本发明涉及用于抑制asc(含有半胱天冬酶募集结构域[card]的凋亡相关斑点样蛋白)的表达、nlrp3(nlr家族，含有3的比林(pyrin)结构域)的表达和/或nlrp3炎性复合体的形成的方法。特别地，本发明涉及使用双醋瑞因或其类似物来治疗和/或预防由asc和/或nlrp3、和/或由nlrp3炎性复合体的形成介导的病症的方法。还提供了含有双醋瑞因或其类似物的药物组合物。
背景技术：
核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nlr)是进化上保守的具有三联结构的胞质受体家族，其具有相同的中央核苷酸结合和寡聚化(nacht)结构域，其两翼通常为c-末端富亮氨酸重复(lrr)结构域和n-末端效应子pyrin结构域(pyd)或半胱天冬酶募集结构域(card)。一旦被病原体相关分子或损伤相关分子激活，则nlr寡聚化并募集衔接蛋白asc和半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶酶原-1(procaspase-1)并形成炎性复合体，导致半胱天冬酶-1的自催化和活化。活化的半胱天冬酶-1最终将前体促炎细胞因子前体il-1β和前体il-18裂解成其成熟的分泌形式。
从nlr形成炎性复合体已涉及多种疾病的发病机理，包括遗传性自体炎性病况以及慢性疾病。特别地，它已经与如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、代谢综合征、年龄相关性黄斑变性等疾病有关联。
基于上述机制，抑制nlr或asc以及炎性复合体的形成已被认为是治疗由这些蛋白介导的疾病的潜在方式(ozaki等人，journalofinflammationresearch2015,8:15-27)。
美国公开号2014/0199320公开了通过由包括il-1β抑制剂在内的多种抑制剂来抑制il-1β、nlrp3、asc、il-1受体1型、半胱天冬酶-1或组织蛋白酶b来治疗痤疮的方法。然而，其侧重于抑制il-1β而不是nlrp3和asc，因此没有给出哪种抑制剂对nlrp3和asc具有直接抑制作用的线索。
此外，已经开发了许多靶向il-1β和il-18(来自炎性体活化的产物)的试剂以治疗炎性疾病，包括阿那白滞素(anakinra)(重组il-1受体拮抗剂)、卡那(canakinumab)奴单抗(il-1β抗体)、列洛西普(rilonacept)(可溶性诱饵il-1受体)、il-18结合蛋白、可溶性il-18受体和抗il-18受体单克隆抗体，但是这些试剂抑制il-1β或il-18，而非nlrp3和asc。
因此，本领域仍然需要能够抑制nlr或asc并抑制炎性复合体的形成的具体方法和化合物。
技术实现要素：
本发明的发明人发现，双醋瑞因及其类似物是asc和nlr(特别是nlrp3)表达的优良抑制剂，因此能够减少炎性复合体的形成。因此，双醋瑞因及其类似物可用于治疗和/或预防由asc和/或nlr介导的病症。
本发明的主要目的是提供一种抑制细胞中asc表达、nlrp3表达和/或nlrp3炎性复合体的形成的方法，其包括使细胞与选自由双醋瑞因、大黄酸、单乙酰大黄酸、其盐、酯和前药(以下称为“双醋瑞因或其类似物”)组成的组的化合物接触。
本发明的另一目的是提供一种在需要其的受试者中抑制asc表达、nlrp3表达和/或nlrp3炎性复合体的形成的方法，其包括对所述受试者施用双醋瑞因或其类似物。
本发明的又一个目的是提供一种在需要其的受试者中治疗和/或预防由asc和/或nlrp3介导的，和/或由nlrp3炎性复合体的形成介导的病症的方法，其包括对所述受试者施用双醋瑞因或其类似物。
在下面的段落及附图中描述了用于实施本发明的详细技术和优选实施方案。
附图说明
图1显示了thp-1细胞被尿酸单钠(msu)刺激并用各种剂量的大黄酸处理后，从荧光共聚焦显微镜观察到的asc和nlrp3的图像；
图2是显示thp-1细胞被msu刺激并用各种剂量的大黄酸处理后asc染色区域的统计柱状图；以及
图3是显示thp-1细胞被msu刺激并用各种剂量的大黄酸处理后nlrp3染色区域的统计柱状图。
具体实施方式
如本文所用，术语“治疗有效量”指缓和或减轻疾病的一种或多种症状的量。
如本文所用，术语“双醋瑞因或其类似物”指双醋瑞因、大黄酸、单乙酰大黄酸或其盐或酯或前药。
如本文所用，术语“前药”是指任意可以转化为大黄酸并在体内以大黄酸的形式发挥其生理功能的化合物。
除本文另有说明外，本说明书中(特别是本文后的权利要求书中)所使用的术语“a(an)”、“the”等应理解为包括单数形式和复数形式。
在化学上，大黄酸是9,10-二氢-4,5-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽羧酸，其具有式(i)的结构。其前药之一双醋瑞因是4,5-双(乙酰氧基)9,10-二氢-4,5-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽甲酸，其具有式(ii)的结构。双醋瑞因在到达体循环之前完全转化为大黄酸，并在体内以大黄酸的形式发挥其生理功能。
式(i)
式(ii)
双醋瑞因是在治疗骨关节炎中广泛使用的一种抗炎剂，其已被证实能抑制白细胞介素-1(il-1)信号传导。目前，双醋瑞因胶囊有50mg的规格并且在不同国家以各种商品名称销售，包括
如上所述，本发明的发明人发现，双醋瑞因或其类似物可能抑制asc的表达。因此，本发明提供了一种抑制细胞中asc表达的方法，其包括使细胞与选自由双醋瑞因、大黄酸、单乙酰大黄酸、其盐、酯和前药组成的组的化合物接触。
在一个实施方案中，所述方法中的细胞是人类细胞。
本发明还提供了在需要其的受试者中抑制asc表达的方法，其包括对受试者施用双醋瑞因或其类似物。
在一个实施方案中，所述受试者是人。
优选地，asc表达被至少30％，更优选地，被至少50％的双醋瑞因或其类似物抑制。
因为asc参与从各种nlr形成炎性复合物，所以双醋瑞因或其类似物可以通过降低asc表达来抑制这些炎性复合体的形成，并且因此可以用于治疗由这些复合物介导的病症。
迄今为止，已清楚地鉴定了五种不同的炎性复合体，即nlrp1、nlrp2、nlrp3、aim2和ipaf/nlrc4。每个炎性体均响应于不同的刺激而被激活。nlr家族的其他成员，即nlrp6、nlrp7和nlrp12也被描述与asc形成炎性体，导致半胱天冬酶-1活化，尽管它们的特异性配体仍然是未知的。
迄今为止，nlrp3炎性复合体(即，由nlrp3、asc和半胱天冬酶酶原-1形成的炎性体)是最佳表征的炎性体，其已被证明在慢性疾病的发展中具有重要意义。
还发现双醋瑞因或其类似物能抑制nlrp3表达。因此，本发明还涉及一种抑制细胞中nlrp3表达和/或nlrp3炎性复合体的形成的方法，其包括使细胞与双醋瑞因或其类似物接触。
在一个实施方案中，所述方法中的细胞是人类细胞。
本发明还涉及一种在需要其的受试者中抑制nlrp3表达和/或nlrp3炎性复合体的形成的方法，其包括对所述受试者施用双醋瑞因或其类似物。
在一个实施方案中，所述受试者是人。
优选地，nlrp3表达被至少30％，更优选地，被至少50％的双醋瑞因或其类似物抑制。
本发明还提供了一种在需要其的受试者中治疗和/或预防由asc和/或nlrp3和/或nlrp3炎性复合体的形成介导的病症的方法，其包括对需要这种治疗和/或预防的受试者施用治疗有效量的双醋瑞因或其类似物。施用引起受试者中asc表达和/或nlrp3表达降低。
在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，双醋瑞因或其类似物以每天约5至500mg的剂量施用。
优选地，该方法中的病症选自由以下组成的组：痛风，假性痛风，2型糖尿病，阿尔茨海默氏病(ad)，年龄相关性黄斑变性(amd)，动脉粥样硬化，炎性肠病(ibd)，类风湿性关节炎(ra)，癌症，系统性红斑狼疮红斑狼疮(sle)，哮喘，过敏性哮喘，接触性过敏，晒伤，uvb诱导的皮肤损伤，原发性高血压，冷吡啉(cryopyrin)相关周期性综合征(caps)，穆-韦综合征(muckle-wellssyndrome,mws)，家族性寒冷型自身炎症综合征(fcas)，新生儿发作多系统炎症疾病/慢性婴儿神经性皮肤和关节综合征(nomd/cinca)，b细胞非霍奇金淋巴瘤，急性心肌梗塞，心肌梗塞，过敏性鼻炎，鼻息肉病，自身免疫性脑脊髓炎(eae)，多发性硬化症(ms)，人类系统性硬化症中的皮肤纤维化(ssc)，高同半胱氨酸血症(hhcys)相关性肾小球硬化症，终末期肾病(esrd)，动脉粥样硬化，肝纤维化，肾纤维化，肺纤维化，慢性肺纤维化病症，特发性肺纤维化(ipf)，纤维化肺病，囊性纤维化(cf)，心脏纤维化，胰岛纤维化，慢性肾病(ckd)，结晶性肾病，慢性阻塞性肺病(copd)，眼白塞氏病(ocularbechet’sdisease)，葡萄膜炎(uvetitis)，银屑病，石棉沉着病，硅肺，疟疾，登革热，细菌感染，过敏性皮炎，高氧肺损伤，结膜炎，角膜炎，特应性皮炎，银屑病关节炎，白癜风，克罗恩氏病，与肥胖症相关的代谢综合征，炎症相关性癌症，过敏性皮炎，家族性地中海热(fmf)，家族性霍乱发热(fhf)，家族性冷型荨麻疹(fcu)，化脓性无菌性关节炎，坏疽性脓皮病，痤疮(papa)，全身发作性幼年关节炎，甲羟戊酸激酶缺陷mkd)，大疱性表皮松解症(eb)，表皮松解鱼鳞病(ei)以及施尼茨勒综合征(schnitzler'ssyndrome,ss)。
更优选地，该方法中的病症选自由以下组成的组：过敏性哮喘，接触性过敏，晒伤，uvb诱导的皮肤损伤，原发性高血压，冷吡啉相关周期性综合征(caps)，穆-韦综合征(mws)，家族性寒冷型自身炎症综合征(fcas)，新生儿发作多系统炎症疾病/慢性婴儿神经性皮肤和关节综合征(nomd/cinca)，b细胞非霍奇金淋巴瘤，急性心肌梗塞，心肌梗塞，过敏性鼻炎，鼻息肉病，自身免疫性脑脊髓炎(eae)，多发性硬化症(ms)，人类系统性硬化症中的皮肤纤维化(ssc)，高同半胱氨酸血症(hhcys)相关性肾小球硬化症，终末期肾病(esrd)，动脉粥样硬化，肝纤维化，肾纤维化，肺纤维化，慢性肺纤维化病症，特发性肺纤维化(ipf)，纤维化肺病，囊性纤维化(cf)，心脏纤维化，胰岛纤维化，慢性肾病(ckd)，结晶性肾病，慢性阻塞性肺病(copd)，眼白塞氏病，葡萄膜炎，银屑病，石棉沉着病，硅肺，疟疾，登革热，细菌感染，过敏性皮炎，高氧肺损伤，结膜炎，角膜炎，特应性皮炎，银屑病关节炎，白癜风，克罗恩氏病，与肥胖症相关的代谢综合征，炎症相关性癌症，过敏性皮炎，家族性地中海热(fmf)，家族性霍乱发热(fhf)，家族性冷型荨麻疹(fcu)，化脓性无菌性关节炎，坏疽性脓皮病，痤疮(papa)，全身发作性幼年关节炎，甲羟戊酸激酶缺陷mkd)，大疱性表皮松解症(eb)，表皮松解鱼鳞病(ei)以及施尼茨勒综合征(ss)。
本发明还提供了用于治疗由所述机制调节的病症的药物组合物。本发明的药物组合物包含足以达到施用这些组合物的目的的治疗有效量的双醋瑞因或其类似物。本发明的药物组合物可以是任意合适的剂型，包括但不限于片剂、口服溶液、注射剂和其它常用剂型形式。
当向需要其的受试者施用时，双醋瑞因或其类似物可以制备为药物组合物。考虑用于本发明目的的药物组合物可以是固体、溶液、乳液、分散体、胶束、脂质体等形式。可以使用本领域已知的任意方式如静脉内，局部，皮内，肌内，经皮，皮下，鼻内，肠胃外，鞘内，经阴道，经直肠，经结肠(colorectally)，口服，颅内，眶后或体内施用所述组合物。优选地，所述组合物适于口服施用。例如，药物可以与合适的赋形剂混合以制备片剂，胶囊剂，丸剂，糖锭(troche)，锭剂(lozenge)，溶液剂，散剂或颗粒剂，混悬剂，硬胶囊剂或软胶囊剂以及适合使用的任意其它形式。
在一些实施方案中，所述受试者与一种或多种适于治疗相关病症的额外的治疗剂共施用，所述额外的治疗剂选自由凝血因子viii、凝血因子ix、对乙酰氨基酚和非类固醇抗炎药(nsaid)包括cox-2抑制剂组成的组。
非甾体抗炎药的实例包括但不限于2-芳基丙酸如布洛芬、酮咯酸和萘普生；n-芳基邻氨基苯甲酸如甲芬那酸和甲氯芬那酸；昔康类(oxicams)如吡罗昔康和美洛昔康；以及芳基链烷酸如双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛和舒林酸。cox-2抑制剂的实例包括但不限于塞来考昔、艾托考昔、罗非考昔和伐地考昔。凝血因子viii和因子ix的实例包括但不限于helixate、monoclate-p、beriate、benefix、alprolix、idelvion和rixubis。
在一些实施方案中，双醋瑞因或其类似物可以是本发明组合物中唯一的活性剂。本发明的组合物可以含有本领域常用的药物赋形剂(即非活性化合物)。
合适的赋形剂包括抗氧化剂、胶凝剂、ph调节剂/缓冲剂、渗透促进剂、防腐剂、螯合剂、保湿剂(humectant)、表面活性剂、乳化剂、增稠剂、溶剂和稳定剂。本文中，本发明中的赋形剂/成分可以具有多种功能，例如，赋形剂可以用作表面活性剂和/或稳定剂和/或乳化剂等。
抗氧化剂的实例包括但不限于维生素c、维生素a和α-硫辛酸、抗坏血酸棕榈酸酯、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)等中的一种或多种。
合适的胶凝剂可以包括但不限于瓜尔胶，黄原胶和卡拉胶，阴离子、非离子、阳离子和亲脂改性的瓜尔胶，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，纤维素树脂，聚乙二醇，羟烷基纤维素，羧烷基纤维素，聚亚烷基胺等中的一种或多种。
ph调节剂/缓冲剂的实例包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、氢氧化铝/碳酸氢钠共沉淀物、氨基酸、甘氨酸铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、醋酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸钠、醋酸钠、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、醋酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙、乳酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙等中的一种或多种。
渗透促进剂的实例包括但不限于二乙二醇单乙醚，二甲基亚砜，丙二醇，肉豆蔻酸异丙酯(ipm)，卡泊三烯(cal-cipotriene)，去垢剂，软化剂，乙氧基二甘醇(ethoxydiglycol)，三醋精，丙二醇，苄醇，月桂醇聚醚硫酸钠，二甲基异山梨醇，肉豆蔻酸异丙酯，中链甘油三酯油(mct油)，薄荷醇，棕榈酸异丙酯，异硬脂酸异丙酯，单硬脂酸丙二醇酯，卵磷脂，己二酸二异丙酯，癸二酸二乙酯，油酸，油酸乙酯，尿素，油酸甘油酯，辛酸/癸酸甘油三酯，丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯，月桂醇聚醚4(laureth4)，油醇聚醚-2(oleth-2)，油醇聚醚-20，碳酸丙烯酯，壬苯醇醚-9，2-正-壬基-1,3-二氧戊环，c7至c14烃基取代的1,3-二氧戊环、1,3-二氧杂环已烷或缩醛，以及壬苯醇醚-15等中的一种或多种。
防腐剂可以是例如苯甲酸钠，丁基化羟基甲苯，丁基化羟基茴香醚，乙二胺四乙酸，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯甲醇，苯乙醇，脱氢乙酸，山梨酸，苯扎氯铵，苄索氯铵，苯酚，硝酸苯汞，硫汞撒(thimerosal)，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯和/或丙酯中的一种或多种。
合适的溶剂的实例包括但不限于醇，蓖麻油，己二酸二异丙酯，乙氧基化醇，乙醇，柠檬酸脂肪醇酯，甘油，1,2,6-己三醇，己二醇，异丙醇，肉豆蔻酸异丙酯，棕榈酸异丙酯，矿物油，磷酸，聚乙二醇300，聚乙二醇400，聚乙二醇1450，聚乙二醇8000，聚乙二醇1000单鲸蜡基醚，聚乙二醇单硬脂酸酯，聚乙二醇400单硬脂酸酯，聚乙二醇，聚氧乙烯20鲸蜡硬脂基醚，聚氧丙烯15-硬脂基醚，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯，碳酸丙烯酯，丙二醇，纯化水，sd醇40，饱和脂肪酸的甘油三酯等中的一种或多种。
合适的稳定剂或表面活性剂可以是例如离子型聚山梨醇酯表面活性剂吐温20、吐温40、吐温60、吐温80，壬基酚聚乙二醇醚，(烷基酚-羟基聚氧乙烯)，聚(氧-1,2-乙二烷基)，α-(4-壬基苯酚)-ω-羟基-，支链(即
即使所提供的组合物的成分可能是用于非治疗上述相关病症目的的现有技术制剂中的活性组分，但只要该成分不以足以有效治疗相关病症的量存在，则对于所提供的组合物的目的，仍将其认为是药物赋形剂。
双醋瑞因或其类似物和额外的治疗剂可以包含在单一制剂中或可以作为单独的制剂共施用。
在下文中，将参考以下实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。
[实施例1]
细胞培养
将20mg的大黄酸粉末溶于1ml100％二甲基亚砜(dmso)中，用0.22μm孔径的滤膜灭菌，使用前于-20℃保存。在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中制备尿酸单钠(msu)晶体(10mg/ml)。将腺苷5'-三磷酸二钠盐(atp)溶解于ddh2o中，并用0.22μm孔滤膜灭菌。将人急性单核细胞白血病细胞系(
免疫荧光染色
将pma预处理的thp-1细胞(1×106个细胞/ml)与0、5或10μg/ml大黄酸过夜培养，然后用100μg/mlmsu晶体刺激6小时。进行荧光共聚焦试验以检测处理后多聚甲醛固定的thp-1细胞中人asc和nlrp3的表达。用奥林巴斯fv1000共聚焦显微镜获取图像。通过metamorph分析仪对asc(绿色)和nlrp3(红色)染色分布的染色区域进行定量和分析。用dapi核染色的图像合并显示，asc与nlrp3(黄色)共区域化(比例尺，10μm)。将染色切片标准化为仅pma的组，并以相对倍数表示，将未处理的对照主观设为1。数据来自一个具有三个视野(平均值±sd)的实验。通过双尾非配对t检验确定p-值。
结果
在nlrp3炎性体活化期间，nlrp3和asc结构域在细胞中聚集。使用荧光共焦试验来测量用大黄酸处理的msu刺激的thp-1细胞中的nlrp3和asc蛋白水平，并且定量染色面积。如图1至3所示，免疫荧光染色结果显示，msu晶体上调nlrp3和asc蛋白表达(p分别等于0.0023和0.0032)。用大黄酸处理后，asc切片的染色以剂量依赖性方式显著降低约64.0％和79.0％平均强度的面积/细胞(p分别为0.0011和0.0022)。此外，在msu诱导的炎症中，大黄酸抑制nlrp3水平约62.5％和84.1％平均强度的区域/细胞(p分别等于0.014和0.0012)。
该研究显示，大黄酸抑制asc和nlrp3的表达，由此抑制asc斑点和nlrp3炎性复合体组装体的形成。
以上公开内容涉及详细的技术内容及其发明特征。本领域的技术人员可以基于所描述的本发明的公开和建议进行各种修改和替换，而不背离其特征。尽管如此，尽管在以上描述中没有充分公开这样的修改和替换，但是在所附的权利要求中已经基本上涵盖了它们。