靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.1-TLR2-shRNA构建及鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向TLR2的shRNA干扰载体PLKO.1-TLR2-shRNA构建及鉴定。根据Gene?Bank中TLR2的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与TLR2mRNA及其他基因编码序列无同源性。shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CCGG，与Age?I酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5′端添加了AATTCAAAAA，与EcoR?I酶切后形成的粘端互补。成功构建了靶向TLR2的shRNA干扰载体PLKO.1-TLR2-shRNA，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体PLKO.1-TLR2-S3，为进一步研究探讨TLR2参与宿主炎症疾病的发病机制和防治具有重要意义。
【专利说明】靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.1-TLR2-shRNA构建及鉴
定
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其一种靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l-TLR2-shRNA 构建及鉴定。
【背景技术】
[0002]一直以来，人们对于天然免疫及其炎症反应的信号通路尚未完全阐明，近年来，随着果蝇Toll蛋白的发现，人们发现在哺乳动物和人类也存在着一类与果蝇Toll蛋白相似的跨膜蛋白，即Toll样受体(toll-like receptor, TLRs),在免疫及炎症反应的信号传导中扮演重要的角色。TLR2在细胞膜上表达，分别涉及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁成分的识别。TLR2能够识别革兰氏阳性细菌壁成份脂磷壁酸(lipoteichoicacid,LTA),肽聚糖和脂肽。TLR2在识别病原微生物、产生促炎细胞因子和启动宿主炎症反应中发挥着重要的作用。在应对外来病原微生物分子的过程中，TLRs介导的细胞内信号传递导致促炎细胞因子基因的表达。由于TLRs是识别外来入侵病原微生物和活化宿主天然免疫系统的主要成份，TLR2表达和信号传递的变化不仅在脓毒血症而且在外科应激的发病机理中也发挥着重要的作用。[0003]最近的研究表明，TLRs在通过上调巨噬细胞的吞噬活力和促进细菌的清除中发挥重要的作用。在微生物病原体的吞噬过程中，表面的TLR2被募集到吞噬体并被微生物细胞壁成分活化。更最近的研究发现，TLR2参与小胶质细胞(一种明确位于大脑的吞噬细胞)对淀粉样蛋白β的吞噬过程和巨噬细胞对真菌的吞噬过程，TLR4与肠细胞的吞噬作用有关。这些结果提示TLR2不仅参与宿主炎症反应的调节，同时也参与调控细胞介导的吞噬作用。
[0004]本研究通过构建靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l_TLR2_shRNA，并筛选出最佳抑制效率的干扰载体PLK0.1-TLR2-S3，为进一步研究探讨TLR2参与宿主炎症疾病的发病机制和防治具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l_TLR2_shRNA构建及鉴定方法。
[0006]靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l_TLR2_shRNA构建及鉴定，其步骤为:
[0007]I)根据Gene Bank中TLR2的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与TLR2mRNA及其他基因编码序列无同源性；
[0008]2)设计shRNA模板、正义链模板、反义链模板三条序列，并将设计好的序列送上海生工生物技术有限公司合成；
[0009]3)靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l_TLR2_shRNA构建及鉴定，用限制性内切酶Age1、EcoRI酶切PLK0.1，连接退火片断和载体，转化，涂板，挑克隆，小抽质粒，并将克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定；
[0010]4)选取有高表达TLR2的细胞株，将构建好的穿梭质粒瞬转，37°C，5% CO2孵箱中孵育72小时后，收集细胞分别用蛋白裂解液及Trizol裂解细胞提取总蛋白及总RNA，进行Western blot分析鉴定。本发明的优点:
[0011]I)根据Gene Bank中TLR2的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与TLR2mRNA及其他基因编码序列无同源性。
[0012]2)针对目的基因我们设计三对shRNA序列，构建了三个重组慢病毒表达载体，并将这些重组载体包装病毒后感染大鼠血管平滑肌细胞，采用Western blot法验证重组慢病毒对靶基因的抑制效率。实验结果显示shRNA-3具有较高的抑制效率，而shRNA-Ι对靶基因无抑制作用，shRNA-2对靶基因抑制效率较低，可能由于这些shRNA序列不能在细胞内表达或者其产物不能有效结合靶基因所致。
[0013]3)我们选择抑制效率高的ShRNA-3进行后续研究，为进一步研究JAK-STAT3信号通路在血管平滑肌细胞增殖、凋亡等作用奠定了基础，为抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗提供了新的思路
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
[0015]雄性SD大鼠，体重150_250g，由南京医科大学实验动物中心提供。U6启动子质粒(如PavU6+27)由北京本 元正阳基因技术公司构建，克隆用大肠杆菌DH5 α株(Gibco/BRL公司)，限制性内切酶Age1、EcoRI，T4DNA连接酶，RT-PCR试剂盒均为大连Ta Kara生物公司产品；RNA提取试剂Tripure、DEPC购自美国Roche公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、Trizol试剂(Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(Roche 公司)；Omniscript RT Kit (Qiagen 公司),反转录随机引物(Toyobo公司)，SYBR Premix Ex Taq(大连Takara公司)。试验中所用的核酸标准分子量Marker以及蛋白预染Marker均为美国Fermentas MBI公司产品。去内毒素质粒大量提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。质粒转染试剂LipofectamineTM 2000购置美国invitrogen公司。兔抗鼠STAT3单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司。用于Western blot检测的增强化学发光试剂ECL为美国Cell Signal 公司产品。PVDF 转印膜购自美国 Schleicher&Schuell Bioscience 公司。
[0016]I)靶向 TLR2 的 shRNA 设计
[0017]根据Gene Bank中TLR2的cDNA序列，参考shRNA设计原则，选择cDNA序列上的四个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列随机打乱设计为阴性对照，对照序列经BLAST检测证实与TLR2mRNA及其他基因编码序列无同源性。shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以 避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5'端添加了 CCGG，与AgeI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了AATTCAAAAA，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。设计三条序列如下；并将设计好的序列送上海生工生物技术有限公司合成。
[0018]SI:
[0019]forward oligo:
[0020]5-CCGGAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGGAGGTTTTG-3Rerverseoligo:
[0021 ] 5-AATTCAAAAAAACCTCCAGGTTCTGATGTTGCTCGAGCAACATCAGAACCTGGTT-3S2:
[0022]forward oligo:
[0023]5-CCGGAAGTCCAGCAGAATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTTTTTTTG-3Rerverse oligo:
[0024]5-AATTCAAAAAAAGTCCAGCAGAATCAATACACTCGAGTGTATTGATTCTGCTGGACTT-3
[0025]S3:
[0026]forward oligo:
[0027]5-CCGGAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTTTTTTTG-3Rerverse oligo:
[0028]5-AATTCAAAAAAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTT-3
[0029]2)靶向TLR2的shRNA干扰载体PLK0.l_TLR2_shRNA构建及鉴定退火buffer溶解弓丨物成25ul/10D，将上下游引物1:1混合，在94度水浴5min，熄火自然冷却到室温，4度Ih0用限制性内切酶Age1、EcoRI酶切PLK0.1，连接退火片断和载体，转化，涂板，挑克隆，小抽质粒,并将克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。
[0030]3)干扰效率检测
[0031]选取有高表达TLR2的细胞株，将构建好的穿梭质粒瞬转，37°C，5% CO2孵箱中孵育72小时后，收集细胞分别用蛋白裂解液及Trizol裂解细胞提取总蛋白及总RNA，进行Western blot分析。检测表明干扰效果明显,达到80%以上。
[0032]4)重组慢病毒 PLK0.l-TLR2-S3-shRNA 的包装
[0033]将干扰效果最好的PLK0.l-TLR2-S3-shRNA,进行慢病毒包装。
[0034]HEK293细胞培养于IOcm平皿中，达 50%~70%融合时进行转染。利用脂质体将重组慢病毒质粒PLK0.l-TLR2-S3-shRNA，包装质粒和包膜质粒共转染HEK293细胞。HEK293细胞用无血清的DMEM培养基洗涤后，加入2ml完全培养基和DNA-脂质体混合物，37°C,5%CO2细胞培养箱培养，12小时后全量换液。继续培养24小时后半量收集细胞上清，48小时后全量收集细胞上清。用0.22 μ m滤器滤过后分装，_70°C冰柜保存。
【权利要求】
1.一种重组慢病毒质粒载体，其特征是该载体含有大鼠的TLR2的基因干扰片段。
2.按照权利要求1所述的载体，其特征是该载体为大肠杆菌表达载体。
3.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为PLK0.1-TLR2-S3。
4.按照权利要求3所述的载体，其特征是该载体的S3序列为forward oligo:5-CCGGAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTTTTTTTG-3Rerverse oligo:5-AATTCAAAAAAAGGTGAAGCGAATCACAGTACTCGAGTACTGTGATTCGCTTCACCTT-3。
5.按照权利要求4所述的载体， 转染到大鼠体内后，降低TLR2蛋白表达。
【文档编号】C12N15/867GK103882059SQ201210563603
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】郑丽丽, 杨艳菊 申请人:苏州中同生物科技有限公司