本申请对2015年11月11日提交的美国临时申请no.62/253,836要求优先权，该临时申请内容的整体通过引用并入本文。
背景技术：
免疫在肿瘤发生中的作用日益受到重视。巨噬细胞是先天免疫和适应性免疫的执行者，并且已被公认为肿瘤及其微环境的关键组分。大量的研究表明了肿瘤相关巨噬细胞(tams)在几乎所有肿瘤的生长，侵袭和转移中的作用。来自循环单核细胞的tam显示出广泛的表型，范围从所选肿瘤的早期阶段的m1样表型到大多数晚期肿瘤中的m2样表型。与其在促进肿瘤发生中的作用一致，m2样tam显示升高表达il-10，il4，mmp和vegf的特征表型，以及降低表达促炎性细胞因子和细胞毒性inos和roi，后者涉及到肿瘤杀伤活性。除了其促进肿瘤发生的内在功能外，tam还通过改变t细胞应答和肿瘤微环境中的平衡而有助于抑制抗肿瘤免疫。tam的功能可塑性已被广泛认可。然而，由于人们对tams可塑性如何受细胞内在因素控制理解尚很有限，靶向tams在肿瘤治疗中的有效性和潜在应用受到了限制。
技术实现要素：
本发明一方面提供了一种治疗癌症的方法。所述方法包括：提供基因修饰的巨噬细胞或单核细胞，其含有编码含有hom-1同源异型框结构域的hom-1多肽或其片段的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接于异源启动子，这样修饰的巨噬细胞或单核细胞表达hom-1多肽或其片段；并将修饰的巨噬细胞或单核细胞施用于患有癌症的受试者。在一个实施例中，修饰了的巨噬细胞或单核细胞的产生方法是将外源表达载体引入来自受试者或另一受试者的巨噬细胞或单核细胞。修饰了的巨噬细胞表现出m1表型。该方法可进一步包括，在施用步骤之前，与对照比较，受试者体内肿瘤相关巨噬细胞中hom-1检测出较低水平的表达。
本文在另一方面描述了一种治疗癌症的方法，其包括使巨噬细胞或单核细胞与一种或多种诱导hom-1表达的试剂接触，于是巨噬细胞或单核细胞中内源hom-1的表达水平高于在接触步骤之前；并将如此处理的巨噬细胞或单核细胞施用于患有癌症的受试者。
本文还描述了一种治疗癌症的方法，其包括使巨噬细胞或单核细胞与诱导m1基因表达的试剂或抑制m2基因表达的试剂接触，于是产生表现m1-表型的巨噬细胞；并将产生的巨噬细胞施用于患有癌症的受试者。
在又一方面，本发明描述了鉴定受试者中的癌症的方法。该方法包括检测来自怀疑为癌症的组织区域的微环境中巨噬细胞的基因表达水平，该基因是hom-1基因，m1基因或m2基因，其中检测(i)与相应的对照水平相比，较低的hom-1基因或m1基因的表达水平；或(ii)更高表达水平的m2基因，表明疑似组织区域是癌症或有成为癌症的风险。
本发明还描述了用于鉴定治疗癌症的候选化合物的方法。该方法包括使测试细胞与测试化合物接触，其中测试细胞是巨噬细胞或单核细胞；在测试细胞中检测(i)hom-1，(ii)与hom-1启动子可操作连接的报告基因，(iii)m1基因，或(iv)m2基因的表达水平；并选择与相应对照水平相比表达水平改变的测试化合物，其中所选化合物是用于治疗癌症的候选化合物。在一个实施例中，所述方法可以进一步包括使原瘤巨噬细胞与所选择的化合物接触，并测试接触了的原瘤巨噬细胞的抗肿瘤活性。原瘤巨噬细胞可以是肿瘤相关巨噬细胞或m2巨噬细胞。接触操作步骤中测试细胞可以在含有癌症样品的共培养物中一起接受接触。测试细胞可以选自m1巨噬细胞，m2巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞，组织巨噬细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞。
本发明一方面描述了用于鉴定治疗癌症的候选化合物的方法，其包括：提供含有测试细胞和癌症样品的共培养物，其中所述测试细胞是巨噬细胞或单核细胞；向共培养物中加入测试化合物，与一个参照物比较，这个测试化合物，(i)抑制癌症样品，(ii)增加测试细胞中与hom-1，或与hom-1启动子可操作连接的报告基因的表达水平，(iii)增加测试细胞中m1基因的表达，(iv)降低测试细胞中m2基因的表达，或(v)抑制hom-1，或与hom-1启动子可操作连接的报告基因的表达水平的显著降低；其中所选择的化合物是用于治疗癌症的候选化合物。在一个实施例中，癌症样品是癌症组织样品。在共培养中，测试细胞和癌症样本可以直接接触或彼此间接接触。测试细胞可以选自m1巨噬细胞，m2巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞，组织巨噬细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞。
另一方面，本发明描述了鉴定用于治疗癌症的候选化合物的方法，其包括：提供癌症组织样品，使组织样品与测试化合物接触，并选择测试化合物，与对照相比，该测试化合物(i)抑制组织样品(的生长)，(ii)增加组织样品中肿瘤相关巨噬细胞或单核细胞中hom-1的表达水平，(iii)增加组织样品中肿瘤相关巨噬细胞或单核细胞中m1基因的表达(iv)降低组织样品中肿瘤相关巨噬细胞或单核细胞中m2基因的表达，或(v)抑制在组织样品中的肿瘤相关巨噬细胞或单核细胞中hom-1表达水平的显著降低；其中所选择的化合物是用于治疗癌症的候选化合物。
在下面的描述中阐述了一个或多个实施例的细节。从以下描述和权利要求中，实施例的其他特征，目的和优点将显而易见。
具体实施方式
与从正常组织分离的巨噬细胞相比，tam中的hom-1表达显著降低，这一发现是惊人的。进一步的发现也是惊人的：增加tam中hom-1的表达将它们转化为具有肿瘤杀伤活性的m1样巨噬细胞。
hom-1是人类同源异型框转录因子，是典型的wnt信号传导拮抗因素。hom-1的核苷酸序列(seqidno：1)及编码的氨基酸序列(seqidno：2)如下所示：
本发明描述了通过向受试者施用表现出抗肿瘤活性的巨噬细胞来治疗受试者的癌症的方法。除非另有说明，本文中所采用的术语“表现抗肿瘤活性的巨噬细胞”，“m1样巨噬细胞”和“表现m1表型的巨噬细胞”可以互换使用。
通过(1)增加巨噬细胞或单核细胞中的hom-1表达，(2)增加巨噬细胞或单核细胞中一种或多种m1基因的表达，与/或(3)在巨噬细胞或单核细胞中抑制一种或多种m2基因的表达，可以产生m1样巨噬细胞。
在该方法中可以使用单核细胞(例如源于受试者的外周血)，因为已经表明hom-1表达对于单核细胞至巨噬细胞的分化是必要的和充分的。换句话说，增加单核细胞中hom-1的表达可驱使它们分化成巨噬细胞。
可以体外诱导巨噬细胞或单核细胞表达更高水平的内源hom-1。可使用各种药剂或治疗来诱导hom-1表达，例如用lps，霍乱毒素(ctx)，化学治疗剂，放射，细胞因子(例如gm-csf)，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)以及抗hom-1表达抑制剂的抗体或rnai。
已被基因修饰升高了hom-1表达水平的巨噬细胞或单核细胞也可用于治疗癌症患者。例如，经基因修饰的巨噬细胞或单核细胞可含有能编码包含hom-1同源框结构域的hom-1多肽或其片段的核苷酸序列。该核苷酸序列可操作地连接至启动子，修饰了的巨噬细胞或单核细胞表达hom-1多肽或其片段。这种修饰了的巨噬细胞或修饰了的单核细胞(其将分化成巨噬细胞)表达足够高水平的hom-1以展现抗肿瘤活性和/或m1表型。
基因修饰的巨噬细胞或单核细胞也可以通过向巨噬细胞或单核细胞中引入额外的hom-1基因拷贝来产生。例如，含有可操作地连接至内源hom-1启动子的hom-1核酸序列(编码包含hom-1同源框结构域的hom-1多肽或其片段)的表达载体可被引入巨噬细胞或单核细胞。
包含hom-1同源框结构域的hom-1多肽或其片段也可通过直接肽递送引入巨噬细胞或单核细胞。
本领域已知的方法可用于基因修饰巨噬细胞和单核细胞。例如，可以将一个用于表达hom-1的外源表达载体引入(例如，稳定或瞬时转染)巨噬细胞或单核细胞。在一个实施例中，hom-1核酸序列可操作地连接到一个异源(即非hom-1启动子)组成型或诱导型启动子。在一个实施例中，hom-1核酸序列可操作地连接至内源启动子。
m1型肿瘤杀伤巨噬细胞也可以通过诱导巨噬细胞或单核细胞中m1基因的表达来产生。可以诱导m1基因的药剂包括但不限于lps，ctx，pma，gm-scf，infγ和化学治疗剂。巨噬细胞或单核细胞也可以被基因修饰以表达升高水平的m1基因。m1基因包括il1b，il6，il12，il23，tnfβ，inos，cd40，cd80，cd86，cd68，tlr4，tlr2，il-1r，mhcii，ccl15，ccl20，cxcl9，cxcl1和socs3。
也可以抑制巨噬细胞或单核细胞中m2基因的表达来产生m1样肿瘤杀伤巨噬细胞。抑制m2基因的药剂包括抗il4药剂(例如抗体或rnai药剂)，抗il13药剂(例如抗体或rnai药剂)，抗m2蛋白的抗体和靶向m2基因的rnai药剂。m2基因包括arg1，mmp9，ccl18，vegf，il10，il4，tgfb，cd163，cd206，cd68，tlr8，tlr1，mhcii，tgm2，dcoyr，il-1rii，yml/2，mmr/cd206和sr。
异源或自体巨噬细胞或单核细胞可用于产生m1样巨噬细胞。如果使用异源巨噬细胞或单核细胞，可进行hla匹配以避免或最小化宿主反应。hla不匹配的巨噬细胞或单核细胞也可能有用。使用本领域已知的方法可从癌症患者获得自体巨噬细胞或单核细胞。
可以通过输注或注射(例如，通过静脉内，鞘内，肌内，腔内，气管内，腹膜内，颅内，皮下或另一种类型的组织内途径)，透皮施用或本领域已知的其他路线。在一个实施例中，巨噬细胞或单核细胞可以直接注射到发现肿瘤的部位或组织(例如肝或胰腺)或其周围区域。
可以根据需要用m1型巨噬细胞经常(例如，每1至30天)和多次(例如1-30次)治疗受试者以治疗癌症。本文所述的m1样巨噬细胞也可用于与其他癌症治疗如放疗，化疗，抗体和小分子药物等组合治疗。
下面描述的数据显示hom-1表达将tam转化为与肿瘤类型无关的肿瘤杀伤细胞。因此，可以使用本文所述的m1样巨噬细胞治疗任何癌症，特别是与表达低水平hom-1的tam相关的癌症。在如上所述用m1样巨噬细胞治疗受试者之前，确定受试者tam中的hom-1表达水平是否低于对照中发现的水平(例如，在受试者的正常组织中发现的巨噬细胞)会是有用的。
可以用m1样巨噬细胞治疗的癌症的实例包括但不限于：癌和肉瘤如白血病，肉瘤，骨肉瘤，淋巴瘤，黑素瘤，神经胶质瘤，恶性胶质瘤，嗜铬细胞瘤，肝细胞瘤，卵巢癌，皮肤癌，睾丸癌，胃癌，胰腺癌，肾癌，乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌，头颈癌，脑癌，食管癌，膀胱癌，肾上腺皮质癌，肺癌，支气管癌，甲状腺癌，子宫内膜癌，鼻咽癌，宫颈癌，肝癌，转移癌和原发部位不明的癌症。
与对照相比，在组织区域的微环境中发现的巨噬细胞中检测到hom-1或m1基因的较低表达水平或m2基因的较高表达水平(例如，与正常组织中巨噬细胞的相应水平比较)表明组织区域是癌症或有可能成为癌症。因此，本发明也考虑了用于鉴定疑似组织区域是癌症还是处于癌症危险中的方法。
本文进一步描述了鉴定用于治疗癌症的候选化合物的方法。可以使测试细胞(即巨噬细胞或单核细胞)与测试化合物接触，并且与对照(例如未与测试化合物接触的测试细胞)的相应水平相比，测试以下基因的表达水平：(i)hom-1，(ii)与hom-1启动子可操作连接的报告基因，(iii)m1基因，(iv)与m1启动子可操作连接的报告基因，(v)m2基因，或(vi)检测细胞中与m2启动子可操作连接的报告基因。测试化合物中增加(i)-(iv)中任何一个的表达水平和/或降低(v)或(vi)的表达水平的，是用于治疗癌症的候选化合物。
在一种筛选方法中，将测试化合物加入含有测试细胞和癌症样品的共培养物中。如果与对照相比，(i)增加测试细胞中hom-1，可操作地连接一个hom-1启动子，一个m1基因，或可操作地连接一个m-1启动子的报告基因的表达水平；(ii)抑制以下基因表达水平显著的降低：hom-1，一个可操作连接于hom-1启动子的报告基因，一个m1基因，或者可操作连接于一个m1启动子的报告基因，或(iii)降低测试细胞中一个m2基因，或一个与m2启动子可操作连接的报告基因的表达水平，在以上情况下测试化合物是用于治疗癌症的候选化合物，。
在共培养系统中，还可以确定测试化合物是否对癌症样品具有抑制作用。与对照相比，抑制癌症样品(例如，抑制癌细胞的生长，杀死癌细胞或减小癌样品的大小)的测试化合物是用于治疗癌症的候选化合物。测试细胞和癌症样本可以直接相互接触。或者，测试细胞和癌症样品不直接接触(例如，利用细胞迁移能力实验方法)。癌症样品可以是含有癌细胞的样品，例如癌组织样品，从癌组织样品分离的癌细胞，或癌细胞系的细胞。癌症组织样本可以从癌症患者手术切除的标本中获得。这种癌症组织样品可能含有tam。
筛选方法也可以在没有测试细胞的情况下用癌症组织样品进行。癌组织样品可以与测试化合物接触。经过一段时间后，可以从癌组织样品中分离tam，并测定tam中hom-1，m1基因或m2基因的表达水平。或者，除此之外，可以确定组织样品中hom-1的表达水平。如果与对照相比(i)增加hom-1或m1基因的表达水平，(ii)抑制了hom-1或一个m1基因的表达水平的显著降低，与/或(iii)降低了m2基因的表达水平，该测试化合物是治疗癌症的候选化合物。一个测试化合物如果抑制了癌组织样品(例如缩小样品的体积)，则测试化合物亦可考虑作为用于治疗癌症的候选化合物。
可以使用本领域已知的方法获得待筛选的测试化合物(例如，蛋白质，肽，模拟肽，类肽，抗体，rnai，小分子或其他药物)。
在本文所述的任何方法中，hom-1，m1基因或m2基因的表达水平可以在mrna水平或在蛋白质水平确定。也可以测量启动子的活性。测量mrna水平，蛋白质水平和启动子活性的方法为本领域所周知。
在任何上述筛选方法中，测试细胞可以是巨噬细胞或单核细胞。巨噬细胞可以是m1巨噬细胞，m2巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞，组织巨噬细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞。测试细胞也可以是单核细胞。
下面的具体例子应被视为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。相信本领域技术人员可以基于本文的描述最大程度地利用本公开，这一点无需进一步说明。本文引用的所有出版物均通过引用整体并入本文。
实施例
我们确定人类同源异型框蛋白hom-1在人巨噬细胞功能极化中的作用。我们发现hom-1促进人类巨噬细胞的m1激活，并且是其所需要的，但对于参与m2激活的关键基因的表达不是必需的。
利用从癌症分离的初级tam，我们发现tam中的hom-1表达与从正常对照组织分离的巨噬细胞相比显著降低。我们表明了tam中hom-1的表达谱与tam表型相关。此外，hom-1的异位表达将tams转化为m1样表型。体外和体内数据均显示hom-1赋予tam肿瘤杀伤活性。总之，我们的研究表明hom-1将tams转化为肿瘤杀伤细胞。我们表明表达hom-1的tam(表现出一个m1表型)对各种癌症的生长具有强烈的抑制作用，表明hom-1调节的tam作为治疗癌症的新模式的作用。
tam中hom-1表达降低
在晚期肿瘤中，tam显示出类似于肿瘤m2的表型。请参阅bronte和murray(2015),natmed21,117-119。tam的可塑性已被充分认识，并且多种细胞因子已被表明与tam向m2表型的极化有关。参见noy和pollard(2014),immunity41,49-61。相比之下，控制tam极化的转录机制在很大程度上仍是未知的。
从结肠癌切除的废弃手术标本被用于从肿瘤组织分离tam，以及从距肿瘤部位15cm的正常粘膜中分离巨噬细胞。如前所述，facs分析显示，与从正常对照粘膜分离的巨噬细胞相比，tam表达显著高水平的与m2表型相关的细胞表面标记，如cd68，cd163，cd206。参见zhang等人(2013),eurjcancer49,3320-3334。我们发现在tam和对照巨噬细胞中，无差别巨噬细胞标记cd33的表达没有显著差异。
为了确定hom-1是否可能在tam中发挥作用，我们采用qrt-pcr对tam中的hom-1表达加以定量，发现与对照巨噬细胞中的表达相比，tam中hom-1表达显著降低。
ventx调节tam可塑性和朝向m1表型的tam极化
先前的研究表明tam可以被lps诱导显示m1表型。参见zhang等。为了确定hom-1是否在tam可塑性中起作用，我们检测了暴露于lps的tam中的hom-1表达。我们发现在用lps刺激后，tam中hom-1的表达显著升高。与先前的发现一致，与这种表达升高相应的是，lps刺激tam导致炎性细胞因子和细胞毒性inos的分泌增加。
为了确定hom-1是否起到tam可塑性的调节作用，我们检查了hom-1敲减对tam表型的影响。用抗hom-1的吗啉代(morpholinos,mo)处理tam导致hom-1表达降低约80％。与hom-1作为tam可塑性的关键调节的作用一致，我们发现hom-1mo中止了lps诱导的tam中的炎性细胞因子和细胞毒性inos的分泌。cd206是甘露糖受体和在tam中高度表达的m2细胞表面标记。tam暴露于lps导致显著减少cd68+cd206+群体和cd68+cd206-细胞数量的增加,这反映tams的可塑性。hom-1mo消除lps对tam的两个作用(p<0.01)。
hom-1表达水平与tam表型之间的相关性促使我们进一步探索hom-1控制tam可塑性的想法。我们分离tam并用编码gpf-hom-1的质粒或对照gfp转染。与对照gfp转染的tam相比，用gfp-hom-1转染的tam表现出具有拉长的/成纤维细胞样形状的m1形态的特征。facs分析显示，在用gfp-hom-1转染的tam中，m1标志物cd40，cd80和cd86的表面表达显著增加。另外，在用gfp-hom-1转染的tam中，促炎细胞因子tnfβ，il-1β和il-12的分泌显著增加，而m2细胞因子il-10的分泌显著降低。相应地，基因表达分析显示，在用gfp-hom-1转染的tam中，m1基因例如il-1β，il-6，tnf-β和inos显著增加，而m2基因例如ccl18，mmp9，vegfa，以及arg1在用gfp-hom-1转染的tam中显著降低。
总之，我们的数据表明hom-1调节tam可塑性，并且促进tam的m1极化。hom-1将tam转化为肿瘤抑制细胞
我们发现hom-1促进tam的ml极化促使我们探索hom-1修饰的tam是否可以发挥肿瘤抑制作用。我们用编码gpf-hom-1的质粒或对照gfp转染来自结肠癌的新鲜分离的tam，然后用细胞迁移能力实验培养系统将修饰的tam与同一患者的肿瘤或正常组织共培养。值得注意的是，在共培养7-10天后，在用gfp-hom-1修饰的tam孵育期间肿瘤体积显著降低(约70％)(p<0.01)，而使用gfp转染的tam或仅使用tam孵育的肿瘤的大小没有显著变化。为了确定肿瘤体积缩小是否与癌细胞减少有关，我们用ck20抗体做了组织切片，h&e染色和结肠癌细胞的免疫组织化学试验。我们发现ck20阳性肿瘤细胞出现在用tam或gfp修饰的tam孵育的肿瘤的巢，线和片中。然而，在与用gfp-hom-1转染的tam孵育期间，ck20阳性肿瘤细胞消失。hom-1修饰的tam的肿瘤杀伤作用的特异性由以下发现证实：在用gfp或gfp-hom-1转染的tam孵育期间，hom-1修饰的tam对正常结肠粘膜的体积和形态发挥最小的作用。
hom-1促进体内tam的肿瘤杀伤功能
我们关于hom-1在体外将tam转化为肿瘤杀伤细胞的发现促使我们探索hom-1调节的tam在体内肿瘤发生中的潜在作用。将结肠癌切成约0.5厘米的小块并手术接种在nsg小鼠的腹侧的皮下空间中。一周后，通过小鼠尾部注射mo-hom-1转染的tam(hom-1抑制)或gfp-hom-1转染的tam(hom-1表达)。异种移植8周后，在注射mo-hom-1转染的tam的小鼠中发生肿瘤，但在注射gfp-hom-1转染的tam的小鼠中未发生肿瘤。
我们还发现，通过在m1分化培养基中培养tam或单核细胞可以诱导它们表现出m1表型。这些m1-分化的tam/单核细胞可以注入nsg小鼠体内并抑制癌症生长。
这种m1分化的tam对肿瘤生长的作用通过抑制这些tam或单核细胞中的hom-1表达而消除。
ham-1在tam中异位表达对各种癌症类型的影响
tam已经涉及基本上所有肿瘤的肿瘤发生。继我们对结肠癌细胞中tam的研究后，我们将研究扩展至其他肿瘤类型。
我们获得了肺，黑素瘤，食管癌，胃癌和胰腺癌的手术样本，并如上所述分离tam。由来自相同患者的相应正常组织获得巨噬细胞。使用实时rt-pcr定量tam和组织巨噬细胞中的hom-1表达。与来自远处正常组织的相应巨噬细胞中的hom-1表达相比，所有这些肿瘤的tam中的hom-1表达低。
为了确定hom-1是否可以将这些tam转化为肿瘤杀伤细胞，将gfp或gfp-hom-1转染入tam中。转染48小时后，分选出gfp阳性细胞并与单个肿瘤共培养。在与gfp-hom-1转染的tam共培养期间，所有肿瘤的肿瘤体积都减少，但对照的gfp转染的tam没有。我们的研究结果表明，hom-1可以将tam转变成与肿瘤类型无关的肿瘤杀伤细胞。
收集结肠组织样本
肿瘤组织和正常组织来自病理学实验室患者手术切除的标本。从每个肿瘤块收集约5-10克组织，或从距肿瘤块15厘米处的正常粘膜收集。患者血液样本也被收集。
上皮内淋巴细胞的制备
使用经修改的先前描述的技术(kamadan等,2008；pignatac人，1990)分离了固有层单核细胞(lpmc)。简而言之，将切开的新鲜粘膜和肿瘤块用含2％胎牛血清(fbs)和1mm二硫苏糖醇(dtt,sigma-aldrich,1mm)的无ca2+、无mg2+的hank's平衡盐溶液(hbss)(生命技术)在10cm培养皿中冲洗)以去除粘液。用剃刀刀片将粘膜和肿瘤切成0.5cm小块，并在6孔板中在含1mmedta(sigma-aldrich)的5mlhbss溶液中于37℃孵育1小时，然后滤过灰色滤网(100微米)。滤液含有上皮内淋巴细胞和上皮细胞，用流式细胞仪分析。
从肿瘤块和正常粘膜中分离巨噬细胞
随后，将粘膜和肿瘤在含有2％fbs，1.5mg/ml胶原酶d(roche)，0.1mg/mldnasei的hbss(含有ca2+、mg2+)中在37℃下孵育1小时。消化的组织通过灰色滤网(70微米)过滤。收集流出物并重新悬于40％percoll溶液(pharmacia)中，然后在60％percoll上分层，并在2000rpm下不加制动离心30分钟。收集界面上的lpmc。根据制造商的说明使用easyseptm人单核细胞/巨噬细胞富集试剂盒(stemcelltechnologies)在不使cd16耗尽的情况下从lpmc纯化正常粘膜巨噬细胞和tam。通过这些技术分离的细胞通常通过碘化丙啶(pi)染色表明存活超过98％。肠巨噬细胞的纯度超过95％。
从外周血制备巨噬细胞
通过ficoll密度梯度离心分离来自brighamandwomen医院的健康成年供体的外周血单核细胞(pbmc)。根据制造商的说明使用easyseptm富集试剂盒在不使cd16耗尽的情况下从pbmc纯化人单核细胞。纯化的细胞在含有10ng/mlm-csf(peprotech)的完整rpmi培养基中培养。富集后，将单核细胞在含有m-csf的完整rpmi培养基中培养5天，将细胞用于共培养系统。
facs分析
用荧光染料缀合的抗体免疫标记细胞后，使用流式细胞术进行tam和其他淋巴细胞的表型分析。使用以下抗体：pe缀合的抗cd3(okt3)，-cd25(bc96)，-cd14(61d3)，-cd68(ebioy182a)，-cd163(ebiogh161)，-cd206抗体，fitc缀合的抗-cd4(rpa-t4)，-cd33(him3-4)抗体，apc-缀合的抗-cd8(okt8)，-cd4(okt4)抗体(ebioscience,inc)。按照制造商提供的方案，用pe-缀合的抗体作foxp3(236a/e7)，ifn-γ，穿孔素和颗粒酶b的细胞内染色。平行进行同位素对照标记。按供应商推荐方式稀释抗体。使用cell-quest软件(bdbiosciences)在facscan流式细胞仪上收集标记的细胞并通过flowlo软件分析。结果表示为阳性细胞的百分比。
肿瘤和巨噬细胞的器官型共培养物
将细胞迁移能力实验用膜(transwellinserts,0.4m孔径，costar，corning)置于12孔聚苯乙烯组织培养板(bectondickinson，franklinlakes，nj)中。称重粘膜和肿瘤块并用1xpbs缓冲液加抗生素洗涤，然后切成0.5cm的块。将约50mg组织接种在12孔transwell的上部隔室中，并注入0.5mlrpmi1640完全培养基。将5×105个tam以50万个细胞/孔的密度添加到下部室中，细胞-组织不直接接触，并注入2mlprmi完全培养基，在37℃，5％co2下培养。取出0.5ml培养基用于细胞因子分析，并且每三天添加一次新鲜培养基。共培养两周后，收集低室巨噬细胞并用trizol试剂(ambion)分离总rna。每周两次卡尺监测肿瘤和正常粘膜，根据公式(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。组织的照片采用徕卡ez4d立体显微镜上的300万像素cmos照相机或iphone上的数码相机拍摄。
免疫组织化学
将肿瘤或正常组织固定在甲醛(fisherscientificcompany，kalamazoo，mi)中，进行ck20染色(dako，carpinteria，ca，克隆ks20.8,1:50)和苏木精/伊红(h&e)染色。ck20染色在线使用epitoperetrieval2系统在leicaboneiii染色平台上在线操作20分钟，使用bonepolymerrefine检测试剂盒。显微分析采用nikoneclipseti荧光显微镜。使用成像软件为niselements(nikon)的彩色照相机以40倍的原始放大倍率拍摄图像。代表性图像的亮度和对比度在各组之间进行平均调整。
hom-1过度表达
根据生产方案通过lipofectamine2000(lifetechnologies)将gfp-hom-1转染入血液巨噬细胞和tam。转染48小时后，通过70μm过滤器过滤细胞用于细胞分选。gfp阳性细胞在无菌条件下通过bakerbio-protecthood下的流式细胞仪bdfacsariaii进行分选。分选后，将细胞在rpmi1640完全培养基中培养。
hom-1基因敲除
根据制造商的说明利用人单核细胞核转染试剂盒(lonza，walkersville，md)用morpholino(mo)反义寡核苷酸转染结肠tam或人原代单核细胞。简而言之，用2.5nmol的hom-1mo寡核苷酸或标准对照mo寡核苷酸将5×106个细胞重悬于100μl核转染溶液中，并用nucleofectorii装置(lonza)电穿孔。然后立即从装置中取出细胞并与含有2mm谷氨酰胺和10％fbs的1ml预热的人单核细胞转录因子培养基一起温育过夜。然后将细胞重悬于完全rpmi培养基中，并用适当的细胞因子处理以诱导分化成巨噬细胞。所有mo寡核苷酸均从genetools(philomath，or)订购。
细胞因子测量
使用从ebiosciences获得的elisa试剂盒对大肠杆菌lps-(sigma-aldrich)处理的血液巨噬细胞或lps处理的tam的上清液中的il-1β，il-10，tnf-β和il-12p70的水平进行定量。上述分析是根据制造商的说明作出的。
qrt-pcr
利用trizol试剂分离总rna，并通过nanodrop2000(thermoscientific)测定rna。根据制造商的方案，用superscriptiii第一链合成系统(lifetechnologies)将等量的rna用于第一链cdna合成。为了用常规pcr扩增hom-1cdna，我们采用accuprimetaqdna聚合酶系统(lifetechnologies)按照生产商的说明进行操作。pcr产物在2％琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。gapdh作为内标。我们用lightcycler(480实时pcr系统；roche)用sybrgreen进行hom-1和其他基因cdna的定量测量。然后使用比较ct方法(ddct方法)计算mrna的相对表达谱。精氨酸酶活性和no测定
通过使用quantichrom精氨酸酶测定试剂盒(darg-200；bioassayssystems)测量尿素的产量，在细胞裂解物中定量精氨酸酶活性。使用griess试剂盒(molecularprobes)测定培养上清液中的亚硝酸盐浓度。
统计分析
统计分析中采用学生氏检验法。
其他实施例
本说明书中公开的所有细节可以以任何组合结合起来。本说明书中公开的每个细节可以由用于相同，等同或类似目的的替代细节替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个细节仅仅是一系列等同或类似细节的一个例子。
从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定所描述的实施例的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对实施例进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求内。