色素性视网膜炎的治疗的制作方法

本发明涉及在眼病基因疗法中使用的化合物。更具体地，本发明涉及病毒载体，特别是腺伴随病毒(AAV)载体，用于在治疗或预防色素性视网膜炎(RP)中的用途，其中所述病毒载体能够将色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)递送至眼。发明背景色素性视网膜炎(RP)是表型关联的一组导致视觉逐渐降低的遗传性视网膜营养不良(inheritedretinaldystrophies)。RP影响3000-4000人中的约1个。RP的早期症状包括夜间和周边视力恶化。随着疾病的进展，细节、中心和颜色视觉也可能受到影响。RP症状的发病年龄是可变的，但通常在10到30岁之间，并且恶化速度因个体而异。RP通常由杆状感光细胞的进行性变性引起。然而，视网膜色素上皮(RPE)和视锥感光细胞在疾病进展期间也可以变性。RP可能由例如与眼健康和功能的许多不同基因之一中的突变引起。在RP的所有单基因原因中，由色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)基因缺陷导致的X连锁疾病是最常见的。X连锁的色素性视网膜炎(XLRP)被认为是色素性视网膜炎的最为严重的形式。患有XLRP的受试者在生命的头20年经历了周边视野的限制和夜盲。另外，眩光、眼睛的不自主摆动，色觉障碍和中心视力减弱表征这种病患。因此，即使在完成中学教育之前，患者通常也会成为法定的盲人。RPGR基因是高致突变性的，这增加了体内产生致病突变的可能性。然而，当产生编码RPGR的载体用于基因疗法时，这种致突变性质也产生了问题。事实上，以前的开发用于XLRP的基因替代疗法的策略已经被此类突变所阻碍：仅最近，有前景的研究项目由于在转基因盒的ORF15区域发现了突变而被推迟。在另一个项目中，通过Western印迹检测到可变RPGR剪接变体(Wu,Z.etal.(2015)Hum.Mol.Genet.24:3956-3970)。目前没有预防RP的发展或在疾病发作后改善视觉的得到批准的疗法。因此，对RP的治疗(特别是防止视觉功能恶化或实现受影响个体的视觉的改善)仍然存在显著的需求。发明概述本发明人已经令人惊讶地发现可以工程化改造色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(isoform)(RPGRORF15)基因的序列以增加序列稳定性，例如通过减少或防止复制期间突变的发生(即增加复制的保真度)。本发明人还出人意料地发现可以减轻影响基因功能的工程化的风险。此外，本发明人已经证明了工程化的基因成功治疗色素性视网膜炎的动物模型。因此，一方面，本发明提供了多核苷酸，其包含编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的核苷酸序列，其中已对所述RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以增加所述序列复制的保真度。优选地，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以减少可变剪接变体的生成。优选地，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以最小化或避免相较于野生型序列的新CpG位点创建。在一个实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含少于220、210、200、190、170、165、160、150、140、130、120、110或100个CpG位点。优选地，已通过用GGC密码子替换了一些或所有GGN密码子(当GGN密码子最初不是GGC密码子时)来对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化。优选地，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以最小化或避免RPGRORF15编码核苷酸序列中富含嘌呤(即富含GA)的区域中新的胸腺嘧啶核苷酸的引入，所述区域例如ORF15外显子区域(这对应于RPGRORF15的核苷酸1754-3459，如SEQIDNO:2的核苷酸1754-3459)。优选地，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以相较于野生型序列减少GT位点(即潜在剪接供体位点)的数量。在一个实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含少于120、115、110、105、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个GT位点。在优选的实施方案中，对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含少于105个GT位点。优选地，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以避免创建异常多聚A信号(如AATAAA)。在一个实施方案中，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以相对于野生型序列减少嘌呤核苷酸的数量。野生型序列例如可以是SEQIDNO:2的序列。优选地，通过用嘧啶核苷酸替换嘌呤核苷酸来减少嘌呤核苷酸的数量。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列的富含嘌呤(即富含GA)的区域中的嘌呤核苷酸的数量是减少的，所述区域例如ORF15外显子区域，(其对应于RPGRORF15的核苷酸1754-3459，例如SEQIDNO:2的核苷酸1754-3459)。在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处不包含嘌呤核苷酸：核苷酸1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2622、2634、2661、2673、2706、2712、2763、2775、2796、2811、2817、2832、2838、2871、2886、2892、2898、2910、2922、2931、2937、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于在SEQIDNO:3中发现的那些。在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列在至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90个或所有这些核苷酸位置处不包含嘌呤核苷酸。优选地，核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。更优选地，该核苷酸序列编码SEQIDNO:1的氨基酸序列。在另一实施方案中，通过用嘧啶核苷酸(例如胸腺嘧啶或胞嘧啶)替换以下位置处的嘌呤核苷酸从SEQIDNO:2衍生本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列：位置1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2622、2634、2661、2673、2706、2712、2763、2775、2796、2811、2817、2832、2838、2871、2886、2892、2898、2910、2922、2931、2937、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，在这些位置处的核苷酸对应于在SEQIDNO:3中发现的那些。在另一实施方案中，已经在这些核苷酸位置的至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或所有位置处替换嘌呤核苷酸。优选地，核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。更优选地，核苷酸序列编码SEQIDNO:1的氨基酸序列。根据本发明，可以将嘌呤核苷酸数量减少野生型序列(如SEQIDNO:2)中的嘌呤核苷酸数量的至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。根据本发明，可以将嘌呤核苷酸数量减少野生型序列(如SEQIDNO:2)中的嘌呤核苷酸数量的0.5-10％、0.5-7.5％、0.5-5％、0.5-4.5％、0.5-4％、0.5-3.5％、0.5-3％、1-5％、1-4.5％、1-4％、1-3.5％或1-3％。在一个实施方案中，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以相较于野生型序列减少腺嘌呤核苷酸的数量。野生型序列例如可以是SEQIDNO:2的序列。在另一实施方案中，已经将腺嘌呤核苷酸的数量减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个。在一个实施方案中，用嘧啶核苷酸(例如胸腺嘧啶或胞嘧啶)替换在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处的腺嘌呤：核苷酸58、114、123、129、181、213、219、226、237、285、306、309、315、324、330、339、400、444、456、478、480、594、606、618、697、744、807、852、877、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1194、1197、1221、1249、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1413、1446、1452、1464、1474、1482、1519、1542、1584、1608、1653、1674、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1854、1881、1893、1902、1909、1929、1960、1987、1992、1998、2020、2047、2049、2062、2067、2076、2167、2169、2190、2208、2229、2259、2298、2323、2361、2373、2382、2403、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2622、2661、2673、2712、2775、2811、2832、2886、2910、2931、2958、3033、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3306、3321、3369、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于在SEQIDNO:3中发现的那些。在一个实施方案中，本发明RPGRORF15编码核苷酸序列在至少一个位置处(优选在至少5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170或180个位置处，优选在所有位置处)不包含嘌呤核苷酸，所述位置对应于其中SEQIDNO:2(wtRPGR)中的嘌呤核苷酸与SEQIDNO:3(coRPGR)中的嘧啶核苷酸比对的位置，例如在图2的序列比对中(wtRPGR,“原始的”；coRPGR,“优化的”)。在另一实施方案中，本发明RPGRORF15编码核苷酸序列在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处不包含嘌呤核苷酸：核苷酸33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2622、2634、2661、2673、2706、2712、2763、2775、2796、2811、2817、2832、2838、2871、2886、2892、2898、2910、2922、2931、2937、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，在这些位置处的核苷酸对应于在SEQIDNO:3中发现的那些。在另一实施方案中，本发明RPGRORF15编码核苷酸序列在至少2,3,4,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180或所有这些核苷酸位置处不包含嘌呤核苷酸。优选地，核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。更优选地，核苷酸序列编码SEQIDNO:1的氨基酸序列。应当注意，本申请中，通过“对应”于SEQIDNO:2中特定位置处的那些位置来定义核苷酸位置。这不应被解释为意味着本发明的序列必须包括存在于SEQIDNO:2中的序列。这里，遵循通过将SEQIDNO:2的5’腺嘌呤指定为核苷酸1的惯例来对RPGRORF15编码核苷酸序列编号。本文参照该编号惯例描述了单个核苷酸的身份和突变的位置。技术人员通过进行与SEQIDNO:2的序列比对可以容易地确定同源序列中的类似位置。图2中示出了此类比对的例子。在另一实施方案中，通过用嘧啶核苷酸(如胸线嘧啶或胞嘧啶)替换以下位置处的嘌呤核苷酸从SEQIDNO:2衍生本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列：核苷酸33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2622、2634、2661、2673、2706、2712、2763、2775、2796、2811、2817、2832、2838、2871、2886、2892、2898、2910、2922、2931、2937、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于在SEQIDNO:3中发现的那些。在另一实施方案中，已在至少2,3,4,5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180或所有这些核苷酸位置处替换嘌呤核苷酸。优选地，已在所有这些核苷酸位置处替换嘌呤核苷酸。优选地，核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的氨基酸序列。更优选地，核苷酸序列编码SEQIDNO:1的氨基酸序列。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列使得对应于SEQIDNO:2的位置33的核苷酸是T，对应于位置58的核苷酸是T，对应于位置59的核苷酸是C，对应于位置114的核苷酸是C，对应于位置123的核苷酸是T，对应于位置129的核苷酸是C，对应于位置181的核苷酸是T，对应于位置182的核苷酸是C，对应于位置213的核苷酸是C，对应于位置219的核苷酸是T，对应于位置226的核苷酸是T，对应于位置227的核苷酸是C，对应于位置237的核苷酸是C，对应于位置267的核苷酸是C，对应于位置285的核苷酸是C，对应于位置306的核苷酸是C，对应于位置309的核苷酸是C，对应于位置315的核苷酸是C，对应于位置324的核苷酸是C，对应于位置330的核苷酸是C，对应于位置339的核苷酸是C，对应于位置400的核苷酸是T，对应于位置401的核苷酸是C，对应于位置444的核苷酸是C，对应于位置456的核苷酸是T，对应于位置478的核苷酸是C，对应于位置480的核苷酸是C，对应于位置510的核苷酸是C，对应于位置594的核苷酸是C，对应于位置606的核苷酸是C，对应于位置618的核苷酸是C，对应于位置639的核苷酸是C，对应于位置697的核苷酸是C，对应于位置726的核苷酸是T，对应于位置744的核苷酸是C，对应于位置777的核苷酸是T，对应于位置807的核苷酸是C，对应于位置852的核苷酸是C，对应于位置877的核苷酸是C，对应于位置879的核苷酸是C，对应于位置888的核苷酸是T，对应于位置891的核苷酸是C，对应于位置921的核苷酸是C，对应于位置930的核苷酸是C，对应于位置960的核苷酸是C，对应于位置1042的核苷酸是C，对应于位置1050的核苷酸是C，对应于位置1116的核苷酸是T，对应于位置1140的核苷酸是T，对应于位置1183的核苷酸是T，对应于位置1184的核苷酸是C，对应于位置1194的核苷酸是T，对应于位置1197的核苷酸是C，对应于位置1221的核苷酸是T，对应于位置1249的核苷酸是C，对应于位置1251的核苷酸是C，对应于位置1257的核苷酸是T，对应于位置1273的核苷酸是C，对应于位置1276的核苷酸是C，对应于位置1281的核苷酸是C，对应于位置1290的核苷酸是T，对应于位置1293的核苷酸是C，对应于位置1357的核苷酸是C，对应于位置1372的核苷酸是T，对应于位置1373的核苷酸是C，对应于位置1413的核苷酸是C，对应于位置1446的核苷酸是C，对应于位置1452的核苷酸是C，对应于位置1464的核苷酸是T，对应于位置1474的核苷酸是T，对应于位置1475的核苷酸是C，对应于位置1482的核苷酸是C，对应于位置1519的核苷酸是T，对应于位置1520的核苷酸是C，对应于位置1542的核苷酸是T，对应于位置1584的核苷酸是T，对应于位置1590的核苷酸是C，对应于位置1599的核苷酸是T，对应于位置1608的核苷酸是C，对应于位置1653的核苷酸是C，对应于位置1668的核苷酸是C，对应于位置1674的核苷酸是T，对应于位置1689的核苷酸是C，对应于位置1692的核苷酸是T，对应于位置1734的核苷酸是T，对应于位置1761的核苷酸是C，对应于位置1776的核苷酸是C，对应于位置1788的核苷酸是C，对应于位置1803的核苷酸是T，对应于位置1824的核苷酸是C，对应于位置1845的核苷酸是C，对应于位置1854的核苷酸是C，对应于位置1881的核苷酸是T，对应于位置1893的核苷酸是T，对应于位置1902的核苷酸是C，对应于位置1909的核苷酸是T，对应于位置1910的核苷酸是C，对应于位置1929的核苷酸是T，对应于位置1932的核苷酸是C，对应于位置1960的核苷酸是C，对应于位置1987的核苷酸是T，对应于位置1988的核苷酸是C，对应于位置1992的核苷酸是C，对应于位置1998的核苷酸是T，对应于位置2020的核苷酸是C，对应于位置2031的核苷酸是C，对应于位置2047的核苷酸是C，对应于位置2049的核苷酸是C，对应于位置2062的核苷酸是C，对应于位置2067的核苷酸是T，对应于位置2076的核苷酸是C，对应于位置2121的核苷酸是C，对应于位置2167的核苷酸是C，对应于位置2169的核苷酸是C，对应于位置2190的核苷酸是C，对应于位置2193的核苷酸是C，对应于位置2208的核苷酸是C，对应于位置2229的核苷酸是C，对应于位置2259的核苷酸是C，对应于位置2283的核苷酸是C，对应于位置2298的核苷酸是C，对应于位置2323的核苷酸是C，对应于位置2343的核苷酸是C，对应于位置2346的核苷酸是C，对应于位置2361的核苷酸是C，对应于位置2373的核苷酸是C，对应于位置2382的核苷酸是C，对应于位置2388的核苷酸是C，对应于位置2403的核苷酸是C，对应于位置2409的核苷酸是C，对应于位置2410的核苷酸是C，对应于位置2412的核苷酸是C，对应于位置2448的核苷酸是C，对应于位置2457的核苷酸是C，对应于位置2472的核苷酸是C，对应于位置2476的核苷酸是C，对应于位置2478的核苷酸是C，对应于位置2505的核苷酸是C，对应于位置2520的核苷酸是C，对应于位置2547的核苷酸是C，对应于位置2574的核苷酸是C，对应于位置2622的核苷酸是C，对应于位置2634的核苷酸是C，对应于位置2661的核苷酸是C，对应于位置2673的核苷酸是C，对应于位置2706的核苷酸是C，对应于位置2712的核苷酸是C，对应于位置2763的核苷酸是C，对应于位置2775的核苷酸是C，对应于位置2796的核苷酸是C，对应于位置2811的核苷酸是C，对应于位置2817的核苷酸是C，对应于位置2832的核苷酸是C，对应于位置2838的核苷酸是C，对应于位置2871的核苷酸是C，对应于位置2886的核苷酸是C，对应于位置2892的核苷酸是C，对应于位置2898的核苷酸是C，对应于位置2910的核苷酸是C，对应于位置2992的核苷酸是C，对应于位置2931的核苷酸是C，对应于位置2937的核苷酸是C，对应于位置2958的核苷酸是C，对应于位置2970的核苷酸是C，对应于位置2997的核苷酸是C，对应于位置3033的核苷酸是C，对应于位置3039的核苷酸是C，对应于位置3069的核苷酸是C，对应于位置3075的核苷酸是C，对应于位置3117的核苷酸是C，对应于位置3129的核苷酸是C，对应于位置3156的核苷酸是C，对应于位置3166的核苷酸是C，对应于位置3235的核苷酸是C，对应于位置3246的核苷酸是C，对应于位置3273的核苷酸是C，对应于位置3285的核苷酸是C，对应于位置3306的核苷酸是C，对应于位置3321的核苷酸是C，对应于位置3369的核苷酸是T，对应于位置3399的核苷酸是C，对应于位置3405的核苷酸是T和/或对应于位置3438的核苷酸是C。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列在对应于SEQIDNO:2的核苷酸1689和/或3438的位置处不包含嘌呤核苷酸。可用嘧啶(优选C)替换位置1689处的核苷酸。可用嘧啶(优选C)替换位置3438处的腺嘌呤。在一个实施方案中，通过用嘧啶核苷酸替换位置3405处腺嘌呤核苷酸而不引入CpG二核苷酸来从SEQIDNO:2衍生RPGRORF15编码核苷酸序列。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列包含在对应于SEQIDNO:2的位置3405的位置处的腺嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，编码的RPGRORF15蛋白质是人类RPGRORF15。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列包含选自以下的一个或多个核苷酸：在对应于SEQIDNO:2的位置30的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置33的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置966的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置969的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1011的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1014的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1029的位置处的T，对应于SEQIDNO:2的位置1299的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1689的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3363的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3405的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3408的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3409的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3410的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3432的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3438的位置处的C，以及在对应于SEQIDNO:2的位置3456的位置处的A。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列包含选自以下的一个或多个核苷酸：在对应于SEQIDNO:2的位置30的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置33的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置48的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置57的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置60的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置69的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置72的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置171的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置189的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置441的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置537的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置546的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置786的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置792的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置966的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置969的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置990的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1011的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1014的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1029的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1299的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1689的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3355的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3357的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3363的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3403的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3404的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3405的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3408的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3409的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3410的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3432的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3438的位置处的C，以及在对应于SEQIDNO:2的位置3456的位置处的A。在一个实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含选自下组的序列：(a)编码与SEQIDNO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)与SEQIDNO:3具有至少80％同一性的的核苷酸序列；和(c)SEQIDNO:3的核苷酸序列，优选地，其中由核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地其中所述氨基酸序列基本上保留了由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。本发明还提供了多核苷酸，其包含编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)或其功能性变体的核苷酸序列，所述功能性变体与SEQIDNO:1具有至少80％同一性，其中所述核苷酸序列选自以下的一个或多个(优选所有)的核苷酸：在对应于SEQIDNO:2的位置30的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置33的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置966的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置969的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1011的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1014的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1029的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1299的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1689的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3363的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3405的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3408的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3409的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3410的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3432的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3438的位置处的C和在对应于SEQIDNO:2的位置3456的位置处的A。所述多核苷酸可以包含所述核苷酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个。本发明还提供了多核苷酸，其包含编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)或其功能性变体的核苷酸序列，所述功能性变体与SEQIDNO:1具有至少80％同一性，其中所述核苷酸序列选自下组：(a)与SEQIDNO:3具有至少80％同一性的核苷酸序列，其中所述序列包含选自以下的一个或多个，优选所有核苷酸：在对应于SEQIDNO:2的位置30的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置33的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置48的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置57的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置60的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置69的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置72的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置171的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置189的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置441的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置537的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置546的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置786的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置792的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置966的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置969的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置990的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1011的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1014的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1029的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置1299的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置1689的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3355的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3357的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3363的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3403的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3404的位置处的C，在对应于SEQIDNO:2的位置3405的位置处的T，在对应于SEQIDNO:2的位置3408的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3409的位置处的A，在对应于SEQIDNO:2的位置3410的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3432的位置处的G，在对应于SEQIDNO:2的位置3438的位置处的C，以及在对应于SEQIDNO:2的位置3456的位置处的A；或(b)SEQIDNO:3的核苷酸序列。多核苷酸可以包含所述核苷酸中的2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33或34个。优选地，所述功能性变体基本上保留由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。在一个实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含与SEQIDNO:3具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，优选地，其中所述由核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。优选地，由本发明RPGRORF15编码核苷酸序列编码的蛋白质提供与由SEQIDNO:1代表的蛋白质提供的相同或改善的视网膜细胞功能发挥和/或视觉功能。在优选的实施方案中，本发明RPGRORF15编码核苷酸序列编码SEQIDNO:1的蛋白质。本发明的多核苷酸相对于包含SEQIDNO:2的人野生型RPGRORF15的等同多核苷酸可具有基本相同或增加的复制保真度。本发明的多核苷酸相对于包含SEQIDNO:2的人野生型RPGRORF15的等同多核苷酸可具有增加的稳定性和/或在多核苷酸复制周期期间不太易于发生突变。本发明的多核苷酸相对于包含SEQIDNO:2的人野生型RPGRORF15的等同多核苷酸可赋予更高的翻译和/或蛋白表达速率。本发明的多核苷酸相对于包含SEQIDNO:2的人野生型RPGRORF15的等同多核苷酸可减少或避免可变剪接的变体和/或截短的蛋白质产生。在优选的实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列具有与SEQIDNO:3基本上相同或增加的复制保真度。可以通过技术人员已知的多种方法中的任一种(例如本文所述的方法)来测量复制保真度。在优选的实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:3的核苷酸序列。RPGRORF15编码核苷酸序列可包含少于165个CpG二核苷酸和/或包含不超过2个CpG岛。可以容易地使用常规方法，例如使用EMBOSSCpgplot(http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/help/)来鉴定CpG岛。本发明的多核苷酸可以编码相对于野生型序列缩短的RPGRorf15。就此而言，本文描述的密码子优化适用于缩短序列的相应部分。优选地，缩短的RPGRorf15具有拯救RPGR功能丧失的能力。本发明的RPGRorf15编码序列可以编码WO2016/001693中公开的缩短的RPGRorf15。在一个实施方案中，本发明的RPGRorf15编码序列通过除去对应于SEQIDNO:2的位置2485至2940的一些或所有核苷酸而缩短。根据该实施方案，RPGRorf15编码核苷酸序列优选在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处不包含嘌呤核苷酸：核苷酸33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于SEQIDNO:3中发现的那些。根据本实施方案，优选的RPGRorf15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:9中所示的序列或由SEQIDNO:9中所示的序列组成。本发明的多核苷酸可以包含：(a)SEQIDNO:9中所示的序列；(b)包含SEQIDNO:3序列但具有对应于以下的缺失的核苷酸序列：(i)SEQIDNO:10的序列，(ii)SEQIDNO:10的序列和在SEQIDNO:3的序列中SEQIDNO:10一侧或两侧上SEQIDNO:10侧翼的至多75个额外的核苷酸，或(iii)来自SEQIDNO:10内的390或更多个连续的核苷酸；或(c)根据(a)或(b)的核苷酸序列但在其5’和3’端之一或两者截短至多150个核苷酸/端。优选地，所述缺失包含SEQIDNO:10的至少400、420或450个连续的核苷酸。ATGAGAGAGCCAGAGGAGCTGATGCCAGACAGTGGAGCAGTGTTTACATTCGGAAAATCTAAGTTCGCTGAAAATAACCCAGGAAAGTTCTGGTTTAAAAACGACGTGCCCGTCCACCTGTCTTGTGGCGATGAGCATAGTGCCGTGGTCACTGGGAACAATAAGCTGTACATGTTCGGGTCCAACAACTGGGGACAGCTGGGGCTGGGATCCAAATCTGCTATCTCTAAGCCAACCTGCGTGAAGGCACTGAAACCCGAGAAGGTCAAACTGGCCGCTTGTGGCAGAAACCACACTCTGGTGAGCACCGAGGGCGGGAATGTCTATGCCACCGGAGGCAACAATGAGGGACAGCTGGGACTGGGGGACACTGAGGAAAGGAATACCTTTCACGTGATCTCCTTCTTTACATCTGAGCATAAGATCAAGCAGCTGAGCGCTGGCTCCAACACATCTGCAGCCCTGACTGAGGACGGGCGCCTGTTCATGTGGGGAGATAATTCAGAGGGCCAGATTGGGCTGAAAAACGTGAGCAATGTGTGCGTCCCTCAGCAGGTGACCATCGGAAAGCCAGTCAGTTGGATTTCATGTGGCTACTATCATAGCGCCTTCGTGACCACAGATGGCGAGCTGTACGTCTTTGGGGAGCCCGAAAACGGAAAACTGGGCCTGCCTAACCAGCTGCTGGGCAATCACCGGACACCCCAGCTGGTGTCCGAGATCCCTGAAAAAGTGATCCAGGTCGCCTGCGGGGGAGAGCATACAGTGGTCCTGACTGAGAATGCTGTGTATACCTTCGGACTGGGCCAGTTTGGCCAGCTGGGGCTGGGAACCTTCCTGTTTGAGACATCCGAACCAAAAGTGATCGAGAACATTCGCGACCAGACTATCAGCTACATTTCCTGCGGAGAGAATCACACCGCACTGATCACAGACATTGGCCTGATGTATACCTTTGGCGATGGACGACACGGGAAGCTGGGACTGGGACTGGAGAACTTCACTAATCATTTTATCCCCACCCTGTGTTCTAACTTCCTGCGGTTCATCGTGAAACTGGTCGCTTGCGGCGGGTGTCACATGGTGGTCTTCGCTGCACCTCATAGGGGCGTGGCTAAGGAGATCGAATTTGACGAGATTAACGATACATGCCTGAGCGTGGCAACTTTCCTGCCATACAGCTCCCTGACTTCTGGCAATGTGCTGCAGAGAACCCTGAGTGCAAGGATGCGGAGAAGGGAGAGGGAACGCTCTCCTGACAGTTTCTCAATGCGACGAACCCTGCCACCTATCGAGGGAACACTGGGACTGAGTGCCTGCTTCCTGCCTAACTCAGTGTTTCCACGATGTAGCGAGCGGAATCTGCAGGAGTCTGTCCTGAGTGAGCAGGATCTGATGCAGCCAGAGGAACCCGACTACCTGCTGGATGAGATGACCAAGGAGGCCGAAATCGACAACTCTAGTACAGTGGAGTCCCTGGGCGAGACTACCGATATCCTGAATATGACACACATTATGTCACTGAACAGCAATGAGAAGAGTCTGAAACTGTCACCAGTGCAGAAGCAGAAGAAACAGCAGACTATTGGCGAGCTGACTCAGGACACCGCCCTGACAGAGAACGACGATAGCGATGAGTATGAGGAAATGTCCGAGATGAAGGAAGGCAAAGCTTGTAAGCAGCATGTCAGTCAGGGGATCTTCATGACACAGCCAGCCACAACTATTGAGGCTTTTTCAGACGAGGAAGTGGAGATCCCCGAGGAAAAAGAGGGCGCAGAAGATTCCAAGGGGAATGGAATTGAGGAACAGGAGGTGGAAGCCAACGAGGAAAATGTGAAAGTCCACGGAGGCAGGAAGGAGAAAACAGAAATCCTGTCTGACGATCTGACTGACAAGGCCGAGGTGTCCGAAGGCAAGGCAAAATCTGTCGGAGAGGCAGAAGACGGACCAGAGGGACGAGGGGATGGAACCTGCGAGGAAGGCTCAAGCGGGGCTGAGCATTGGCAGGACGAGGAACGAGAGAAGGGCGAAAAGGATAAAGGCCGCGGGGAGATGGAACGACCTGGAGAGGGCGAAAAAGAGCTGGCAGAGAAGGAGGAATGGAAGAAAAGGGACGGCGAGGAACAGGAGCAGAAAGAAAGGGAGCAGGGCCACCAGAAGGAGCGCAACCAGGAGATGGAAGAGGGCGGCGAGGAAGAGCATGGCGAGGGAGAAGAGGAAGAGGGCGATAGAGAAGAGGAAGAGGAAAAAGAAGGCGAAGGGAAGGAGGAAGGAGAGGGCGAGGAAGTGGAAGGCGAGAGGGAAAAGGAGGAAGGAGAACGGAAGAAAGAGGAAAGAGCCGGCAAAGAGGAAAAGGGCGAGGAAGAGGGCGATCAGGGCGAAGGCGAGGAGGAAGAGACCGAGGGCCGCGGGGAAGAGAAAGAGGAGGGAGGAGAGGTGGAGGGCGGAGAGGTCGAAGAGGGAAAGGGCGAGCGCGAAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGCGAAGGAGAAGGCGAGGAAGAAGAGGGAGAGGAGGAAGGCGAGGAGGAAGGAGAGGGGGAGGAGGAGGGAGAAGGCGAGGGCGAAGAAGAAGAAGAGGGAGAAGTGGAGGGCGAAGTCGAGGGGGAGGAGGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGAAGAGGGCGAAGAAGAAGGCGAGGAAAGAGAAAAAGAGGGAGAAGGCGAGGAAAACCGGAGAAATAGGGAAGAGGAGGAAGAGGAAGAGGGAAAGTACCAGGAGACAGGCGAAGAGGAAAACGAGCGGCAGGATGGCGAGGAATATAAGAAAGTGAGCAAGATCAAAGGATCCGTCAAGTACGGCAAGCACAAAACCTATCAGAAGAAAAGCGTGACCAACACACAGGGGAATGGAAAAGAGCAGAGGAGTAAGATGCCTGTGCAGTCAAAACGGCTGCTGAAGAATGGCCCATCTGGAAGTAAAAAATTCTGGAACAATGTGCTGCCCCACTATCTGGAACTGAAATAA(SEQIDNO:9)GAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCGAGGAAGAAGAGGGCGAGGGGGAAGAAGAGGAGGGAGAGGGCGAAGAGGAAGAGGGGGAGGGAAAGGGCGAAGAGGAAGGAGAGGAAGGGGAGGGAGAGGAAGAGGGGGAGGAGGGCGAGGGGGAAGGCGAGGAGGAAGAAGGAGAGGGGGAAGGCGAAGAGGAAGGCGAGGGGGAAGGAGAGGAGGAAGAAGGGGAAGGCGAAGGCGAAGAGGAGGGAGAAGGAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGAGAAGGGAAGGGCGAGGAGGAAGGCGAAGAGGGAGAGGGGGAAGGCGAGGAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGGAGAGGACGGCGAGGGCGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGGGAATGGGAAGGCGAAGAAGAGGAAGGCGAAGGCGAAGGCGAAGAAGAGGGCGAAGGGGAGGGCGAGGAGGGCGAAGGCGAA(SEQIDNO:10)本发明的RPGRorf15编码核苷酸序列可以编码WO2016/014353中公开的缩短的RPGRorf15。在一个实施方案中，本发明的RPGRorf15编码序列通过除去对应于SEQIDNO:2的位置2086至3027的一些或所有核苷酸而缩短。根据该实施方案，RPGRorf15编码核苷酸序列优选在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处不包含嘌呤核苷酸：核苷酸33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于SEQIDNO:3中发现的那些。根据本实施方案，优选的RPGRorf15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:11中所示的序列或由SEQIDNO:11中所示的序列组成。在一个实施方案中，RPGRorf15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:3但具有对应于SEQIDNO:12的一些或所有序列的缺失。ATGAGAGAGCCAGAGGAGCTGATGCCAGACAGTGGAGCAGTGTTTACATTCGGAAAATCTAAGTTCGCTGAAAATAACCCAGGAAAGTTCTGGTTTAAAAACGACGTGCCCGTCCACCTGTCTTGTGGCGATGAGCATAGTGCCGTGGTCACTGGGAACAATAAGCTGTACATGTTCGGGTCCAACAACTGGGGACAGCTGGGGCTGGGATCCAAATCTGCTATCTCTAAGCCAACCTGCGTGAAGGCACTGAAACCCGAGAAGGTCAAACTGGCCGCTTGTGGCAGAAACCACACTCTGGTGAGCACCGAGGGCGGGAATGTCTATGCCACCGGAGGCAACAATGAGGGACAGCTGGGACTGGGGGACACTGAGGAAAGGAATACCTTTCACGTGATCTCCTTCTTTACATCTGAGCATAAGATCAAGCAGCTGAGCGCTGGCTCCAACACATCTGCAGCCCTGACTGAGGACGGGCGCCTGTTCATGTGGGGAGATAATTCAGAGGGCCAGATTGGGCTGAAAAACGTGAGCAATGTGTGCGTCCCTCAGCAGGTGACCATCGGAAAGCCAGTCAGTTGGATTTCATGTGGCTACTATCATAGCGCCTTCGTGACCACAGATGGCGAGCTGTACGTCTTTGGGGAGCCCGAAAACGGAAAACTGGGCCTGCCTAACCAGCTGCTGGGCAATCACCGGACACCCCAGCTGGTGTCCGAGATCCCTGAAAAAGTGATCCAGGTCGCCTGCGGGGGAGAGCATACAGTGGTCCTGACTGAGAATGCTGTGTATACCTTCGGACTGGGCCAGTTTGGCCAGCTGGGGCTGGGAACCTTCCTGTTTGAGACATCCGAACCAAAAGTGATCGAGAACATTCGCGACCAGACTATCAGCTACATTTCCTGCGGAGAGAATCACACCGCACTGATCACAGACATTGGCCTGATGTATACCTTTGGCGATGGACGACACGGGAAGCTGGGACTGGGACTGGAGAACTTCACTAATCATTTTATCCCCACCCTGTGTTCTAACTTCCTGCGGTTCATCGTGAAACTGGTCGCTTGCGGCGGGTGTCACATGGTGGTCTTCGCTGCACCTCATAGGGGCGTGGCTAAGGAGATCGAATTTGACGAGATTAACGATACATGCCTGAGCGTGGCAACTTTCCTGCCATACAGCTCCCTGACTTCTGGCAATGTGCTGCAGAGAACCCTGAGTGCAAGGATGCGGAGAAGGGAGAGGGAACGCTCTCCTGACAGTTTCTCAATGCGACGAACCCTGCCACCTATCGAGGGAACACTGGGACTGAGTGCCTGCTTCCTGCCTAACTCAGTGTTTCCACGATGTAGCGAGCGGAATCTGCAGGAGTCTGTCCTGAGTGAGCAGGATCTGATGCAGCCAGAGGAACCCGACTACCTGCTGGATGAGATGACCAAGGAGGCCGAAATCGACAACTCTAGTACAGTGGAGTCCCTGGGCGAGACTACCGATATCCTGAATATGACACACATTATGTCACTGAACAGCAATGAGAAGAGTCTGAAACTGTCACCAGTGCAGAAGCAGAAGAAACAGCAGACTATTGGCGAGCTGACTCAGGACACCGCCCTGACAGAGAACGACGATAGCGATGAGTATGAGGAAATGTCCGAGATGAAGGAAGGCAAAGCTTGTAAGCAGCATGTCAGTCAGGGGATCTTCATGACACAGCCAGCCACAACTATTGAGGCTTTTTCAGACGAGGAAGTGGAGATCCCCGAGGAAAAAGAGGGCGCAGAAGATTCCAAGGGGAATGGAATTGAGGAACAGGAGGTGGAAGCCAACGAGGAAAATGTGAAAGTCCACGGAGGCAGGAAGGAGAAAACAGAAATCCTGTCTGACGATCTGACTGACAAGGCCGAGGTGTCCGAAGGCAAGGCAAAATCTGTCGGAGAGGCAGAAGACGGACCAGAGGGACGAGGGGATGGAACCTGCGAGGAAGGCTCAAGCGGGGCTGAGCATTGGCAGGACGAGGAACGAGAGAAGGGCGAAAAGGATAAAGGCCGCGGGGAGATGGAACGACCTGGAGAGGGCGAAAAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGAAGAAGAAGAGGGAGAAGTGGAGGGCGAAGTCGAGGGGGAGGAGGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGAAGAGGGCGAAGAAGAAGGCGAGGAAAGAGAAAAAGAGGGAGAAGGCGAGGAAAACCGGAGAAATAGGGAAGAGGAGGAAGAGGAAGAGGGAAAGTACCAGGAGACAGGCGAAGAGGAAAACGAGCGGCAGGATGGCGAGGAATATAAGAAAGTGAGCAAGATCAAAGGATCCGTCAAGTACGGCAAGCACAAAACCTATCAGAAGAAAAGCGTGACCAACACACAGGGGAATGGAAAAGAGCAGAGGAGTAAGATGCCTGTGCAGTCAAAACGGCTGCTGAAGAATGGCCCATCTGGAAGTAAAAAATTCTGGAACAATGTGCTGCCCCACTATCTGGAACTGAAATAA(SEQIDNO:11)CTGGCAGAGAAGGAGGAATGGAAGAAAAGGGACGGCGAGGAACAGGAGCAGAAAGAAAGGGAGCAGGGCCACCAGAAGGAGCGCAACCAGGAGATGGAAGAGGGCGGCGAGGAAGAGCATGGCGAGGGAGAAGAGGAAGAGGGCGATAGAGAAGAGGAAGAGGAAAAAGAAGGCGAAGGGAAGGAGGAAGGAGAGGGCGAGGAAGTGGAAGGCGAGAGGGAAAAGGAGGAAGGAGAACGGAAGAAAGAGGAAAGAGCCGGCAAAGAGGAAAAGGGCGAGGAAGAGGGCGATCAGGGCGAAGGCGAGGAGGAAGAGACCGAGGGCCGCGGGGAAGAGAAAGAGGAGGGAGGAGAGGTGGAGGGCGGAGAGGTCGAAGAGGGAAAGGGCGAGCGCGAAGAGGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCGAGGAAGAAGAGGGCGAGGGGGAAGAAGAGGAGGGAGAGGGCGAAGAGGAAGAGGGGGAGGGAAAGGGCGAAGAGGAAGGAGAGGAAGGGGAGGGAGAGGAAGAGGGGGAGGAGGGCGAGGGGGAAGGCGAGGAGGAAGAAGGAGAGGGGGAAGGCGAAGAGGAAGGCGAGGGGGAAGGAGAGGAGGAAGAAGGGGAAGGCGAAGGCGAAGAGGAGGGAGAAGGAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGAGAAGGGAAGGGCGAGGAGGAAGGCGAAGAGGGAGAGGGGGAAGGCGAGGAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGGAGAGGACGGCGAGGGCGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGGGAATGGGAAGGCGAAGAAGAGGAAGGCGAAGGCGAAGGCGAAGAAGAGGGCGAAGGGGAGGGCGAGGAGGGCGAAGGCGAAGGGGAGGAAGAGGAAGGCGAAGGAGAAGGCGAGGAAGAAGAGGGAGAGGAGGAAGGCGAGGAGGAAGGAGAGGGGGAGGAGGAGGGA(SEQIDNO:12)在另一实施方案中，本发明的RPGRorf15编码序列通过除去对应于SEQIDNO:2的位置2584–2961的一些或所有核苷酸而缩短。根据该实施方案，RPGRorf15编码核苷酸序列优选在对应于SEQIDNO:2的以下核苷酸的位置处不包含嘌呤核苷酸：核苷酸33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405和/或3438。优选地，这些位置处的核苷酸对应于SEQIDNO:3中发现的那些。根据本实施方案，优选的RPGRorf15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:13中所示的序列或由SEQIDNO:13中所示的序列组成。在一个实施方案中，RPGRorf15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:3但具有对应于SEQIDNO:14的一些或所有序列的缺失。ATGAGAGAGCCAGAGGAGCTGATGCCAGACAGTGGAGCAGTGTTTACATTCGGAAAATCTAAGTTCGCTGAAAATAACCCAGGAAAGTTCTGGTTTAAAAACGACGTGCCCGTCCACCTGTCTTGTGGCGATGAGCATAGTGCCGTGGTCACTGGGAACAATAAGCTGTACATGTTCGGGTCCAACAACTGGGGACAGCTGGGGCTGGGATCCAAATCTGCTATCTCTAAGCCAACCTGCGTGAAGGCACTGAAACCCGAGAAGGTCAAACTGGCCGCTTGTGGCAGAAACCACACTCTGGTGAGCACCGAGGGCGGGAATGTCTATGCCACCGGAGGCAACAATGAGGGACAGCTGGGACTGGGGGACACTGAGGAAAGGAATACCTTTCACGTGATCTCCTTCTTTACATCTGAGCATAAGATCAAGCAGCTGAGCGCTGGCTCCAACACATCTGCAGCCCTGACTGAGGACGGGCGCCTGTTCATGTGGGGAGATAATTCAGAGGGCCAGATTGGGCTGAAAAACGTGAGCAATGTGTGCGTCCCTCAGCAGGTGACCATCGGAAAGCCAGTCAGTTGGATTTCATGTGGCTACTATCATAGCGCCTTCGTGACCACAGATGGCGAGCTGTACGTCTTTGGGGAGCCCGAAAACGGAAAACTGGGCCTGCCTAACCAGCTGCTGGGCAATCACCGGACACCCCAGCTGGTGTCCGAGATCCCTGAAAAAGTGATCCAGGTCGCCTGCGGGGGAGAGCATACAGTGGTCCTGACTGAGAATGCTGTGTATACCTTCGGACTGGGCCAGTTTGGCCAGCTGGGGCTGGGAACCTTCCTGTTTGAGACATCCGAACCAAAAGTGATCGAGAACATTCGCGACCAGACTATCAGCTACATTTCCTGCGGAGAGAATCACACCGCACTGATCACAGACATTGGCCTGATGTATACCTTTGGCGATGGACGACACGGGAAGCTGGGACTGGGACTGGAGAACTTCACTAATCATTTTATCCCCACCCTGTGTTCTAACTTCCTGCGGTTCATCGTGAAACTGGTCGCTTGCGGCGGGTGTCACATGGTGGTCTTCGCTGCACCTCATAGGGGCGTGGCTAAGGAGATCGAATTTGACGAGATTAACGATACATGCCTGAGCGTGGCAACTTTCCTGCCATACAGCTCCCTGACTTCTGGCAATGTGCTGCAGAGAACCCTGAGTGCAAGGATGCGGAGAAGGGAGAGGGAACGCTCTCCTGACAGTTTCTCAATGCGACGAACCCTGCCACCTATCGAGGGAACACTGGGACTGAGTGCCTGCTTCCTGCCTAACTCAGTGTTTCCACGATGTAGCGAGCGGAATCTGCAGGAGTCTGTCCTGAGTGAGCAGGATCTGATGCAGCCAGAGGAACCCGACTACCTGCTGGATGAGATGACCAAGGAGGCCGAAATCGACAACTCTAGTACAGTGGAGTCCCTGGGCGAGACTACCGATATCCTGAATATGACACACATTATGTCACTGAACAGCAATGAGAAGAGTCTGAAACTGTCACCAGTGCAGAAGCAGAAGAAACAGCAGACTATTGGCGAGCTGACTCAGGACACCGCCCTGACAGAGAACGACGATAGCGATGAGTATGAGGAAATGTCCGAGATGAAGGAAGGCAAAGCTTGTAAGCAGCATGTCAGTCAGGGGATCTTCATGACACAGCCAGCCACAACTATTGAGGCTTTTTCAGACGAGGAAGTGGAGATCCCCGAGGAAAAAGAGGGCGCAGAAGATTCCAAGGGGAATGGAATTGAGGAACAGGAGGTGGAAGCCAACGAGGAAAATGTGAAAGTCCACGGAGGCAGGAAGGAGAAAACAGAAATCCTGTCTGACGATCTGACTGACAAGGCCGAGGTGTCCGAAGGCAAGGCAAAATCTGTCGGAGAGGCAGAAGACGGACCAGAGGGACGAGGGGATGGAACCTGCGAGGAAGGCTCAAGCGGGGCTGAGCATTGGCAGGACGAGGAACGAGAGAAGGGCGAAAAGGATAAAGGCCGCGGGGAGATGGAACGACCTGGAGAGGGCGAAAAAGAGCTGGCAGAGAAGGAGGAATGGAAGAAAAGGGACGGCGAGGAACAGGAGCAGAAAGAAAGGGAGCAGGGCCACCAGAAGGAGCGCAACCAGGAGATGGAAGAGGGCGGCGAGGAAGAGCATGGCGAGGGAGAAGAGGAAGAGGGCGATAGAGAAGAGGAAGAGGAAAAAGAAGGCGAAGGGAAGGAGGAAGGAGAGGGCGAGGAAGTGGAAGGCGAGAGGGAAAAGGAGGAAGGAGAACGGAAGAAAGAGGAAAGAGCCGGCAAAGAGGAAAAGGGCGAGGAAGAGGGCGATCAGGGCGAAGGCGAGGAGGAAGAGACCGAGGGCCGCGGGGAAGAGAAAGAGGAGGGAGGAGAGGTGGAGGGCGGAGAGGTCGAAGAGGGAAAGGGCGAGCGCGAAGAGGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCGAGGAAGAAGAGGGCGAGGGGGAAGAAGAGGAGGGAGAGGGCGAAGAGGAAGAGGGGGAGGGAAAGGGCGAAGAGGAAGGAGAAGGCGAGGAAGAAGAGGGAGAGGAGGAAGGCGAGGAGGAAGGAGAGGGGGAGGAGGAGGGAGAAGGCGAGGGCGAAGAAGAAGAAGAGGGAGAAGTGGAGGGCGAAGTCGAGGGGGAGGAGGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGAAGAGGGCGAAGAAGAAGGCGAGGAAAGAGAAAAAGAGGGAGAAGGCGAGGAAAACCGGAGAAATAGGGAAGAGGAGGAAGAGGAAGAGGGAAAGTACCAGGAGACAGGCGAAGAGGAAAACGAGCGGCAGGATGGCGAGGAATATAAGAAAGTGAGCAAGATCAAAGGATCCGTCAAGTACGGCAAGCACAAAACCTATCAGAAGAAAAGCGTGACCAACACACAGGGGAATGGAAAAGAGCAGAGGAGTAAGATGCCTGTGCAGTCAAAACGGCTGCTGAAGAATGGCCCATCTGGAAGTAAAAAATTCTGGAACAATGTGCTGCCCCACTATCTGGAACTGAAATAA(SEQIDNO:13)GGAGAGGAAGGGGAGGGAGAGGAAGAGGGGGAGGAGGGCGAGGGGGAAGGCGAGGAGGAAGAAGGAGAGGGGGAAGGCGAAGAGGAAGGCGAGGGGGAAGGAGAGGAGGAAGAAGGGGAAGGCGAAGGCGAAGAGGAGGGAGAAGGAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGAGAAGGGAAGGGCGAGGAGGAAGGCGAAGAGGGAGAGGGGGAAGGCGAGGAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGGAGAGGACGGCGAGGGCGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGGGAATGGGAAGGCGAAGAAGAGGAAGGCGAAGGCGAAGGCGAAGAAGAGGGCGAAGGGGAGGGCGAGGAGGGCGAAGGCGAAGGGGAGGAAGAGGAAGGCGAA(SEQIDNO:14)本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列可以可操作连接至多核苷酸，所述多核苷酸包含能够在人视杆和视锥感光细胞中驱动RPGRORF15或其功能性变体表达的启动子元件。本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列可以可操作连接至视紫红质激酶(GRK1)启动子，优选为人GRK1启动子。优选地，除了启动子，没有额外增强子元件用于控制RPGRORF15的表达。因此，在一个实施方案中，本发明的核苷酸序列不含有增强子元件。在一个实施方案中，核苷酸序列不含有土拨鼠(woodchuck)肝炎表面抗原(WPRE)元件。另一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸的病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体。在优选的实施方案中，病毒载体是病毒颗粒的形式。在优选的实施方案中，病毒载体是AAV载体。AAV载体可以是任何血清型(例如包含任何AAV血清型基因组和/或壳体蛋白)的，只要该载体能够感染或转导眼细胞即可。在一个实施方案中，AAV载体包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或11基因组。在另一实施方案中，AAV载体包含AAV血清型2、4、5或8基因组。优选地，AAV载体包含AAV血清型2基因组。在一个实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或11壳体蛋白。在另一实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV血清型2、4、5或8壳体蛋白。优选地，AAV载体颗粒包含AAV血清型8壳体蛋白。AAV血清型8壳体蛋白例如可以是AAV8/Y733F突变体壳体蛋白。在一个实施方案中，AAV载体颗粒包含AAV2基因组和AAV2壳体蛋白(AAV2/2)；AAV2基因组和AAV5壳体蛋白(AAV2/5)；或AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)。优选地，AAV载体颗粒包含AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)。本发明的AAV载体颗粒可以是一种或多种天然存在的AAV的嵌合的、改组的或壳体修饰的衍生物。特别地，AAV载体颗粒可以包含来自相同载体内AAV的不同血清型、进化枝、克隆或隔离群(isolate)的壳体蛋白序列(即假型化载体(pseudotypedvector))。因此，在一个实施方案中，AAV载体是假型化AAV载体颗粒的形式。另一方面，本发明提供了病毒颗粒生产系统，其包含一组编码所述病毒载体生产所需要的组分的多核苷酸，其中所述病毒载体基因组包含本发明的多核苷酸。在一个实施方案中，病毒载体是腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体。优选地，病毒载体是AAV载体。另一方面，本发明提供了用于本发明的病毒载体生产系统的DNA构建体，其包含本发明的多核苷酸。另一方面，本发明提供了病毒载体生产细胞，其包含本发明的多核苷酸、病毒载体生产系统或DNA构建体。病毒载体生产细胞例如可以是HEK293、HEK293T、Sf9、C12或HeLa细胞。优选地，病毒载体生产细胞是HEK293或HEK293T细胞。另一方面，本发明提供了生产病毒载体的方法，其包括将本发明的多核苷酸引入细胞并在适合于病毒载体的生产的条件下培养细胞。另一方面，本发明提供了使用本发明的载体生产细胞或通过本发明的方法可获得的病毒载体。另一方面，本发明提供了用本发明的多核苷酸转染或通过本发明的病毒载体转导的细胞。另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本发明的多核苷酸、病毒载体，或细胞。另一方面，本发明提供了本发明的多核苷酸或病毒载体，用于治疗或预防色素性视网膜炎。本发明还提供了本发明的多核苷酸或病毒载体，用于减少患有或有风险形成色素性视网膜炎的受试者中的感光细胞死亡。在一个实施方案中，色素性视网膜炎是X-连锁的色素性视网膜炎。在一个实施方案中，通过视网膜下、直接视网膜注射或玻璃体内注射来将多核苷酸或病毒载体施用至受试者的眼。优选地，通过视网膜下注射来将多核苷酸或病毒载体施用至受试者的眼。可以使用本文描述的两步视网膜下注射法进行视网膜下注射。优选地，视网膜下注射包括以下步骤：(a)通过视网膜下注射以对于使视网膜至少部分脱离有效的量对所述受试者施用溶液以形成视网膜下泡，其中所述溶液不含所述多核苷酸或病毒载体；和(b)通过视网膜下注射将药物组合物施用到由步骤(a)形成的泡中，其中所述药物包含所述多核苷酸或病毒载体。在一个实施方案中，以单一剂量向受试者施用AAV载体。例如，AAV载体可以以约1-2×109、1-2×1010、1-2×1011、1-2×1012或1-2×1013个基因组颗粒(gp)/mL的浓度在悬浮液中。因此，约2×1010gp的AAV载体剂量例如可以通过注射约10μL浓度为约2×1012gp/mL的AAV载体剂量来施用。技术人员能够根据需要容易地调整AAV载体的剂量、体积和浓度。例如，施用的AAV载体的体积可以是例如约1-500μL，例如约10-500、50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250、50-150、1-100或1-10μL。例如，体积可以是约1、2、5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，注射的AAV载体组合物的体积是约100μL。在一个实施方案中，以至少2×107、2×108、2×109、2×1010、2×1011或2×1012gp/眼的剂量施用AAV载体。在另一实施方案中，以约1-2×107、1-2×108、1-2×109、1-2×1010、1-2×1011或1-2×1012gp/眼的剂量施用AAV载体。优选地，以约2×1011gp/眼的剂量施用AAV载体，优选通过视网膜下注射。在一个实施方案中，由于色素性视网膜炎引起的感光细胞变性在受试者的一生中基本上得以阻止。感光细胞可以包含视锥细胞和/或视杆细胞，优选地视锥和视杆细胞。在另一实施方案中，在施用多核苷酸或病毒(如AVV)载体时存在于治疗的眼中感光细胞(如视锥细胞和/或视杆细胞)数量的少于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％随后由于受试者的一生中的色素性视网膜炎而变性。优选地，存活的细胞仍然是有功能的。在一个实施方案中，在治疗的眼中视觉功能基本恢复或维持。例如，在受影响的眼中视觉功能(例如通过本文描述的视觉功能的测试所确定)可以恢复至如色素性视网膜炎发作前所存在的约相同的水平。或者，视觉功能例如可以在有风险形成色素性视网膜炎的健康受试者中或在已经患有色素性视网膜炎的受试者中保持约相同的水平(例如，施用本发明的多核苷酸或病毒(如AVV)载体后，基本上没有由色素性视网膜炎导致的视觉功能恶化或进一步恶化)。如果不治疗，由于色素性视网膜炎，大部分或全部视杆细胞可随时间变性(例如死亡)。视锥细胞在疾病的进展期间也可以变性。另一方面，本发明提供了治疗或预防色素性视网膜炎的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的多核苷酸或病毒载体。本发明还提供了在患有或有风险形成色素性视网膜炎的患者中减少感光细胞死亡的方法，其包括向所述受试者施用本发明的多核苷酸或病毒载体。施用的模式(如方法和剂量)和效果，和要治疗的受试者可以如本文所述。本发明还提供了本发明的多核苷酸和病毒载体在以下中的用途：相对于包含野生型RPGRORF15基因的载体或多核苷酸，减少或避免可变剪接的变体和/或截短的RPGRORF15蛋白的产生。本发明还提供了本发明的多核苷酸和病毒载体在以下中的用途：相对于包含野生型RPGRORF15基因的核苷酸序列，增加包含RPGRORF15基因的核苷酸序列的复制稳定性和/或保真度。本发明还提供了本发明的多核苷酸和病毒载体在以下中的用途：相对于包含野生型RPGRORF15基因的载体或多核苷酸，实现RPGRORF15蛋白的更高的翻译和/或蛋白表达速率。本发明还提供了本发明的多核苷酸和病毒载体在以下中的用途：相对于包含野生型RPGRORF15基因的多核苷酸，增加RPGRORF15编码核苷酸序列的产率。附图简述图1人类、小鼠和狗RPGR的基因组序列的比较。图2密码子优化的(顶部)和野生型(底部)RPGRORF15序列的比较。用红色和下划线突出显示了一级序列中的差异。图3标准克隆载体中野生型(A、B)和密码子优化的(C、D)RPGR序列之间的克隆效率和序列保真度比较。来自微量制备物(minipreparations)(E)和宏制备物(megapreparations)(G)的质粒产率比较，以及相同序列间样品纯度(F)的比较。图4标准克隆载体中野生型(A)和密码子优化的(B)RPGR序列之间的序列保真度比较。图5密码子优化的RPGR序列的蛋白质产物的液相色谱串联质谱法(LC/MS-MS)鉴定约80％的氨基酸(未能确认的氨基酸标记为红色)。图6Western印迹，其确认了野生型和密码子优化的RPGR衍生的(分别为wtRPGR和coRPGR)肽的相同分子量(220kDa)(上图)。Western印迹信号强度的差异图指示了来自coRPGR序列的约4倍更高的RPGR蛋白质生成(下图)。图7具有天然存在的RPGR突变的小鼠模型(C57BL/6Rd9/Boc)中使用AAV.coRPGR的治疗效果概览。在C57BL/6Rd9/Boc小鼠的经治疗的眼(TE)中而非在未经治疗的眼(UE)中，治疗后6个月的整个视网膜裂解物的Western印迹显示出约200kDa的RPGR蛋白质产物(A)。L，蛋白质梯；+，阳性对照(用coRPGR表达质粒转染的HEK293T细胞蛋白裂解物)；-，阴性对照(未转染的HEK293T细胞蛋白裂解物)。治疗后6个月的未固定的冰冻切片的免疫组化(B)。上图显示了未经治疗的眼中缺少RPGR染色(绿色)。在治疗的眼中(底部)，可以看到RPGR染色共定位至睫状蛋白Rpgrip(红色)。比例尺＝20μm。治疗后3个月(C)和6个月(D)的暗适应(DA)ERG单闪光强度系列。平均值的红色迹线(trace)来自治疗后的眼(TE)，黑色迹线来自未经治疗的眼(UE)。触须线(whisker)显示95％置信区间。图8质粒身份和结构稳定性，从pAAV.RK.coRPGR的RCB制备的质粒。自pAAV.RK.coRPGR的RCB产生的质粒DNA的内切核酸酶限制性消化片段大小。用以下限制性酶得到的预期模式：XmnI：11+11+161+211+2681+4006bp；SmaI：11+11+161+211+2681+4006bp(11bp片段通过琼脂糖凝胶并且不能可视化)。标志物1kbp梯(PlasmidFactory,Itemno.MSM‐865‐50)，300ng道1DNARCB1729‐151023，未消化的，250ng道2DNARCB1729‐151023，未消化的，250ng道3DNARCB1729‐151023，用XmnI消化的，250ng道4DNARCB1729‐151023，用SmaI消化的，250ng图9pAAV.RK.coRPGR的100mg质粒制备物的质粒身份和结构稳定性。质粒pAAV.RK.RPGR的内切核酸酶限制性消化片段大小。用限制性酶XmnI的预期模式：11+11+161+211+2681+4006bp(11bp片段通过琼脂糖凝胶并且不能可视化)。标志物1kbp梯(PlasmidFactory,Itemno.MSM‐865‐50)，300ng道1pAAV.RK.coRPGR，250ng道2pAAV.RK.coRPGR，未消化的，250ng标志物1kbp梯(PlasmidFactory,Itemno.MSM‐865‐50)，300ng道3pAAV.RK.coRPGR，XmnI消化，250ng道4pAAV.RK.co.RPGR，XmnI消化，250ng标志物1kbp梯(PlasmidFactory,Itemno.MSM‐865‐50)，300ng图10pAAV.RK.coRPGR的100mg质粒制备物的通过A260的质粒DNA浓度。计算的平均浓度：1.0mgmL-1。图11DNA纯度。方法：220nm和320nm之间的UV-扫描。通过220nm和320nm之间的UV来确定100mgpAAV.RK.coRPGR的质粒制备物的质粒纯度。图12HEK293细胞中RPGRORF15表达的Western印迹分析。(A)三次独立实验中，与未转染的样品(UNT)相比，在转染有CAG.coRPGRORF15(co)或CAG.wtRPGRORF15(wt)的细胞中检测到RPGRORF15(黑色箭头)表达。(B)盒式图显示了在相对于内源性对照物(β肌动蛋白)标准化后，通过光密度测定法的以任意单位(AU)表示的RPGRORF15表达水平的量。图13HEK293T细胞中RPGRORF15表达的Western印迹分析。(A)与未转染的样品(UNT)相比，在转染有CAG.coRPGRORF15(co)或CAG.wtRPGRORF15(wt)的细胞中检测到RPGRORF15(黑色箭头)表达。在转染有wt序列的细胞中检测到截短的蛋白质(白色箭头)。(B)柱形图显示了每个样品中相对于内源性对照物(β肌动蛋白)标准化后，通过光密度测定法的RPGRORF15表达水平的定量。发明详述现在将通过非限制性例子描述本发明的各种优选特征和实施方案。除非另有指示，本发明的实践将使用在本领域普通技术人员的能力范围内的化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术。在文献中解释此类技术。参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.etal.(1995及定期增补)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9,13和16章,JohnWiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.andKahn,A.(1996)DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons；Polak,J.M.andMcGee,J.O’D.(1990)InSituHybridization:PrinciplesandPractice,OxfordUniversityPress；Gait,M.J.(1984)OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress；以及Lilley,D.M.andDahlberg,J.E.(1992)MethodsinEnzymology:DNAStructuresPartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNA,AcademicPress。这些通用教科书中的每篇通过引用并入本文。一方面，本发明提供了多核苷酸，其包含编码色素性视网膜炎GTP酶调节物ORF15同种型(RPGRORF15)的核苷酸序列，其中已对所述RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以增加所述序列复制的保真度。色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)色素性视网膜炎GTP酶调节物(RPGR)可能充当鸟嘌呤核苷酸释放因子，并对正常视力至关重要。研究表明，RPGR可能通过参与微管组织和运输调节来在纤毛生成中起作用。纤毛是从细胞表面的指状突起物，其可参与包括信号传导和细胞运动在内的多种生物学活性。纤毛还对包括听觉、嗅觉和视觉在内的一系列感官知觉是必须的，并且它们是关键的感光细胞器。多种RPGR蛋白同等型表达自RPGR基因。包含ORF15外显子的同等型与本发明特别相关并且有时称为ORF15。该同等型称为RPGRORF15。RPGRORF15主要在视网膜中，特别是感光细胞中表达，而其他同等型在其它地方表达并且可能也参与纤毛形成和/或功能。人野生型RPGRORF15的示例性氨基酸序列为：MREPEELMPDSGAVFTFGKSKFAENNPGKFWFKNDVPVHLSCGDEHSAVVTGNNKLYMFGSNNWGQLGLGSKSAISKPTCVKALKPEKVKLAACGRNHTLVSTEGGNVYATGGNNEGQLGLGDTEERNTFHVISFFTSEHKIKQLSAGSNTSAALTEDGRLFMWGDNSEGQIGLKNVSNVCVPQQVTIGKPVSWISCGYYHSAFVTTDGELYVFGEPENGKLGLPNQLLGNHRTPQLVSEIPEKVIQVACGGEHTVVLTENAVYTFGLGQFGQLGLGTFLFETSEPKVIENIRDQTISYISCGENHTALITDIGLMYTFGDGRHGKLGLGLENFTNHFIPTLCSNFLRFIVKLVACGGCHMVVFAAPHRGVAKEIEFDEINDTCLSVATFLPYSSLTSGNVLQRTLSARMRRRERERSPDSFSMRRTLPPIEGTLGLSACFLPNSVFPRCSERNLQESVLSEQDLMQPEEPDYLLDEMTKEAEIDNSSTVESLGETTDILNMTHIMSLNSNEKSLKLSPVQKQKKQQTIGELTQDTALTENDDSDEYEEMSEMKEGKACKQHVSQGIFMTQPATTIEAFSDEEVEIPEEKEGAEDSKGNGIEEQEVEANEENVKVHGGRKEKTEILSDDLTDKAEVSEGKAKSVGEAEDGPEGRGDGTCEEGSSGAEHWQDEEREKGEKDKGRGEMERPGEGEKELAEKEEWKKRDGEEQEQKEREQGHQKERNQEMEEGGEEEHGEGEEEEGDREEEEEKEGEGKEEGEGEEVEGEREKEEGERKKEERAGKEEKGEEEGDQGEGEEEETEGRGEEKEEGGEVEGGEVEEGKGEREEEEEEGEGEEEEGEGEEEEGEGEEEEGEGKGEEEGEEGEGEEEGEEGEGEGEEEEGEGEGEEEGEGEGEEEEGEGEGEEEGEGEGEEEEGEGKGEEEGEEGEGEGEEEEGEGEGEDGEGEGEEEEGEWEGEEEEGEGEGEEEGEGEGEEGEGEGEEEEGEGEGEEEEGEEEGEEEGEGEEEGEGEGEEEEEGEVEGEVEGEEGEGEGEEEEGEEEGEEREKEGEGEENRRNREEEEEEEGKYQETGEEENERQDGEEYKKVSKIKGSVKYGKHKTYQKKSVTNTQGNGKEQRSKMPVQSKRLLKNGPSGSKKFWNNVLPHYLELK(SEQIDNO:1)在一个实施方案中，编码人野生型RPGRORF15的核苷酸序列为：ATGAGGGAGCCGGAAGAGCTGATGCCCGATTCGGGTGCTGTGTTTACATTTGGGAAAAGTAAATTTGCTGAAAATAATCCCGGTAAATTCTGGTTTAAAAATGATGTCCCTGTACATCTTTCATGTGGAGATGAACATTCTGCTGTTGTTACCGGAAATAATAAACTTTACATGTTTGGCAGTAACAACTGGGGTCAGTTAGGATTAGGATCAAAGTCAGCCATCAGCAAGCCAACATGTGTCAAAGCTCTAAAACCTGAAAAAGTGAAATTAGCTGCCTGTGGAAGGAACCACACCCTGGTGTCAACAGAAGGAGGCAATGTATATGCAACTGGTGGAAATAATGAAGGACAGTTGGGGCTTGGTGACACCGAAGAAAGAAACACTTTTCATGTAATTAGCTTTTTTACATCCGAGCATAAGATTAAGCAGCTGTCTGCTGGATCTAATACTTCAGCTGCCCTAACTGAGGATGGAAGACTTTTTATGTGGGGTGACAATTCCGAAGGGCAAATTGGTTTAAAAAATGTAAGTAATGTCTGTGTCCCTCAGCAAGTGACCATTGGGAAACCTGTCTCCTGGATCTCTTGTGGATATTACCATTCAGCTTTTGTAACAACAGATGGTGAGCTATATGTGTTTGGAGAACCTGAGAATGGGAAGTTAGGTCTTCCCAATCAGCTCCTGGGCAATCACAGAACACCCCAGCTGGTGTCTGAAATTCCGGAGAAGGTGATCCAAGTAGCCTGTGGTGGAGAGCATACTGTGGTTCTCACGGAGAATGCTGTGTATACCTTTGGGCTGGGACAATTTGGTCAGCTGGGTCTTGGCACTTTTCTTTTTGAAACTTCAGAACCCAAAGTCATTGAGAATATTAGGGATCAAACAATAAGTTATATTTCTTGTGGAGAAAATCACACAGCTTTGATAACAGATATCGGCCTTATGTATACTTTTGGAGATGGTCGCCACGGAAAATTAGGACTTGGACTGGAGAATTTTACCAATCACTTCATTCCTACTTTGTGCTCTAATTTTTTGAGGTTTATAGTTAAATTGGTTGCTTGTGGTGGATGTCACATGGTAGTTTTTGCTGCTCCTCATCGTGGTGTGGCAAAAGAAATTGAATTCGATGAAATAAATGATACTTGCTTATCTGTGGCGACTTTTCTGCCGTATAGCAGTTTAACCTCAGGAAATGTACTGCAGAGGACTCTATCAGCACGTATGCGGCGAAGAGAGAGGGAGAGGTCTCCAGATTCTTTTTCAATGAGGAGAACACTACCTCCAATAGAAGGGACTCTTGGCCTTTCTGCTTGTTTTCTCCCCAATTCAGTCTTTCCACGATGTTCTGAGAGAAACCTCCAAGAGAGTGTCTTATCTGAACAGGACCTCATGCAGCCAGAGGAACCAGATTATTTGCTAGATGAAATGACCAAAGAAGCAGAGATAGATAATTCTTCAACTGTAGAAAGCCTTGGAGAAACTACTGATATCTTAAACATGACACACATCATGAGCCTGAATTCCAATGAAAAGTCATTAAAATTATCACCAGTTCAGAAACAAAAGAAACAACAAACAATTGGGGAACTGACGCAGGATACAGCTCTTACTGAAAACGATGATAGTGATGAATATGAAGAAATGTCAGAAATGAAAGAAGGGAAAGCATGTAAACAACATGTGTCACAAGGGATTTTCATGACGCAGCCAGCTACGACTATCGAAGCATTTTCAGATGAGGAAGTAGAGATCCCAGAGGAGAAGGAAGGAGCAGAGGATTCAAAAGGAAATGGAATAGAGGAGCAAGAGGTAGAAGCAAATGAGGAAAATGTGAAGGTGCATGGAGGAAGAAAGGAGAAAACAGAGATCCTATCAGATGACCTTACAGACAAAGCAGAGGTGAGTGAAGGCAAGGCAAAATCAGTGGGAGAAGCAGAGGATGGGCCTGAAGGTAGAGGGGATGGAACCTGTGAGGAAGGTAGTTCAGGAGCAGAACACTGGCAAGATGAGGAGAGGGAGAAGGGGGAGAAAGACAAGGGTAGAGGAGAAATGGAGAGGCCAGGAGAGGGAGAGAAGGAACTAGCAGAGAAGGAAGAATGGAAGAAGAGGGATGGGGAAGAGCAGGAGCAAAAGGAGAGGGAGCAGGGCCATCAGAAGGAAAGAAACCAAGAGATGGAGGAGGGAGGGGAGGAGGAGCATGGAGAAGGAGAAGAAGAGGAGGGAGACAGAGAAGAGGAAGAAGAGAAGGAGGGAGAAGGGAAAGAGGAAGGAGAAGGGGAAGAAGTGGAGGGAGAACGTGAAAAGGAGGAAGGAGAGAGGAAAAAGGAGGAAAGAGCGGGGAAGGAGGAGAAAGGAGAGGAAGAAGGAGACCAAGGAGAGGGGGAAGAGGAGGAAACAGAGGGGAGAGGGGAGGAAAAAGAGGAGGGAGGGGAAGTAGAGGGAGGGGAAGTAGAGGAGGGGAAAGGAGAGAGGGAAGAGGAAGAGGAGGAGGGTGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGAAAGGGGAGGAAGAAGGGGAAGAAGGAGAAGGGGAGGAAGAAGGGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGAGAAGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGAGAAGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGAAAGGGGAGGAGGAAGGAGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGGAAGGGGAGGATGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAATGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAAGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAAGAAGAAGGGGAGGAAGAAGGAGAGGGAGAGGAAGAAGGGGAGGGAGAAGGGGAGGAAGAAGAGGAAGGGGAAGTGGAAGGGGAGGTGGAAGGGGAGGAAGGAGAGGGGGAAGGAGAGGAAGAGGAAGGAGAGGAGGAAGGAGAAGAAAGGGAAAAGGAGGGGGAAGGAGAAGAAAACAGGAGGAACAGAGAAGAGGAGGAGGAAGAAGAGGGGAAGTATCAGGAGACAGGCGAAGAAGAGAATGAAAGGCAGGATGGAGAGGAGTACAAAAAAGTGAGCAAAATAAAAGGATCTGTGAAATATGGCAAACATAAAACATATCAAAAAAAGTCAGTTACTAACACACAGGGAAATGGGAAAGAGCAGAGGTCCAAAATGCCAGTCCAGTCAAAACGACTTTTAAAAAACGGGCCATCAGGTTCCAAAAAGTTCTGGAATAATGTATTACCACATTACTTGGAATTGAAGTAA(SEQIDNO:2)已经将RPGR基因中超过300种的突变与X连锁的色素性视网膜炎(XLRP)相关联。此外，在约70％的XLRP病例中观察到RPGR突变。大多数XLRP相关的RPGR突变发生在ORF15外显子(其对应于RPGRORF15的核苷酸1754-3459，如SEQIDNO:2的核苷酸1754-3459)并且通常导致截短的，功能障碍的蛋白质。RPGR中的突变可能破坏光感受器纤毛的正常功能，然而，目前还不清楚这是如何引起光感受器的逐渐丧失和导致疾病特征的视力问题。RPGR是由于RPGR基因的外显子15的富含嘌呤的区域中高度致突变区域而产生的RP的常规病因。如果野生型RPGR核苷酸序列用于该目的，则AAV载体克隆中期望发生相似的问题。为了解决该问题，我们使用密码子优化来添加嘧啶核苷酸以打破RPGR基因外显子15中的重复GA序列并避免wtcDNA中可能导致大部分报道的截短RPGR变体的其它潜在剪接位点(Wuetal.,HumanMolecularGenetics2015:24(14)；3956-70)。设计了本发明的coRPGR以避免CpG序列，隐藏的剪接位点和异常的多聚A信号。密码子优化本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列已经相对于野生型基因序列(例如SEQIDNO:2的核苷酸序列)进行了密码子优化。使用本文公开的优化策略制备的本发明的密码子优化的RPGR基因因此比野生型cDNA序列更为稳定，从而避免了与wtRPGR相关的问题，该wtRPGR在通过基因疗法将wtRPGR再次引入转录机器时可能产生可变剪接变体和截短的蛋白质(Wuetal.,HumanMolecularGenetics2015:24(14)；3956-70)。密码子优化利用遗传密码中的冗余来改变核苷酸序列而保持编码的蛋白质的相同的氨基酸序列。通常，进行密码子优化以促进编码的蛋白质的表达增加或降低。这是通过将核苷酸序列中的密码子选择调整为特定细胞类型的密码子选择来实现的，从而利用对应于细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏倚的细胞密码子偏倚。通过改变核苷酸序列中的密码子使得可调整它们以匹配相应tRNA的相对丰度，增加表达是有可能的。相反，通过选择已知相应的tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来降低表达是有可能的。然而，本发明的密码子优化不特别地针对影响细胞表达水平。相反，本发明已经利用了遗传密码中的丰度来工程化改造易于突变的RPGRORF15野生型核苷酸序列(例如SEQIDNO:2)以提供相对于野生型序列(e.g.SEQIDNO:2)表现出增加的复制保真度的序列(即不太易于在多核苷酸复制循环期间发生突变，例如在克隆过程期间或在天然细胞循环期间)。此外，本发明人已经显示了：(i)可以避免具有密码子优化序列的可变剪接变体，其已经见于非密码子优化的人cDNARPGR构建体中；和(ii)来自密码子优化的序列的蛋白质表达水平比野生型序列的表达水平更高，从而使该构建体对于一般翻译更有效(虽然不希望受到理论的束缚，这可能是由于消耗谷氨酸和甘氨酸tRNA的细胞库的重复GAN密码子数量的减少造成的)。野生型ORF15区域含有远少于基因组中预测的T和C核苷酸。例如，在野生型序列序列中位置2410和3160之间的750碱基对的序列中根本不含有C核苷酸。这导致许多重复序列，该重复序列在克隆和载体生产过程中可能不正确地重组。由于由于大部分密码子在该区域的位置1处以G开始，考虑到在本发明的密码子优化策略中限制CpG二核苷酸的数量，已经在前面的密码子的位置3处添加了C核苷酸。这是因为太多的这些二核苷酸可能将转基因DNA鉴定为非天然的，这可使得易于C核苷酸的基于甲基化的沉默。例如，在SEQIDNO:3的位置2410和3160之间的750个碱基对的序列中，通过密码子优化过程，总共添加了45个C核苷酸，导致45个CpG二核苷酸(6.00％)。这与这些二核苷酸的预测的野生型频率(6.25％)相比是有利的。另一个在优化RPGRORF15的密码子序列过程中限制CpG二核苷酸的理由在于真核细胞具有先天免疫的进化保守机制，其使它们(而不是周围的细胞)作为针对例如病毒感染的防御机制(Willettetal.,Frontiersinimmunology2013；4:261)。未甲基化的CpG岛可以鉴定为来自宿主细胞的病毒DNA，从而引发潜在导致程序性细胞死亡的途径(Toll-/Nod-/RIGI-样受体信号传导等)(Kriegetal.TheJournaloflaboratoryandclinicalmedicine1996；128:128-133)。而且，未甲基化的CpG二核苷酸能够刺激引发炎症的免疫应答。此外，C密码子优化在可能的情况下已应用于编码甘氨酸的四重简并密码子“GGN”。这是因为转基因内CpG二核苷酸的C核苷酸的任何随后甲基化和随后对胸腺嘧啶(T)的脱氨基作用(即使它确实发生)将不会改变RPGR蛋白序列，因为GGC和GGT均编码甘氨酸。也已限制了本发明的核苷酸序列中RPGR的富含GA的区域内的T核苷酸的插入以在本发明的密码子优化过程中避免创建异常的多聚A信号(如AATAAA)和可能的剪接供体位点(GT)。避免剪接供体位点是考虑因素，因为该区域含有许多在5’方向上具有重复的G嘧啶碱基和潜在的A核苷酸分支点的剪接受体(AG)序列。在计算机上广泛地建模了密码子优化模式以确定最佳修饰以降低GA重复并且也降低异常剪接和创建未成熟多聚A信号的风险。使用本文公开的优化策略制备的本发明的密码子优化的基因从而比野生型cDNA序列更为稳定，其中当通过基因疗法再次引入转录机器时所述野生型cDNA序列可产生可变剪接的变体和截短的蛋白质(Wuetal.,HumanMolecularGenetics2015:24(14)；3956-70)。本发明的密码子优化的基因从而避免了与wtRPGR有关的引起疾病的问题。可以修改和应用本发明人已经开发和证明的原理以创建显示类似有利特征的SEQIDNO:3的变体。因此，本发明不应视为对SEQIDNO:3的具体序列的限制。可以通过技术人员已知的任何数量的方法来测量复制的保真度。例如，可以对RPGRORF15编码核苷酸序列进行PCR扩增并连接到标准克隆载体中。然后可以将连接产物转化入细胞系(如标准大肠杆菌菌株)，并且可以分析许多得到的转化体集落以确定其中包含的RPGRORF15基因的核苷酸序列。可以在不同的RPGRORF15编码核苷酸序列(例如包括参考预期序列)之间比较测序结果以确定包含突变的和未突变的序列的测试集落的分数。在一个实施方案中，当通过多核苷酸测序(例如使用桑格(Sanger)测序法)来分析包含序列的多核苷酸(如分离自细胞集落(如大肠杆菌菌落)的多核苷酸(如通过自集落分离包含序列的质粒)时，少于9个(例如少于8、7、6、5、4、3或2个)突变存在于RPGRORF15编码核苷酸序列中。优选地，当对RPGRORF15编码核苷酸序列测序时，存在0个突变。在另一实施方案中，少于25％(例如少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的测试克隆(即多核苷酸，其包含自细胞克隆分离的本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列，如自大肠杆菌菌落分离的质粒)包含含有至少一个突变(例如当分析了4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500个克隆时)的RPGRORF15编码核苷酸序列。优选地，0％的测试克隆包含含有至少一个突变的RPGRORF15编码核苷酸序列。在一个实施方案中，已对本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列进行了密码子优化以与野生型序列(例如SEQIDNO:2)相比降低嘌呤核苷酸的数量。腺嘌呤和鸟嘌呤是在野生型RPGRORF15编码核苷酸序列中发现的两个嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，RPGRORF15编码核苷酸序列的富含嘌呤(即，富含GA)的区域(例如ORF15外显子区域)中的嘌呤核苷酸的数量是减少的。在一个实施方案中，将嘌呤核苷酸的数量减少野生型序列(如SEQIDNO:2)中嘌呤核苷酸数量的至少0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。在一个实施方案中，将嘌呤核苷酸的数量减少野生型序列(如SEQIDNO:2)中嘌呤核苷酸数量的0.5-10％、0.5-7.5％、0.5-5％、0.5-4.5％、0.5-4％、0.5-3.5％、0.5-3％、1-5％、1-4.5％、1-4％、1-3.5％或1-3％。本发明的示例性密码子优化的RPGRORF15序列为：ATGAGAGAGCCAGAGGAGCTGATGCCAGACAGTGGAGCAGTGTTTACATTCGGAAAATCTAAGTTCGCTGAAAATAACCCAGGAAAGTTCTGGTTTAAAAACGACGTGCCCGTCCACCTGTCTTGTGGCGATGAGCATAGTGCCGTGGTCACTGGGAACAATAAGCTGTACATGTTCGGGTCCAACAACTGGGGACAGCTGGGGCTGGGATCCAAATCTGCTATCTCTAAGCCAACCTGCGTGAAGGCACTGAAACCCGAGAAGGTCAAACTGGCCGCTTGTGGCAGAAACCACACTCTGGTGAGCACCGAGGGCGGGAATGTCTATGCCACCGGAGGCAACAATGAGGGACAGCTGGGACTGGGGGACACTGAGGAAAGGAATACCTTTCACGTGATCTCCTTCTTTACATCTGAGCATAAGATCAAGCAGCTGAGCGCTGGCTCCAACACATCTGCAGCCCTGACTGAGGACGGGCGCCTGTTCATGTGGGGAGATAATTCAGAGGGCCAGATTGGGCTGAAAAACGTGAGCAATGTGTGCGTCCCTCAGCAGGTGACCATCGGAAAGCCAGTCAGTTGGATTTCATGTGGCTACTATCATAGCGCCTTCGTGACCACAGATGGCGAGCTGTACGTCTTTGGGGAGCCCGAAAACGGAAAACTGGGCCTGCCTAACCAGCTGCTGGGCAATCACCGGACACCCCAGCTGGTGTCCGAGATCCCTGAAAAAGTGATCCAGGTCGCCTGCGGGGGAGAGCATACAGTGGTCCTGACTGAGAATGCTGTGTATACCTTCGGACTGGGCCAGTTTGGCCAGCTGGGGCTGGGAACCTTCCTGTTTGAGACATCCGAACCAAAAGTGATCGAGAACATTCGCGACCAGACTATCAGCTACATTTCCTGCGGAGAGAATCACACCGCACTGATCACAGACATTGGCCTGATGTATACCTTTGGCGATGGACGACACGGGAAGCTGGGACTGGGACTGGAGAACTTCACTAATCATTTTATCCCCACCCTGTGTTCTAACTTCCTGCGGTTCATCGTGAAACTGGTCGCTTGCGGCGGGTGTCACATGGTGGTCTTCGCTGCACCTCATAGGGGCGTGGCTAAGGAGATCGAATTTGACGAGATTAACGATACATGCCTGAGCGTGGCAACTTTCCTGCCATACAGCTCCCTGACTTCTGGCAATGTGCTGCAGAGAACCCTGAGTGCAAGGATGCGGAGAAGGGAGAGGGAACGCTCTCCTGACAGTTTCTCAATGCGACGAACCCTGCCACCTATCGAGGGAACACTGGGACTGAGTGCCTGCTTCCTGCCTAACTCAGTGTTTCCACGATGTAGCGAGCGGAATCTGCAGGAGTCTGTCCTGAGTGAGCAGGATCTGATGCAGCCAGAGGAACCCGACTACCTGCTGGATGAGATGACCAAGGAGGCCGAAATCGACAACTCTAGTACAGTGGAGTCCCTGGGCGAGACTACCGATATCCTGAATATGACACACATTATGTCACTGAACAGCAATGAGAAGAGTCTGAAACTGTCACCAGTGCAGAAGCAGAAGAAACAGCAGACTATTGGCGAGCTGACTCAGGACACCGCCCTGACAGAGAACGACGATAGCGATGAGTATGAGGAAATGTCCGAGATGAAGGAAGGCAAAGCTTGTAAGCAGCATGTCAGTCAGGGGATCTTCATGACACAGCCAGCCACAACTATTGAGGCTTTTTCAGACGAGGAAGTGGAGATCCCCGAGGAAAAAGAGGGCGCAGAAGATTCCAAGGGGAATGGAATTGAGGAACAGGAGGTGGAAGCCAACGAGGAAAATGTGAAAGTCCACGGAGGCAGGAAGGAGAAAACAGAAATCCTGTCTGACGATCTGACTGACAAGGCCGAGGTGTCCGAAGGCAAGGCAAAATCTGTCGGAGAGGCAGAAGACGGACCAGAGGGACGAGGGGATGGAACCTGCGAGGAAGGCTCAAGCGGGGCTGAGCATTGGCAGGACGAGGAACGAGAGAAGGGCGAAAAGGATAAAGGCCGCGGGGAGATGGAACGACCTGGAGAGGGCGAAAAAGAGCTGGCAGAGAAGGAGGAATGGAAGAAAAGGGACGGCGAGGAACAGGAGCAGAAAGAAAGGGAGCAGGGCCACCAGAAGGAGCGCAACCAGGAGATGGAAGAGGGCGGCGAGGAAGAGCATGGCGAGGGAGAAGAGGAAGAGGGCGATAGAGAAGAGGAAGAGGAAAAAGAAGGCGAAGGGAAGGAGGAAGGAGAGGGCGAGGAAGTGGAAGGCGAGAGGGAAAAGGAGGAAGGAGAACGGAAGAAAGAGGAAAGAGCCGGCAAAGAGGAAAAGGGCGAGGAAGAGGGCGATCAGGGCGAAGGCGAGGAGGAAGAGACCGAGGGCCGCGGGGAAGAGAAAGAGGAGGGAGGAGAGGTGGAGGGCGGAGAGGTCGAAGAGGGAAAGGGCGAGCGCGAAGAGGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCGAGGAAGAAGAGGGCGAGGGGGAAGAAGAGGAGGGAGAGGGCGAAGAGGAAGAGGGGGAGGGAAAGGGCGAAGAGGAAGGAGAGGAAGGGGAGGGAGAGGAAGAGGGGGAGGAGGGCGAGGGGGAAGGCGAGGAGGAAGAAGGAGAGGGGGAAGGCGAAGAGGAAGGCGAGGGGGAAGGAGAGGAGGAAGAAGGGGAAGGCGAAGGCGAAGAGGAGGGAGAAGGAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGAGAAGGGAAGGGCGAGGAGGAAGGCGAAGAGGGAGAGGGGGAAGGCGAGGAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGGAGAGGACGGCGAGGGCGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGGGAATGGGAAGGCGAAGAAGAGGAAGGCGAAGGCGAAGGCGAAGAAGAGGGCGAAGGGGAGGGCGAGGAGGGCGAAGGCGAAGGGGAGGAAGAGGAAGGCGAAGGAGAAGGCGAGGAAGAAGAGGGAGAGGAGGAAGGCGAGGAGGAAGGAGAGGGGGAGGAGGAGGGAGAAGGCGAGGGCGAAGAAGAAGAAGAGGGAGAAGTGGAGGGCGAAGTCGAGGGGGAGGAGGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGAAGAGGGCGAAGAAGAAGGCGAGGAAAGAGAAAAAGAGGGAGAAGGCGAGGAAAACCGGAGAAATAGGGAAGAGGAGGAAGAGGAAGAGGGAAAGTACCAGGAGACAGGCGAAGAGGAAAACGAGCGGCAGGATGGCGAGGAATATAAGAAAGTGAGCAAGATCAAAGGATCCGTCAAGTACGGCAAGCACAAAACCTATCAGAAGAAAAGCGTGACCAACACACAGGGGAATGGAAAAGAGCAGAGGAGTAAGATGCCTGTGCAGTCAAAACGGCTGCTGAAGAATGGCCCATCTGGAAGTAAAAAATTCTGGAACAATGTGCTGCCCCACTATCTGGAACTGAAATAA(SEQIDNO:3)在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含选自下组的序列：(a)核苷酸序列，其编码与SEQIDNO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；和/或(b)与SEQIDNO:3具有至少80％同一性的核苷酸序列；或(c)SEQIDNO:3的核苷酸序列，优选地，其中由核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留了由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码与SEQIDNO:1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地其中所述氨基酸序列基本上保留了由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。在另一实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含与SEQIDNO:3具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的核苷酸序列，优选地其中由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列基本上保留了由SEQIDNO:1代表的蛋白质的天然功能。在优选的实施方案中，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列包含SEQIDNO:3的核苷酸序列。优选地，本发明的RPGRORF15编码核苷酸序列编码蛋白质，该蛋白质在患有或有风险形成色素性视网膜炎的受试者中，相对于SEQIDNO:1的蛋白质，有助于提供以下的相似或更高预防：(a)与RP有关的视网膜色素改变的临床表现；(b)光感受器(如视锥细胞，优选视锥和视杆细胞)细胞死亡；和/或(c)视觉功能恶化。如本文所用，核苷酸符号“N”表示按照IUPAC-IUB惯例，任何核苷酸可以存在于该位置(例如G、A、T或C)。色素性视网膜炎色素性视网膜炎(RP)是遗传性视网膜营养不良的表型相关组，其通常由杆状感光细胞的进行性变性引起。视网膜色素上皮(RPE)和视锥感光细胞也可能在疾病的进展中变性。X连锁的色素性视网膜炎(XLRP)，一种以X染色体连锁模式遗传的疾病形式(即与疾病相关的基因位于X染色体上)认为是色素性视网膜炎最严重的形式。RP在临床表现上表征为视网膜色素改变，这可能伴随着小动脉衰减和视神经萎缩。视网膜变化可能由视网膜色素的分散和聚集引起。这可能会引起从粒状或斑点到类似于骨针的独特局灶性聚集体的外观。可能会出现黑色或深褐色星形浓度的色素。此外，色素沉着限于视网膜的一个象限，可以观察到似乎从盘放射出的异常和与严重血管病变相关的变化。本文描述的RP的治疗或预防可减少或防止上述RP表型的出现。它可以导致保护感光细胞(如视锥细胞)免于变性。优选地，该治疗防止视锥和视杆细胞变性。临床技术人员可通过使用诸如适应光学，自发荧光和光学相干断层扫描(OCT)扫描的技术来估计视杆和视锥的数量。优选地，RP治疗使视觉功能得以维持或改善。技术人员可以容易地进行视网膜外观的可视化和视觉功能的评估。例如，可以由技术人员进行的视觉功能测试包括最佳校正视敏度、视野测试、微视野检查术(microperimetry)、色觉、暗适应性测量术(darkadaptometry)、视网膜电描记术和视锥闪烁融合测试。如本文所用，“维持或改善视觉功能”应理解为当在已进行本发明的方法之前和之后比较治疗的眼中的视力时(通过一种或多种此类视觉功能测试评估)，基本上相同水平的维持或改善的视觉水平。眼的结构就色素性视网膜炎(RP)的治疗或预防而言，本文公开的药物可以递送至哺乳动物，优选人眼。治疗眼病的技术人员将对眼的结构有一个详细而全面的了解。然而，描述了与本发明特别相关的以下结构。视网膜视网膜是多层膜，其作为眼的内后房衬里并且感测视觉世界的图像，该图像通过视神经传达给大脑。从眼的内到外的顺序，视网膜包含感觉神经性视网膜层和视网膜色素上皮，其中脉络膜位于视网膜色素上皮外部。感觉神经性视网膜和感光细胞感觉神经性视网膜含有直接感光的感光细胞。其包含以下的层：内界膜(ILM)；神经纤维层；神经节细胞层；内丛状层；内核层；外丛状层；外核层(光感受器的核)；外界膜(ELM)；和视杆和视锥的光感受器(内部和外部区段)。技术人员将对感光细胞有详细的了解。简言之，感光细胞是位于视网膜的特化神经元，其可将光转化为生物信号。感光细胞包含在视网膜间差异分布的视锥和视杆细胞。视杆细胞主要分布在视网膜的外部部分间。它们非常灵敏，并在低光条件下提供视力。正常人视网膜中平均有大约1.25亿个视杆细胞。视锥细胞遍布视网膜，但特别高度集中在小凹(fovea)中，所述小凹是感觉神经性视网膜中负责中央高分辨率视力的凹陷。视锥细胞没有比视杆细胞灵敏。在正常人视网膜中平均有约6-7百万个视锥细胞。视网膜色素上皮视网膜色素上皮(RPE)是位于紧邻感觉神经性视网膜外部处的细胞的着色层。RPE执行许多功能，包括将营养物质和其它物质运输到感光细胞，和吸收散射光来改善视力。脉络膜脉络膜是位于RPE和眼外巩膜之间的血管层。脉络膜的脉管系统能够向视网膜提供氧气和营养物质。载体载体是允许或便于将实体从一种环境转移到另一种的工具。根据本发明，并且举例而言，在重组核酸技术中使用的一些载体允许诸如核酸片段(例如异源DNA区段，如异源cDNA区段)等实体被转移到靶细胞中。载体可以用于在细胞内维持异源核酸(如DNA或RNA)，促进包含核酸区段的载体的复制，或促进由核酸区段编码的蛋白质的表达的目的。载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的例子包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA或RNA)。在其最简单的形式中，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。一方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中使用的载体例如可以是质粒或病毒载体在并且可以包括用于多核苷酸表达的启动子和优选地该启动子的调节物。病毒载体在优选的实施方案中，本发明的载体是病毒载体。优选地，所述病毒载体是病毒载体颗粒的形式。病毒载体例如可以是腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体。技术人员能够容易地选择适合于需要目的的病毒作为本发明中的载体，例如基于要递送的转基因的大小和类型以及靶细胞的类型。此外，病毒载体和病毒载体颗粒(如源自AAV、逆转录病毒、慢病毒或腺病毒的那些)的制备和修饰方法是本领域已知的并且可以由技术人员容易地针对所需的目的改编。腺伴随病毒(AAV)载体在优选的实施方案中，本发明的载体是腺伴随病毒(AAV)载体。优选地，AAV载体是AAV颗粒的形式。AAV载体可以包含AAV基因组或其衍生物。AAV基因组是多核苷酸序列，其编码产生AAV颗粒所需的功能。这些功能包括在宿主细胞中AAV的复制和包装循环中运行的那些，包括AAV基因组进入AAV颗粒的壳体化。天然存在的AAV是复制缺陷的并且依赖于以反式提供的用于完成复制和包装循环的辅助功能。因此，本发明的载体的AAV基因组通常是复制缺陷的。AAV基因组可以是单链形式的(正义或反义)或者双链形式的。双链形式的使用允许绕过靶细胞中的DNA复制步骤并因此可加速转基因表达。AAV基因组可以是来自AAV的任何天然衍生的血清型、隔离群或进化枝。因此，AAV基因组可以是天然存在的AAV的完整基因组。如技术人员所知，可根据各种生物学系统来对自然界中存在的AAV分类。通常，AAV按照其血清型提及。血清型对应于AAV的变体亚种，该亚种基于其壳体表面抗原的表达谱，具有独特的可用于与其它变体亚种相区分的反应性。通常，具有特定AAV血清型的病毒不与对任何其它AAV血清型特异性的中和抗体有效起叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，并且还有重组血清型，如最近从灵长类动物脑鉴定的Rec2和Rec3。任何这些AAV血清型都可以用于本发明。因此，在本发明的一个实施方案中，AAV载体颗粒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rec2或Rec3AAV载体颗粒。对AAV血清型的综述可见Choietal.(2005)Curr.GeneTher.5:299-310以及Wuetal.(2006)MolecularTherapy14:316-27。用于本发明的包括ITR序列、rep或cap基因在内的AAV基因组的序列或AAV基因组的元件可源自AAV整个基因组序列的以下登录号：腺伴随病毒1NC_002077,AF063497；腺伴随病毒2NC_001401；腺伴随病毒3NC_001729；腺伴随病毒3BNC_001863；腺伴随病毒4NC_001829；腺伴随病毒5Y18065,AF085716；腺伴随病毒6NC_001862；禽AAVATCCVR-865AY186198,AY629583,NC_004828；禽AAV毒株DA-1NC_006263,AY629583；牛AAVNC_005889,AY388617。AAV也可以按照进化枝或克隆提及。这是指天然衍生的AAV的系统发育关系，并通常指可以追溯到共同祖先的AAV的系统发育组，并且包括其所有的后代。另外，AAV可以按照特定的隔离群，即自然界中发现的具体的AAV的遗传隔离群提及。术语遗传隔离群描述了AAV群体，其与其它天然存在的AAV经历了有限的遗传混合，从而在遗传水平定义独特得可识别的群体。技术人员可以基于他们共同的常识来选择合适的AAV的血清型、进化枝、克隆或隔离群用于本发明。例如，AAV5已经显示出有效转导灵长类视锥光感受器，如通过成功矫正遗传性色觉缺陷来证明的(Mancusoetal.(2009)Nature461:784-7)。AAV血清型决定了AAV病毒感染(或向性)的组织特异性。因此，用于根据本发明施用至患者的AAV中优选的AAV血清型是那些对眼内靶细胞具有天然向性，或高效感染靶细胞的AAV血清型。在一个实施方案中，用于本发明的AAV血清型是感染神经性视网膜，视网膜色素上皮和/或脉络膜细胞的那些。通常，AAV的天然衍生的血清型、隔离群或进化枝的AAV基因组包含至少一个反向末端重复序列(ITR)。ITR序列以顺式作用来提供功能性复制起点并允许整合载体和从细胞基因组切除载体。在优选的实施方案中，一个或多个ITR序列在编码RPGRORF15的核苷酸序列的侧翼。AAV基因组通常还包含包装基因，如编码AAV颗粒包装功能的rep和/或cap基因。rep基因编码蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体的一种或多种。cap基因编码一种或多种壳体蛋白，如VP1、VP2和VP3或其变体。这些蛋白质组成了AAV颗粒的壳体。下面讨论壳体变体。启动子将可操作连接到每个包装基因。此类启动子的具体例子包括p5、p19和p40启动子(Laughlinetal.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5567-5571)。例如，p5和p19启动子通常用于表达rep基因，而p40启动子通常用于表达cap基因。如上所讨论的，用于本发明载体的AAV基因组因此可以是天然存在的AAV的完整基因组。例如，包含完整AAV基因组的载体可用于体外制备AAV载体或载体颗粒。然而，尽管这种载体原则上可以施用至患者，但实践中很少这样做。优选地，为了施用至患者的目的，衍生化AAV基因组。此类衍生化是本领域的标准，并且本发明涵盖了使用任何已知的AAV基因组衍生物，和可通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组和AAV壳体的衍生化综述于CouraandNardi(2007)VirologyJournal4:99,以及于Choi等人和Wu等人,以上引用。AAV基因组的衍生物包括AAV基因组的任何截短或修饰形式，其允许体内从本发明的载体表达转基因。通常可以显著截短AAV基因组以包括最小病毒序列而保留以上功能。这是出于安全的原因而优选的，以降低载体与野生型病毒重组的风险，并且还避免通过靶细胞中存在病毒基因蛋白而引发细胞免疫应答。通常，衍生物将含有至少一种反向末端重复序列(ITR)，优选地多于一种的ITR，如2种ITR或更多。一种或多种ITR可源自具有不同血清型的AAV基因组，或可以是嵌合或突变体ITR。优选的突变体是具有trs(末端解析位点)缺失的变体。该缺失允许基因组的继续扩增以生成含有编码和互补序列两者的单链基因组，即自身互补的AAV基因组。这允许绕过靶细胞中的DNA复制，从而可以加速转基因表达。一种或多种ITR将优选地位于编码RPGRORF15的核苷酸序列任一末端的侧翼。包含一种或多种ITR是优选的，以有助于本发明载体在宿主细胞核中的多连体形成，例如在通过宿主细胞DNA聚合酶的作用将单链载体DNA转化为双链DNA之后。此类附加型多连体的形成在宿主细胞生命期间保护载体构建体，从而允许体内转基因的延长表达。在优选的实施方案中，ITR元件将是衍生物中从天然AAV基因组保留的唯一序列。因此，衍生物将优选不包含天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其它序列。由于上述原因，这是优选的，并且也是为了减少载体整合到宿主细胞基因组中的可能性。此外，减少AAV基因组的大小允许增加向载体内整合除转基因之外的其它序列元件(例如调节元件)的灵活性。因此可以在本发明的衍生物中除去以下部分：一个反向末端重复(ITR)序列、复制(rep)和壳体(cap)基因。然而，在一些实施方案中，衍生物可以额外地包含一种或多种rep和/或cap基因或AAV基因组的其它病毒序列。天然存在的AAV在人19号染色体上的特定位点以高频率整合，并显示出忽略不计的随机整合的频率，使得在疗法设置中可以容忍在载体中整合能力的保留。当衍生物包含壳体蛋白(即VP1、VP2和/或VP3)时，所述衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV的嵌合的、改组的或壳体修饰的衍生物。特别地，本发明涵盖了提供来自相同载体(即假型化载体)内的AAV的不同血清型、进化枝、克隆或隔离群的壳体蛋白序列。通常将选择嵌合的、改组的或壳体修饰的衍生物以为病毒载体提供一种或多种所需的功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组的AAV载体(诸如AAV2的AAV载体)相比，这些衍生物可显示出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞)、改变的向性范围和/或改善的特定细胞类型靶向。可通过细胞表面上改善的受体或共受体结合、改善的内化、改善的细胞内运输并对细胞核的运输、改善的病毒颗粒脱壳和改善的单链基因组转换为双链形式来实现增加的基因递送效率。增加的效率还可以涉及改变的向性范围或靶向特定的细胞群体，使得载体剂量不通过施用至不需要它的组织而稀释。嵌合壳体蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两个或更多个壳体编码序列之间的重组产生的那些。这可以例如通过标志物挽救方法进行，其中一种血清型的非感染性壳体序列与不同血清型的壳体序列共转染，并且使用定向选择来选择具有期望特性的壳体序列。可以通过细胞内的同源重组来改变不同血清型的壳体序列，以产生新的嵌合壳体蛋白。嵌合壳体蛋白也包含通过工程化改造壳体蛋白序列生成的那些以在两种或多种壳体蛋白之间(例如在不同血清型的两种或多种壳体蛋白之间)传递特定壳体蛋白结构域、表面环或特定氨基酸残基。也可通过DNA改组或通过易错PCR来生成改组或嵌合壳体。杂合AAV壳体基因可以通过随机片段化相关AAV基因的序列(如编码多种不同血清型的壳体蛋白的那些)并然后随后在自引发聚合酶反应中再组装片段(这也可能引起序列同源性区域中的交换)而创建。可以对通过改组数种血清型的壳体基因的方式创建的杂合AAV基因的文库进行筛选以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于随机突变AAV壳体基因以创建不同的变体库，然后可以对变体库筛选期望的特性。也可以对壳体基因的序列进行遗传修饰以相对于天然野生型序列引入特定的缺失、替换或插入。特别地，可通过在壳体编码序列的开放阅读框内或在壳体编码序列的N-和/或C-端插入不相关蛋白质或肽的序列来修饰壳体基因。不相关的蛋白质或肽可以下述的蛋白质或肽，其有利地为充当特定细胞类型的配体，从而赋予对靶细胞的改善的结合或改善将载体靶向特定细胞群的特异性。例子可以包括使用RGD肽来阻断视网膜色素上皮的摄入并因此增强周围视网膜组织的转导(Croninetal.(2008)ARVOAbstract:D1048)。不相关的蛋白质也可以是作为生产过程的一部分来辅助纯化病毒颗粒的蛋白质，即表位或亲和标签。通常选择插入位点以免干扰病毒颗粒的其它功能，如病毒颗粒的内化、运输。技术人员可以基于他们的普通常识来鉴别适合插入的位置。在上面引用的Choi等人中公开了特定的位置。本发明还包括将不同顺序和结构的AAV基因组序列提供至天然AAV基因组序列。本发明还包括用来自另一种病毒的序列或用由来自超过一种病毒的序列组成的嵌合基因来替换一种或多种AAV序列或基因。此类嵌合基因可以由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列组成。本发明的载体可以采用包含AAV基因组或其衍生物和编码RPGRORF15转基因或其变体序列的核苷酸序列的形式。本发明的AAV颗粒包含转壳体的形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物包装到不同血清型的壳体中。本发明的AAV颗粒还包括镶嵌(mosaic)形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰壳体蛋白的混合物构成病毒壳体。AAV颗粒还包括带有吸附到壳体表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。因此，例如，本发明的AAV颗粒包括具有AAV2基因组和AAV2壳体蛋白(AAV2/2)的那些、具有AAV2基因组和AAV5壳体蛋白(AAV2/5)的那些，以及具有AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)的那些。逆转录病毒和慢病毒载体在本发明的另一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。逆转录病毒和慢病毒已经适于用作宽泛目的的基因疗法载体。逆转录病毒可大致分为“简单”和“复杂”两类。逆转录病毒甚至可以进一步分成七组。这些组中的五组代表具有致癌潜力的逆转录病毒。剩下的两组是慢病毒和泡沫病毒(spumaviruses)。这些逆转录病毒的综述呈现于Coffin,J.M.etal.(1997)Retroviruses,pp.758-763,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Eds:J.M.Coffin,S.M.Hughes,H.E.Varmus中。本发明中使用的逆转录病毒载体可以源自或可以来源于任何合适的逆转录病毒。已经鉴定了大量不同的逆转录病毒，并且技术人员能够为特定目的选择合适的逆转录病毒。例子包括：鼠白血病病毒(MLV)、人类T细胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和禽幼红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可在Coffin,J.M.etal.(1997)Retroviruses,pp.758-763,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Eds:J.M.Coffin,S.M.Hughes,H.E.Varmus中找到。在本发明的另一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体是较大组的逆转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细列表可以在Coffin,J.M.etal.(1997)Retroviruses,pp.758-763,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Eds:J.M.Coffin,S.M.Hughes,H.E.Varmus中找到。简言之，慢病毒可以分为灵长类组和非灵长类组。灵长类慢病毒的例子包括但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒(slowvirus)”visna/maedi病毒(VMV)，以及相关的羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)，和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。腺病毒在本发明的另一实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体是双链、线性DNA病毒，其不经历RNA中间体。存在超过50种的不同人类腺病毒血清型，根据遗传序列的同源性，其被分成6个亚组。腺病毒的天然靶标是呼吸道和肠胃上皮，通常只引发温和症状。血清型2和5(具有95％的序列同源性)是腺病毒载体系统中最常使用的，并且通常与年轻人的上呼吸道感染有关。腺病毒已经用作基因疗法和表达异源基因的载体。大基因组(36kb)能够容纳高达8kb的外源插入DNA，并能够在互补细胞系中高效复制，产生高达1012的极高效价。因此，腺病毒是用于研究基因在原代非复制细胞中表达的最佳系统之一。来自腺病毒基因组的病毒基因或外源基因的表达不需要正在复制中的细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦在细胞中，腺病毒载体很少整合进宿主染色体。相反，它们作为线性染色体在宿主细胞核中以附加体方式发挥作用(独立于宿主染色体)。因此，使用重组腺病毒能减轻与随机整合入宿主染色体中有关的问题。启动子和调节序列本发明的载体还可以包括允许体外或体内表达RPGRORF15转基因的元件。可以将这些称为表达控制序列。因此，载体通常包含可操作连接至编码转基因的核苷酸序列的表达控制序列(如包含启动子序列)。可以使用任何合适的启动子，技术人员可以容易地进行选择。启动子序列可以是组成型活性的(即在任何宿主细胞背景中都起作用的)，或可选地可以仅在特定的宿主细胞环境中有活性，从而允许转基因在特定的细胞类型中靶向表达(如组织特异性启动子)。启动子可响应另一个因子(例如存在于宿主细胞中的因子)的存在而显示可诱导的表达。在施用载体用于治疗的任何情况下，优选的是启动子在靶细胞背景中应当是有功能的。在一些实施方式中，优选的是，启动子显示视网膜细胞特异的表达以允许转基因只在视网膜细胞群中表达。因此，来自启动子的表达可以是视网膜细胞特异的，例如只限定于感觉神经性视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。优选的启动子包括鸡beta-肌动蛋白(CBA)启动子，任选地与巨细胞病毒(CMV)增强子元件组合。用于本发明的示例性启动子是杂合的CBA/CAG启动子，例如用于rAVE表达盒子中的启动子(GeneDetect.com)。用于本发明的另一个示例性启动子具有以下序列：ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT(SEQIDNO:4)基于可诱导视网膜特异性基因表达的人序列的启动子的例子包括用于视杆和视锥的视紫红质激酶(Alloccaetal.(2007)J.Virol.81:11372-80)、仅用于视锥的PR2.1(Mancusoetal.(2009)Nature461:784-7)和/或用于视网膜色素上皮的RPE65(Bainbridgeetal.(2008)N.Engl.J.Med.358:2231-9)。在一些实施方案中，RPGRORF15编码多核苷酸可操作连接至(优选地)人视紫红质激酶(GRK1)启动子，该启动子可以包含SEQIDNO:7的核苷酸序列或与其具有至少90或95％同一性的功能性变体。GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGG(SEQIDNO:7)在另一实施方案中，与RPGRORF15编码多核苷酸可操作连接的启动子元件优选为人感光细胞间类视色素(retinoid)结合蛋白(IRBP)启动子，该启动子可以包含SEQIDNO:8的核苷酸序列或与其具有至少90或95％同一性的功能性变体。agcacagtgtctggcatgtagcaggaactaaaataatggcagtgattaatgttatgatatgcagacacaacacagcaagataagatgcaatgtaccttctgggtcaaaccaccctggccactcctccccgatacccagggttgatgtgcttgaattagacaggattaaaggcttactggagctggaagccttgccccaactcaggagtttagccccagaccttctgtccaccagc(SEQIDNO:8)优选地，除了启动子，没有额外的调节元件用于控制RPGRORF15的表达。然而，本发明的载体还可以包含一种或多种额外的调节序列，该序列可以在转录前或转录后起作用。调节序列可以是天然转基因基因座的一部分或可以是异源调节序列。本发明的载体可以包含来自天然转基因转录物的5'-UTR或3'-UTR部分。调节序列是促进转基因表达的任何序列，即起作用以增加转录物的表达，改善mRNA的核输出或增强其稳定性。此类调节序列例如包括增强子元件、调节后元件和聚腺苷酸化位点。优选的聚腺苷酸化位点是牛生长激素多聚A信号，其可以如下所示：TCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGG(SEQIDNO:5)在本发明的载体的背景下，此类调节序列将是顺式作用的。然而，本发明还包括使用位于其它遗传构建体上的反式作用调节序列。本发明的载体中使用的优选的调节后元件是土拨鼠肝炎表面抗原(WPRE)或其变体。下面显示了WPRE的示例序列：ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC(SEQIDNO:6)本发明涵盖了与没有WPRE的载体相比增加转基因表达的WPRE的任何变体序列的应用。优选地，变体序列在其整个序列上与SEQIDNO:6显示至少70％的同一性，更优选地在整个序列上与SEQIDNO:6显示75％、80％、85％、90％和更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可用于本发明的载体中的另一个调节序列是支架结合区(scaffoldattachmentregion)(SAR)。技术人员可以容易地选择其它调节序列。施用方法在本发明的一个实施方案中，通过视网膜下注射、直接视网膜注射或玻璃体内注射来将病毒(如AAV)载体施用至受试者的眼。技术人员将熟悉并且能够进行单独的视网膜下注射、直接视网膜注射或玻璃体内注射。优选地，通过视网膜下注射来施用病毒(如AAV)载体。视网膜下注射视网膜下注射为注射到视网膜下空间，即感觉神经性视网膜下面。在视网膜下注射期间，将注射的材料直接导入感光细胞和视网膜色素上皮(RPE)层之间，并在其间创建空间。当通过小视网膜切开术进行注射时，可创建视网膜脱离。通过注射材料生成的视网膜的脱离的、凸出的层称为“泡”。由视网膜下注射产生的孔必须足够小，以使得注射的溶液在施用后不显著回流到玻璃体腔中。当注射药物时此类回流会特别成问题，因为药物的作用会被引导离开目标区域。优选地，注射在感觉神经性视网膜中创建自密封的入口点，即一旦取出针头，由针头创建的孔再封闭，使得很少或几乎没有注入的材料通过孔释放。为了促进这一过程，专家视网膜下注射针头是市售的(例如DORC41GTeflon视网膜下注射针头,DutchOphthalmicResearchCenterInternationalBV,Zuidland,TheNetherlands)。设计了这些针头以进行视网膜下注射。除非在注射期间发生视网膜损伤，并且只要使用足够小的针，基本上所有注射的材料都保持位于分离的感觉神经性视网膜和局部视网膜脱离部位处的RPE之间(即不会回流进玻璃体腔)。事实上，短时间框架内典型的泡持续表明注射材料通常很少逃逸到玻璃体中。随着注入的物质的吸收，泡可能在更长的时间框架内消散。例如使用光学相干断层扫描术可以在手术前对眼，特别是视网膜进行可视化。两步视网膜下注射本发明的载体可以通过使用两步法(其中通过视网膜下注射第一溶液创建局部视网膜脱离)以更高的准确性和安全性递送。第一溶液不包含载体。然后使用第二次视网膜下注射将包含载体的药物递送到由第一次视网膜下注射创建的泡的视网膜下液中。由于递送药物的注射不用于分离视网膜，在该第二步骤中可以注射特定体积的溶液。在本发明的一个实施方案中，通过以下递送病毒(如AAV)载体：(a)通过视网膜下注射以对于使视网膜至少部分脱离有效的量对所述受试者施用溶液以形成视网膜下泡，其中所述溶液不含载体；和(b)通过视网膜下注射将药物组合物施用到由步骤(a)形成的泡中，其中所述药物包含载体。步骤(a)中注射以至少部分分离视网膜的溶液体积可以是例如约10-1000μL，例如约50-1000、100-1000、250-1000、500-1000、10-500、50-500、100-500、250-500μL。例如，体积可以是约10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μL。步骤(b)中注射的药物组合物的体积例如可以是约10-500μL，例如约50-500、100-500、200-500、300-500、400-500、50-250、100-250、200-250or50-150μL。例如，体积可以是约10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μL。优选地，步骤(b)中注射的药物组合物的体积是100μL。较大的体积可以增加伸展视网膜的风险，而较小的体积可能难以看到。如下所述，不包含药物的溶液(即步骤(a)的“第一溶液”)可以类似地配制成包含药物的溶液。不包含药物的优选溶液是平衡盐水溶液(BSS)或与视网膜下空间的pH和渗透压(osmolality)相匹配的相似缓冲溶液。手术过程中可视化视网膜在某些情况下，例如在末期视网膜变性期间，识别视网膜是困难的，因为它很薄，透明并且相对于它所位于的破裂的和重度色素沉着的上皮难以看到。使用蓝色活体染料(如BrilliantGeuder；MembraneBlue-Dorc)可以促进制备用于视网膜分离方案的视网膜孔的识别(即本发明的两步视网膜下注射方法中的步骤(a))，使得药物可以通过相同的孔施用而没有回流到玻璃体腔的风险。蓝色活体染料的使用还可以识别视网膜上有增厚的内界膜或视网膜前膜的任何区域，因为通过这些结构中的任何一个的注射都会阻碍完全(clean)接近视网膜下空间。此外，手术期后立即收缩这些结构中的任何一个可导致视网膜进入孔的拉伸，这将导致药物回流入玻璃体腔。药物组合物和注射溶液本发明的药物(例如载体)可以配制成药物组合物。除药物外，这些组合物还可包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域公知的其它物质。此类材料应当是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。本领域技术人员根据施用途径(例如，视网膜下注射、直接视网膜注射或玻璃体内注射)可以确定载体或其它物质的确切性质。药物组合物通常为液体形式。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物或植物油，矿物油或合成油。生理盐水溶液、氯化镁、葡萄糖或其它糖类溶液，或二醇类诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇可以包括在内。在一些情况下，可以使用表面活性剂，如普朗尼克酸(PF68)0.001％。为了在患处注射，活性成分可以是无热原的水溶液形式，并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够使用例如等渗载体如氯化钠注射液，林格注射液或乳酸林格注射液制备合适的溶液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。为了延迟释放，根据本领域已知的方法，药物可以包含在配制用于缓释的药物组合物中，例如在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载体系统中。治疗方法应当理解，本文中对治疗的全部提及包括治愈性、姑息性和预防性处理；尽管在本发明的上下文中，提及预防更通常与预防性处理有关。治疗也可以包括阻止疾病严重程度的进展。哺乳动物，特别是人类的治疗是优选的。然而，人类和兽医治疗都在本发明的范围内。变体、衍生物、类似物、同源物和片段除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本发明还包括变体、衍生物、类似物、同源物及其片段的用途。在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核酸残基)已经经过修饰而使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留在至少一种其内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列。如本文中使用，术语“衍生物”就本发明的蛋白质或多肽而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的蛋白质或多肽基本上保留至少一种其内源功能。如本文中使用，术语“类似物”就多肽或多核苷酸而言包括任何模拟物，即拥有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。通常，可以进行氨基酸取代，例如1、2或3至10或20个取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。用于本发明的蛋白质也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。可以进行保守取代，例如根据下表。第二列中相同块中并且优选在第三列的同一行中的氨基酸可以彼此取代：如本文所用，术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的上下文中，优选的是在序列同一性方面表达同源性。同源序列可以包括可以与主题序列是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同，优选至少95％或97％或99％相同的核苷酸序列。尽管同源性也可以在相似性方面考虑，但在本发明的上下文中，优选的是在序列同一性方面表达同源性。优选地，提及与本文详述的SEQIDNO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQIDNO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。可以通过眼或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些商品化的计算机程序可以计算两种或更多种序列之间的百分比同源性或同一性。可以在连续序列上计算百分比同源性，即将一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，仅在相对较短数目的残基上进行此类无缺口比对。尽管这是非常简单且一致的方法，但是它未能考虑到例如在其它方面相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可以导致以下密码子退出比对，因此当进行全局比对时潜在导致同源性百分比的大幅降低。因此，大多数序列比较方法设计为产生考虑可能的插入和缺失的最佳比对，而不会过度地对总体同源性分数罚分。这通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性最大化实现。然而，这些更复杂的方法为比对中发生的每个缺口分配“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对(反映两个比较序列之间的较高相关性)将比具有许多缺口的比对实现更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(affinegapcost)”，其对于缺口的存在要出相对较高的代价，并且对于缺口中的每个随后的残差要出较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。当然，高缺口罚分会当然产生具有较少缺口的优化的比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用此类软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCGWisconsinBestfit软件包时，氨基酸序列的默认缺口罚分对于缺口为-12并且对于每次延伸为-4。因此，考虑缺口罚分，最大百分比同源性的计算首先需要产生最佳比对。用于进行此类比对的合适的计算机程序是GCGWisconsinBestfit包(UniversityofWisconsin,U.S.A.；Devereuxetal.(1984)NucleicAcidsRes.12:387)。可以执行序列比较的其它软件的例子包括但不限于BLAST包(参见Ausubeletal.(1999)ibid–Ch.18)、FASTA(Atschuletal.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENETORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者均可用于离线和在线搜索(参见Ausubeletal.(1999)同上,第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用GCGBestfit程序。另一种称为BLAST2Sequences的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMSMicrobiol.Lett.(1999)177:187-8)。尽管可以根据同一性测量最终百分比同源性，但是比对过程自身通常不是基于全或无(allornothing)对比较。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个成对比较。通常使用的此类矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(若提供的话)(关于进一步详情，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG包的公共默认值，或者在其它软件的情况下使用默认矩阵，如BLOSUM62。一旦软件已经产生最佳比对，可以计算百分比同源性，优选百分比序列同一性。软件通常将这作为序列比较的一部分进行，并产生数字结果。全长RPGRORF15的“片段”也是变体，并且该术语通常是指功能上或例如在测定法中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。可以使用标准重组DNA技术如定点诱变来制备此类变体。在要做出插入的情况下，可以制备编码插入以及与插入位点的任一侧的天然存在序列对应的5’和3’侧翼区域的合成DNA。侧翼区域将包含对应于天然存在序列中的位点的方便的限制性位点，使得可以用合适的酶切割序列，并将合成的DNA连接到切割物中。然后，根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅仅例示了本领域中已知的用于操作DNA序列的许多标准技术，并且也可以使用其它已知技术。上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述产品、用途、方法和试剂盒的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，如要求保护的本发明不应过度限于这些具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的描述模式的各种修改旨在在所附权利要求书的范围内。实施例实施例1：实施例1A--用于X连锁的色素性视网膜炎的小鼠模型系统某些物种(例如小鼠和狗)具有与人RPGR同源的基因(比较图1中显示的黄色外显子序列)。此类物种因此可作为由人RPGR中突变引起的X连锁色素性视网膜炎的潜在模型。获得两个小鼠模型以测试该研究中治疗性载体的安全性和功效。两者均具有同源基因Rpgr中的改变。1.Rpgr-/-菌株：如下工程化改造该菌株：通过含有编码β-半乳糖苷酶和新霉素抗性标志物的序列来靶向性破坏外显子4的部分至外显子6的部分(HongD.H.etal.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3649-3654)。2.Rd9菌株：该菌株的特征在于导致移码的32bp天然存在的插入突变(ThompsonD.A.etal.(2012)PLoSOne7:e35865)。Rpgr-/-和Rd9小鼠模型两者缺乏Rpgr蛋白表达，但特征仅在于非常轻微的表型(ThompsonD.A.etal.(2012)PLoSOne7:e35865)。实施例1B-RPGR的密码子优化RPGR密码子优化使用密码子优化来制备合成的RPGRORF15序列(coRPGR，“优化的”；SEQIDNO:3)以稳定高度致突变性富含嘌呤的区域(图2)。密码子优化的RPGR基因的表征在标准克隆载体中比较了野生型和密码子优化的序列之间的克隆效率和序列保真度(图3A-D)。使用限制性消化分析，发现24个克隆中仅有3个成功以野生型序列(wtRPGR；图3B，用星号突出显示成功的克隆)为特征。相反，24个克隆中的18个成功以正确的密码子优化序列(coRPGR；图3D)为特征。发现使用coRPGR序列比wtRPGR，来自微量制备物的质粒产率更高(图3E)，尽管保持了相似水平的样品纯度(图3F)。为了支持该发现，当使用coRPGR序列时，来自宏制备物的总质粒产率(图3G)也是较高的。克隆过程中RPGR突变频率分析当使用coRPGR序列时，发现所得克隆的Sanger测序更为容易且与更好的整体信噪比相关联，因为发现模糊的碱基调用是不太可能的(图4)。由于多个G段和wtRPGR的富含嘌呤的性质，必须进行34个独立的测序反应以覆盖大约4kb的DNA序列。在ORF15区域，发现了6个潜在的突变(2个缺失和4个插入)，以及具有进一步点突变潜力的74个模糊的碱基调用。相反，coRPGR更易于测序并且仅17个反应便实现了其序列的清楚确认(至少2x)。序列保真度的定量分析在ISO9001认证的、GLP认证的实验室(SourceBioScience,UK)(作为商业承包商)中使用Sanger测序(验证DNA序列的金标准)(SangerFetal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467)对wtRPGRORF15和coRPGRORF15的四个独立制备的质粒宏制备物的每个进行测序。序列数据与发表的参考数据(NCBIGeneID:6103)的比对揭示了wtRPGRORF15测序数据中的平均20个突变(大部分为单核苷酸缺失、插入和点突变)，但在coRPGRORF15中没有。wtRPGRORF15coRPGRORF15缺失[平均(范围)]1.5(0-4)无插入[平均(范围)]0.5(0-1)无点突变[平均(范围)]17.8(9-33)无总数[平均(范围)]19.75(9-38)无该分析清晰地证明了密码子优化的RPGR序列中高得多的序列稳定性。coRPGR转基因产物蛋白分析进行了液相色谱串联质谱法(LC/MS-MS)以确认coRPGR转基因产物的蛋白质序列(图5)。直接鉴定出约80％的RPGR氨基酸。仅朝向蛋白质C末端的高度富含谷氨酸的且重复的区域的部分逃脱了肽分析(图5，红色序列)。这是因为缺乏为光谱测定法创建寡聚物的特定基序。然而，C末端序列的完美匹配表明产生了没有任何移码的全长蛋白质。另外，Western分析说明来自转染细胞的wtRPGR和coRPGR衍生肽的相同分子量(图6)。这支持了以下结论：不存在已经由密码子优化方法引入的差异(如插入或缺失)。Western分析还清晰地显示了密码子优化使得翻译和蛋白质生产的速率更高(图6)。结论总体而言，与野生型序列相比，密码子优化的RPGRORF15(coRPGR)序列表现出优越的序列保真度和增加的表达水平，并因此被认为有可能改善XLRP基因替代疗法的治疗潜力。实施例1C-密码子优化的RPGR的AAV介导的体内递送将coRPGR序列包装入AAV2/8载体中，该载体用于将RPGR引入缺乏RPGR表达的小鼠(Rd9和Rpgr-/-小鼠品种)的感光细胞中。更详细地，转基因盒特征在于coRPGR多核苷酸序列上游的视紫红质激酶启动子和Kozak共有序列，和来自来自编码序列下游的牛生长激素的多聚A序列。coRPGR导致Rd9和Rpgr-/-小鼠中RPGR蛋白质表达Western印迹分析显示出用AAV.coRPGR载体治疗Rd9和Rpgr-/-小鼠导致RPGR蛋白质表达(图7A)。此外，在来自Rd9和Rpgr-/-小鼠的治疗的和未经治疗的眼中进行了RPGR的免疫组化染色并证明了蛋白质产物的正确定位(图7B)。用coRPGR的基因提升导致Rd9和Rpgr-/-小鼠中的疗效Rd9和Rpgr-/-小鼠模型两者仅在一只眼中经受基因疗法并且使用视网膜电描记术(ERG)来客观评估治疗与未经治疗眼的功能。暗适应后单闪光强度系列的a波和b波振幅(图7C,D)的研究显示了治疗后两个时间点，治疗组相较于未经治疗组具有统计学显著的幅度(p<0.05)。总之，上述数据(其在实施例4和5中更详细地描述)显示了人RPGR的密码子优化序列产生具有预测大小和氨基酸序列的野生型RPGR蛋白质。另外，密码子优化导致更高的序列保真度和表达水平。当通过置换基因疗法在具有Rpgr蛋白表达固有缺乏的模型中应用时，coRPGR序列提供了RPGR的表达。另外，RPGR定位于连接纤毛的生理作用部位，并且能够改善如ERG研究所示的视网膜结构(内部和外部区段长度)和功能。实施例2-工业规模生产pAAV.RK.coRPGR质粒实施例2a编码密码子优化的RPGR序列的质粒的细菌细胞库的生产用质粒pAAV.RK.coRPGR来转化K-12大肠杆菌细菌菌株XL10Gold，该菌株具有基因型TetrD(mcrA)183D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1supE44thi-1recA1gyrA96relA1lacHte[F′proABlacIqZDM15Tn10(Tetr)AmyCamr]，并于补充有氨卡青霉素的琼脂平板上铺板以选择含有具有密码子优化的RPGR序列的质粒DNA的单一菌落。选择了单一菌落，接种至培养基并在小规模液体培养物中扩大。一旦细胞处于对数生长期，收获它们并重悬于含有甘油的冷冻保存介质中，然后将约50个1.5mL的等分试样分配到1.8mL冷冻管中并在-80℃下冷冻以生产细菌细胞库，RCBpAAV.RK.coRPGR大肠杆菌XL10Gold。将细胞库解冻并通过微量制备提取制备质粒DNA(BirnboimH.C.andDolyJ.1979；ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNAin1979Nov24；7(6):1513-23)并通过Xmn1和Sma1内切核酸酶限制消化并随后通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和0.5mg/mL溴化乙啶染色进行分析(图8)。图8清晰地显示了来自稳定的和结构上完整的pAAV.RK.coRPGR质粒的预期的限制消化片段模式，这证明了细胞库培养扩大和生产期间质粒DNA的稳定维持和再生产。还对细胞库评估摇瓶中肉汤培养后的质粒产率并产生每克湿细胞质量598μg的质粒DNA。获得了正确质粒的高质粒产率。当通过将菌落复制涂板到含有抗生素和无抗生素的琼脂平板上来测试隔离稳定性时，也没有质粒丢失的证据。结果显示100％质粒保留。使用Sanger(SangerFetal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467)来对来自细胞库的质粒DNA测序，所得的序列分析显示，当与密码子优化的RPGR序列的理论参考序列比较时，以100％保真度保留密码子优化的RPGR序列。再次，没有证据表明不稳定。还对RCBpAAV.RK.coRPGR大肠杆菌XL10Gold测试细菌纯度(证实了缺乏细菌污染)和裂解和溶原性噬菌体的缺乏(无一检出)。还通过使用API-20E测试(BioMerieux)的生物化学鉴定确认了RCBpAAV.RK.coRPGR大肠杆菌XL10Gold的物种身份。结论RPGR基因的密码子优化导致了PRGR基因的稳定性改善，这导致生成工业上有用的细菌细胞库的能力，该细胞库显示与参考密码子优化的序列100％序列保真度、100％质粒分离稳定性和良好的质粒产率。实施例2b以工业规模生产编码密码子优化的RPGR序列的高质量质粒从如实施例2a中简要描述的那样生成的大肠杆菌XL10Gold细菌细胞库RCBpAAV.RK.coRPGR制造并纯化了高质量质粒DNA(Schmeeretal.(2014)PharmaceuticalGradeLarge-ScalePlasmidDNAManufacturingProcess:219-242)。将单个小瓶的细菌细胞库解冻并扩增并以工业规模培养，然后通过离心收获细菌细胞团块。通过碱性细菌细胞裂解从细菌生物质中提取质粒DNA，通过离心和过滤将得到的可溶性质粒DNA与不溶性蛋白质和复合的基因组DNA分离。质粒DNA通过多步骤层析法进一步纯化。完全纯化的质粒DNA最终通过沉淀和切向流过滤和膜过滤在配制缓冲液中配制以在10mMTris+1mMEDTA,pH8.0中以1.0mg/mL生成100mg的高度纯化的质粒DNA(图10)并且有足够的纯度(图11)用于进一步制造过程以生产rAAV载体。通过Xmn1内切核酸酶限制消化并随后通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和0.5mg/mL溴化乙啶染色来测试纯化的质粒的质粒身份和结构稳定性(图10)。图11清晰地显示了来自稳定的和结构上完整的pAAV.RK.coRPGR质粒的预期限制消化片段模式；说明了细胞培养扩增和质粒纯化期间质粒DNA的稳定维持和再生产。使用Sanger测序法(SangerFetal.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467)对纯化的质粒测序，所得的序列分析显示，当与密码子优化的RPGR的理论参考序列相比时，以100％保真度保留密码子优化的RPGR序列。结论RPGR基因的密码子优化导致RPGR基因的稳定性的改善，这导致产生对于进一步制造过程以生产rAAV载体足够数量(100mg)和质量的高纯度质粒DNA的能力。实施例2c在工业规模生产rAAV2/8编码密码子优化的RPGR序列使用实施例2b中制造的高质量质粒DNA以及辅助质粒pDP8.ape(PlasmidFactory,Bielefeld,GermanyandGrimmD,KayMA,KleinschmidtJA.Helpervirus-free,opticallycontrollable,andtwo-plasmid-basedproductionofadeno-associatedvirusvectorsofserotypes1to6.MolTher2003；7:839-850)以制造rAAV8/2载体，该载体通过大规模瞬时转染和随后纯化用于体内应用(Locketal.2010；HumanGeneTherapy:1259-1271)。简而言之，HEK293细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中，在37℃和5％CO2下贴壁培养，直至足够的细胞可用于接种足够的多层细胞培养容器。通过对使用pAAV.RK.coRPGR质粒和pDP8.ape辅助质粒在多层细胞培养容器中对贴壁生长的HEK293细胞进行磷酸钙瞬时转染以产生分泌到生长培养基中的rAAV颗粒来生产未纯化的AAV。通过从细胞培养容器中除去培养基并过滤除去细胞碎片来收获rAAV颗粒。rAAV最初通过切向流过滤(TFF)和超滤来浓缩，并通过使用相同的TFF仪器渗滤进行部分纯化。使用碘克沙醇不连续梯度超速离心和柱离子交换色谱进一步纯化rAAV。然后通过进一步的基于TFF的超滤和渗滤将纯化的rAAV配制成浓度为3.55x1012gp/ml的最终制剂缓冲液。通过将较高剂型稀释到制剂缓冲液中来制备1.00x1012gp/ml的第二低的rAAV浓度制剂。两种剂型均以50μL等分试样进行小瓶灌装并在≤60℃下贮存。结论RPGR基因的密码子优化导致RPGR基因稳定性的改善，这导致以对于用于体内给药研究足够的数量和质量产生纯化的rAAV载体的能力。实施例2d本研究的目的在于建立AAV8-RPGR基因疗法载体的体内递送，所述载体通过视网膜下给药(优选的临床施用途径(ROA))来递送。在C57B/6J小鼠中在GLP依从性、视网膜下注射、单剂量研究中用AAV8-RPGR进行工作，然后在4周和26周期间分析。出于以下原因，选择C57B/6J色素沉着的小鼠品系作为这些体内递送研究的相关物种。首先，该品系具有色素沉着的眼，允许非常接近地模拟临床环境中应用的施用程序。第二，该品种的转基因变体RPGR敲除小鼠模型显示出与在人中的预期相似的对AAV8-RPGR研究产品的生物学响应。第三，人和小鼠RPGR蛋白共享高度的氨基酸序列同源性和成功的AAV8-RPGR靶向，并且先前已经在体内药理学研究中证实了小鼠视网膜组织的转导。动物接受单次视网膜下1μL媒介物(BSSPlus,AlconPharma)或AAV8-RPGR(以两种不同的gp/眼剂量)的双眼注射。对任何毒性作用进行广泛的评估，这包括体重评估、毒性临床体征(包括食物消耗，临床病理学和组织病理学)，以及对眼球，眼外结构，眼前节，主要是角膜和晶状体以及包括眼底在内的内部结构进行了详细和定期的眼科检查。此外，进行了常规的眼压测量评估和视网膜电图检查评估。视网膜电描记术(ERG)记录在不同光强度，波长和曝光持续时间的光刺激后视网膜中出现的电位。视网膜电流图表示数百万从色素上皮延伸至内核层的视网膜细胞的复合活性。其被用作评估视网膜功能和检测视网膜变性的早期阶段。AAV8-RPGR基因疗法在小鼠中具有良好的耐受性，并且没有观察到治疗的严重不良反应。任何观察结果都是短暂的并且与媒介物治疗组中报道的给药和麻醉程序一致。为了理解递送的AAV8-RPGR载体的分布，将治疗的动物组分为在注射后第8、29和183天处死的亚组。另外，在第2天，第15天和第92天，在每个亚组中收集非终末血液样品，用于通过AAV8-RPGR特异性定量PCR测定(qPCR)测定载体水平。动物接受单次视网膜下1μL载体(BSSPlus,AlconPharma)或AAV8-RPGR的双眼注射。测定来自在第8、29和183天在尸体剖检时取自动物的几种组织/体液(血液、骨髓、泪液、脑、眼、心脏、水和玻璃体液、肾、肝、肺、淋巴结、视神经、视网膜、唾液、睾丸、脾、尿)的qPCR样品以用于载体DNA定量。这些组织/液体中的载体DNA定量将在研究结束时通过qPCR方法进行。这些结果将证实基因疗法的成功递送并通过小鼠组织绘制(map)其分布。实施例3-coRPGRORF15转基因产物蛋白质的体外分析本实施例中，分析了密码子优化对RPGR表达水平升高以及剪接替代形式合成的改进的影响。为此目的，使用人类胚胎肾293细胞(HEK293)和表达猿猴病毒40(SV40)T抗原的HEK293(HEK293T)细胞。如下所述，用CAG.coRPGRORF15和CAG.wtRPGRORF15质粒构建体转染这些细胞并处理用于转基因检测。材料和方法分别将HEK293和HEK293T细胞以4和2.5x105个细胞/ml接种在6孔板中并在补充有10％热失活的胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM中，在37℃和5％CO2下培养直到它们超过70％汇合。使用Mirus-LT1转染试剂(GeneflowLtd.,Lichfield,UK)和无血清/抗生素培养基将1微克质粒DNA(CAG.coRPGRORF15和CAG.wtRPGRORF15)递送至细胞。转染的细胞在37℃下温育48小时。在蛋白质水平进行转基因表达分析。转染后48小时，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞，之后在用具有cOmplete微型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片(RocheProductsLtd.,WelwynGardenCity,UK)的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(Sigma-AldrichCompanyLtd.,Dorset,UK)进行细胞裂解和蛋白质溶解。通过使用超声频率的超声处理破碎细胞团粒并且通过13,000g和4℃下离心10分钟来除去细胞碎片。使用PierceTM双金鸡宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(ThermoScientific)根据制造商的说明来定量上清液中总蛋白含量。通过Western印迹分析来评估蛋白质表达。30μg总蛋白质在2xLaemmli缓冲液中(Sigma-Aldrich)在95℃下变性5分钟，并在7.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上(CriterionTMTGXTMPrecastGels,Bio-RadLaboratoriesLtd.,HemelHempstead,UK)以100V电泳2小时来分离。使用Trans-BlotTurboTMTransferStarter系统(Bio-Rad)，将SDS-PAGE中分离的蛋白质样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Trans-BlotTurboTMMidiPVDF,Bio-Rad)上。用含有0.1％吐温20的PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭膜45分钟，并用一抗在室温下温育1小时。用以下一抗鉴定作为靶蛋白的RPGR和作为上样对照物的β-肌动蛋白：兔多克隆RPGR(1:500,Sigma-Aldrich)和小鼠单克隆β-肌动蛋白(1:30000,AmbionInc.,ThermoScientific,Nortumberland,UK)。使用ECL检测试剂，用辣根过氧化物偶联的二抗来检测条带。使用ImageStudioLite(版本5.2)通过密度测定法定量RPGR蛋白质水平并相对于β-肌动蛋白标准化。结果对全蛋白裂解物的Western印迹分析显示了约220kDa的主要条带，其对应于用CAG.coRPGRORF15和CAG.wtRPGRORF15质粒转染的HEK293和HEK293T中的RPGRORF15蛋白(图12A和13A)。RPGRORF15条带强度的定量(通过β-肌动蛋白的强度来标准化)显示用密码子优化的质粒转染的HEK293细胞中的RPGR的表达，2.79[1.1至17.0]任意单位(AU)(中位值[Q1至Q3])，高于用野生型序列转染的细胞中的RPGR的表达，0.36[0.08至4.88]AU。相似地，与用野生型序列转染的细胞(3.01±0.07AU(平均值±标准差))相比，用密码子优化的序列转染的HEK293T细胞显示出增加的RPGR表达水平，4.23±0.11AU(平均值±标准差)(图12B和13B)。除了用两个质粒构建体的完全RPGRORF15序列的表达外，在用野生型RPGRORF15序列转染的HEK293T细胞中检测到额外的80kDa分子量的清晰条带。该结果显示了密码子优化改善了序列稳定性，因而减少了可变剪接形式。结论这些结果证实了通过引入同义主要密码子而增加RPGRORF15编码序列的密码子适应指数(CAI)，导致更高的转基因表达水平，而通过增加序列的稳定性和保真度降低了截短的蛋白质的合成。实施例4：RPGR基因疗法旨在重构靶细胞中RPGR表达，该细胞具有RPGR中引起疾病的突变，该突变导致RPGR的完全丧失(无效突变)或功能障碍蛋白。实现这点的一种方式是通过引入编码RPGR的核苷酸序列的正确拷贝，该序列然后由靶细胞自己的翻译机器翻译为RPGR蛋白。可以通过用重组AAV转导的方式来引入此类核苷酸序列。这里，我们呈现了来自先导试验(pilottrial)的数据，该先导实验设计为探索小鼠视网膜下注射后重组AAV载体AAV2/8.RK.coRPGR和AAV2/8.RK.wtRPGR的转导效率。为了将RPGR基因疗法更加接近临床情况建模，我们使用了缺乏Rpgr表达的Rpgr-/y小鼠。Rpgr是RPGR的鼠同系物，X连锁色素性视网膜炎的大多数情况中受影响的基因，并且因此转基因Rpgr-/y小鼠在遗传水平上模拟人类患者中的无效突变。密码子优化的RPGR特征在于比野生型RPGR更高的表达水平并且至关重要的是提供了更大的序列保真度，同时导致相同的RPGR蛋白产物。重组AAV载体AAV2/8.RK.coRPGR和AAV2/8.RK.wtRPGR能够在体外转导光感受器样细胞。本研究的目的在于探索在视网膜下注射AAV2/8.RK.coRPGR或AAV2/8.RK.wtRPGR后RPGR是否能够体内表达，以及RPGR是否会定位至缺乏固有Rpgr表达的感光细胞中的连接纤毛。材料和方法产生含有AAV2/8.RK.coRPGR和AAV2/8.RK.wtRPGR的重组AAV溶液并评估质量和滴度。为了控制AAV2/8的手术介入和光感受器转导，使用了具有在CAG启动子控制下的作为报告基因的GFP的第三构建体(AAV2/8.CAG.GFP)。通过qPCR对这些载体溶液进行定量以计算载体基因组数目/ml。贮存在-80℃的等分试样在立即应用之前于冰上解冻，并在具有0.001％PF68(BASF,Ludwigshafen,Germany)的用于玻璃体视网膜手术的平衡盐溶液(AlconLaboratories,Camberley,UK)中稀释以允许2μl体积的1x1010vg的视网膜下递送。Rpgr-/y小鼠用于该先导研究，因为它们缺乏Rpgr表达，而保持用于转基因产物RPGR的潜在定位的连接纤毛。麻醉小鼠用于在上半视网膜下视网膜下注射2μlAAV溶液。手术后三周，再次麻醉经治疗的Rpgr-/-小鼠用于使用共焦扫描激光检眼镜检查(cSLO)的体内视网膜成像以研究已经接受AAV2/8.RK.coRPGR、AAV2/8.RK.wtRPGR的动物中的自发荧光模式，和用AAV2/8.CAG.eGFP治疗的动物中作为转导效率读数的GFP荧光。成像后立即将小鼠处死并迅速摘出。快速处理整个眼睛用于免疫组化而不固定。简而言之，用Hoechst33342染料和针对RPGR的氨基酸379-509的多克隆抗体(Sigma,HPA001593)对未固定的视网膜样品的16μm切片进行染色。使用具有缀合的AlexaFluor488(Invitrogen)的驴抗兔作为指示RPGR检测的二抗。在共焦显微镜(ZeissLSM710)上记录高功率(油浸x63)光学切片以研究经治疗的Rpgr-/y小鼠的感光细胞中RPGR表达和定位。未经治疗的小鼠用作阴性对照以测试测定的特异性。手术结果所有动物在视网膜下空间中接受预定剂量的AAV溶液并从麻醉中恢复良好。这通过手术过程变得可能，该手术过程首先通过在用载体悬液创建半视网膜脱离之前进行前段穿刺术(paracentesis)来降低眼内压(IOP)。该技术允许递送高达2μl的体积，而不会由于高IOP而发展出角膜水肿和/或限制眼内循环。同时，较低的IOP降低了视网膜下液体通过注射管回流(即进入脉络膜循环或轨道)的风险。在手术后24小时对治疗小鼠的眼底镜评估显示了在所有情况下完全重新连接的视网膜。视网膜成像显示了安全递送和报道基因表达。三周后，cSLO成像显示出良好的光学介质，其具有在红外成像中清晰的眼底视图。自发荧光成像显示了在用AAV2/8.RK.coRPGR或AAV2/8.RK.wtRPGR治疗的Rpgr-/y小鼠的经治疗的和未经治疗的眼中的超荧光点。应用AAV2/8.CAG.GFP载体的小鼠表现出强的且无处不在的GFP衍生荧光。这说明强健的转基因表达并使得可能的是其它重组AAV载体将有足够的时间导致转基因表达。完成了(未)经治疗的Rpgr-/y小鼠中共焦扫描激光检眼镜检查。完成了内层视网膜上焦平面的红外记录。完成了自身荧光模式记录。未经治疗的和用AAV.RK.wtRPGR或AAV.RK.coRPGR治疗的小鼠均显示出超荧光的斑点模式(punctuatepattern)。在相同的灵敏度设置下，用AAV.CAG.GFP治疗的眼显示出超出上半视网膜脱离的广泛且强烈的GFP荧光，这说明超出下视网膜载体递送位点的成功的细胞转导。免疫组化显示出RPGR表达在来自治疗小鼠的切片中而非在来自未经治疗的小鼠的切片中观察到特异性信号。由于用携带作为转基因的RPGR的AAV转导，该信号源自与RPGR表位结合的抗体并且与RPGR表达相一致。在用AAV2/8.RK.coRPGR(携带密码子优化的coRPGR的AAV)治疗的眼的切片中看到更强的信号。免疫组化显示了经治疗的Rpgr-/y小鼠中的RPGR。Rpgr-/y动物的未经治疗的眼显示出缺乏RPGR染色。用AAV.RK.wtRPGR进行单次治疗导致检测的信号，该信号的大部分定位至内部和外部区段之间的区域。用密码子优化的载体治疗的Rpgr-/y小鼠显示出大部分RPGR表达，其具有连接纤毛标志物的典型的逗号型(comma-type)染色模式。讨论这里应用的手术技术允许将多达2μl安全应用至小鼠的视网膜下空间中。由此产生的半视网膜脱离自发地在所有动物中在24h内重新附着，并且没有观察到眼后遗症。同时，其防止(暂时)角膜水肿形成和/或停止眼内循环，这可以在没有先前穿刺的情况下在视网膜下注射后观察到。光学介质在接下来的3周内保持清澈，并且没有指示眼内病变，诸如细胞浸润，虹膜的前/后粘连或白内障形成。视网膜成像显示了接受了AAV2/8.CAG.GFP的对照组中GFP转基因表达的强健水平。有趣的是，报告蛋白GFP在整个视网膜中是明显的，尽管直接应用仅限于上半视网膜。这说明脱离区域外的至少有一定程度的细胞转导。GFP表达由非特异性CAG启动子驱动，该启动子导致不限于光感受器的遍在的转基因表达。这与携带本发明的coRPGR的载体形成对比，本发明的载体中视紫红质激酶启动子驱动coRPGR的光感受器特异性表达。如聚焦在内部视网膜上的红外图像所示，用AAV2/8.RK.coRPGR或AAV2/8.RK.wtRPGR治疗的眼显示出正常的视网膜脉管系统和神经纤维层。相反，用AAV2/8.CAG.eGFP载体治疗的小鼠显示出强的且遍在的GFP衍生的荧光。未固定的切片显示了Rpgr-/y小鼠中RPGR表达和定位至连接纤毛。这是在RP动物模型中通过AAV成功递送密码子优化的RPGR载体序列作为基因疗法的首个证据。与之前的研究(其中在用于转基因表达的载体的开发期间的突变导致了替代的蛋白质产物)相比，本工作证明了基于密码子优化序列(该序列翻译为野生型RPGR蛋白质产品)的RPGR表达和正确定位。实施例5：coRPGR基因疗法的安全性和效力由于许多原因，为XLRP开发基因疗法仍然是一个挑战。一个原因是RPGRORF15的富含嘌呤的重复序列，这使得难以在不遇到自发突变的情况下克隆。通过Sanger测序确认序列的完整性也是有问题的，因为频繁的多聚鸟嘌呤段导致DNA聚合酶停顿或停止。第二个问题在于鼠动物模型(如Rpgr/y和C57BL/6JRd9/Boc小鼠)中的轻度表型。由于这些疾病模型与野生型对照之间的结构和功能差异相对较小，在治疗分组中难以达到统计学显著性水平。为了解决第一点，我们应用密码子优化的原理来改变RPGRORF15编码序列的一级核苷酸序列。由于只使用同义密码子，所得到的氨基酸序列保持不变，同时密码子优化的RPGR构建体相较于野生型RPGR构建体具有优异的序列稳定性和翻译效率。当使用AAV构建体的质粒转染和转导实验时，这种益处在体外是明显的。然后将相同的AAV构建物用于先导试验以证明其转导光感受器的潜力(实施例4)。产生的RPGR蛋白定位于连接的纤毛，它在光感受器中的生理区室(compartment)。为了解决具有和不具有破坏性Rpgr突变的分组之间的小差异的第二个问题，我们根据相关的、客观的和量化的结果指标进行了样本大小和功效(power)计算。本工作的目的在于在两种相关的动物模型(Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc小鼠)中测试AAV.RK.coRPGR作为XLRP3的基因治疗剂的功效以及探索野生型动物(C57BL/6J)中任何潜在的毒性作用。选择该研究设计是为了提供具有充当临床I期试验监管批准的基础的潜力的有力统计证据。材料和方法样本大小和功效计算使用由来自加利福尼亚大学旧金山分校流行病学和生物统计学系，生物统计学分部的RollinBrant所提供的基于JavaScript的算法来进行样本大小和功效计算。用于此的主要结果测量是在0.01cd.s/m2的暗适应单次闪光刺激后的a-波振幅[μV]，其反应了鼠视网膜中绝大部分的光感受器(本研究中的靶细胞群)的生理学。测量了这些视网膜电描记术(ERG)反应并且在Excel中计算了n＝4/分组(C57BL/6J,C57BL/6JRd9/Boc,和Rpgr-/y小鼠)的平均值和标准差。在计算样本大小前，计算了C57BL/6J(目标正常值)与C57BL/6JRd9/Boc(治疗前基线)之间以及C57BL/6J与Rpgr-/y之间的平均a波幅度差异，并且假设由于治疗而获得50％的增加，1/2的此差异增加到各自疾病模型的当前平均值。这为μ0(未经治疗分组的平均值)和μ1(治疗分组的平均值)提供了值。将σ的值(抽样群体的标准差)设置为各疾病模型中a波幅度的标准差。采取单因素检验设计，I型错误率设为α＝0.05并且为了样本大小计算，期望功效定义为90％。然后使用可比较的样本大小来计算检测C57BL/6J小鼠中的毒性作用的功效。对此，假设基线处平均a波振幅的10％损失为毒性作用，并且基线标准差输入为σ。试验设计选择ERG应答作为主要结果量度，作为与疾病过程相关的视网膜功能的客观和定量生物标志物和对测试项目AAV.RK.coRPGR的潜在治疗和/或毒性效应的适当读数。由于分组内的个体间变异性相对较高，选择个体内测试范例：一只眼用AAV.RK.coRPGR(真实)治疗，而对侧眼用作对照。为了捕获自然疾病过程并在此类设计中具有用无活性物质(AAV.对照)的对照注射，进行两个平行的试验：使用具有用AAV.RK.coRPGR单侧治疗随机化眼的一项(必须)公开标签试验来比较治疗效果与自然疾病过程。第二个设计是具有接受AAV.RK.coRPGR或AAV.对照的眼的随机选择的掩蔽(masked)试验。后一项试验用于控制手术和AAV暴露的效果。所有129只动物在出生后第P22±2天断奶的情况下处理并且处死前在三个随后的时间点进行测试：出生后2个月(PM2)、PM4和PM6。在所有三个时间点记录ERG并且在最后一个时间点PM6再进行cSLO。功效和毒理学研究设计对Rpgr-/y、C57BL/6JRd9/Boc,和C57BL/6J小鼠进行掩蔽的双侧治疗测试AAV.RK.coRPGR对(vs.)AAV.对照(上图)或单独用AAV.RK.coRPGR进行单侧治疗。将所有的眼随机分配到真实与假治疗或治疗与不治疗。在出生后22天(P22)进行手术并且在出生后2个月(PM2)、PM4和PM6用视网膜电描记术(ERG)随访。在PM6，扫描激光检眼镜检查(SLO)在处死前进行并且处理眼用于组织学或Western印迹法。C57BL/6J野生型小鼠在两个试验中共处理n＝47只C57BL/6J小鼠，以探索视网膜下AAV2/8.RK.coRPGR递送的潜在毒性作用。24只动物接受了未掩蔽的单侧治疗，其中以随机化的方式选择眼。治疗由具有0.001％PF-68的中稀释的1.5x109vg的AAV2/8.RK.coRPGR的单次视网膜下注射组成。剩余的23只动物以掩蔽和随机化的方式接受双侧注射。真实组中的治疗如上，而对照接受在相同媒介物(具有0.001％PF-68的)中稀释的1.5x109vgAAV2/8.control。这两个媒介物在实施例4中详细描述。在3周龄断奶的情况下进行视网膜下注射。外科医生使用分级系统(0-10)来指示视网膜下注射的量，其中0/10表示没有载体递送并且10/10完全载体递送而在视网膜下注射期间或之后没有任何形式的并发症，如外部(如结膜下)或内部(如视网膜内/玻璃体)出血。例如，9/10级在完成载体递送但轻微结膜下出血的情况下给出。较差的注射定义为评级≤7并且从试验中排除。手术干预后，纵向观察出生后2个月(PM2)和PM4时ERG记录中的个体内变化。在PM6，在ERG记录后立即进行另外的视网膜SLO成像。在最后时间点(PM6)处死小鼠，并且解剖眼以通过Western印迹或免疫组化来检测转基因。C57BL/6JRd9/Boc小鼠在两个试验中共治疗n＝36只C57BL/6JRd9/Boc小鼠。19只动物接受了未掩蔽的单侧治疗，而登记17只动物以接受用真实物或对照进行的掩蔽的且随机化的双侧注射，如上文针对C57BL/6J小鼠所述。这是为了评估基于AAV的RPGR基因置换基因疗法的功效而完成的。如上计划了随访。Rpgr-/y小鼠使用Rpgr-/y小鼠来评估在第二种XLRP动物模型中基于AAV的RPGR基因置换基因疗法的功效。对此，在上述两个独立试验中共治疗n＝46只。如上所述，25只动物接受了未掩蔽的单侧治疗，而21只在双眼中接受了治疗(真实和对照)。如上针对C57BL/6J小鼠那样来计划干预后读数。结果样本大小和功效计算基于从四只眼(两个动物)/分组(C57BL/6J、C57BL/6JRd9/Boc和Rpgr-/y小鼠)收集的ERG数据来计算样本大小。每只眼记录了n＝9试验的平均a波振幅。在从上述数据计算μ0,μ1和sigma值后，建议的样本量范围为16到21。与野生型对照(81±7μV)相比，C57BL/6JRd9/Boc小鼠显示出最小振幅(65±11μV；平均值±标准差)并因此仅需要n＝16的估计样本大小。由于其在基线处的较高振幅(728μV)，Rpgr-/y的推荐样本大小为n＝21。功效计算显示了使用n＝20的分组大小以100％的功率检测野生型小鼠中从基线起10％幅度的损失。C57BL/6J野生型小鼠由于手术操作不当，6只眼被排除在试验之外，另一只因预先存在的前节改变而被排除。这导致用于单侧试验的n＝19和用于双侧试验的n＝22的总体分组大小。记录的手术质量的平均[和范围]在所有组中非常相似：9.0[8-10]对于开放标签组，9.5[8-10]对于真实组，以及对照组中的9.3[8-10]。所有小鼠在手术后迅速恢复。在黑暗或光适应条件下记录的信号强度系列无一在任何时间点显示出治疗组与未经治疗组之间或真实组与对照组之间的显著差异。用扫描激光检眼镜检查(SLO)的视网膜成像也证实了在视网膜下应用AAV.RK.coRPGR后长达6个月对视网膜结构没有观察到毒性作用。C57BL/6J小鼠在双侧视网膜下注射AAV.RK.coRPGR或AAV.对照后的EGR记录提供了来自PM2、来自PM4和来自PM6(测试的最后时间点)的数据。重复测量的因子ANOVA在所有分析中保留了无效假设(无差异)。全视网膜裂解物的Western印迹证实了在治疗的眼而非对照眼中RPGR转基因表达。条带显示了预测的分子量，并且没有额外的条带是明显的。未固定的冷冻切片的免疫组化也证明了治疗的眼中而非未经治疗的对照眼中RPGR转基因表达和与天然Rpgrip的共定位。来自治疗的眼(TE)和未经治疗的眼(UE)的视网膜切片中的苏木精和伊红(H&E)染色显示了两分组中正常视网膜解剖。这两个分组都没有在任何切片中显示任何炎症或变性体征。完成了来自C57BL/6J、C57BL/6JRd9/Boc和Rpgr-/y小鼠的处理的对未处理的眼的全视网膜裂解物的Western印迹。RpgrORF15表达限制在治疗的眼并且显示在约200kDa处的条带。在C57BL/6JRd9/Boc中可见最强条带，然后是C57BL/6J，而Rpgr-/y样品显示最弱表达。GAPDH用作上样对照(红色)。幼稚的HEK293T细胞用作阴性对照(nc)并且转染有coRPGR表达质粒的HEK293T细胞用作阳性对照。在C57BL/6J小鼠中免疫组化。对照治疗的眼中未见RPGR表达。用AAV.coRPGR治疗导致RPGR表达和人RPGR与Rpgrip的共定位。C57BL/6J小鼠中苏木精和伊红染色显示任何切片中没有可见的炎症或变性体征。观察正常的解剖结构。C57BL/6JRd9/Boc小鼠由于未经治疗的对照眼中预先存在的角膜浸润及相关的眼小畸形(microphthalmus)，必须排除单侧开放标签试验的一只小鼠。眼小畸形可导致未经治疗的眼中错误的低ERG记录。这导致单侧试验的n＝18，和用于双侧注射的n＝17只动物的总数。治疗的动物无一因为手术并发症而不得不排除，并且接受注射的所有动物均评级良好或优秀，其中平均值(所有组中的范围为8-10)为开放标签组的9.7，真实组的9.1以及对照组中9.0。在纵向随访中，来自单侧试验的两只动物在PM4中未从麻醉中恢复。已成功记录并保存了来自三个时间点的共计102个双侧ERG数据集以供进一步分析。在开放标签、单侧试验中，重复测量的因子ANOVA在第一个时间点(PM2)保留无效假设(无差异)，但是在暗适应强度系列和强光适应强度系列两者中在较高强度显示治疗的眼的较大振幅的趋势。在PM4，对于a波(p＝0.001)和b波(p＝0.002)两者，治疗的眼在暗适应强度系列间以显著更高的振幅响应。光适应的响应没有显著差异。这种模式一直持续到最后一个时间点(PM6)。在掩蔽的双侧试验中，无效假设在所有时间点均保留。然而，真实处理的眼再次总是显示更高振幅的趋势，特别是在更高的刺激强度下。用扫描激光检眼镜检查(SLO)的视网膜成像也确认了在视网膜下应用AAV.RK.coRPGR后长达6个月对视网膜结构没有观察到毒性作用。然而，自发荧光成像揭示了C57BL/6JRd9/Boc治疗小鼠中疾病呈现的变化：我们之前显示了小鼠中Rpgr表达的缺乏与在自发荧光下可见的视网膜间的超荧光点相关，而野生型小鼠只有最小的、均匀的自发荧光信号。有趣的是，在PM6的真实治疗眼中的成像显示在最初应用了载体的上半视网膜中这些超荧光点的减少。经治疗的眼中半视网膜场显著不同：经治疗的上半视网膜中的13±14(平均值±标准差)对同侧下视网膜中的59±40(p＝0.005；n＝6,配对t检验)。治疗者的上半视网膜与对侧未经治疗的视网膜的比较产生了类似的结果(p＝0.037；n＝6,配对t检验)。全视网膜裂解物的Western印迹证实了在经治疗的眼而非对照眼中的RPGR转基因表达。条带显示了预测的分子量，并且没有额外的条带是明显的。未固定的冷冻切片的免疫组化也证明了经治疗的眼，而非对照眼中RPGR转基因表达和与天然Rpgrip的共定位。Rpgr-/y小鼠由于在未处理的眼中预先存在的眼小畸形，不得不排除单侧开放标签试验的一只小鼠，所述眼小畸形仅在对侧眼的手术干预后才注意到，并且将在未处理的眼中导致假的低ERG记录。另外，由于手术并发症(具有玻璃体内出血的部分玻璃体内注射)，必须排除治疗动物的双侧试验中的一只动物。这导致单侧试验的n＝24，以及双侧注射的n＝20只动物的总数。C57BL/6JRd9/Boc小鼠中，所有分组的手术成功率都较高：平均[范围]评级为针对开放标签的9.3[8-10]、针对真实和免疫组化的9.5[9-10]。在对照处理的眼中，顶部图显示没有RPGR表达。用AAV.coRPGR治疗导致RPGR表达和其与Rpgrip的共定位。比例尺表示20μm。对照组中9.4[8-10]。在纵向随访中，PM2时一只双侧注射的动物和PM4时单侧注射的两只动物未从麻醉中恢复。已成功记录并保存来自三个时间点的共计128个双侧ERG数据集以供进一步分析。在开放标签、单侧试验中，在最早的时间点(PM2)的眼之间没有明显的差异，但是在PM4(p<0.001)和PM6(p<0.001)时在a波和b波幅度两者上在黑暗适应的ERG响应中可见强健的治疗效果。在PM6时，光适应的b波反应显著更大(p＝0.004)。掩蔽的双侧试验显示PM6的暗适应b波响应幅度显著增加，以及在PM4处(而非在PM6处)光适应的b波振幅显著增加。用AAV.RK.coRPGR治疗的Rpgr-/y小鼠的眼显示出在上半视网膜中超荧光点的减少，在治疗的C57BL/6JRd9/Boc小鼠中也观察到。相反，Rpgr-/y小鼠的未经治疗的或假处理的眼显示出与Rpgr无效突变相关的超荧光点的遍在模式。全视网膜裂解物的Western印迹证实了在经治疗的眼而非对照眼中的RPGR转基因表达。条带显示了预测的分子量，并且没有额外的条带是明显的。未固定的冷冻切片的免疫组化也证明了经治疗的眼，而非对照眼中RPGR转基因表达和与天然Rpgrip的共定位。Rpgr-/y小鼠中单侧视网膜下注射AAV.RK.coRPGR后的ERG记录Rpgr-/y小鼠中单侧视网膜下注射AAV.RK.coRPGR或AAV.对照后的ERG记录。用AAV.RK.coRPGR的治疗导致暗适应的ERG振幅显著改善。光适应b波振幅中的治疗效果在PM6时未维持。在红外模式下使用扫描激光检眼镜检查成像，焦平面被设置为内视网膜或外视网膜。治疗眼和假或对照眼之间出现明显不同的自发荧光模式：经处理的眼在上半视网膜(AAV.RK.coRPGR应用的区域)中显示较少的超荧光点。Rpgr-/y小鼠中的免疫组化。未观察到对照治疗的眼中RPGR表达。用AAV.coRPGR治疗导致RPGR表达和人RPGR与Rpgrip的共定位。比例尺表示20μm。讨论自从表征RPGR作为XLRP3的遗传原因以来，RPGR替代疗法已引起人们的兴趣。其仍然是一个尚未转化为临床试验的目标的这一事实的主要原因在于RPGR是一种具有高度突变变化倾向的复杂基因的这一事实。这对支持临床试验应用的数据集的开发造成了严重的延误。并且即使在监管批准安全试验的情况下，用于RPGR基因疗法的临床级AAV的产生将是一个重大挑战。这些数据显示在野生型动物(C57BL/6J)中没有毒性作用，并且显示在两种相关的动物模型(Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc小鼠)中显示出用于RPGR基因治疗的新型载体构建体的功效。这种基于AAV的载体具有密码子优化的RPGRORF15编码序列，这使得该构建体更加基因稳定，同时导致相同的蛋白质产物RPGRORF15。在广泛的体外分析和Rpgr-/ymice小鼠的先导性试验之后(实施例4)，本发明显示了单次视网膜下应用AAV.RK.coRPGR是安全的并且可以停止或减缓由于Rpgr突变导致的视网膜变性进展。安全性为了探索AAV.RK.coRPGR的潜在毒性作用，我们在41只C57BL/6J小鼠中测试了相同的剂量(1.5x109vg在1.5μl中)。19只小鼠仅在一只眼中治疗，而22只接受了用AAV.RK.coRPGR或AAV.对照的掩蔽的双侧治疗。在真实组和对照或未处理组之间的任一试验的任何时间点，ERG的视网膜功能测量之间没有显著差异。另外，体内视网膜成像说明了AAV.RK.coRPGR治疗对视网膜结构没有影响。H&E染色没有显示治疗的毒性作用，并且免疫组化和Western印迹显示了在治疗的动物，而非在未经治疗的或对照治疗的动物中RPGRORF15表达和共定位。总之，用AAV.RK.coRPGR的野生型小鼠的单次治疗没有诱导任何毒性作用并显示出良好的安全谱。因此我们得出结论，用AAV.RK.coRPGR治疗是安全的。功效在两个良好表征的XLRP3小鼠模型中证明了AAV.RK.coRPGR的疗效：具有Rpgr中的天然存在的突变的转基因模型Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc。已经显示两种模型都缺乏视网膜中的RpgrORF15表达并且因此选择作为XLRP3的相关动物模型。然而，有一些使用这些动物模型的注意事项。最重要的是，令人惊讶地，疾病表型是轻微的，这在试验中需要相对较大的分组来获得必要的统计能力。因此，我们在总共80只动物中进行了试验，并提供了强健的功效证据，如通过Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc小鼠中电生理测量的显著挽救来指示。治疗在第一个时间点并不明显，这最可能是由于两个动物模型中缓慢的疾病发展。然而，在这两个动物模型中，AAV.RK.coRPGR治疗在PM4和PM6时与显著的ERG援救相关。该援救在暗适应强度系列中更为明显，该强度系列反映较低强度范围(单次闪光至多0.01cd./m2)中视杆光感受器的总电势。认为更高的闪光强度刺激混合的视锥-视杆响应。在约1cd.s/m2强度看到治疗的眼和假-/未经治疗的眼之间的最大差异，这说明视杆和视锥光感受器两者可以均已从AAV.RK.coRPGR转导获益。综上所述，AAV.RK.coRPGR治疗安全有效。在野生型小鼠中用AAV.RK.coRPGR成功转导光感受器没有导致与RPGRORF15的表达相关的毒性作用。另外，XLRP3动物模型的治疗显示在经治疗的而非未经治疗的眼中统计上显著的ERG响应援救。这些数据证明本发明的RPGRORF15的密码子优化的编码序列可用于安全地治疗眼睛。序列表<110>牛津大学创新有限公司<120>色素性视网膜炎的治疗<130>P107084PCT<150>GB1516066.6<151>2015-09-10<160>14<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1152<212>PRT<213>智人<400>1MetArgGluProGluGluLeuMetProAspSerGlyAlaValPheThr151015PheGlyLysSerLysPheAlaGluAsnAsnProGlyLysPheTrpPhe202530LysAsnAspValProValHisLeuSerCysGlyAspGluHisSerAla354045ValValThrGlyAsnAsnLysLeuTyrMetPheGlySerAsnAsnTrp505560GlyGlnLeuGlyLeuGlySerLysSerAlaIleSerLysProThr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