87之间，(即SEQ ID NO2中，核苷酸413和486之间)。在这些实验中，EAS4衍生序列置于一个截短的CaMV 35S启动子之前〔Benfey等(1990)EMBO J，91677-1684〕。此图也说明EAS4衍生转录调节区与异源最小化启动子融合时也能起作用。
在对其它转化体的更广泛分析中，或者是整个EAS4上游序列-567到+67或者是其5′缺失片段插入载体pBI101(Clonetech，Palo Alto，CA)中GUS(β-葡糖醛酸酶)报导基因的上游位置，然后分析在诱导和非诱导条件下GUS报导基因的表达水平。虽然其它上游序列的存在可以介导表达活性增强，但EAS4基因转录起点上游160bp序列足以指导调节GUS报导基因的调节性表达。在电击转移原生质体中，含EAS4转录起点上游最少167bp的构建体能提供瞬时基因表达，并且使GUS报导基因表达受释放素诱导(基因表达提高至少2.5倍)。相反，EAS3上游序列(SEQ ID NO1)在瞬时表达系统中，似乎不能支持报导基因高水平表达，也不能使下游基因受释放素诱导。
有时，可以预期释放素诱导的GUS报导基因表达出现在原生质体系统中，因为产生原生质体时用到了真菌细胞壁降解酶，已经证实这些酶在植物体中能诱导植物抗毒素合成和倍半萜环化酶基因的表达〔Chappell(1991)植物生理学(Plant Physiol) 97693-698〕这些原生质体能对第二次释放素处理发生反应，可能的解释是细胞在第二次诱导处理之前有6-8小时恢复期。这种恢复期使得细胞恢复对释放素的反应。
pBI101是Clontech(Palo Alto，CA)公司商业化产品。它包含在pUC19载体上的GUS报导基因上游的CaMV 35S启动子；这样它能作为瞬时表达实验的载体，在瞬时表达实验中重组载体被导入植物原生质体中。该质粒及其衍生质粒的存在可以通过在含卡那霉素的培养基上生长来选择。在农杆菌双元质粒载体pBIN19〔Bevan M.(1984)核酸研究(Nucl.Acids Res.)128711〕中一个“启动子减弱”GUS盒同样带有一个在植物中表达的卡那霉素抗性决定子。
实施例9可诱导转录调节元件的鉴定用S1核酸酶保护试验和引物延伸实验〔Sambrook等(1989)，同上〕对EAS3和EAS4基因组克隆5′侧翼区作图。含有从转录起点5′端1kb片段的亚克隆进行序列分析并与pBI101质粒中的β-葡糖醛酸酶(GUS)报导基因融合，以便在转基因植物组织中研究。得到的重组质粒用电击法转化烟草原生质体。采用瞬时表达法测量GUS活性，稳定的转基因烟草细胞系分离出来，测定GUS报导基因的诱导和表达水平。
制备含修饰的pBI101载体中EAS4转录起点上游最少约200bp序列的构建体，获得β-葡糖醛酸酶(GUS)报导基因，用于分析驱动调节性GUS报导基因表达的能力。200bp侧翼序列似乎足以驱动电转化原生质体基因瞬时表达，并且提供GUS报导基因的释放素诱导表达特性(诱导至少2.5倍)。类似地用EAS3侧翼序列实验，结果表明来自EAS3基因座的200bp序列不支持GUS报导基因在转基因植物细胞中高水平瞬时表达或对释放素诱导的反应。疫霉属纤维素酶和释放蛋白〔Ricci等(1989)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)183555-563〕有助于诱导EAS4衍生调节序列介导的基因表达。
推断出来的EAS4调节区经过寡核苷酸定点突变〔Kunkel(1985)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.USA)82488-492〕，进一步对介导病原菌入侵时(如纤维素酶或释放素)诱导基因表达的重要序列进行鉴定。将EAS4转录起点第-233到-234位(相当于SEQ IDNO2核苷酸334-335)野生型核苷酸CA换成GT，用释放素(纤维素酶)处理20小时，似乎并没有改变测量到的GUS报导基因表达水平。
基本上如Sambrook等(1989)所述进行的初步甲基化干涉试验和凝胶阻滞试验表明，以翻译起点-233附近为中心(以SEQ ID NO2的334核苷酸为中心)有一个八聚体结合植物细胞核蛋白质。甲基化干涉试验表明如果先和核提取物作用后，位于-233位处的G被优先保护对抗DMS(硫酸二甲酯)的甲基化。凝胶阻滞试验结果和甲基化保护试验结果一致，当含有-343到-140区(相对于转录起点)(相当于SEQ ID NO2的核苷酸230到433区段)的DNA片段和核提取物作用后，在非变性凝胶电泳中的运动受到阻滞。如果将-234到-233处GT换成CA，其结合蛋白性质消失。在对照和释放素诱导的细胞提取物中得到相似的结果，报导基因表达活性不受这种2bp核苷酸突变的影响。这样，可以得出结论，-233附近区域并不直接涉及对于病原菌入侵或释放素处理发生反应的基因表达的诱导。
初步实验结果表明EAS4相对于转录起点位置-253到-48(SEQID NO2中在320到525核苷酸之间)的DNA序列对其下游报导基因表达具有定性和定量的影响。EAS4相对于转录起点-110到-1(SEQ ID NO2中从463到572核苷酸处)的序列介导诱导反应，而相对于转录起点-202到-110(SEQ ID NO2中371到463)的序列能增强诱导和非诱导细胞中报导基因的表达水平。
实施例10嵌合EAS4启动子(-1148到+68)GUS报导基因的构建在另一系列实验中，我们检测EAS4启动子(-1148到+67)在转基因烟草中的活化。要得到烟草EAS4基因启动子(-1148到+67)的5’侧翼序列，首先从上述gEAS4基因组克隆中分离出包含EAS45’端部分序列的大约1.9kb HindIII-HindIII片段，将该片段克隆到pBluescript KS(+)质粒载体(Stratagene)的多克隆位点。以含有EAS4 HindIII-HindIII片段的pKS(+)质粒DNA作为模板，用标准PCR方法扩增出大约1.2kb EAS4启动子片段(-1148到+67)，该片段含有EAS4转录起点上游1148核苷酸序列和下游67bp序列。该片段的核苷酸序列见图3A。这段含有EAS4启动子(-1148到+67)的1215bp HindIII-BamHI片段随后与双元载体pBI101.1中GUS编码序列按正确的阅读框连接。图3B图示说明得到的EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因结构。
实施例11释放素和病原菌诱导转基因烟草嵌合基因EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的表达为了分析烟草EAS4启动子(-1148到+67)的功能，用释放素或病原菌处理含有如图3B所示的GUS报导基因构建体的转基因烟草，按下述方法测定GUS报导基因表达。
通过三亲交配方法[Schardl等基因(Gene)，611-11，1987]将如图3B所示EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因转移到没有攻击力的根癌农杆菌菌株GV3850中。用Horsch等[科学(Science)，2271229-1231，1985]叶盘转化法将带有GUS构建体的没有攻击力的农杆菌转化烟草(Nicotiana tabacum cv Xanthi)。在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下表达GUS报导基因的转基因烟草也被得到再生植株作为对照。得到的再生转基因烟草植株的种子在含100mg/L卡那霉素的培养基上萌发，得到的抗卡那霉素幼苗移栽到温室土壤中生长。按如上的方法，在没有处理(水对照)和诱导(释放素或病原菌处理)条件下，测定这些植株GUS报导基因表达水平。
为了测定EAS4启动子(-1148到+67)驱动GUS表达的释放素诱导特性，如下所述，用真菌释放蛋白crypogein或水处理转基因烟草植株叶片，测定GUS活性。取生长2个月的转基因烟草全展叶(从植株下部往上数第八片叶)之一半，在远轴端用微量加样器加大约50μl 25nM crypogein[根据Ricci等欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)183555-563，1989方法制备]对叶片进行渗透；另一半叶片同样地用约50ul水处理。渗透开始后在不同时间从完整植株叶片分别取水和crypogein渗透处理区的叶片，分析GUS活性。
如图4A所示，来自三个独立转基因烟草系的叶片经25nM crypogein渗透处理后，以释放素处理大约4小时后，诱导GUS报导基因表达。相形之下，释放素处理不能诱导35S CaMV启动子GUS报导基因(数据未示出)。另外，用水处理含有EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因植物叶片后，GUS报导基因活性不能被诱导(图4)。从显微镜中观察，GUS活性限制在用释放素处理的叶片组织，表明EAS4启动子(-1148到+67)没有被其它信号所诱导(图8A)。
按下述方法用释放素crypogein处理转基因烟草植株根和茎，测定GUS活性，从而确定EAS4启动子(-1148到+67)控制的GUS表达的器官特异性。从转基因烟草植株取下的根放在无菌Murashige和Skoog培养基上备用。茎取自在温室中生长两个月的转基因烟草植株(从顶端而下1到1.5英寸左右取样)。用释放素处理前，根和茎切成大约15-30um片段。置于用100nM crypogein或水润湿的滤纸上，在室温下处理18个小时。接着按上述方法测定根段和茎段的GUS活性。
图4B为两个独立转基因烟草系的根和茎crypogein处理18个小时后诱导的GUS表达活性。在根和茎中分别可见GUS活性相对于用水处理(对照)的样品增加15倍。根中GUS活性高于茎。这些结果表明在根和茎中释放素处理可诱导EAS4启动子(-1148到+67)。
为了确定病原真菌是否能诱导EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的表达，按如下方法用寄生疫霉烟草变种的两个不同生理小种处理转基因植物叶片，测定GUS表达活性。取生长约45天的转基因烟草植株顶端幼叶，如Tedford等[Tedford等植物病(PlantDisease)，74313-316，1990]所述，用在燕麦片琼脂培养基上培养两天的寄生疫霉烟草变种生理小种0和生理小种1菌丝体药栓(直径约1cm)感染。感染叶片置于培养箱中用蒸馏水润湿的滤纸上，于25℃用连续荧光处理24小时。对照叶片用空白燕麦片琼脂药栓接种。收集接种叶片，按上述方法测定GUS活性。
如图5所示，用寄生疫霉烟草变种生理小种0或生理小种1处理，均诱导转基因烟草叶片GUS活性。虽然寄生疫霉烟草变种生理小种0和生理小种1一般诱导不同的病症，但是它们处理转基因N.tabacumcv.Xanthi时，没有看到明显的病症上的差别。另外，我们观察到寄生疫霉生理小种0和1诱导GUS报导基因表达的能力相同。
为了确定病原细菌或释放素是否诱导GUS报导基因表达，按下述方法用丁香假单胞菌丁香致病变种61和它的hrpH突变体以及解淀粉欧文氏菌释放素harpin处理转基因烟草叶片，测定GUS活性。取生长约45天的转基因烟草顶端幼叶，用丁香假单胞菌丁香致病变种61或它的hrpH突变体细胞悬浮液(A600＝0.05)，harpin释放素(50ug/mL)渗透，渗透按前面所述用加样器进行。对照为用水同样渗透的叶片。大约12个小时，收集叶片按上述方法测定GUS活性。
如图6所示，用假单胞菌，hrpH突变体，或harpin释放素处理转基因烟草叶片12小时，均能诱导GUS活性。相形之下，水处理的叶片只能检测到低GUS活性。另外不论是用野生型丁香假单胞菌丁香致病变种61还是用纯化的harpin释放素渗透处理组织区12-15小时后，均能观察到超敏反应。这些结果表明无论病原细菌还是细菌来源的释放素均能活化EAS4启动子(-1148到+67)。
实施例12免疫印迹分析如下所述，用标准Western印迹方法分析crypogein处理转基因植物后不同组织中EAS表达情况。用Vogeli和Chappell(同上)所述方法从对照和crypogein释放素处理的烟草组织中提取蛋白质，烟草组织用含20％(w/v)甘油，10mM偏亚硫酸氢钠，10mM抗坏血酸钠，15mM氯化镁和5mM β-巯基乙醇的80mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)匀浆。用Bio-Rad法测定蛋白质浓度。取等量的蛋白进行SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维素膜上，按Voegeli和Chappell(同上)所述方法进行免疫检测。
如图7A-B所示，用Western印迹实验在烟草叶片中没有检测到EAS蛋白质。相形之下，用释放素处理转基因烟草后叶片中诱导出现EAS蛋白质。茎段和根段在没有释放素处理时也能检测到EAS蛋白质，表明其中存在EAS多基因家族的一个或几个成员，但根据上述组织化学定位数据可确定不是EAS4，它们在植物受伤时活化。实施例13转基因烟草中EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的细胞特异性表达型式图8A-K所示为用释放蛋白处理烟草不同转基因系组织后GUS活性染色结果。图8A-K数据表示图3B中表达EAS4启动子(-1148到+67)GUS报导基因的转基因烟草几个独立转基因系一系列不同时间的观察结果。转基因组织中GUS活性染色按下面方法进行组织切片用含50mM磷酸钠，pH7.0，0.05％Triton X-100，0.1％β-巯基乙醇的1mM X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚β-葡糖苷酸)溶液于37℃保温12-16小时，然后用50％乙醇，5％冰乙酸，10％甲醛固定2小时。切片在70％乙醇中温育以除去适当组织中的叶绿素，在Zeiss IIIRS显微镜下观察染色的植物组织，用MC63显微成像仪照相。
图8B-F显示，除了表皮细胞层GUS活性极微弱外，GUS活性存在于转基因叶片的释放素渗透区，表明在全部叶片组织中crypogein和parasicein渗透能活化EAS4启动子(-1148到+67)。在茎和根的表皮细胞中也看到类似的微弱染色(图8G和8L)。尽管极微弱GUS活性出现在转基因叶片的表皮细胞，但转基因植物叶和根的表皮毛中也能观察到GUS活性(图8B和8L)。
另外，如图8C-F和8L所示，释放素诱导的GUS活性出现在茎和根切片的不同亚表皮层(图8C-F和8L)。图8F显示茎组织中GUS活性也存在于形成层，韧皮层，和初生木质部组织层；极微弱GUS活性也存在于茎的皮层区。并且，类似于茎，根中GUS活性也定位于维管系统(图8L)。
cryptogein处理前后均未发现GUS活性存在于花瓣中，包括有色素和无色素的组织。
实施例14转基因烟草植株中EAS4启动子(-1147到+67)5′缺失分析。
另外一系列实验用标准PCR技术得到EAS4启动子(-1147到+67)的几个5′缺失构建体。这些缺失的启动子随按上述方法与pBI101.1和pBI221载体中GUS报导基因融合并转化烟草。表1
如表1所示，和植物中存在完整EAS4启动子(-1148到+67)相比，缺失-1148到-567区段的EAS4启动子使可诱导GUS活性降低50％。进一步缺失到-212，使可诱导GUS活性平均降低90％，缺失到-160，GUS活性降低至具有完整启动子(-1148到+67)的植物的2％，缺失至-63，启动子仍然含有推测的CAAT盒和TATA盒，完全不能诱导对照和释放素处理叶片中嵌合基因的表达。这些数据表明烟草中控制EAS4的定量表达水平的多个正调节元件位于-1148到-160区段。
比较缺失至-567和缺失至-212区段的结果也可以看出，-567到-212区段影响表达水平，因为该区段缺失导致表达水平降低4倍，大部分GUS活性丧失。虽然缺失到-160可诱导GUS活性大部分丧失，但发现-160下游序列足以指导叶片组织中可诱导的基因表达。如图9B所示，用释放素处理叶片，可以观察到17倍的诱导。这些数据说明释放素诱导性的定性控制元件位于-160到-115之间。
实施例15转基因植物抗病性按下述方法分离寄生疫霉生理小种0的parA1编码序列分离基因组DNA，将其作为PCR模板，SIG正向引物为(CGTTGGATCCCCACCTCATCCGAAATGAAC；SEQ ID NO9，BamHI位点用下划线标出)；25-27位核苷酸相当于翻译起点，反向引物为(GGCTGAGCTCCTGGACGFCAGAGATCAAACC；SEQ ID NO10SstI位点用下划线标出)，以扩增ParA1释放蛋白包括信号肽序列的编码区。为了分离相应于ParA1释放蛋白编码序列的扩增引物，使用MAT正向引物(GCCGGATCCTTATGACTAGTTGCACCACCACGCAGCAAACTG，SEQ ID NO11，BamHI位点GGATCC，SpeI位点ACTAGT均用下划线标出；翻译起点在核苷酸12-14处)，反向引物同前(SEQ IDNO10)，以基因组DNA作为模板。
扩增引物DNA用BamHI和SstI消化后，亚克隆到pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)或pEAS4构建体。使用成熟蛋白的编码序列时，用SpeI消化成熟释放素/pEAS4构建体，以便在开放阅读框的5′端插入植物信号肽序列。pEAS4-GUS载体用BamHI和SstI消化，大片段DNA用琼脂糖凝胶电泳纯化。
图9说明构建抗病植株的分子操作过程。用PCR方法得到ParA1释放蛋白编码序列，使其具有BamHI和SstI末端。gEAS4600(环化酶)-GUS-pBI101在EAS启动子调控之下指导GUS报导基因的表达，将其用BamHI和SstI消化，释放出GUS报导基因。将gEAS4600(环化酶)-GUS-pBI101消化后的大片段和BamHI/SstI消化的parA1扩增引物连接，得到gEAS4600(环化酶)-parA1-pBI101，植物细胞或组织以该质粒转化后，用适当的释放素诱导，ParA1释放蛋白就能合成。
为了分析对于植物病原菌的抗性，用上述通过农杆菌介导的基因转移方法重新产生含有gEAS4600(环化酶)启动子控制的parA1成熟释放蛋白基因(SEQ ID NO12中氨基酸21-118)或带有信号序列的parA1释放蛋白基因(SEQ ID NO12中氨基酸1-118)的转基因烟草植株(Nicotiana tabacum cv.KY160)。得到的转基因植株用于分析对寄生疫霉烟草变种生理小种0和1分离株的抗性，分析方法采用Tedford等(同上)的标准离体叶片法。
如图10所示，和对照相比(即与没有转化的Nicotiana tabacumcv.KY160或含有gEAS4600(环化酶)启动子GUS报导基因的转基因Nicotiana tabacum cv.KY160相比)，几个含有gEAS4600(环化酶)启动子控制之下的parA1成熟释放蛋白基因的独立烟草转基因系具有提高的对寄生疫霉烟草变种生理小种0和1的抗性。
尽管已经对本发明的一些实施方案作了详细说明，但显然本领域的技术人员能够对它进行修饰，扩充，修改和优化。正如在权利要求中列出的，必须清楚地认识到这些修饰和修改等都在本发明的精神和范围之内。
序列表(1)一般信息(i)申请人Board of Trustees of the University of Kentucky(ii)发明名称转录控制序列和方法(iii)序列数14(iv)通讯地址(A)联系人Fish&Richardson，P.C.
(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州MA(E)国家US(F)邮政编码02110-2804(G)电话(H)传真(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Rekease#1.0版本#1.30(vi)现申请数据(A)申请号US(B)申请日(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号US08/577,483(B)申请日1995年12月22日(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号US08/471,983(B)申请日1995年6月6日(C)分类(vii)在先申请数据
(A)申请号US08/443,639(B)申请日1995年5月18日(C)分类(viii)代理人/代理机构信息(A)姓名Paul T.Clark(B)登记号32,164(C)参考/备案号码07678/003BRl(ix)电讯信息(A)电话(617)542-5070(B)传真(617)542-8906(A)电传200154(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度512碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)初始来源(A)生物烟草(xi)序列表述SEQ ID NO1CCGCGATTGG AGGATGTTGT ACGTCGAGCT ACGCGGCACC GCGCTTAATT TTACTCGGTC 60AAGAAGGAAC GGGGATGGTG GTCAACGAAA CACGACGGGC CCGACATCAT GCCTGACAAC 120CCGCCGTGGG TGAAGAAGTC GACGTTGGAA AAGAGCTACA GCCTGCTCCA CGCGGATGCG 180GGGATGGCCG CTGACTACAG AAAGTGCGTT TCCCGCCACC CGGGGCGAGC CCGGGTTTTG 240AAGATCAATG CTGACCGAAC CAGACGGCGG TACGTCATCC GCTTGAGGGT AGAGACGGAT 300CAGTTCTTGT TGTCGTGTGT CGAACTCGGG ACGTTTGTCA CATGGCTGGA CGGGTTATTC 360GCCGCCATCA ACGTGTCGCC GCCAATCGAC GAGCGCGACT TTCCCAGAGA CTTTAGCGTG 420CCACGGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC 480ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT AA512(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度642碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)初始采源(A)生物烟草(xi)序列表述SEQ ID NO2TAGGTGAATG TCAGGGCTTA TGCTCCACGA TACTTATGCC CTGCCAGTAC ACCTCGCAGT 60GGGACTCGCT GAAAAAACGT CTTTGTTGTG AGAAATTGCA ATTTTGAACC TCTACAATTT 120CGACAAAACC TTGGTTCGTG AAAACTGTTT GATTAACTTT TAGACCATCC AGTCAATTTA 180ACTCTAAACT GACCTAAATA AATACTACGT ACACTAGTCT TTAAGTTCAT CAAAGTGGAC 240TCTGCATTAA TAATTGAAAT TTATGCCGCA ACAATGACAT TAGGTTTTAT AAATAAAGTA 300ATAGGAATTT GATAGTTCCA GGAAACAACT CTACAGTACT CCCTTATTTT GTGCCTTTTT 360AAATAATATT ATTCAGTTGA CGAAACAAAT AAATAAAATA TTTGGGAAAC TGGATCAATA 420GACCCCAGAC GCCAACAATG AATCAAAAGG CTGCTAGCTA GTGTAAAGTC TAGTAAGGCA 480ACTGGGAAAT TAAATGATTA GGTGCTTTTG ATCAATTACA TTAACTAGTC TCTCACCACT 540ATATATACTT GTCCCTTCTC TTCCATTTAA GTAGAGTTCC TTTCTTTCTT CCTTAAAACT 600TAAAAGAACA AGTAAAAATA CACTCATCTT TAATTAGCAA TG 642(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述SEQ ID NO3ATGCTGTTAG CAACCGGAAG G(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述SEQ ID NO4ATCCAAAATC TCATCAATTT C(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述SEQ ID NO5ATGAGTCCTT ACATGTGA(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征
(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义有(xi)序列表述SEQ ID NO6GGGAGCTCGA ATTCCATGGC CTCAGCAGCA GCAGTTGCAAACTAT(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度4253碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)初始来源(A)生物烟草(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置1216..1327(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置1454..1718(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置1805..2182(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置2259..2477(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置2609..2747(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置2902..3148(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置3261..3555(xi)序列表述SEQ ID NO7AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACGC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT 120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC 180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA 240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT 300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT 360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT 420ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA 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NO9信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述SEQ ID NO9CGTTGGATCC CCACCTCATC CGAAATGAAC(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物”(iii)假设无(iv)反义有(xi)序列表述SEQ ID NO10GGCTGAGCTC CTGGACGCAG AGATCAAACC(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征
(A)长度42碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型其它核酸(A)表述/desc＝“PCR寡核苷酸引物(反向)”(iii)假设无(iv)反义有(xi)序列表述SEQ ID NO11GCCGGATCCT TATGACTAGT TGCACCACCA CGCAGCAAAC TG(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度593碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)初始来源(A)生物寄生疫霉(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置207..563(xi)序列表述SEQ ID NO12GTCGACGAAA GCCGAAGTGC GTGGCAGATC TTGCCGTTCG AATGCTACGC GCCACGGCAA 60AACCTACACG GTACAACAGC TTCAAATAAA CCTGCAAGCG AGCCGCCAGC CCAACTCCAG 120CTAGTCAAGC CTAGTTTGCC TCCAACTGCC ATTGTACAAT TTGCTCTCAT CCACACCCAC 180CCCACTTCTC CCCCACCTCA TCCGAA ATG AAC TTC CGC GCT CTG TTC GCC GCC 233Met Asn Phe Arg Ala Leu Phe Ala Ala555 560ACC GTC GCC GCC CTC GTC GGC TCC ACC TCC GCC ACC ACG TGC ACC ACC 281Thr Val Ala Ala Leu Val Gly Ser Thr Ser Ala Thr Thr Cys Thr Thr565 570 575ACG CAG CAA ACT GCG GCG TAC GTG GCG CTC GTA AGC ATC CTC TCG GAC 329Thr Gln Gln Thr Ala Ala Tyr Val Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp580 585 590ACG TCG TTC AAC CAG TGC TCG ACG GAC TCT GGC TAC TCA ATG CTG ACG 377Thr Ser Phe Asn Gln Cys Ser Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr595 600 605GCC ACC TCG TTG CCC ACG ACG GAG CAG TAC AAG CTC ATG TGC GCG TCG 425Ala Thr Ser Leu Pro Thr Thr Glu Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala Ser610 615 620ACG GCG TGC AAG ACG ATG ATC AAC AAG ATC GTG ACG CTG AAC CCG CCC 473Thr Ala Cys Lys Thr Met Ile Asn Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro625 630 635 640GAC TGC GAG TTG ACG GTG CCT ACG AGC GGC CTG GTA CTC AAC GTG TTC 521Asp Cys Glu Leu Thr Val Pro Thr Ser Gly Leu Val Leu Asn Val Phe645 650 655ACG TAC GCG AAC GGG TTC TCG TCT ACG TGC GCG TCA CTG TAA 563Thr Tyr Ala Asn Gly Phe Ser Ser Thr Cys Ala Ser Leu660 665GCGGGTTTGA TCTCTGCGTC CAGAATCGAT593(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度118氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述SEQ ID NO13Met Asn Phe Arg Ala Leu Phe Ala Ala Thr Val Ala Ala Leu Val Gly1 5 10 15Ser Thr Ser Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gln Gln Thr Ala Ala Tyr20 25 30Val Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp Thr Ser Phe Asn Gln Cys Ser35 40 45Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr Ala Thr Ser Leu Pro Thr Thr50 55 60Glu Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala ser Thr Ala Cys Lys Thr Met Ile65 70 75 80Asn Lys Ile Val Thr Leu Asn Pro Pro Asp Cys Glu Leu Thr Val Pro85 90 95Thr Ser Gly Leu Val Leu Aan Val Phe Thr Tyr Ala Asn Gly Phe Ser100 105 110Ser Thr Cys Ala Ser Leu115(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度1368碱基对(b)类型核酸(C)链型两种(D)拓扑构型两种(ii)分子类型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO14AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACAC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT 120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC 180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA 240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT 300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT 360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT 420ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT 480ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT 540TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA 600AAAACTAGAG CGATACCAAA GGAAATTTTA AATTCAAAAA CTAACTTGAA ATTAATATAT 660TTAAAATTTC ATTTTTTTTT GTGTGGAGAA AACAAAGCAT AACACTTTGC TTTGTAACAC 720TTTGCCTAGG TGAATGTCAG GGCTTATGCT CCACGATACT TATGCCCTGC CAGTACACCT 780CGCAGTGGGA CTCGCTGAAA AAACGTCTTT GTTGTGAGAA ATTGCAATTT TGAACCTCTA 840CAATTTCGAC AAAACCTTGG TTCGTGAAAA CTGTTTGATT AACTTTTAGA CCATCCAGTC 900AATTTAACTC TAAACTGACC TAAATAAATA CTACGTACAC TAGTCTTTAA GTTCATCAAA 960GTGGACTCTG CATTAATAAT TGAAATTTAT GCCGCAACAA TGACATTAGG TTTTATAAAT1020AAAGTAATAG GAATTTGATA GTTCCAGGAA ACAACTCTAC AGTACTCCCT TATTTTGTGC1080CTTTTTAAAT AATATTATTC AGTTGACGAA ACAAATAAAT AAAATATTTG GGAAACTGGA1140TCAATAGACC CCAGACGCCA ACAATGAATC AAAAGGCTGC TAGCTAGTGT AAAGTCTAGT1200AAGGCAACTG GGAAATTAAA TGATTAGGTG CTTTTGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC1260ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT1320AAAACTTAAA AGAACAAGTA AAAATACACT CATCTTTAAT TAGCAATG 1368
权利要求
1.一种含有可诱导的植物抗病调节元件的重组核酸分子。
2权利要求1的核酸分子，其中调节元件来源于一种编码萜烯环化酶的基因。
3权利要求2的核酸分子，其中萜烯环化酶是一种倍半萜环化酶。
4.权利要求3的核酸分子，其中调节元件指导表-5-马兜铃烯(aristolochene)合酶(EAS)的表达。
5.权利要求4的核酸分子，该核酸分子包括图3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)，或由此产生的一个可诱导的植物抗病片段。
6.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子具有图3A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO14)。
7.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸463-473。
8.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸406-486。
9.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸463-572。
10.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸371-463。
11.权利要求5的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO2中核苷酸411-457。
12.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子来源于双子叶植物。
13.权利要求12的核酸分子，其中双子叶植物是茄科的一个成员。
14.权利要求13的核酸分子，其中茄科植物是烟草属的一个成员。
15.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子来源于单子叶植物。
16.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子来源于裸子植物。
17.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子来源于松柏类植物。
18.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子为基因组DNA。
19.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子为化学合成DNA。
20.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子为基因组DNA和化学合成DNA的组合。
21.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子为基因组DNA和cDNA的组合或基因组DNA，cDNA和化学合成DNA的组合。
22.权利要求1的核酸分子，其中所说的诱导由植物病原菌介导。
23.权利要求22的核酸分子，其中植物病原菌是一种真菌。
24.权利要求23的核酸分子，其中病原真菌是疫霉属的一个成员。
25.权利要求22的核酸分子，其中所说的诱导由病原细菌介导。
26.权利要求25的核酸分子，其中病原细菌是假单胞菌属的一个成员。
27.权利要求22的核酸分子，其中所说的诱导由病原病毒介导。
28.权利要求27的核酸分子，其中病原病毒为烟草花叶病毒。
29.权利要求1的核酸分子，其中所说的诱导由释放素介导。
30.权利要求29的核酸分子，其中所说的诱导由真菌释放素介导。
31.权利要求29的核酸分子，其中所说的诱导由细菌释放素介导。
32.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子可操纵地与编码异源多肽的核苷酸序列连接。
33.权利要求32的核酸分子，其中异源多肽能使植物具有抗病性。
34.权利要求33的核酸分子，其中异源多肽是一种释放蛋白。
35.权利要求33的核酸分子，其中释放蛋白是一种真菌释放蛋白。
36.权利要求35的核酸分子，其中真菌释放蛋白来源于疫霉属。
37.权利要求36的核酸分子，其中释放蛋白包括ParA1多肽。
38.权利要求33的核酸分子，其中释放蛋白是一种细菌释放蛋白。
39.权利要求38的核酸分子，其中细菌释放蛋白是肝素。
40.权利要求32的核酸分子，其中所说的诱导由一种或多种外源介质介导。
41.权利要求32的核酸分子，其中该核酸分子能以细胞特异性方式表达所说的异源多肽。
42.权利要求32的核酸分子，其中所说的异源多肽是一种药用蛋白质。
43.一种包括权利要求1的DNA的载体。
44.权利要求43的载体，该载体能在含载体的细胞中可诱导地调节核苷酸序列的表达。
45.权利要求44的载体，所说的核苷酸序列编码一种异源多肽。
46.一种含有整合至其基因组中的权利要求1的核酸分子的转基因植物。
47.一种含有整合至其基因组中的权利要求32的核酸分子的转基因植物。
48.一种来自权利要求46的转基因植物的种子。
49.一种来自权利要求47的转基因植物的种子。
50.一种来自权利要求46的转基因植物的细胞。
51.一种来自权利要求47的转基因植物的细胞。
52.一种向转基因植物提供抗病性的方法，该方法包含下列步骤(a)产生含有整合至其基因组中的权利要求32的核酸分子的转基因植物细胞；以及(b)从所说的植物细胞培养转基因植物，其中权利要求32的核酸分子的表达使转基因植物具有抗病性。
53.权利要求52的转基因植物，其中该转基因植物是一种双子叶植物。
54.权利要求53的转基因植物，其中双子叶植物是茄科的一个成员。
55.权利要求54的转基因植物，其中茄科植物是烟草属的一个成员。
56.权利要求52的转基因植物，其中该转基因植物是一种单子叶植物。
57.权利要求52的转基因植物，其中该转基因植物是一种裸子植物。
58.权利要求52的转基因植物，其中该转基因植物是一种松柏类植物。
59.一种增加转基因植物细胞中下游DNA序列转录表达的方法，该方法包括下列步骤(a)产生含有权利要求1的核酸分子的转基因植物细胞，该核酸分子整合到转基因植物细胞基因组中，并且位于增加下游DNA序列转录的位置；(b)从所说的植物细胞培养转基因植物。
全文摘要
本发明公开了定性和定量的转录调控序列,前者在植物、植物组织和植物细胞的可诱导基因表达中发挥功能,后者在植物、植物组织和植物细胞中增加下游遗传信息的转录表达。本发明也公开了提高转基因植物抗病性的方法和重组DNA分子,尤其是一种控制能够引发植物超敏反应的蛋白质表达的可诱导启动子。
文档编号C12N15/82GK1191565SQ96195657
公开日1998年8月26日 申请日期1996年5月7日 优先权日1995年5月18日
发明者J·查佩尔, C·A·G·科尔内特, 殷绍辉 申请人:肯塔基州州立大学托管委员会