本发明涉及一种用于提高哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的半乳糖含量的方法，其中在所述细胞的培养过程中，改变所述细胞培养物的ph并且补料包含核苷、过渡金属盐和/或糖的组合物。
发明背景
在过去20年中，使用治疗抗体用于治疗不同的疾病，如炎性疾病和癌症，已经变得越来越重要，并且第一种生物类似药(biosimilar)抗体产品已经上市。
源自哺乳动物血清的天然产生的抗体在其恒定区糖基化，并且这种糖基化对于所述抗体的效应子功能是重要的，如抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。此外，真核细胞中产生的重组单克隆抗体显示出特定的糖基化模式。在生物类似药治疗抗体的研发中，也必须注意生物类似药抗体就糖基化而言与起源产品是相当的。
几个研究已经表明，重组抗体的半乳糖含量影响所述抗体的生物活性，如在补体依赖性细胞毒性(cdc)测试中所测量的(gazzano-santoro等(1997)j.immunol.meth.202:163；boyd等(1995)mol.immunol.32:1311-1318；jefferis(2009)naturereviewsdrugdiscovery8:226-234)。鉴于半乳糖基化对糖蛋白的活性和功效的作用，监测和控制糖蛋白组合物中的半乳糖基化水平是重要的。
现有技术公开了各种用于调节糖蛋白组合物的半乳糖基化特征的方法。
gramer等(2011)biotechnol.bioeng.108(7):1591-1602公开了可以通过给产生所述抗体的细胞提供尿苷、氯化镁和半乳糖来调节抗体半乳糖基化。相似地，wo2012/149197a2提供了一种使用含有镁和/或半乳糖的细胞培养补充物来控制半乳糖基化的方法。
此外，ep2511293a1描述了一种通过pco2调节控制半乳糖基化的方法。
在ivarsson等(2014)j.biotechnol.188:88-96中，研究了包括ph和溶氧张力的单个和组合化学和机械应激参数对糖基化的影响。
wo2014/170866a2公开了一种通过在细胞培养方法过程中降低温度以及将pco2水平维持在特定范围中来提高重组蛋白的半乳糖含量的方法。
mccracken等(2014)biotechnol.prog.30(3):547-553报道了细胞培养基中的天冬酰胺和铵浓度对重组蛋白的半乳糖基化的影响。
尽管如此，仍然需要一种细胞培养方法，其能够精确控制蛋白质半乳糖基化，特别是在生物类似药产品的研发中，其中生物类似药产品的半乳糖水平应当与参照产品的相当。
发明概述
本发明人已经发现，将ph降低与向哺乳动物细胞补料(feed)尿苷、氯化镁和半乳糖进行组合，对重组产生的抗体的半乳糖基化的提高程度，高于补料尿苷、氯化镁和半乳糖但不降低ph的情况。
因此，本发明涉及一种用于提高哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的半乳糖含量的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养基中，在第一ph，将用至少一个编码重组蛋白的重组核酸分子转化的哺乳动物细胞，培养第一时间段；
b)在不同于第一ph的第二ph，在所述细胞培养基中培养所述哺乳动物细胞第二时间段；和
c)向(b)的培养物补料包含至少两种以下成分的组合物：
(i)一种或多种核苷；
(ii)一种或多种过渡金属盐；和
(iii)一种或多种糖。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法，所述方法包括：
a)在细胞培养基中，在第一ph，将用至少一个编码重组蛋白的重组核酸分子转化的哺乳动物细胞，培养第一时间段；
b)在不同于第一ph的第二ph，在所述细胞培养基中培养所述哺乳动物细胞第二时间段；和
c)给(b)的培养物补料包含至少两种以下成分的组合物：
(i)一种或多种核苷；
(ii)一种或多种过渡金属盐；和
(iii)一种或多种糖；
d)收集包含重组蛋白的细胞培养物液体；和
e)获得重组蛋白。
优选，大规模生产所述重组蛋白。
还优选，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
在优选实施方案中，所述重组蛋白是含fc蛋白。
优选，所述第二ph低于第一ph，并且更优选，所述第二ph比第一ph低0.05至0.3个ph单位。
优选，所述核苷是尿苷，并且更优选，组合物内的尿苷浓度为1至20mm。
优选，所述过渡金属盐是氯化镁(ii)，并且更优选组合物内的氯化镁(ii)浓度为0.002mm至0.1mm。
优选，所述糖是半乳糖，并且更优选组合物内的半乳糖的浓度为5mm至100mm。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种用于在中国仓鼠卵巢细胞中生产利妥昔单抗(rituximab)生物类似药抗体的方法，所述方法包括：
a)在ph7.15，在细胞培养基中，将用一个或多个编码抗体的轻链和重链的重组核酸分子转化的中国仓鼠卵巢细胞，培养第一时间段；
b)在ph7.00，在细胞培养基中培养所述中国仓鼠卵巢细胞第二时间段；
c)给(b)的培养物补料包含以下成分的组合物：
(i)1至20mm尿苷；
(ii)0.002mm至0.1mm氯化镁(ii)；和
(iii)5mm至100mm半乳糖；
d)收集包含利妥昔单抗的细胞培养物液体；和
e)获得利妥昔单抗。
在再一个实施方案中，本发明涉及一种用于提高中国仓鼠卵巢细胞产生的治疗抗体与其参照抗体的生物相似性(biosimilarity)的方法，所述方法包括步骤：
a)在ph7.15，在细胞培养基中，将用一个或多个编码治疗抗体的轻链和重链的重组核酸分子转化的中国仓鼠卵巢细胞，培养第一时间段；
b)在ph7.00，在所述细胞培养基中培养所述中国仓鼠卵巢细胞第二时间段；
c)给(b)的培养物补料包含以下成分的组合物：
(i)尿苷；
(ii)氯化镁(ii)；和
(iii)半乳糖。
在优选实施方案中，在第一ph下培养细胞直至活细胞密度为4.5至6.0×106个细胞/ml。
在另一个优选实施方案中，在第二ph下培养细胞6至7天。
优选，在步骤(a)、(b)和(c)过程中，温度保持恒定。
还优选，组合物进一步含有至少一种选自l-缬氨酸、l-半胱氨酸、l-苯丙氨酸和l-丝氨酸的氨基酸。
优选，步骤(c)的补料进行至少两次。
还优选，在步骤(c)的补料前为使用尚未添加成分(i)和(iii)的组合物的补料步骤。
优选，步骤(a)和(b)中的培养基不含尿苷和半乳糖。
还优选，步骤(c)的组合物不含胸苷、果糖、甘露糖、蔗糖和n-乙酰基甘露糖胺中的一种或多种。
优选，步骤(a)、(b)和(c)中培养物的摩尔渗透压浓度低于400mosm/kg。
发明详述
尽管就特定实施方案来描述本发明，但该描述不应以限制含义来解释。
在详细描述本发明的示例性实施方案前，给出了对于理解本发明重要的定义。如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”和“一个(an)”也包括相应的复数，除非上下文另外明确地描述。在本发明的内容中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解仍然确保所讨论特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示所示数值±20％，优选±15％，更优选±10％，乃至更优选±5％的偏离。将理解术语“包含”是非限制性的。对于本发明的目的，认为术语“由……组成”是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将一组限定为包含至少特定数量的实施方案，则这意味着还包括优选地仅由这些实施方案组成的一组。此外，说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等等，用于区分相似要素，并不一定是用于描述顺序或时间顺序。将理解，由此使用的这些术语在合适的情况下是可互换的，并且本文中描述的实施方案能够以不同于本文中所述或所示的其他顺序进行。当术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或试验的步骤时，在这些步骤之间没有时间或时间间隔相干性，即，所述步骤可以同时进行，或在这些步骤之间可以存在几秒、几分钟、几小时、几天、几周、几个月或甚至几年的时间间隔，除非在上文或下文中另有表示。
将理解本发明不限于本文中描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以改变。还将理解本文中所用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，并不是用来限制本发明的范围，所述范围将只受附属权利要求的限制。除非另外限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如以上讨论的，本发明是基于发现——细胞培养物ph的改变(优选降低)以及向细胞培养物补料包含核苷、过渡金属盐和糖(优选尿苷、氯化镁(ii)和半乳糖)的组合物，可以提高重组蛋白(优选重组抗体)的半乳糖含量。
术语“半乳糖含量的提高”用来表示，在改变(优选降低)培养物的ph并且给细胞培养物补料包含核苷、过渡金属盐和糖的组合物(优选，包含尿苷、氯化镁和半乳糖的组合物)时，重组蛋白中半乳糖基化同种型g1f、g1’f和g2f中的一种或全部的百分比，与在维持恒定ph且不补料上述组合物的细胞培养物中产生的相同重组蛋白中的这些同种型的百分比相比高。这种g1f、g1’f和g2f的百分比提高伴随着非半乳糖基化的糖型(glycoform)(如g0和g0f)的降低。
g0f、g1f、g1’f和g2f糖型具有以下结构：
其中gn是n-乙酰基葡糖胺；fuc是岩藻糖；m是甘露糖和gal是半乳糖。这些聚糖结构连接n-糖基化位点，其在igg1重组抗体的情况中可以位于fc区的cγ2结构域的天冬酰胺301处。
如果与维持在恒定ph下并且没有补料以上限定的组合物的细胞培养物产生的相同重组蛋白中的g1f、g1’f和g2f同种型的百分比总和相比，根据本发明的方法产生的重组蛋白中的g1f、g1’f和g2f同种型的百分比总和提高至少1％，2％或3％，优选至少4％，5％，6％或7％，更优选至少8％，9％或10％，并且最优选至少11％或12％，则半乳糖含量是提高的。
如果与维持在恒定ph下并且没有补料以上限定的组合物的细胞培养物产生的相同重组蛋白中的g0f同种型的百分比相比，根据本发明的方法产生的重组蛋白中的g0f同种型的百分比降低至少1％，2％或3％，优选至少4％，5％或6％，更优选至少7％，8％或9％，并且最优选至少10％，则半乳糖含量也是提高的。
将细胞接种于细胞培养基后八至十四天，测定半乳糖含量。在优选实施方案中，将细胞接种于细胞培养基后九至十天，测定半乳糖含量。
可以通过本领域已知的任何方法，测定重组蛋白的不同聚糖同种型(特别是半乳糖基化的同种型g1f、g1’f和g2f)的相对比例，并且因此测定半乳糖含量。优选，在重组蛋白已经脱糖基化并且用荧光衍化剂处理后，使用利用激光诱导荧光检测的毛细管电泳(ce-lif)。通过荧光检测确定每种聚糖同种型的相对含量并且使用相应峰的面积％值计算。示例性方法描述于下文中的实施例部分。
术语“细胞接种于细胞培养基”是指在适于细胞生长和增殖的条件下将细胞接触细胞培养基的步骤。
术语“重组蛋白”是指，作为编码所述重组蛋白的基因的转录和翻译的结果，可以通过哺乳动物细胞培养物产生的任何蛋白质，其中所述基因携带于已经引入哺乳动物宿主细胞中的重组核酸分子上。所述重组蛋白可以不在所用的哺乳动物细胞中天然产生，或所述重组蛋白可以在所用的哺乳动物细胞中天然产生，但以较低水平产生。优选，哺乳动物宿主细胞不天然产生所述重组蛋白。
特别地，术语“重组蛋白”包括治疗蛋白，如细胞因子、生长因子、凝血因子和抗体，其中半乳糖含量影响所述蛋白的生物功能。优选，所述重组蛋白是含有fc的蛋白，如抗体、或igg抗体的fc部分与另一个蛋白的部分或全部的融合蛋白。
igg抗体的fc部分与另一个蛋白的部分或全部的融合蛋白的实例包括etanercept(与tnf受体融合)、aflibercept(与vegf受体1和2的胞外结构域融合)、abatacept(与ctla-4的胞外结构域融合)和belatacept(与ctla-4的胞外结构域融合)。
更优选，所述重组蛋白是重组抗体。术语“重组抗体”是指，作为编码所述重组抗体的基因的转录和翻译的结果，可以通过哺乳动物细胞培养物产生的任何抗体，所述基因携带于已经引入哺乳动物宿主细胞中的重组核酸分子上。所述重组抗体可以不在所用的哺乳动物细胞中天然产生，或所述重组抗体可以在所用的哺乳动物细胞中天然产生但以较低水平产生。优选，所述重组抗体不在用于其生产的哺乳动物宿主细胞中天然产生。
术语“免疫球蛋白”和“抗体”在本文中可互换使用。免疫球蛋白可以是单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、或其呈现出所需抗原结合活性的片段。天然产生的抗体是具有可变结构的分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的杂四聚糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从n-至c-末端，每条重链具有可变结构域(vh)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个或四个恒定结构域(ch1、ch2、ch3和任选的ch4)。相似地，从n-至c-末端，每条轻链具有可变结构域(vl)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(cl)结构域。抗体的轻链，基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以被确定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型之一。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；单链抗体分子；双链抗体(diabody)；线性抗体；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
优选，免疫球蛋白是单克隆抗体。本文中使用的术语“单克隆抗体”是指，获自一群基本上同质抗体的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然突变外，构成该群体的个体抗体是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体是获自基本上同质的抗体群的特征，并不应解释为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。
免疫球蛋白可以是鼠类别igg1、igg2a、igg2b、igm、iga、igd或ige，人类别igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd或ige，或其组合或片段。
免疫球蛋白可以识别包括但不限于以下抗原的任一种蛋白或其组合：cd2，cd3，cd4，cd8，cd11a，cd14，cd18，cd20，cd22，cd23，cd25，cd33，cd40，cd44，cd52，cd80(b7.1)，cd86(b7.2)，cd147，cd152，il-la，il-1β，il-1，il-2，il-3，il-7，il-4，il-5，il-8，il-10，il-12，il-23，il-2受体，il-4受体，il-6受体，il-12受体，il-13受体，il-18受体亚基，pdgf-β，及其类似物，plgf，vegf，tgf，tgf-β2，tgf-p1，egf受体，plgf受体，vegf受体，血小板受体gpiib/iiia，血小板生成素受体，凋亡受体pd-1，肝细胞生长因子，骨保护素配体，干扰素γ，b淋巴细胞刺激剂blys，t-细胞激活调节剂ctla-4，c5补体，ige，肿瘤抗原ca125，肿瘤抗原muc1，pem抗原，erbb2/her-2，以升高的水平存在于患者血清中的肿瘤相关表位，在乳房、结肠、鳞状细胞、前列腺、胰腺、肺、和/或肾癌细胞上和/或在黑素瘤、神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞上表达的癌症相关表位或蛋白，肿瘤的坏死核心，整联蛋白α4β7，整联蛋白vla-4，b2整联蛋白，α4β1和α4β7整联蛋白，trail受体1、2、3和4，rank，rank配体(rankl)，tnf-α，粘附分子vap-1，上皮细胞粘附分子(epcam)，胞内粘附分子-3(icam-3)，白细胞整合素(leukointegrin)粘附素，血小板糖蛋白gpiib/iiia，心脏肌球蛋白重链，副甲状腺激素，硬骨素(sclerostin)，mhci，癌胚抗原(cea)，甲胎蛋白(afp)，肿瘤坏死因子(tnf)，fc-y-1受体，hla-dr10β，hla-dr抗原，l-选择蛋白和ifn-γ。
免疫球蛋白例如可以是阿非莫单抗(afelimomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、belimumab、canakinumab、西妥昔单抗(cetuximab)、denosumab、曲妥单抗(trastuzumab)、英西单抗(imciromab)、卡罗单抗(capromab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹单抗(ipilimumab)、abciximab、利妥昔单抗、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、诺非单抗(nofetumomab)、奥马珠单抗(omalizumab)、达克珠单抗(daclizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、muromonab-cd3、依决洛单抗(edrecolomab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、golimumab、赛妥珠单抗、eculizumab、ustekinumab、ocrelizumab、ofatumumab、obinutuzumab、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、romosozumab、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)、galiximab、foravirumab、lexatumumab、贝伐单抗(bevacizumab)和vedolizumab。
本发明的免疫球蛋白优选是igg分子，如igg1、igg2、igg3或igg4分子。更优选，所述免疫球蛋白是igg1。再更优选，所述免疫球蛋白是其中至少fc部分是人的igg1。所述免疫球蛋白可以是鼠-人嵌合igg1，其中所述igg1的fc部分是人的，而可变区是鼠来源的。最优选，所述嵌合免疫球蛋白是利妥昔单抗或英夫利昔单抗。
利妥昔单抗是嵌合的抗-cd20抗体，其详细描述于例如wo94/11026中。
英夫利昔单抗是嵌合的抗-tnfα抗体，其详细描述于例如wo92/16553中。
免疫球蛋白可以是鼠起源免疫球蛋白的人源化igg1形式，其中可变结构域的cdr源自鼠，而可变结构域的框架区源自人。最优选，所述人源化抗体是曲妥单抗或贝伐单抗。
曲妥单抗(trastuzumab)是人源化抗-her2抗体，其详细描述于例如wo92/22653中。
贝伐单抗是人源化抗-vegf抗体，其详细描述于例如wo98/45331中。
免疫球蛋白可以是完全人igg1抗体，即，抗体的所有部分源自人来源。最优选，人抗体是阿达木单抗或denosumab。
阿达木单抗是人抗-tnfα抗体，其详细描述于例如wo97/29131中。
denosumab是人抗-rankl抗体，其详细描述于例如wo03/002713中。
在一个实施方案中，抗体可以是利妥昔单抗或贝伐单抗。
本文中的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时所述链的剩余部分与源自另一物种的抗体或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们呈现出所需的生物活性。
此外，本文中的单克隆抗体还包括“人源化”抗体。这样的抗体通过非人(例如鼠)抗体的“人源化”获得并且只含有最少的源自该动物免疫球蛋白的序列。该分子的大部分由人氨基酸序列组成。来自人受体抗体的超变区的残基被来自具有所需结合特性的非人供体抗体的超变区的残基替代。
最后，本文中的单克隆抗体还包括完全人抗体，其最初可以通过人抗体文库的筛选获得。
在本发明的方法中，在哺乳动物细胞中产生所述重组蛋白。用于表达本发明重组抗体的合适哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞(包括与dhfr选择标记一起使用的dhfr阴性cho细胞)、ns0骨髓瘤细胞、cos细胞、sp2细胞、猴肾cv1、人胚胎肾系293；幼仓鼠肾细胞(bhk)、小鼠sertoli细胞(tm4)、非洲绿猴肾细胞(vero-76)、人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdc)、buffalo大鼠肝细胞(brl3a)、人肺细胞(w138)、人肝细胞(hepg2)、小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562)、tri细胞、mrc5细胞和fs4细胞。优选，所述宿主细胞源自啮齿动物。更优选，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，甚至更优选所述细胞是cho-k1细胞，并且最优选所述细胞是适应于在无血清培养基(cho-s)中生长的cho-k1细胞和/或可获自invitrogen(目录号r-800-07)。
所述哺乳动物细胞已经用至少一个重组核酸分子(如能够在哺乳动物宿主细胞中稳定产生重组蛋白的表达载体)转化，即遗传修饰。
在重组抗体的生产中，所述哺乳动物细胞可以用同时编码抗体的重链和轻链的一个重组核酸分子或用一个编码抗体的轻链而另一个编码抗体的重链的两个重组核酸分子来转化。在一个实施方案中，从同时编码抗体的重链和轻链的一个重组核酸分子产生所述重组抗体。在更优选的实施方案中，从一个重组核酸分子产生所述重组抗体，并且通过可以相同或不同的分开启动子控制所述重链和轻链的表达。在最优选的实施方案中，从一个重组核酸分子产生所述重组抗体，并且通过相同的分开启动子控制所述重链和轻链的表达。
术语“培养基”、“细胞培养培养基”、“培养培养基”在本文中可互换使用并且是指含有哺乳动物细胞生长所需营养素的溶液。通常，细胞培养基提供细胞用于最低生长和/或存活所需要的必需和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和微量元素。优选，培养基是化学成分确定的，即，其所有成分和它们的浓度是已知的。还优选，所述培养基是无血清和无水解物的，并且不含任何源自动物的成分。在更优选的实施方案中，所述培养基是无血清和无水解物的，并且不含任何源自动物的成分，但含有hepes和
优选，不向培养基中添加额外量的尿苷、氯化镁和半乳糖，但基础细胞培养基中可以存在这些成分中的一种或多种。无论如何，细胞培养基可以含有这些化合物中的任一种或全部，如果它们存在于所用的化学成分确定培养基中的话。更优选，细胞培养基不包含任何半乳糖。
优选将细胞培养基进行无菌过滤，更优选使用具有0.1微米孔径的过滤器来无菌过滤。
在本发明方法的步骤a)中细胞培养基的ph，也称为“第一ph”，维持在ph7.15至7.25的范围内(优选通过添加na2co3或h3po4来维持)，持续第一时间段。第一时间段为细胞培养基接种哺乳动物细胞后60至80小时，优选63至79小时，更优选66至78小时，并且最优选70小时。
第一时间段后，将细胞培养基的ph改变(优选降低)至第二ph。更优选，第二ph比第一ph低0.05至0.3个ph单位，并且甚至更优选，第二ph比第一ph低0.15至0.25个ph单位。最优选，第二ph为ph7.00。可以通过添加合适的酸或co2气体，优选通过添加h3po4，来降低所述ph。当活细胞密度达到4.0至7.0×106时，改变所述ph。其中在第二ph下培养细胞的第二时间段为约6至11天，或约6至8天，优选约七天。因此，在本发明方法中整个培养时间为细胞培养基接种哺乳动物细胞后八至十四天。优选，本发明方法中整个培养时间为细胞培养基接种哺乳动物细胞后九至十天。
在本发明的方法中，在步骤(c)中给细胞补料包含至少两种以下成分的组合物：(i)一种或多种核苷，(ii)一种或多种过渡金属盐和(iii)一种或多种糖(下文中也称为成分(i)至(iii))，特别是包含尿苷、氯化镁和半乳糖的组合物。
术语“补料”表示将组合物加入步骤(a)或(b)的细胞培养物中，并且在补料过程中没有取出培养基或细胞。所述补料通常不连续进行，但在限定的时间点进行。在本发明的方法中，如以下进一步详述的，在限定的时间点提供所述组合物。
所补料的组合物可以仅包含成分(i)至(iii)，例如，在水或合适的缓冲液中，或可以基于另外含有成分(i)至(iii)的细胞培养基。优选，在所述方法的步骤(c)中补料的组合物是基于另外含有成分(i)至(iii)的细胞培养基。这种细胞培养基可以与细胞初始培养中(即，接种后和补料前(步骤(a)和(b))使用的细胞培养基相同或不同。优选，用于补料的细胞培养基不同于细胞初始培养(即，步骤(a)和(b))中使用的。更优选，用于补料的细胞培养基是sigmaaldrich的
除了成分(i)至(iii)，除了基础细胞培养基，用于补料的细胞培养基还可以含有其他成分，如氨基酸和其他补充剂。优选，用于补料的细胞培养基另外含有l-缬氨酸、l-半胱氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸中的一种或多种和化学确定的补充剂(如bdrecharge)。更优选，除了成分(i)至(iii)，用于补料的细胞培养基包含l-缬氨酸、l-半胱氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸和化学确定的补充剂。最优选，用于补料的细胞培养基是
优选将用于补料的细胞培养基进行无菌过滤，更优选使用具有0.2或0.1微米孔径的滤器进行无菌过滤。
在另一个实施方案中，用于补料的组合物不含胸苷、果糖、甘露糖、蔗糖和n-乙酰基甘露糖胺。
用于补料的组合物包含一种或多种核苷。核苷由含氮碱基和包括五碳原子的糖(如核糖和脱氧核糖)组成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。优选，所述核苷是尿苷。
用于补料的组合物内的一种或多种核苷的浓度为1至20mm，优选1.5至15mm，更优选2至12mm，甚至更优选2.5至10mm，并且最优选为3mm。用于补料的组合物内的尿苷浓度为1至20mm，优选1.5至15mm，更优选2至12mm，甚至更优选2.5至10mm，并且最优选为3mm。
用于补料的组合物进一步包含一种或多种过渡金属盐。过渡金属盐是过渡金属与反离子的盐。过渡金属包括fe、co、cr、mn、mo、ni、cu、zn和合适的反离子，包括氯(cl-)、硫酸根(so42-)和磷酸根(po43-)。优选，过渡金属盐是镁盐，并且最优选是氯化镁(ii)。
用于补料的组合物中的一种或多种过渡金属盐的浓度为0.002mm至0.1mm，优选0.005mm至0.09mm，更优选0.008mm至0.08mm，甚至更优选0.01mm至0.07mm，并且最优选为0.06mm。用于补料的组合物中的氯化镁(ii)的浓度为0.002mm至0.1mm，优选0.005mm至0.09mm，更优选0.008mm至0.08mm，甚至更优选0.01mm至0.07mm，并且最优选0.06mm。
用于补料的组合物进一步包含一种或多种糖。糖是短链碳水化合物并且包括葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖。优选，所述糖是半乳糖。
用于补料的组合物中的一种或多种糖的浓度为5mm至100mm，优选7.5mm至75mm，更优选10mm至60mm，甚至更优选12.5mm至50mm，并且最优选为15mm。用于补料的组合物中的半乳糖浓度为5mm至100mm，优选7.5mm至75mm，更优选10mm至60mm，甚至更优选12.5mm至50mm，并且最优选为15mm。
在一个实施方案中，用于补料的组合物中的一种或多种核苷的浓度为1至20mm，用于补料的组合物中的一种或多种过渡金属盐的浓度为0.002mm至0.1mm，用于补料的组合物中的一种或多种糖的浓度为5mm至100mm。在优选实施方案中，用于补料的组合物中的一种或多种核苷的浓度为3mm，用于补料的组合物中的一种或多种过渡金属盐的浓度为0.06mm，用于补料的组合物中的一种或多种糖的浓度为15mm。
在一个实施方案中，用于补料的组合物中的尿苷浓度为1至20mm，用于补料的组合物中的氯化镁(ii)浓度为0.002mm至0.1mm，用于补料的组合物中的半乳糖浓度为5mm至100mm。在优选实施方案中，用于补料的组合物中的尿苷浓度为3mm，用于补料的组合物中的氯化镁(ii)浓度为0.06mm，用于补料的组合物中的半乳糖浓度为15mm。
给细胞培养物补料包含成分(i)至(iii)的组合物至少一次，优选至少两次，更优选补料两次。优选在用细胞接种细胞培养物后四至六天，进行包含成分(i)至(iii)的组合物的补料，更优选在用细胞接种细胞培养基后五天进行。如果用包含成分(i)至(iii)的组合物补料两次，则在接种细胞培养基后四至六天，优选五天，进行包含成分(i)至(iii)的组合物的第一次补料，并且在接种细胞培养基后六至八天，优选七天，进行包含成分(i)至(iii)的组合物的第二次补料。更优选，在接种后五天进行包含成分(i)至(iii)的组合物的第一次补料，并且在接种后七天进行包含成分(i)至(iii)的组合物的第二次补料。
在第一个补料步骤中，将包含成分(i)至(iii)的组合物稀释8.5至10.5倍，优选9.0至10.0倍，并且最优选9.3倍。在第二个补料步骤中，将包含成分(i)至(iii)的组合物稀释9.5至11.5倍，优选10.0至11.0倍，并且最优选10.3倍。
优选，在用包含成分(i)至(iii)的组合物的一个或多个补料步骤之前，为使用以下组合物的补料步骤，所述组合物除了没有添加成分(i)至(iii)外其他与包含成分(i)至(iii)的组合物相同。在细胞培养基接种后二至四天，优选三天，进行没有添加成分(i)至(iii)但其他与包含成分(i)至(iii)的组合物相同的组合物的补料。
因此，本发明的方法优选包括以下补料步骤：
c1)在接种后第3天补料尚未添加成分(i)至(iii)的组合物；
c2)在接种后第5天补料添加了成分(i)至(iii)的组合物；
c3)在接种后第7天补料添加了成分(i)至(iii)的组合物。
在本发明的方法中，细胞培养物(即，包含哺乳动物细胞的细胞培养基)的温度在整个培养过程中优选保持恒定，这意味着在该过程中不主动地上调或下调温度，并且总是使用相同的预设温度。然而，在培养过程中可以发生温度的微小变动。优选，将培养过程中的温度设定为36℃至38℃，并且更优选将温度设定为37℃。
在本发明的方法中，摩尔渗透压浓度优选在整个过程中(即，步骤(a)至(c))低于400mosm/kg，如权利要求中限定的。
优选，摩尔渗透压浓度在250至400mosm/kg范围中，更优选在300至380mosm/kg范围中，并且最优选在330至370mosm/kg范围中。如本文中使用的术语“摩尔渗透压浓度”定义为，每千克溶剂中溶质的渗透压摩尔数，并且可以包括离子化分子或非离子化分子。可以通过使用具有低盐浓度的培养基，来维持低摩尔渗透压浓度，如低于400mosm/kg的摩尔渗透压浓度。特别地，用于补料的组合物包含低盐浓度或除了补料步骤c)中使用的过渡金属盐外完全不含其他盐。
在本发明的方法中，在需氧条件下培养细胞，即，50±40％的溶氧水平。任选通过调节混合比例或通气强度，将二氧化碳的水平维持在0至90mmhg的范围内。
进行本发明的方法，不限制葡萄糖。因此，将葡萄糖加入细胞培养物中，使葡萄糖水平保持在5至35mm的范围中，优选在10至25mm的范围中。
如果细胞培养物产生泡沫，可以在本发明方法过程中的任何时间向培养物加入消泡剂。
根据本发明的方法已经产生重组蛋白后，收集所述产品。由于从哺乳动物细胞表达的重组蛋白，特别是抗体，通常在培养过程中分泌至细胞培养物液体中，故在培养过程结束时通过将包含重组蛋白的细胞培养物液体与细胞分离来进行产品收集。细胞分离方法应当是温和的，以最小化细胞破坏，以避免细胞碎片的增加以及蛋白酶和可能影响免疫球蛋白产品品质的其他分子的释放。通常，包含重组蛋白的细胞培养物液体的收集涉及离心和/或过滤，由此重组蛋白分别存在于上清液和滤液中。扩张床吸附色谱(expandedbedadsorptionchromatography)是用于避免离心/过滤方法的可替换方法。
收集包含重组蛋白的细胞培养物液体后，必须从细胞培养物液体纯化重组蛋白。重组蛋白并且特别是重组抗体的纯化通常通过一系列色谱步骤来完成，如阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和大小排阻色谱。此外，所述纯化方法可以包括一个或多个超滤、纳滤或渗滤步骤。描述于pct/ep2015/054862中的一种特别合适的方法涉及步骤：流通模式的阴离子交换色谱、蛋白a树脂上的亲和色谱、和结合-和-洗脱模式的阳离子交换色谱。
本发明的方法适用于大规模地生产重组蛋白，意味着在至少500或1,000升的培养体积，优选至少5,000或8,000升，并且最优选10,000或20,000升的培养体积中。
本发明的方法提高生物类似药治疗抗体与其参照产品(即，市售治疗抗体)的生物相似性。生物类似药治疗抗体是原研产品的专利保护已经到期后销售的并且与原研产品具有相同氨基酸序列但翻译后修饰可能略有不同的治疗抗体。然而，它们显示出与原研产品相同的生理效应。在提交已市售抗体的生物类似药的销售许可申请时，必须证明该生物类似药抗体的结构与参照产品相当。用于评价糖基化蛋白的生物相似性的一个重要参数是可以影响抗体的效应子功能的糖基化模式。
通过使用本发明的方法，生物类似药抗体的糖基化模式并且特别是半乳糖水平与参照产品的相当，由此与未接受ph降低并且没有补料包含尿苷、氯化镁(ii)和半乳糖的组合物时的治疗抗体的糖基化模式和生物相似性相比，提高了生物相似性。
提供以下实施例和附图用于举例说明的目的。因此将理解所述实施例和附图不应解释为限制性的。本领域技术人员将清楚地能够设想本文中所给出的原则的其他改变形式。
实施例
通过参考以下非限制性实施例来支持和说明本发明的方法。
使用利妥昔单抗(鼠-人嵌合的抗-cd20igg1抗体)进行下表中列出的选定实验，所述抗体在不同规模的补料-分批培养中繁殖的cho细胞中重组表达。在所述实施例中，这种抗体也被称为模式抗体。
然而，本发明的方法不依赖于特定的抗体，也不依赖于用于免疫球蛋白表达的特定宿主细胞。对于表达模式和选定的培养条件，也是如此，所述选定的培养条件就蛋白半乳糖基化特征和收获最大产量而言是优化的。
1.方法
1.1细胞培养物
细胞
中国仓鼠卵巢细胞系s(cho-s)购自invitrogen(目录号no.:r-800-07，批号1335750)，该细胞系源自可商业购得的普通chok1细胞系的悬浮偏好(suspension-preferring)亚克隆，适应于在无血清培养基中生长，并且最初是基于其出色的生长(包括在搅拌培养中不太聚集)和转染效率而选择的。使该cho-s细胞适应于在无血清化学确定的powercho-2培养基(lonzaincus)中生长。
补料-分批培养
遗传工程化表达模式抗体的cho细胞最初在基础培养基powercho-2(lonza)中生长。从第3天(接种后)开始，每隔一天，以15％的补料对初始工作体积(基础培养基体积加接种物)的比例，将三倍浓缩(3×)excell补料(37g/l；safc)以shot-wise模式加入培养物中。
实施例中利用的培养基和其他补充剂的供应商和目录编号概括于以下：
将培养温度维持在37℃。通过添加0.5mna2co3或h3po4，将ph保持在ph7.05至ph7.15的范围中。溶解氧(do)设定点为40％。每天测量相关代谢物。将葡萄糖水平维持在约20mm。将细胞培养9至10天。
主要用1、5、10或100l的实验室规模收集的培养物液体进行实验。实施例中使用的生产规模和最大培养体积为1000l。如果没有另外明确指出，所述规模总是指培养体积。
1.2纯化
蛋白a色谱
为了质量分析，使用蛋白a色谱从发酵液中亲和纯化所获得的模式抗体。这种捕获给予带fc的分子特别的选择性，由此在单个步骤中除去超过99.5％的杂质。
1.3分析学
活细胞密度和存活力
使用台盼蓝染色方法，通过countesstm自动化细胞计数器(invitrogencarlsbad，ca，2008)，测定了活细胞密度和细胞存活力。
葡萄糖
使用accu-chek血糖计(roche，mannheim，德国)，测量了葡萄糖浓度。
pco2
使用abl80血液气体分析仪(radiometer，bronshoj，丹麦)，测定了溶解的二氧化碳含量(pco2)。
ph测量
使用s47sevenmultiph计(mettlertoledo，苏黎世，瑞士)，进行在线ph测量用于原位ph计重校准。
摩尔渗透压浓度
使用advancedmodel2020多样品渗压计(advancedinstrument，norwood，ma)测定了样品的摩尔渗透压浓度。
滴度
通过蛋白a亲和hplc测定了(在工艺过程中)样品的蛋白质滴度。
糖基化特征
使用激光诱导荧光检测(ce-lif)，通过毛细管电泳，测定了聚糖群的相对比例，表示为聚糖型的迁移时间校正的面积％。通过用pngase-f在37℃下孵育3小时，将蛋白质样品(200μg)脱糖基化。使用冷乙醇进行蛋白质的沉淀，接着干燥。使用荧光衍化剂9-氨基芘-1,4,6-三磺酸(apts)和氰基硼氢钠进行还原性胺化后，接着在55℃加热90分钟。将样品淬灭，并使用配备有488nm固态激光的ce-lif系统进行电泳。通过荧光检测来测定聚糖的相对含量。使用相应峰的面积％值来计算释放的聚糖量。针对释放和稳定性测试，评价了模式抗体的四种主要聚糖(g0f、g1f、g1’f、g2f)。验收标准为：g0f：40-56面积％；g1f：28-38面积％；g1’f：9-13面积％和g2f：5-12面积％。
分离参数包括：
·50μmi.d.的毛细管直径
·毛细管长度:总长(lt)＝50.2cm
·到检测仪的长度(ld)＝40.2cm
·中性毛细管
·peo凝胶
·20分钟运行时间
·毛细管温度20℃
·样品存储温度10℃
生物活性
使用补体依赖性细胞毒性(cdc)试验，测定模式抗体的生物活性。cdc方法的基础是模式抗体以特异性的方式结合靶细胞表面上表达的抗原；由此形成的抗原-抗体复合物激活补体系统，作为其结果，细胞以剂量依赖性方式死亡。通过添加
2.结果
2.1摩尔渗透压浓度的优化
为了根据细胞的营养需求优化补料组合物，在1l补料分批发酵实验中分析了补料组合物的摩尔渗透压浓度对cho细胞产生的模式抗体的蛋白糖型/半乳糖基化的影响。
遗传工程化表达模式抗体的cho细胞最初在基础培养基(powercho-2，lonzaincus)中生长。从(接种后)第3天开始，每隔一天，将15％3×浓缩excell补料(37g/l；safc)以shot-wise方式加入培养物中。
表1显示出各自实验过程中的培养基补充。
表1：补料-分批发酵运行a和b过程中使用的补料策略
将培养温度维持在37℃。通过添加0.5mna2co3或h3po4，将ph保持在ph7.05至ph7.15的范围中。溶解氧(do)设定点为40％。每天测量相关代谢物。将葡萄糖水平维持在约20mm。将细胞培养9-10天。
从(接种后)培养第3天开始，每天从发酵液的样品分析糖基化模式。为了质量分析，使用蛋白a从发酵液中亲和纯化所获得的抗体。从培养接种后第3天开始，每天评价细胞存活力、滴度和摩尔渗透压浓度。
使用补体依赖性细胞毒性(cdc)试验，测定了所获抗体的生物活性。
当在恒定ph、do、搅拌速度和温度下监控代谢物并确保充足营养物水平时，在培养过程中，摩尔渗透压浓度一直地递增并在培养后期达到650mosm/kg，而活细胞密度稳定地降低。
基于来自补料-分批实验的样品的几个结果，表2显示，递增摩尔渗透压浓度导致了明显较差的糖基化模式，意味着高于400mosm/kg的摩尔渗透压浓度可能对蛋白质糖基化具有负面影响。由于培养物中盐的累积，非半乳糖基化形式(g0f)的量递增，而半乳糖基化形式的量递减。类似地，根据cdc试验，相应抗体样品的生物活性随着发酵液的摩尔渗透压浓度的递增而递减。
表2：摩尔渗透压浓度发酵参数对半乳糖基化的影响
*从13种市售抗体批次的糖基化谱的平均值和标准差计算的。
因为三倍浓缩的含盐excell补料促使了细胞培养物的高摩尔渗透压浓度，故将初始的excell补料组合物改变成与初始培养基相比含有少66％的磷酸钠。
来自补料-分批发酵运行a和b在(接种后)培养10天后的抗体糖基化模式显示于表3中。
表3：摩尔渗透压浓度发酵参数对半乳糖基化的影响
*从13种市售抗体批次的糖基化谱的平均值和标准差计算的。
由于补料-分批发酵运行b中使用的定制无盐excell补料，摩尔渗透压浓度低于400mosm/kg，这对抗体糖基化模式具有积极影响，例如，与使用含盐的excell补料进行的补料-分批发酵运行a相比，非半乳糖基化的糖型减少而半乳糖基化的糖型和cdc活性提高。
2.2通过使用umg的补料补充结合培养ph的改变来优化半乳糖基化
使用tapbiosystems,uk的ambr(高级微量生物反应器)系统(其是以微量模拟台式生物反应器特征的高通量规模缩减(down-scale)发酵平台)，在应用ph改变的不同时间点，在umg补料和轻微ph改变后，研究了所获抗体的半乳糖基化模式。
方法
将遗传工程化表达模式抗体的cho细胞在基础培养基(powercho-2，lonzaincus)中培养9天。从(接种后)第3天开始，每隔一天，将根据实验b(实施例2.1，表1，除了脯氨酸外)补充的15％(3×)sfexcell补料(37g/l；safc)以shot-wise方式加入培养物中。在(接种后)培养的第5和7天，与定制的sfexcell补料一起，加入umg补充剂(3mm尿苷，0.06mm氯化镁(ii)和15mm半乳糖)。
通过添加0.5mna2co3或h3po4，将ph保持在ph7.15，直至(接种后)培养的第3天。在4.0-7.0×106细胞/ml的活细胞密度，在接种后第65-78小时之间的不同时间点，通过添加h3po4，使ph朝向ph7.00改变。
从粗纯化的蛋白，用毛细管电泳分析所产生抗体的半乳糖基化模式。
培养ph对所获抗体样品的半乳糖基化模式的影响概括于表4中。
表4：依赖于培养ph的抗体半乳糖基化。
*从13种市售抗体批次的糖基化谱的平均值和标准差计算的。
在(接种后)培养第3天从ph7.15轻微改变至ph7.00，与对照(其中在培养过程中ph7.15保持恒定)相比，已经对抗体的糖基化具有影响。ph改变后，非半乳糖基化的糖型(g0f)的百分比可降低，且半乳糖基化糖型g1f、g1’f和g2f的百分比提高了。这种轻微ph改变对抗体半乳糖基化的积极影响，甚至可以在高于400mosm/kg摩尔渗透压浓度(通过nacl补充培养基在相应样品中调节)下，观察到。然而，高于400mosm/kg的摩尔渗透压浓度导致相应抗体明显较差的糖基化模式。
表5显示(接种后)培养第8天和第9天时所获抗体样品的g0f、g1f、g1’f和g2f半乳糖基化各自的百分比分布，以及应用ph改变时的时间点。表5：在ph改变的不同时间点在umg补料和ph改变组合后的抗体半乳糖基化模式。
培养第8天的半乳糖基化模式的分析显示出，与对照样品(其中在发酵过程中ph7.15保持恒定)相比，非半乳糖基化糖型g0f的百分比含量降低。ph改变和umg补料的结合导致了所获抗体的半乳糖基化糖型(g1f、g1’f和g2f)的百分比含量提高。
如表6中可以看到的，与没有添加umg的对照相比，单独的umg补料在(接种后)培养第7天时对抗体半乳糖基化具有积极影响。然而，只有结合两个特征(轻微ph改变+umg的补料补充)时，才实现了所获抗体的非半乳糖基化糖型的百分比含量的显著降低和半乳糖基化糖型的百分比含量的显著提高。
表6：ph改变和umg补料相结合对抗体半乳糖基化的影响
*从13种市售抗体批次的糖基化谱的平均值和标准差计算的。
总之，所获抗体样品的糖基化模式的分析表明了，包括在(接种后)培养的第5天和第7天补充umg以及从ph7.15至ph7.00的轻微ph改变的改进补料策略，导致了提高的抗体半乳糖基化。