专利名称：动脉粥样硬化炎症相关的miRNA的筛选方法
技术领域：
本发明涉及动脉粥样硬化疾病的治疗领域，尤其涉及动脉粥样硬化炎症相关
的miRNA的筛选方法。
背景技术：
动脉粥样硬化形成的病理生理机制虽然尚未完全明确，但目前比较公认的 是炎症反应学说。炎症是动脉粥样硬化发生发展的关键因素。国内外研究表明， 参与动脉粥样硬化病理过程的炎症因素很多，其中关键性步骤是单核细胞迁入 内膜下，受局部氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的刺激被激活分化为巨噬细胞， 吞噬了过量ox-LDL的巨噬细胞分化成泡沫细胞，后者不仅是动脉粥样硬化脂质 核心的主要成分，还产生和释放基质金属蛋白酶(MMPs)，促使斑块趋向不稳定 单核源巨噬/泡沬细胞是动脉粥样硬化炎症反应的最主要细胞，ox-LDL则是局部 单核细胞被激活的主要刺激因子。
microRNA(miRNA)，是细胞内一类在进化上高度保守、长度约22nt的非编 码RNA基因产物。miRNA来源于细胞内源性转录体(发夹状pre-miRNA)，以单 链形式存在，能与靶mRNA完全配对，介导靶mRNA降解或抑制靶mRNA编码蛋 白质的翻译，从而沉默特定靶基因发挥作用，研究表明miRNA在调节细胞生长、 分化和凋亡等方面都扮演着重要角色。目前研究己发现在单核细胞约有200余种 miRNA表达，在血管内皮细胞和平滑肌细胞也有几百种。
动脉粥样硬化炎症反应是多因素参与的过程，在ox-LDL炎症刺激下，单核 /巨噬细胞内有多种基因或蛋白表达会发生改变。若仅通过改变一种基因或蛋白 表达来抑制动脉粥样硬化炎症反应可能存在一定的局限性。另外，到底有哪些miRNA参与动脉粥样硬化炎症反应过程并不清楚，而且这些miRNA所行使的 功能更无从了解。分别测定动脉粥样硬化中数百种miRNA的表达水平的方法不 仅费时费力，而且需要大量的总RNA (每次Northerenblot至少需20微克)，另 外还要运用放射性同位素进行放射自显影，这无疑是不可行的。最近，国外已 利用生物芯片分析(Microarray Analysis)这一技术，成功筛选了 LPS作用下的 人THP-1单核细胞株miRNA表达的差异，发现miRNA-132、 miRNA-146和 miRNA-155表达增高。然而，该研究是用LPS作为刺激因素诱导炎症，以THP-1 细胞株为研究对象，这样模拟的只是哺乳动物天然免疫反应，与动脉粥样硬化 状态下的miRNA的改变并不匹配。况且，细胞株毕竟是肿瘤细胞，在许多方面 都与原代细胞存在着差异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以人原代单核细胞为目标，利用Microarray Analysis技术体外检测细胞miRNAs的表达差异的方法，本发明采用的技术方案 的技术步骤如下所述。
一种动脉粥样硬化炎症相关的miRNA的筛选方法，其包含如下步骤
(1) 利用ox-LDL刺激人原代单核细胞，诱导其分化成巨噬细胞和泡沫细
胞;
(2) 应用Microarray analysis技术，体外检测细胞miRNAs表达的差异， 筛选出参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs;
(3) 用tagman探针荧光定量PCR验证，然后用数据库及计算机软件分析 并筛选出miRNAs所对应的耙mRNA。
上述步骤中，人原代单核细胞取自人静脉血。
在步骤(2)中，将样品RNA分离得到片段小于300nt的小RNA， Poly(A)聚合酶在分离得到的小RNA3'端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记 与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的荧光标记，标记后的miRNAs与 miRNAs芯片杂交筛选出参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs。
本发明通过选择ox-LDL(30ug/ml)作为剌激因子，剌激人原代单核细胞，诱 导其分化成巨噬细胞和泡沫细胞，结合microarray analysis技术，体外检测细胞 miRNAs表达的差异，筛选出可能参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs，然后 用tagman探针荧光定量PCR验证，并用数据库及计算机软件分析并预测筛选出 miRNAs所对应的可能靶mRNA，最大程度筛选出贴近动脉粥样硬化特异性炎症 反应病理状态的miRNA，进一步完善动脉粥样硬化的形成机制，并为动脉粥样 硬化、尤其急性冠脉事件的防治开辟新的治疗耙点和方法。
图1是miRNA质控结果电泳图2为ox-LDL刺激单核细胞不同时间后基因芯片筛选Cy3/Cy5信号比值图； 图3为差异表达microRNA的层次聚类分析结果图； 图4为为taqman探针荧光定量PCR验证的结果图。
具体实施例方式
现依据附图，对本发明做进一步的描述。 实施例1 人外周血单核细胞分离及其在ox-LDL炎症刺激不同时间后的表型 鉴定
取健康成年志愿者肝素抗凝静脉血,密度梯度离心及贴壁法分离单核细胞， 单核细胞加ox-LDL (30mg/L)共同孵育6至12小时。实施例2 分单核细胞组、ox-LDL炎症刺激不同时间组(6小时、12小时)， 用Microarray analysis技术检测各组细胞miRNAs表达水平变化
Qiagen试剂盒提取大于5jig总RNA样品，并通过YM-100 (Millipore)微离 心过滤柱分离得到片段小于300 nt的小RNA。请见图1所示，由图可见明显的 5S，18S，28S的电泳条带，证明小RNA没有丢失。
Poly(A)聚合酶在分离得到的小RNA3'端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚 核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的荧光标记(Cy3和 Cy5)。
标记后的miRNAs与miRNAs芯片杂交杂交反应通过微循环泵杂交仪器 在/zParaflo微流体芯片上过夜(Atactic Technologies)。杂交使用含有25%的甲酰 胺的100 |xL 6xSSPE缓冲液(0.90 M NaCl, 60 mM Na2HP04， 6 mM EDTA， pH 6.8)，杂交温度34。C。杂交检测使用Cy3和Cy5特异性荧光标记、激光扫描仪 (GenePix 4000B, Molecular Device)采集杂交图象、Array-Pro(Media Cybernetics) 软件对杂交图像进行数字化转换。结果请见图2所示，当Cy3信号高于Cy5信 号时，色彩显示为绿色；当Cy3信号与Cy5信号相当时，色彩显示为黄色；当 Cy5信号高于Cy3信号时，色彩显示为红色。左图为ox-LDL刺激单核细胞0h、 6h;中间为ox-LDL剌激单核细胞0h、 12h;右图为ox-LDL刺激单核细胞6h、 12h。 然后进行的数据处理和分析首先扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然 后通过LOWESS (Locally-Weighted Regression)过滤进行标准化。将计算两种检 测信号的比值(log2)和t-test的p值。以p值<0.01定义显著差异性表达。数据 处理结果采用Hierarchical聚类分析。结果请见图3所示，其中纵轴代表不同种 miRNAs相对表达量；横轴代表ox-LDL剌激单核细胞的时间(6h、 12h)，数据 处理采用MeV MultiExperiment Viewer (Version 4.0 July 06， 2006).红色上调， 绿色下调，黑色没有变化。实施例3 检测证实miRNAs的差异表达并预测相应miRNAs可能的耙mRNA
由芯片筛选出的在ox-LDL炎症刺激6到12小时差异最为显著的5个miRNA 用tagman探针(Applied Biosystems, Foster City, CA)在7000反应仪上进行荧光定 量PCR验证，先用MuLV(Multiscribe)逆转录酶和特异引物逆转录，按说明书 配15-PL反应体系，设置循环参数16。 C30分钟，42。 C30分钟，85。 C 5分钟, 终止温度4° C.然后用RT产物，Taqman2X通用PCR Master Mix和含由引 物和特异探针的5X MicroRNA Assay Mix配制20- u L反应体系进行扩增，设置 循环参数95。 C10分钟，95° C 15秒变性退火扩增60° C60秒，40个循环， 重复3次。验证结果与芯片筛选完全吻合，原始CT值经过统计学处理，对0小 时，6小时，12小时作用组分别进行分析，其结果请见图4所示，显示 miR-146a,miR-146b國5p,miR画155， miR画9， miR誦125a-5p在0至U 6小时和0到12小 时有明显增加，改变倍数约在3到11倍左右，其中miR-125a-5p上调最为明显， T-TEST和ANOVE分析P值均小于0.01 ，有显著性差异。
权利要求
1、一种动脉粥样硬化炎症相关的miRNA的筛选方法，其包含如下步骤(1)利用ox-LDL刺激人原代单核细胞，诱导其分化成巨噬细胞和泡沫细胞；(2)应用microarray analysis技术，体外检测细胞miRNAs表达的差异，筛选出参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs；(3)用tagman探针荧光定量PCR验证，然后用数据库及计算机软件分析并筛选出miRNAs所对应的靶mRNA。
2、 如权利要求l所述的方法，在步骤(2)中，将样品RNA分离得到片段 小于300 nt的小RNA， Poly(A)聚合酶在分离得到的小RNA 3'端加上poly(A) 尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的 荧光标记，标记后的miRNAs与miRNAs芯片杂交筛选出参与动脉粥样硬化炎 症反应的miRNAs。
全文摘要
本发明通过选择ox-LDL(30ug/ml)作为刺激因子，刺激人原代单核细胞，诱导其分化成巨噬细胞和泡沫细胞，结合microarray analysis技术，体外检测细胞miRNAs表达的差异，筛选出可能参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs，然后用tagman探针荧光定量PCR验证，并用数据库及计算机软件分析并预测筛选出miRNAs所对应的可能靶mRNA，最大程度筛选出贴近动脉粥样硬化特异性炎症反应病理状态的miRNA，进一步完善动脉粥样硬化的形成机制，并为动脉粥样硬化、尤其急性冠脉事件的防治开辟新的治疗靶点和方法。
文档编号C12Q1/68GK101624618SQ20081004048
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者月 汪, 王连升, 王长谦, 婷 陈, 黄周青 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院