壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定是从被污染的酵母培养液中分离到一菌株，经鉴定为一种革兰氏阳性杆菌，其所分泌的主要蛋白产物经纯化后，测定了它的N-端氨基酸序列，与已知的几种内切壳聚糖酶十分类同。根据其同源DNA序列，通过PCR方法克隆了其全长基因。该菌株生长极快，其组成型分泌产物主要为内切壳聚糖酶。该酶通过疏水层析和分子筛两步即得到纯化。进一步研究了该酶的酶学性质及其催化壳聚糖降解为壳寡糖的条件。提高该壳聚糖酶的产率后，有望用于壳寡糖的生产，有实际应用价值。
【专利说明】壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株革兰氏阳性杆菌，该菌分泌一种壳聚糖酶，特别涉及对该壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定。
【背景技术】
[0002]几丁质(chitin)主要是N-乙酰葡萄糖胺通过β-1，4_糖苷键形成的链状多聚物，主要存在于水生甲壳动物、软体动物和节肢动物的外壳中(如虾、蟹等)，每年产量超过10亿吨，仅次于纤维素，是一类丰富的自然资源。但几丁质不溶于常用溶剂，直接利用非常困难。将丁质用碱液处理后得到脱乙酰基产物(脱乙酰度为65%~99%，以70%~80%最常见)，即壳聚糖(chitosan)。壳聚糖在自然界中也存在，主要在一些真菌和一些绿藻的细胞壁中。但目前生产中应用的壳聚糖基本上是几丁质的脱乙酰化产物。与几丁质相比，壳聚糖可溶于酸性溶剂并带正电荷，可用于食品、制药、纺织、污水处理等行业。壳聚糖可进一步通过化学法或酶法降解成壳寡糖(一般由几个到十几个糖残基组成)。壳寡糖的水溶性好，而且具有多种生物活性，例如可以抑制细菌和真菌生长，具有抗肿瘤与调节免疫活性，可增强植物抗病性等。所以壳寡糖的研究近年来受到越来越多的重视，可能成为一个新兴产业。
[0003]壳聚糖酶(chit0SanaSe，EC 3.2.1.123)可以水解壳聚糖中的β_1，4_糖苷键，将壳聚糖降解。已发现的壳聚糖酶绝大部分为内切酶，可以将壳聚糖降解为壳寡糖。目前研究最多的是来源于细菌和真菌的壳聚糖酶。相对于化学水解法，利用壳聚糖酶酶解生产壳寡糖有其独特的优势，例如壳寡糖的得率高，对环境污染小等。但其前提是要开发出廉价的壳聚糖酶，所以寻找合适的壳聚糖酶对酶解法生产壳寡糖非常重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于得到了一株革兰氏阳性杆菌，该菌分泌一种壳聚糖酶，能够降解壳聚糖得到壳聚二糖和壳聚三糖。
[0005]我们从被污染的酵母培养液中分离到一杂菌，为革兰氏阳性杆菌，其分泌的主要蛋白产物，经分离纯化后，测定其N-端氨基酸序列与已知的几种壳聚糖酶极相似，据此克隆了其全长基因，并研究其酶学性质。该酶能快速高效地将壳聚糖降解为壳寡糖，由于该杆菌生长快，主要分泌产物为壳聚糖酶，有望用于壳寡糖的生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1:Bacillus sp.ΤΚ-02 革兰氏染色。
[0007]图2 =SDS-PAGE分析发酵上清(A)和纯化产物(B):M为蛋白分子量标准；
[0008]Sup为发酵上清；1为初步纯化产物；2为二次纯化产物。
[0009]图3 =HPLC进行纯度鉴定结果。
[0010]图4:电喷雾质谱进行分子质量测定结果。【具体实施方式】:
[0011]实施例1:
[0012]壳聚糖酶生产菌株的培养:我们从被污染的酵母培养液中分离到一杂菌，革兰氏染色以及形态观察表明它是一种革兰氏阳性杆菌(图1)，暂命名为Bacillussp.TK-02。该菌株先在LB固体培养基上培养过夜(30°C )，然后挑取单克隆接种于LB液体培养基中于30°C震荡培养24h。将菌液离心(5000g，IOmin)，收集上清。
[0013]实施例2:
[0014]壳聚糖酶的纯化与N-端氨基酸序列测定:该菌发酵液上清组成相对简单，分泌表达产物主要为该壳聚糖酶(图2A)。将培养液上清浓缩后进行分离纯化，首先用疏水层析的方法将该壳聚糖酶从大体积的发酵液上清中分离出来，SDS-PAGE鉴定表明该步纯化得到的壳聚糖酶主要含有一种分子质量较大的杂蛋白(图2B，lane I)。据此，再通过分子筛进行纯化，便得到了高纯度的壳聚糖酶(图2B，lane2)。该壳聚糖酶的纯度进一步用C3反相HPLC进行鉴定。如图3所示，该酶在HPLC上只有一个峰，其纯度大于95%。洗脱的壳聚糖酶用电喷雾质谱测定其分子质量(图4):测定的分子质量(44017U)与预期的分子质量(45780U)有较大出入，测定的分子质量比理论值小1763u。分析该壳聚糖酶的C端序列发现其含有双碱性氨基酸(KK)，推测纯化到的该壳聚糖酶在该双碱性氨基酸处被剪切，由此得到的壳聚糖酶的理论分子质量为44040U，与测定的分子质量基本相符，误差仅千分之一左右。[0015]在SDS-PAGE上得到单一蛋白条带，其测定的N-端氨基酸序列为:AAAKEMKPFPQQ。通过网上蛋白质序列检索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST),找到11条相同的序列，它们都是壳聚糖酶，而且全部来源于杆菌属(Bacillus)。根据壳聚糖酶活力测定，我们推测纯化到的蛋白是一种壳聚糖酶。
[0016]实施例3:
[0017]壳聚糖酶基因的克隆:根据其它壳聚糖酶的DNA序列，取其信号肽前及终止信号TAA的保守基因序列,设计引物如下:Primer I:
[0018]5， _tta_aaaggagctgacaacataat3， ；Primer 2:5， —ttaatatcgtatccttcataaattgca-3’。以菌体基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR扩增。扩增出一约1.3kb的序列，再克隆到T-载体后进行DNA序列测定。通过网上检索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)其序列与其它11种壳聚糖酶有高度同源，达96 %~98 %，它们在GenBank的编号分别是:AAQ 75085、ZP00240544、AAK 07481、YP 084010、NP 832437、NP845032、BAB 19277、AAQ 75084, AAQ 19679、AA049750和AAQ 19678。它们都属于糖苷水解酶8家族，而且全部来源于杆菌属(Bacillus)。该基因编码453个氨基酸，其中N-端46个残基为前导肽，在分泌的成熟酶中被切除。
[0019]实施例4:
[0020]壳聚糖酶最适温度和最适pH的测定:对该壳聚糖酶在不同温度下的反应速度进行了测定。如图6所示，该酶在65°C活性最高，但在50°C的活性也达到了最大活力的70%。综合考虑活力与热稳定性，该酶的其它活力测定均在50°C进行，此时该酶既保持较高的活力又比较稳定。此外，该壳聚糖酶在ρΗ4.5~ρΗ6.0活力最高，pH低于4.5时活力迅速下降。在PH高于6.0时，由于壳聚糖的溶解度降低，所以测得的酶活力也随之降低。该酶在酶解反应缓冲液中(0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)于60°C时半衰期很短，只有几分钟(虽然在该温度下活力高)，而在50°C比较稳定，半衰期约3h。在室温下(23°C )，该酶在反应缓冲液中(0.lmol/L NaAc-HAc,pH4.5)可保存数天而活力不丧失。该酶的底物饱和曲线达到最大反应速度一半时的底物浓度约为0.04mg/ml。酶活力测定在不同温度下进行，底物为
0.5mg/ml壳聚糖(溶于0.lmol/L NaAc-HAc, ρΗ4.5)。壳聚糖酶活力测定在50°C进行，壳聚糖溶解在0.lmol/L NaAc-HAc (pH4.5)缓冲液中。
[0021]测定最适温度时，将0.5mg/ml壳聚糖溶于0.lmol/L NaAc-HAc，pH4.5缓冲液中作为底物，测定该酶在不同温度下的反应速度。测定最适PH时，先将壳聚糖溶解在0.lmol/LHA c中(0.5mg/ml)，然后用4mol/L NaOH调到所需pH值。酶解反应在50°C下测定。
[0022]实施例5:
[0023]内切壳聚糖酶活性的鉴定:内切或外切壳聚糖酶活性通过测定壳聚糖溶液黏度判断，溶液黏度用乌氏黏度计测定。将10mg/ml壳聚糖溶液(溶于0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)加入到乌氏黏度计中，于50°C水浴预热。随后加入纯化的壳聚糖酶，混匀，壳聚糖溶液的粘度迅速下降，30nim内下降超过70% ;而此时还原糖的产生量却很少，约I %。因此可确定该壳聚糖酶为内切酶。酶解反应在50°C进行，于不同时间测定溶液黏度变化，并在不同时间取样测定还原糖的生成量。
[0024]实施例6:
[0025]壳聚糖水解产物 的薄层层析分析:于10mg/ml壳聚糖溶液(溶于0.1mol/LNaAc-HAc, pH4.5)中加入一定量的壳聚糖酶(Img壳聚糖酶水解200g壳聚糖)，50°C下保温反应，于不同反应时间取样在硅胶薄板上层析。薄层层析用正丙醇:30%氨水(体积比2: I)展开，用0.1%印三酮(溶于正丙醇饱和水中)显色。
[0026]该酶水解壳聚糖得到的最终产物为二糖和三糖，而不是单糖。这也进一步说明它是内切壳聚糖酶。通过控制酶解时间，可以得到不同链长的壳寡糖混合物，即该酶可以用来把壳聚糖转化为壳寡糖，可有望用于壳寡糖的生产。
【权利要求】
1.一株革兰氏阳性杆菌，暂命名为Bacillus sp.TK-02。
2.如权利要求1所述的杆菌(Bacillussp.TK-02),其特征在于 1)该菌生长快； 2)其分泌的主要蛋白产物N-端氨基酸序列与已知的几种壳聚糖酶极相似； 3)其核酸序列与其它11种壳聚糖酶有高度同源，达96%~98%； 4)能够非诱导性分泌胞外壳聚糖酶； 5)能够分泌胞外壳聚糖酶，降解壳聚糖得到二糖和三糖； 6)该酶的反应温度为50°C，在PH4.5~PH6.0时活力最高。
3.一种降解壳聚糖生产二糖和三糖的方法，其特征在于利用生物壳聚糖酶降解壳聚糖。
4.一种以内切的方式降 解壳聚糖做种产生壳聚二糖和壳聚三糖。
【文档编号】C12N1/20GK103881943SQ201210563604
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月24日 优先权日:2012年12月24日
【发明者】杨艳菊, 何胜祥 申请人:苏州中同生物科技有限公司