本发明涉及一种用于离体(exvivo)扩增非造血组织驻留γδt细胞的方法。术语“非造血组织驻留γδt细胞”是指驻留在非造血组织内而不是在淋巴器官和血液内的t淋巴细胞的亚群。这样的细胞包括非vδ2细胞，例如，vδ1、vδ3和vδ5细胞。本发明还涉及这些细胞在过继性t细胞治疗和在嵌合抗原受体疗法中的用途，以及它们在筛查检查点调节剂(checkpointmodulator)的方法中的用途。本发明还涉及作为非造血组织驻留γδt细胞的离体扩增的结果而产生的细胞。
背景技术：
在用于癌症的t细胞免疫治疗方面的兴趣日益增加，这些兴趣集中在cd8+(1-4)和cd4+αβ(5，6)t细胞亚群识别癌细胞和介导宿主保护功能潜能的明显能力上，特别是当由pd1(7，8)、ctla4(9，10)和其他受体(11)发挥的抑制途径的临床介导的拮抗作用而脱阻抑时。尽管如此，依然存在许多问题。例如，似乎有许多主要的临床情景，其中这种治疗的疗效似乎很差(11)；通常存在严重的不良事件(ae)(12)；预测效力或ae的能力非常有限(13)；并且对允许宿主感知肿瘤细胞的相互作用(所谓的“免疫原性”)的解释非常少，其必须优先于传统的抗原特异性cd8+和cd4+αβt细胞应答的激活。
在此方面，许多科学家和临床医生都以同样的方式重新评估γδt细胞的潜力，γδt细胞是具有体细胞生成受体(somatically-generatedreceptors)的淋巴细胞的第三谱系，其在进化上与αβt细胞和b细胞高度保守。实质上存在人γδt细胞的两个亚群：一个在人外周血中占优势，主要表达vδ2t细胞受体(tcr)；而另一个在非造血组织中占优势，大多数表达vδ1tcr，具有表达包含vδ3或vδ5链或一些其他非vδ2链的tcr的较小的群体(14)。
在大多数成人中，vδ2细胞在稳定状态下仅包含小的且高度可变的血液t细胞成分(0.01-5％)，但细胞迅速扩增，瞬时达到高达约25％的cd3+细胞，随后受到包括许多细菌和寄生虫的广谱试剂挑战(14)。该反应的主要基础是低分子量“磷酸部分”的vδ2tcr-介导的识别，包括羟基-甲基丁-2-烯基焦磷酸酯(hmbpp)(15)，其是合成胆固醇和合成用于修饰蛋白质(例如通过香叶基化或法尼基化)的其他脂质的关键微生物途径中的中间体。在灵长类中，这种合成通过甲羟戊酸(mevalonate)途径发生，其中一种中间体-异戊烯焦磷酸(ipp)在病毒感染的和转化的细胞中以非常高的水平表达，并且也是vδ2tcr介导的识别的靶标(16)。
此外，大多数vδ2t细胞表达高水平的nkg2d受体，其可以在接合nkg2d配体如mica、micb和ulbp时(与tcr一起)激活或共刺激细胞的细胞溶解潜力。那些配体是当细胞被暴露于如氧化性的试剂或渗透性应激或紫外线时上调的宿主蛋白质。这些试剂促进表皮生长因子受体(egfr)途径的超活性信号转导，其通常在人实体瘤中也是失调的(17)。
vδ2t细胞使用它们的tcr和/或nkg2d检测转化细胞的能力(18-20)、连同它们强大的细胞溶解能力以及将抗原呈递给cd8+t细胞的明显潜力(21)，已经共同引发了vδ2t细胞可能在临床上被用来递送癌症免疫治疗的观点。这可以通过细胞过继转移来实现，其中认为γδt细胞的衰竭被mhc限制显著且有利地限制了移植物抗宿主病(gvhd)的可能性(22)。为了实现这一点，可以通过添加细胞因子如白介素(il)-2，连同外源性tcr激活剂如磷酸部分(例如，brhpp)，或连同抑制甲羟戊酸途径中的法尼基焦磷酸合成酶的临床批准的双膦酸(例如，唑来膦酸)来离体扩增血液驻留vγ9vδ2γδt细胞，从而诱导tcr激活部分ipp的累积。然而，通过诸如brhpp的试剂对vγ9vδ2细胞的慢性激活可以逐渐导致细胞耗尽并降低细胞毒性的可能性。
可替代地，可以使用hmbpp的药理学修饰形式或临床批准的氨基双膦酸原位激活患者自身的γδt细胞。通过这些方法，超过250名癌症患者得到了治疗，看似安全，但仅有极少完全缓解的发生率。关于细胞有限的临床疗效的一个主要问题是它们变为由慢性抗原暴露不能恢复地耗尽的倾向性。第二个主要问题是它们在归巢于实体瘤和包容这些肿瘤的组织时看起来效率低下(23)。
嵌合抗原受体t细胞(car-t)治疗显示出在针对b细胞恶性肿瘤的临床中的前景。然而，就治疗实体瘤而言，迄今为止car-t细胞的表现一直低于预期，表现出在诱导完全肿瘤应答方面的较低效力和脱靶(off-tumour)细胞毒性的高发生率(24)。对于外周血γδt细胞，实体瘤的car-t方法成功的主要障碍可能性是全身car-t细胞迁移至恶性肿瘤部位并以功能有效状态驻留其中的效率低下(25)。此外，由于基于常规αβt细胞，car-t细胞必须克服肿瘤微环境中的免疫抑制信号，例如，通过pd1受体传递的那些。
可能有与使用针对car-t方法的γδt细胞相关的优势，因为可以用肿瘤反应性嵌合抗原特异性tcr转导它们，同时保留它们使用受体如nkg2d识别转化细胞的先天能力。因此，它们可能同时施加肿瘤适应性(tcr)和先天性(nkg2d)介导的效应。然而，仍然存在人血液γδt细胞在归巢至固体组织内的肿瘤并且在其中保持活性形式时看起来效率低的问题。这一考虑因素激发了对通常存在于非造血组织中的γδt细胞的更详细的考虑。
作为它们的发展的一部分，这样的t细胞迁移到非造血组织并且因此与那些t细胞不同，那些t细胞例如在全身性引发后浸润组织的组织驻留tcrαβ+记忆t细胞(所谓的trm细胞)。组织驻留γδt细胞在小鼠中得到最充分的研究，其中它们已被证明在皮肤、肠道和生殖组织以及其他部位普遍存在。已证实许多此类细胞具有先天样(innate-like)功能性潜能，借此它们可以通过激活nkg2d受体来响应于挑战。本发明人最近获得的数据表明，人皮肤和肠同样拥有具有先天样活性的非造血组织驻留γδt细胞的大区室。然而令人惊讶的是，在非造血组织内形成的恶性肿瘤、炎症、特应性疾病、变态反应和其他病理学的研究很大程度上未能考虑驻留在其中发生病理损害的组织中的这些先天样人t细胞的潜在影响。
驻留在非造血组织中的人γδt细胞被研究得很少，这是由于它们的定位使得细胞更难以取样，并且因为尚未建立培养它们的手段。在可获得的相对稀少的信息中，该亚型包含具有非mhc限制性细胞溶解潜能的多样性细胞，由于它们不表达含有vγ2的tcr，因此它们与低分子量磷酸部分是完全不反应的。尽管对于这些细胞已知很少精确的tcr特异性，但可获得的数据表明，细胞对自体抗原是反应性的，自体抗原例如是由巨细胞病毒(cmv)感染的细胞和许多实体瘤过度表达的内皮蛋白c受体(epcr)(32)。非造血组织相关的γδt细胞也通常表达nkg2d(14)。鉴于这些性质以及细胞在非造血组织如皮肤和肠道内的生理学驻留，将这些细胞过继转移给癌症患者可能在靶向实体肿瘤和潜在的其他免疫病理学方面更有效。
为了开发用于免疫疗法的非vδ2细胞，需要原位扩增细胞或收集它们并在再输注前离体扩增它们的手段。已经采用后一种方法，因为没有已知的tcr激活剂具有证实的原位扩增大量非vδ2细胞的能力。为了克服非造血组织的有限可用性的挑战，一些研究人员试图从血液(其中vδ2表达性细胞是优势子集)中扩增极少量的非vδ2细胞，做出假设即这些细胞等同于组织驻留型非vδ2细胞。血液中发现的少量的非vδ2γδt细胞在活性cmv感染期间显著扩增，通过与vδ2t细胞相比，显示出对cmv的优异反应性，并且在子宫内的cmv感染的情况下似乎能够保护人胎。此外，cmv反应性非vδ2γδt细胞似乎在免疫抑制期间保护移植患者免于cmv重新激活，并且通过与转化的细胞的交叉反应性降低了继发性恶性肿瘤的风险(26)。类似地，有数据表明γδt细胞在控制hiv感染方面发挥有益作用，其中例如非vδ2γδt细胞相对于vδ2t细胞在血液中扩增(24)。
通过添加直接激活tcr信号传导的外源性试剂(例如，通过使用诸如抗cd3抗体、泛γδ-tcr特异性抗体或植物血球凝集素(pha)的试剂)，或通过将经刺激的非vδ2t细胞与人工抗原呈递细胞(aapc)共培养，在离体扩增血液驻留型非vδ2细胞，共培养中γδt细胞和aapc之间的直接接触是离体非vδ2t细胞扩增所需要的(41-44)。可替代地，已经通过使用固定化重组mica(nkg2d配体)促进nkg2d受体信号传导来扩增细胞，例如，如用于维持来自上皮癌浸润淋巴细胞(til)的离体γδt细胞培养物的增殖(28)。总之，离体扩增vδ2表达性血液γδt细胞或非vδ2血液γδt细胞的现有方法需要添加试剂，总是促进tcr和/或nkg2d受体与补充细胞因子如白细胞介素-2(il-2)(41-44)的激活。受体激活信号和细胞因子的这种组合反映了社会上广泛采用的培养和扩增t细胞的标准方法。迄今为止，还没有描述任何方法以显著扩增驻留在非造血组织中的γδt细胞。此处描述了这种方法。
技术实现要素：
作为人皮肤t细胞的表型和功能表征的一部分，本发明人已分离出通常驻留在非造血组织中并且具有相对于αβt细胞和血液驻留型γδt细胞的独特性质的独特和大量的γδt细胞。本发明人已经发现，细胞显示对nkg2d配体和细胞因子的强烈的、tcr非依赖性的先天样反应。鉴于扩增原代αβt细胞的努力通常采用与其他支持细胞共同培养作为有益生长因子(29)的来源，本发明人出乎意料地证实，通过将驻留在皮肤和其他非造血组织中的γδt细胞与自体真皮成纤维细胞和潜在的其他基质组分如角质形成细胞和内皮细胞接触来共培养，这些驻留在皮肤和其他非造血组织中的γδt细胞被深度和特异性地抑制。这种相互作用的减轻允许细胞大量快速扩增以用于潜在的临床应用。
此外，与迄今为止扩增血液来源的和肿瘤来源的γδt细胞的努力相反，本发明人已证实，这种非造血组织驻留γδt细胞可被扩增而无需有意添加任何激活其tcr或nkg2d信号传导途径的外源性试剂。
本文公开了有效且可重复地从人类或非人类动物非造血组织如皮肤和肠中分离和扩增γδt细胞的新的手段。通过破坏非造血组织来源的非vδ2t细胞与自体成纤维细胞和潜在的其他基质成分的接触来促进扩增，并通过在白细胞介素-2(il-2)和/或白细胞介素-15(il-15)中培养保持扩增。
扩增是高度选择性的，因为αβt细胞或vδ2表达性t细胞或nk细胞的扩增不是通过破坏它们与自体成纤维细胞的接触而诱导的(图3a、图3c和图3d)。通过从成纤维细胞介导的检查点调节释放的非造血组织驻留γδt细胞的这种扩增也导致细胞效应物电位的“自发”激活(图5a和图5b)，这在抗肿瘤活性的情况下是非常期望的。这些开发允许非造血组织驻留γδt细胞在培养物中扩增并被激活以潜在用作对患者的“现成的”细胞输注。同时，通过成纤维细胞(或其他基质细胞或上皮细胞)开发抗体或其他形式的组织驻留γδt细胞的检查点调节抑制剂应允许通过检查点阻滞原位激活非造血组织驻留γδt细胞，例如在癌症患者中。
从非造血组织(例如，皮肤)获得和生长γδt细胞的能力已识别出与血液来源的vδ1t细胞的明显不同。例如，皮肤来源的vδ1t细胞显示出先前的t细胞激活的标志物，例如cd69表达、icos和tim3阳性以及经典共刺激分子cd28的很少或不表达(图10a)。此外，它们显示nkg2d的高表达。相比之下，源自人血液的vδ1t细胞不表达cd69或tim3，仅表达低水平的icos，并且对于cd28的表达在一定程度上也是阳性的。此外，在不存在t细胞受体的刺激的情况下，血液来源的vδ1t细胞的nkg2d表达与皮肤来源的vδ1t细胞的表达相比要低得多，而皮肤来源的vδ1t细胞显示出对nkg2d配体如重组mica的先天样反应，血液来源的vδ1t细胞则不是(图10b)。如本文所述的来自非造血组织的γδt细胞也可以显示出相对于血液来源的vδ1t细胞和其他淋巴细胞的群体的增加的ccr3、cd39、cd11b、il-13和/或cd9的表达。
在第一方面中，本发明提供了一种用于体外扩增非造血组织驻留γδt细胞的方法，方法包括在il-2和/或白细胞介素-15(il-15)的存在下培养从人或非人动物的非造血组织获得的淋巴细胞，其中在培养期间淋巴细胞不与基质细胞或上皮细胞直接接触。
优选地，在培养期间淋巴细胞不与成纤维细胞直接接触。
γδt细胞通常在体内驻留在非造血组织中。
优选地，该方法包括在il-2和il-15的存在下培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。
在一些实施方式中，可以在不存在诱导t细胞激活的tcr激活剂或共刺激剂的情况下培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。例如，可以在存在或不存在cd28激活剂的情况下，在不存在tcr途径激动剂的情况下培养淋巴细胞，tcr途径激动剂如cd3激活剂，例如抗cd3抗体。
对于使用本发明的方法扩增非造血组织驻留γδt细胞，不需要添加这种tcr信号传导的外源激活剂。因此，用于本发明的方法中的合适的γδ扩增培养基可以缺乏t细胞激活活性，例如αβt细胞或血液γδt细胞激活活性，并且可能不激活或共刺激tcr。
例如，γδ扩增培养基可以不包含或基本上不包含激活t细胞信号传导的试剂或因子，例如tcr激活剂或共刺激剂，包括外源添加的tcr途径激动剂。γδ扩增培养基可以包含il-2和/或il-15。在一些实施方式中，除了il-2和/或il-15之外，γδ扩增培养基可以包含一种或多种另外的生长因子，例如细胞因子。合适的生长因子不显示t细胞激活活性。在其他实施方式中，γδ扩增培养基可以不包含除il-2和/或il-15以外的生长因子；例如γδ扩增培养基可以由补充有il-2和/或il-15的基础培养基组成。
在一个实施方式中，可以在不存在基质细胞或上皮细胞的情况下培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。例如，可以在培养之前去除基质细胞或上皮细胞。优选地，可以在不存在成纤维细胞的情况下培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。例如，可以在培养之前去除成纤维细胞。
可以从任何合适的人或非人动物非造血组织如皮肤、胃肠道(例如，结肠或回肠)、乳腺组织、肺、肝、胰腺、脂肪组织或前列腺获得淋巴细胞。
非造血组织驻留γδt细胞优选为非vδ2细胞，最常见的是表达含有vδ1链的tcr，即vδ1细胞。非造血组织驻留γδt细胞还可包括所谓的双阴性(dn)γδt细胞，其被定义为表达既不包含vδ1也不包含vδ2链的γδtcr。
该方法可选地包括从人或非人动物非造血组织获得淋巴细胞的步骤。例如，可以从人或非人动物非造血组织的样品获得淋巴细胞。一种方法可包括提供人或非人动物非造血组织样品，并从所述样品的非造血细胞分离淋巴细胞以产生基本上不包含基质细胞的淋巴细胞的群体。
第二方面，本发明提供了一种用于扩增γδt细胞的方法，方法包括(i)提供从非造血组织获得的γδt细胞的群体；和(ii)培养基本上不包含基质细胞接触的γδt细胞以产生扩增的γδt细胞的群体。
从非造血组织获得的γδt细胞的群体可以是基本上纯的γδt细胞的群体。
从非造血组织获得的γδt细胞的群体优选为非vδ2细胞，最通常地表达含有vδ1链的tcr，即vδ1细胞。γδt细胞的群体也可以包含dnγδt细胞。
从非造血组织获得的γδt细胞的群体可以表达一种或多种另外的组织驻留γδt细胞标志物，如cla、il13、ccl1、cd103和ccr8。在一些实施方式中，从非造血组织获得的γδt细胞的群体可以包含vδ1+ccr8+γδt细胞。
可以在不与基质细胞接触的情况下培养γδt细胞以产生扩增的γδt细胞的群体(即，细胞培养物中的γδt细胞和基质细胞之间不存在接触)。
可以在不存在tcr激活信号或共刺激信号的情况下培养γδt细胞。在一些实施方式中，可以在基质细胞条件培养基(stromalcell-conditionedmedium)中或在il-2、il-15或它们的组合的存在下进行培养步骤。例如，可以在包含il-2和/或il-15的γδ扩增培养基中培养γδt细胞。合适的γδ扩增培养基不能激活或共刺激tcr。例如，γδ扩增培养基可以不包含或基本上不包含激活t细胞信号传导的试剂或因子，例如tcr激活剂或共刺激剂，包括tcr途径激动剂。γδ扩增培养基可以包含il-2和/或il-15。在一些实施方式中，除了il-2和/或il-15之外，γδ扩增培养基可以包含一种或多种另外的生长因子，例如细胞因子。合适的生长因子不显示t细胞激活活性。在其他实施方式中，γδ扩增培养基可以不包含除il-2和/或il-15以外的生长因子；例如γδ扩增培养基可以由补充有il-2和/或il-15的基础培养基组成。
第三方面中，本发明提供了一种扩增γδt细胞的方法，包括：(i)提供非造血组织，该组织包含非造血细胞和γδt细胞；(ii)将γδt细胞与非造血细胞分离以产生基本上不包含基质细胞的包含γδt细胞的群体；(iii)在不存在tcr激活信号或共刺激信号的情况下培养步骤(ii)的群体以产生扩增的γδt细胞的群体。
例如，γδt细胞可以从αβt细胞分离。
步骤(ii)的群体可以是基本上纯的γδt细胞的群体。
步骤(ii)的群体中的γδt细胞可以包含非vδ2γδt细胞，最常见地表达含有vδ1链的tcr，即vδ1γδt细胞。步骤(ii)的群体中的γδt细胞还可以包含dnγδt细胞。
步骤(ii)的群体中的γδt细胞还可以包含表达一种或多种另外的组织驻留γδt细胞标志物如cla、cd103和ccr8的γδt细胞。在一些实施方式中，步骤(ii)的群体中的γδt细胞可以包含vδ1+ccr8+γδt细胞。
步骤(iii)的培养可以基本上不包含与步骤(ii)的群体接触的基质细胞和/或在不存在tcr激活信号或共刺激信号的情况下。例如，可以在γδt细胞和基质细胞之间没有接触的情况下进行培养。在一些实施方式中，步骤(iii)的培养在基质细胞条件培养基中或在il-2、il-15或它们的组合的存在下进行。
在一些实施方式中，可以在包含il-2和/或il-15的γδ扩增培养基中培养γδt细胞。合适的γδ扩增培养基不能激活或共刺激tcr。例如，γδ扩增培养基可以不包含或基本上不包含激活t细胞信号传导的试剂或因子，例如tcr激活剂或共刺激剂，例如tcr途径激动剂。在一些实施方式中，除了il-2和/或il-15之外，γδ扩增培养基可以包含一种或多种另外的生长因子，例如细胞因子。合适的生长因子不显示t细胞激活活性。在其他实施方式中，γδ扩增培养基可以由补充有il-2和/或il-15的基础培养基组成。
根据第二或第三方面的扩增的γδt细胞的群体可以包含从非造血组织获得的或从非造血组织分离的γδt细胞的至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或至少10000倍的γδt细胞。扩增群体可以在培养的3天、5天、7天、10天、14天、21天或28天内产生。
扩增群体中的γδt细胞优选为vδ2-t细胞。γδt的扩增细胞的群体可以包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的vδ1+细胞。γδt细胞的扩增的群体对于ccr4、ccr8和cd103中的一个、两个或全部三个可以是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％阳性。例如，扩增群体对于cd103可以是至少10％阳性，对于ccr4可以是至少30％阳性并且对于ccr8可以是至少60％阳性。
在第四方面中，本发明提供了通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞或其群体。
在第五方面中，本发明提供了一种筛选非造血组织驻留γδt细胞的检查点调节剂的方法，该方法包括：
(i)在存在和不存在测试化合物的情况下与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)直接接触体外培养非造血组织驻留γδt细胞，或与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)直接接触体外培养非造血组织驻留γδt细胞，其中γδt细胞内和/或基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)中的测试基因的表达改变；和
(ii)在存在和不存在测试化合物的情况下或在存在和不存在测试基因在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中的表达改变的情况下测定非造血组织的γδt细胞的增殖或激活的速率，或者在存在和不存在测试化合物的情况下或在存在和不存在测试基因在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中的表达改变的情况下测定杀伤基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)的速率，
其中如果t细胞的增殖或激活的速率在存在测试化合物的情况下比不存在测试化合物的情况下更高，或在存在测试基因在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中的表达改变的情况下比在不存在测试基因在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中的改变的情况下更高，和/或如果基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)的杀伤速率在存在测试化合物的情况下比不存在测试化合物的情况下更高，或在存在测试基因在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中的表达改变的情况下比在不存在测试基因在成纤维细胞和/或γδt细胞中的改变的情况下更高，则测试化合物可能是检查点调节剂或测试基因可能是候选检查点基因或其调节剂。
例如，可以通过rna靶向试剂如小干扰rna(sirna)或小发夹rna(shrna)或通过基因编辑，例如使用crispr/cas系统改变γδ细胞中和/或基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)内的测试基因的表达。
在第六方面中，本发明提供了一种通过继承性t细胞疗法来治疗受试者的方法，其中方法包括向有需要的受试者施用通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞。受试者优选是人。
受试者优选是人癌症患者或病毒感染患者，例如，cmv感染患者或hiv感染患者。
在第七方面中，本发明提供了用于在通过过继性t细胞疗法治疗人或非人动物的方法中使用的通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞。非造血组织驻留γδt细胞可以具有以下性质中的一种或多种：
(i)表现出表型cd69高、icos高、tim3高和cd28低/缺乏
(ii)上调ccr3、cd11b、cd9和cd39中的一种或多种，
(iii)在不存在tcr激动剂的情况下响应nkg2d配体产生ifn-γ，
(iv)在不存在tcr激动剂的情况下产生il-13，
(v)响应tcr激活而产生ifn-γ、tnf-α和gm-csf中的一种或多种，
(vi)响应tcr激活而不产生或基本上不产生il-17，
(vii)在含有il-2而没有另外的生长因子的培养基中生长，
(viii)在不存在tcr激动剂的情况下显示细胞毒性t细胞应答，和/或
(ix)显示相对于正常细胞针对肿瘤细胞的选择性细胞毒性。
在一个优选的实施方式中，人是人癌症患者或病毒感染患者，例如，cmv感染或hiv感染的患者，其中cmv或hiv感染是mica相关的。
在第八方面中，本发明提供了一种通过嵌合抗原受体疗法来治疗受试者的方法，方法包括向有需要的受试者施用通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞。受试者优选是人。
在一个优选的实施方式中，受试者是人癌症患者。
在第九方面中，本发明提供了用于在通过嵌合抗原受体疗法治疗人或非人动物的方法中使用的通过本发明的第一、第二或第三方面的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞。
在一个优选的实施方式中，人是人癌症患者。
可以将上述每个实施方式与任何其他实施方式中的任何一个或多个组合。
下面进一步详细描述本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1a-图1d示出人皮肤包含显著的驻留γδt细胞的群体。图1a：使用由clark等人(29)发表的“clark方案(theclarkprotocol)”的器官型细胞培养物分离皮肤驻留淋巴细胞。在cd45+细胞内，使用抗cd3来染色t细胞并使用抗cd56抗体以分别识别nk细胞、cd3-cd56+。在cd3+细胞内，使用抗泛γδt细胞受体的抗体来识别皮肤驻留γδt细胞并使用抗cd8α以识别cd3+、泛γδtcr-门内的常规cd4和cd8阳性αβt细胞的比例。图1b示出了使用clark方案的对于7-10位供体的这些实验的总结。使用该方案，人类皮肤内的淋巴细胞仍与真皮成纤维细胞接触，并且完全没有补充细胞因子或者补充有白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-15(il-15)或者il-2和il-15，表明当将培养基补充有il-15或il-2和il-15时，除了稍微更大的γδt细胞的群体之外，使用细胞因子不改变皮肤驻留淋巴细胞组成，验证clark等人的方案。使用细胞因子示出3周器官型皮肤培养后的淋巴细胞组成，其示出为4个供体的总结。图1c：皮肤驻留γδ细胞主要包含表达vδ1的γδt细胞(76.24％±17.3)，小群体的表达vδ2的t细胞(3.06％±6,1)和对vδ1或vδ2为染色阴性的泛-γδtcr阳性细胞的群体，在本文中也称为双阴性(dn)γδt细胞(20.7％±13.97)。健康志愿者的血液的对照染色示出人γδt细胞的强区室化，因为在血液中γδt细胞的优势群体表达vδ2tcr链。图1d：皮肤驻留γδt细胞示出先前与已被慢性激活的t细胞相关的标志物，尽管这些标志物是组织驻留的签名指示物，但不一定反映慢性激活。直方图示出γδt细胞上的指示的标志物(实心直方图)与每种抗体的合适同种型对照(空心直方图)的染色。
图2a至图2d示出通过clark方案直接来源于人皮肤的皮肤驻留γδt细胞在通过用于激活t细胞的常规手段激活时示出所谓的th1-偏向响应，并且同样在由单独的nkg2d配体激活时示出th1-偏向响应。图2a：皮肤驻留γδt细胞表现出激活性和nk细胞相关受体nkg2d的强表达(实心直方图，相比于空心直方图表示的同种型)。在使用板结合的重组mica(nkg2d受体的已知配体之一)激活后，皮肤γδt细胞在没有任何其它刺激的情况下响应并且独立于tcr连接，因为在存在阻断nkg2d抗体的情况下应答被废止。将细胞在布雷菲德菌素a和100单位的il-2/ml存在下刺激6小时，随后通过染色cd107a来分析脱粒。在表面染色和随后细胞内细胞因子染色后，通过透化(permeabilisation)分析tnfα和inf-γ的产生。将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(p)与离子霉素(i)组合用作用于激活t细胞的阳性对照。图2b：皮肤驻留γδt细胞示出th1偏向响应。使用clark方案恢复γδt细胞并在布雷菲德菌素a存在下用pma和离子霉素刺激6小时并对细胞内细胞因子染色。从人皮肤新鲜分离的γδt细胞在刺激后产生tnfα和ifn-γ，但只有少量或不可检测量的细胞因子，例如与th2或th-17细胞相关的il-4、il-17a、il-13、il-22，而常规的cd4+αβt细胞示出更广泛的各种细胞因子产生。图2c：在直接来源于人皮肤的淋巴细胞中，由γδt细胞、cd8a+常规αβt细胞和nk细胞表达不同水平的nkg2d受体。在这些细胞中，nk细胞响应于暴露于单独的nkg2d配体，但在t细胞内，只有γδt细胞的群体在没有任何tcr刺激的情况下用nkg2d配体刺激时示出细胞因子反应(参见上列的流式细胞术点状图)。使用可溶性阻断性抗-nkg2d抗体可以阻断该反应，表明反应仅通过nkg2d受体介导。图2d：在皮肤驻留γδt细胞中，只有vδ1和dnγδt细胞示出由单独的重组mica激活的先天样潜能(由*表示)。在皮肤内发现少量的表达vδ2的t细胞不示出这种反应。
图3a-图3d示出皮肤驻留γδt细胞排他地响应于具有强激活和增殖的真皮基质的分离。图3a：使用clark方案分离皮肤驻留淋巴细胞。在3周的器官型培养后，收获皮肤淋巴细胞并与包括成纤维细胞在内的任何残余皮肤细胞分离，并以1百万个淋巴细胞/ml的密度放入组织培养孔中并补充100u/ml的il-2。再另外3周后，驻留γδt细胞已强烈扩增并富集在皮肤淋巴细胞培养物内。这种强烈的增殖现象是皮肤驻留γδt细胞所独有的，以大部分vδ1+t细胞为代表，其在3周内增殖平均127.18倍，而常规αβt细胞仅增殖平均5.21倍；这正好少了20倍。图3b：皮肤驻留vδ1+t细胞通过在14天内强烈上调标志物ki-67(指示细胞周期)而响应于组织损失(同种型对照由以虚线包围的空白直方图表示；在第0天的ki-67表达由空白直方图表示；第7天的ki-67表达由浅灰色直方图表示；第14天染色的ki-67表达由深灰色直方图表示)。此外，当与真皮基质接触时，大部分对il-2受体α(cd25)呈阴性的皮肤驻留vδ1t细胞在从组织分离后上调cd25(同种型对照：虚线直方图，第0天染色：浅灰色直方图，第7天染色：深灰色直方图)。
图3c：如由ki-67的中值荧光强度(mfi)所指示的高细胞周期率仅在以vδ1+t细胞为代表的皮肤驻留γδt细胞中可见，并且在常规αβt细胞和nk细胞中均未见到，其中mfi实际上下降了14天。图3d：在3周培养后，与基质细胞隔离的皮肤淋巴细胞示出强烈富集的驻留γδt细胞的群体。该γδt细胞的群体含有大部分vδ1阳性细胞(77.49％±17.04)和泛γδtcr阳性dnt细胞(21.46％±16.92)。在使用clark方案新鲜收获的皮肤淋巴细胞中观察到的最初的小vδ2t细胞的群体在组织γδt细胞扩增3周后减少并且几乎丧失(0.6％±1.204)。
图4a和图4b示出了皮肤驻留γδt细胞对组织损失的应答，并且通过皮肤基质细胞特别是成纤维细胞通过接触依赖性机制保持检查。图4a：在3周后，按照clark方案在器官型培养后收获混合的皮肤淋巴细胞。然后，将混合的淋巴细胞接种在自体皮肤成纤维细胞的融合层顶上并在transwell中以控制由成纤维细胞产生的可溶性抑制剂的存在。在14天后，针对γδt细胞和常规αβt细胞，测量通过存在的绝对细胞计数计算的逐倍增长。当从组织分离时并在成纤维细胞的存在下，但只有当不与自体成纤维细胞直接接触时，皮肤驻留γδt细胞示出强烈的增殖反应。常规αβt细胞在任何测试的条件下都没有示出这种反应。图4b：将从器官型培养获得的混合淋巴细胞接种到单层自体成纤维细胞(浅灰色直方图)上或接种到补充有il-2的空孔(深灰色直方图)中并培养7天。在成纤维细胞的直接存在下，皮肤驻留vδ1+t细胞(左图)以及泛γδtcr+、dnt细胞(右图)保持静止，但当与真皮器官型培养基隔离并且不存在成纤维细胞时表现出强激活，如由cd25、th相关转录因子t-bet和细胞周期标志物ki-67的上调表达(mfi)所示的(虚线，空白直方图表示相应的同种型对照)。
图5a和图5b示出扩增的皮肤γδt细胞表现去抑制和获得强细胞毒性潜力的迹象。图5a：在与器官型细胞培养物隔离后，允许皮肤驻留γδt细胞扩增14天。然后，通过排除用泛αβtcr单克隆抗体染色的所有常规t细胞，将γδt细胞负性流式细胞术分选。然后，将150,000个分选的γδt细胞一式两份地接种到96平板孔培养板中，并且在没有细胞因子补充也没有补充任何激活配体的培养基中放置24小时。收获上清液并使用affymetrix
图6a-图6d示出了人类肠道中的组织驻留γδt细胞的分析。图6a：clark方案的改写允许分离肠道驻留淋巴细胞。混合的肠道淋巴细胞含有大群体的通常主要包含vδ1细胞的组织驻留γδt细胞，但也含有vδ2和双阴性γδt细胞。图6b：从肠器官型培养物分离的γδt细胞示出对皮肤来源的γδt细胞的类似的反应，因为一旦它们与肠道基质隔离，它们就随着时间上调ki-67。图6c：如通过cd107a上调所测量的，肠道来源的γδt细胞通过产生ifn-γ和通过脱粒对诸如重组mica的先天样刺激产生应答。图6d：从肠道器官型培养物中分离的γδt细胞示出与皮肤来源的γδt细胞类似的反应，并在细胞培养物中随时间扩增，如通过与肠道基质缺乏接触的淋巴细胞培养物的总体富集所见。
图7a和图7b示出了扩增的皮肤来源的γδt细胞的组织表型。图7a：皮肤来源的γδt细胞对皮肤淋巴细胞抗原(cla)、皮肤归巢趋化因子受体ccr4和ccr8呈阳性染色。图7b：表达水平分别在来源于皮肤或血液的扩增的γδt细胞上不同。
图8示出，在没有任何tcr刺激的情况下，皮肤来源的γδt细胞的去抑制导致自发性th-1细胞因子产生，并且有趣地是，与新鲜的tcr激活的γδt细胞相反，在特应性细胞因子il-13的产生中。与新鲜来源的γδt细胞一致，去抑制和扩增的γδt细胞产生可忽略的量的th-2相关细胞因子，例如，il-4和il-5。允许皮肤来源的γδt细胞扩增14天，并通过排除常规αβt细胞来负性分选。对于4个供体在96孔平板孔中以100万个细胞/ml的密度一式二份培养150,000个混合的γδt细胞，没有任何刺激或细胞因子补充。24小时后收集上清液并通过affymetrix使用基于
图9a至图9c示出了扩增和负性分选的皮肤来源的γδt细胞对与它们共同培养的各种人肿瘤细胞系示出强的细胞毒性(图9a：hct1954，图9b：hct116，图9c：md231)，如通过使用elisa的靶细胞释放半胱天冬酶切割的细胞角蛋白18所测量的。
图10a和图10b示出了新鲜的未扩增的皮肤来源的vδ1t细胞示出了先前的t细胞激活的标志物。图10a：皮肤来源的vδ1t细胞表达高cd69、icos和tim3和低cd28。此外，它们示出激活的标志物nkg2d的高表达。该表型在体外扩增期间由皮肤来源的vδ1t细胞维持。相比之下，来源于人血的vδ1t细胞缺乏这些激活迹象，不表达cd69或tim3，并且仅表达较小水平的icos。与皮肤来源的vδ1t细胞相比，血液来源的vδ1t细胞上的nkg2d表达低得多，而血液来源的vδ1t细胞表达共刺激性分子cd28。图10b：在没有任何其他刺激物如t细胞受体配体的情况下，只有皮肤来源的vδ1t细胞对nkg2d配体如重组mica有反应性。血液来源的vδ1或vδ2t细胞不示出对先天样刺激的这种反应性。如所示的，将细胞接种到具有重组mica或抗cd3抗体或两者的96孔板中。将细胞在il-2100u/ml中培养超过6小时，并且bfa在最后4小时中，然后是针对ifn-γ的表面抗原染色、透化和细胞内染色。
图11示出皮肤来源的vδ1t细胞表达较低水平的cd16，但示出高亲和性igg受体cd64的大量表达。因此，除了直接的细胞毒活性之外，组织来源的vδ1t细胞也可以用于增加单克隆抗体疗法如cd20或her2疗法的功效，因为它们将被抗体引导至恶性肿瘤和转移瘤的侧面，识别调理的肿瘤细胞并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)杀伤它们。示出的结果来自(四位)中的一位代表性供体。
图12示出il-2(左图)、il-15(中图)和il-2+il-5(右图)中的vδ1t细胞的扩增。将新鲜分离的皮肤来源的淋巴细胞在含有10％的fcs和1％的pen/strep并分别补充il-2、il-15或il-2+il-15的rpmi培养基中在96孔平底板中培养7天。与在不存在任何基质细胞的情况下的同种型(真阴性)染色相比，如ki-67染色的变化所指示的，il-2和il-15以及两种细胞因子的组合都诱导vδ1t细胞的增殖。ki-67仅染色已经离开细胞周期的g0并且通常与增殖相关的细胞。
图13示出流式细胞术结果，其示出在第21天扩增的vδ1γδt细胞表面上的cd9、ccr3和cd39的表达。如通过(黑色直方图)与等效同种型染色(真阴性，开放直方图)所示，扩增的皮肤来源的vδ1t细胞维持高水平的细胞表面标志物，ccr3、cd39和cd9。
图14示出皮肤来源的vδ1t细胞(深色条)和血液来源的vδ1t细胞(浅色条)中的ccr3和cd9的mrna表达。如本文所公开的，扩增皮肤来源的vδ1t细胞，并且使用针对vδt细胞受体(20μg/ml)的平板结合抗体扩增血液来源的vδ1t细胞。在扩增后，使用荧光激活细胞分选(facs)分离vδ1t细胞，对于两组(血液＝灰色与皮肤＝黑色)从3个供体分离rna。对整个mrna测序，并将所示mrna的表达水平归一化并log2转化。所有表达水平都以直接比较的方式并且与gapdh的比例的方式示出，在大多数人类细胞中以高水平表达常见看家基因。
图15示出皮肤来源的vδ1t细胞(深色条)和血液来源的vδ1t细胞(浅色条)中的il-13的mrna表达。如本文所公开的，扩增皮肤来源的vδ1t细胞，并且使用针对vδt细胞受体的平板结合高剂量抗体(20μg/ml)扩增血液来源的vδ1t细胞。在扩增后，使用facs分离vδ1t细胞，对于两组(血液＝灰色与皮肤＝黑色)从3个供体分离rna。对整个mrna测序，并将il-13的mrna的表达水平归一化并log2转化。以直接比较的形式并且以与gapdh的比例形式示出表达水平。
图16a和图16b示出用pma/离子霉素(图16a)或抗-cd3(图16b)进行tcr刺激后的皮肤来源的vδ1t细胞中的细胞因子的产生。分离和扩增后，使用荧光激活细胞分选(facs)纯化皮肤来源的vδ1t细胞。对3个供体一式两份地将150.000个vδ1t细胞接种到96孔平底板中，并用平板结合的抗cd3(5μg/ml)或pma/离子霉素刺激24小时。使用
具体实施方式
γδt细胞(γδt细胞)代表t细胞的小子集，在其表面上表达了不同的、典型的(defining)t细胞受体(tcr)。该tcr由一个γ(gamma)和一个δ(delta)链组成。
人γδt细胞有两种主要亚型：一种在外周血中占优势，而另一种在非造血组织中占优势。
第二种人类γδt细胞亚型的非造血组织定位使其更难以采样，并且还没有确定的培养细胞的手段。为了满足这种需要，本发明涉及一种扩增非造血组织驻留γδt细胞(可替代地在本文中称为非造血组织天然γδt细胞)的方法。这些γδt细胞通常驻留在非造血组织中。如在本文中所描述的，使用的非造血组织驻留γδt细胞可以源自或获自非造血组织。非造血组织可能含有非造血细胞和γδt细胞。
本文所描述的方法提供了从可以从患者取出的任何人或非人动物非造血组织扩增γδt细胞的手段，非造血组织包括皮肤、胃肠道(例如，结肠)、乳腺组织、肺、前列腺、肝脏、脾脏和胰腺。γδt细胞也可以驻留在人癌症组织中，例如，乳腺和前列腺的肿瘤。在一些实施方式中，γδt细胞可以来自人癌症组织。在其他实施方式中，γδt细胞可以来自除人癌症组织之外的非造血组织。
在血液中占优势的γδt细胞主要是vδ2t细胞，而在非造血组织中占优势的γδt细胞主要是vδ1t细胞，使得vδ1t细胞包括约70-80％的非造血组织驻留γδt细胞的群体。然而，在非造血组织中，例如，在肠道中也发现了一些vδ2t细胞，其中它们可以包含约10-20％的γδt细胞(图6)。一些驻留在非造血组织中的γδt细胞既不表达vδ1也不表达vδ2tcr，我们将其命名为双阴性(dn)γδt细胞。这些dnγδt细胞很可能主要是表达vδ3的t细胞，其中少数是表达vδ5的t细胞。
因此，通常驻留在非造血组织中并且通过本发明的方法扩增的γδt细胞优选为非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞，包含少量的dnγδt细胞。
如本文所使用的，“双阴性”γδt细胞(dnγδt细胞)是指表达γδ受体(即，对泛-tcr阳性的染色)但对vδ1和vδ2受体呈阴性的γδt细胞。dnγδt细胞包括表达除vδ1和vδ2以外的vδ受体(例如，vδ3、vδ4、vδ5或vδ8)的那些。如通过标准facs门控方法测定的，如果标志物的表达高于阴性对照细胞，则细胞可被表征为标志物(例如，vδ1+)阳性的。
本文所描述的方法可以包括体外培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。
可以从任何合适的人或非人动物非造血组织获得淋巴细胞。非造血组织是除了血液、骨髓或胸腺组织以外的组织。在一些实施方式中，γδt细胞不是从特定类型的生物体液的样品如血液或滑液中获得的。这种合适的人或非人动物非造血组织的实例包括皮肤或其一部分(例如，真皮、表皮)、胃肠道(例如，胃肠上皮、结肠、小肠、胃、阑尾、盲肠或直肠)、乳腺组织、肺(优选地其中该组织不是通过支气管肺泡灌洗获得的)、前列腺、肝、脾和胰腺。γδt细胞也可以驻留在人癌症组织中，例如，乳腺和前列腺癌症组织。在一些实施方式中，γδt细胞不是从人癌症组织获得的。非造血组织样品可以通过标准技术例如通过外植体(例如，活组织检查)获得。
淋巴细胞可以通过允许从人或非人动物非造血组织分离淋巴细胞的任何合适的方法获得。clark等人提出了一种这样的方法(29)，其描述了用于从人皮肤分离淋巴细胞的三维皮肤外植体方案。可以将外植体粘附到合成支架上以促进淋巴细胞从外植体流出(egress)到支架上。合成支架是指适合支持细胞生长的非天然三维结构。合成支架可以由诸如以下各项的材料构造：聚合物(例如，天然或合成聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯)，陶瓷(例如，磷酸三钙、铝酸钙、钙羟基磷灰石)，或金属(钽、钛、铂和与铂、铌、铪、钨相同的元素组中的金属，及它们的合金的组合)。可以根据本领域已知的方法将生物因子(例如，胶原(例如，胶原i或胶原ii)、纤连蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白、血管生成因子、抗炎因子、葡萄糖胺聚糖、vitrogen、抗体及其片段、细胞因子(例如，白细胞介素-2(il-2)或白细胞介素-15(il-15)以及它们的组合)涂覆到支架表面上或包封在支架材料内以增强细胞粘附、迁移、存活或增殖。该方法和其他方法可以用于从许多其他非造血组织类型例如，肠道、前列腺和乳腺中分离淋巴细胞。合适方法的其他实例包括组织的酶消化和carrasco等人(30)描述的“爬出”(crawlout)方法，其中组织被切断并添加il-2以便淋巴细胞“爬出”。
如上所述，可以使用任何合适的非造血组织，例如皮肤、胃肠道(例如，结肠)、乳腺组织、肺、前列腺、肝、脾和胰腺。
优选从人组织获得非造血组织驻留γδt细胞。然而，它们可以从任何合适的非人动物如小鼠、大鼠、狗、马和猪的非造血组织获得。
关键的一步是深思熟虑的分离，例如在培养远离从其中获得了t细胞的组织的非造血细胞(基质细胞，尤其是成纤维细胞)的非造血组织驻留t细胞(例如，在混合的淋巴细胞的群体内，其例如可以包含αβ、γδ2和非γδ2t细胞)数天或数周之后，以及如下所述的细胞作为细胞因子中的淋巴细胞的随后的培养。这使得组织来源的γδ1和dnγδt细胞在接下来的数天和数周内的选择性和显著的扩增。
如本文所使用的，“分离(separation)”，“分离的(separated)”或“分离开(separate)”是指破坏或禁止不同细胞的群体之间的物理接触的行为。分离可以通过例如，强制吸取混合的细胞的群体以破坏膜间关联，或通过用例如趋化因子或细胞因子培养来诱导细胞的群体从例如组织基质的“爬出”来进行，如carrasco等人(30)所描述的。可以在使用transwell培养系统的培养期间或通过防止不同细胞的群体之间的物理接触的类似培养方法维持分离。
如本文所使用的，“基本上纯的”是指以数量、质量或体积计大于90％的纯度。“基本上不包含”是指以给定组分的数量、质量或体积计少于5％。可以将从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞培养至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少2周、至少3周或至少4周。
该方法包括在il-2的存在下培养从人或非人动物非造血组织获得的淋巴细胞。il-2的浓度优选为至少10国际单位/ml(iu/ml或u/ml)，至少20u/ml，至少30u/ml，至少40u/ml，至少50u/ml，至少60u/ml，至少70u/ml，至少80u/ml，至少90u/ml或至少100u/ml。
使用il-2来促进皮肤来源的γδt细胞的扩增并不明显，因为细胞表达非常低水平的称为cd25的高亲和力il-2受体(图1d)。然而，该受体通过与其他细胞类型如基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)分离而在γδt细胞的离散子集上上调(参见图3b和图4b)，使得细胞对il-2高度敏感。
如本文所使用的，“il-2”是指野生型il-2(例如，天然或重组的)或充当一种或多种il-2受体(il-2r)亚基(例如，il-2突变蛋白、长效il-2类似物，其亚基，其受体复合物)的激动剂的试剂。这些试剂可以支持il-2依赖性细胞系ctll-2(33；美国典型培养物保藏中心(
可以通过常规方法如聚合酶链式反应(pcr)获得编码人il-2的核酸。人il-2(基因id3558)的氨基酸序列在genbank中以登录定位号np_000577.2gi:28178861获得。小鼠(小家鼠(musmusculus))il-2氨基酸序列(geneid16183)在genbank中以登录定位号np_032392.1gi:7110653获得。
优选地，在il-2和il-15存在下培养淋巴细胞，因为与单独的il-2相比，加入与il-2组合的il-15获得增殖性非造血组织驻留γδt细胞的增强的扩增。il-15的浓度优选为至少10ng/ml。
与il-2一样，il-15是已知的t细胞生长因子，其可以支持il-2依赖性细胞系ctll-2的增殖。grabstein等人(35)首次报道il-15为114个氨基酸成熟蛋白。如本文所使用的，术语“il-15”意指天然或重组il-15和突变蛋白、其类似物、亚基或其复合物(例如，如wo2007/046006中描述的受体复合物，例如寿司肽)，并且其中的每一种会刺激ctll-2细胞的增殖。在ctll-2增殖测定中，用重组表达的前体和成熟形式的il-15的框内融合体转染的细胞的上清液可诱导ctll-2细胞增殖。
如本文所使用的，术语il-15还意指源自多种哺乳动物物种包括例如人、猿猴、牛、猪、马和鼠的il-15。如本文所提及的，il-15“突变蛋白”或“变体”是与天然哺乳动物il-15的序列基本上同源但由于氨基酸缺失、插入或替换而具有与天然哺乳动物il-15多肽不同的氨基酸序列的多肽。变体可以包含保守替换的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似生理化学特征的残基替换。保守取代的实例包括一个脂肪族残基被另一个替换，例如ile、val、leu或ala彼此替换，或一个极性残基替换另一个，例如在lys和arg之间；glu和asp之间；或gln和asn之间。其他这样的保守替换，例如具有相似疏水性特征的整个区域的替换是众所周知的。天然存在的il-15变体也包括在本发明中。此类变体的实例是由选择性mrna剪接事件或il-15蛋白质的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中il-15结合特性被保留。mrna的选择性剪接可产生截短的但具有生物活性的il-15蛋白。可归因于蛋白质水解的变体包括例如，由于从il-15蛋白进行蛋白水解移除一个或多个末端氨基酸(通常为1-10个氨基酸)，在不同类型的宿主细胞中表达时的n-末端或c-末端的差异。
可以根据grabstein等人(35)描述的程序或通过常规程序如聚合酶链式反应(pcr)获得人il-15。1993年2月19日在atcc进行人il-15cdna的保藏，分配的登录号为69245。
人il-15(基因id3600)的氨基酸序列在genbank中以登录定位号np000576.1gi:10835153(同种型1)和np_751915.1gi:26787986(同种型2)获得。小鼠(小家鼠(musmusculus))il-15氨基酸序列(geneid16168)在genbank中以登录定位号np_001241676.1gi:363000984获得。
可以在不存在il-6、il-23和il-1b的情况下，或在存在低浓度的这些细胞因子(例如，小于20ng/ml)的情况下培养淋巴细胞，因为添加细胞因子的这种组合似乎减少非造血组织驻留γδt细胞的增殖。这是令人惊讶的，因为预期这些细胞因子会促进增殖。
可以在不存在激活t细胞信号传导的试剂(例如，t细胞受体(tcr)途径激动剂)的情况下培养从非造血组织获得的淋巴细胞。例如，可以在不支持或诱导αβt细胞和血液驻留γδt细胞的增殖或激活的培养基中培养从非造血组织获得的淋巴细胞。合适的培养基可以不包含或基本上不包含tcr激动剂或其他激活t细胞信号传导的试剂。相反，来自造血组织的γδt细胞的培养需要存在激活t细胞信号传导的试剂，如唑来膦酸(41,42)或抗cd3抗体如okt3(43)。
激活t细胞信号传导的试剂是指通过tcr信号传导或共刺激来诱导t细胞(如αβt细胞和/或血液驻留γδt细胞)的增殖或激活的化合物。t细胞信号调节剂通过依次激活70kda(zap70)的src相关蛋白酪氨酸激酶(ptk)、lck和fyn以及ζ链(tcr)相关蛋白激酶而起作用。这些ptk导致多肽磷酸化，包括t细胞的接头激活剂(lat)，其通过细胞外信号调节激酶(erk)、c-junn-末端激酶(jnk)和激活的t细胞的核因子导致下游刺激(nfat)。共刺激，例如，通过cd28和cd45，可以增强磷酸化并增强tcr信号传导途径。因此，靶向tcr的部分或共刺激途径的任何试剂都可以激活t细胞信号传导。激活t细胞信号传导的试剂可以是可溶性的或膜结合的，并且可以例如呈递在细胞上，例如人工抗原呈递细胞(aapc)。用于激活t细胞信号传导的合适aapc是本领域中已知的(44)。
在一些实施方式中，可以在不存在以下各项的情况下培养淋巴细胞：外源添加的t细胞受体途径激动剂如cd3和/或cd28激活剂(例如，抗cd3和/或抗cd28单克隆抗体)；植物血凝素(pha)；伴刀豆球蛋白a、合成的磷酸抗原如brhpp(溴醇焦磷酸)、2m3b1pp(2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸)、hmbpp((e)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸)，或ipp(异戊烯焦磷酸)；n-双膦酸如唑来膦酸；重组cd70；抗cd2单克隆抗体；抗cd27单克隆抗体；抗泛tcrγδ抗体；抗-cd277单克隆抗体；或人工抗原呈递细胞(aapc)。激活t细胞信号传导的试剂还包括细胞表面结合的分子，例如与抗原呈递细胞(apc)或人工apc相关的mhc或hla复合物。通过外源添加tcr途径激动剂激活t细胞的合适方法是本领域公知的，并在deniger等人(44)的图1中总结。
例如，可以在不包含或基本上不包含外源添加的t细胞受体途径激动剂的培养基中培养淋巴细胞。使用本发明的方法扩增非造血组织驻留γδt细胞不需要添加这样的t细胞受体信号传导激活剂。与此相反，造血组织来源的γδt细胞的扩增需要il-2和t细胞受体信号激活剂如唑来膦酸(41,42)二者的存在。
在一些实施方式中，可以在来自基质细胞培养物的条件培养基中培养淋巴细胞以提供γδt细胞生长的补充。
在一些实施方式中，可以在包含il-2和/或il-15的γδ扩增培养基中培养γδt细胞。合适的γδ扩增培养基缺乏t细胞激活活性，例如αβt细胞或血液γδt细胞激活活性，并且可以例如不包含或基本上不包含tcr激动剂或共刺激剂。在一些实施方式中，除了il-2和/或il-15之外，γδ扩增培养基可以包含一种或多种另外的生长因子，例如细胞因子。合适的生长因子不显示t细胞激活活性。在其他实施方式中，γδ扩增培养基可以不包含除il-2和/或il-15以外的生长因子；例如γδ扩增培养基可以由补充有il-2和/或il-15的基础培养基组成。
适用于γδt细胞增殖的许多基础培养基是可用的，特别是完全培养基，如aim-v、iscoves培养基和rpmi-1640(lifetechnologies)。培养基可补充有其他培养基因子，如血清、血清蛋白和选择性试剂，如抗生素。例如，在一些实施方式中，rpmi-1640培养基含有2mm的谷氨酰胺，10％的fbs，10mm的hepes，ph7.2，1％的青霉素-链霉素、丙酮酸钠(1mm；lifetechnologies)、非必需氨基酸(例如，100μm的gly、ala、asn、asp、glu、pro和ser；1xmem的非必需氨基酸lifetechnologies)和10μl/lβ-巯基乙醇。基础培养基可以标准浓度补充有il-2和/或il-15，其可以通过常规实验由技术人员容易地确定。
方便地，将细胞在含有5％co2的潮湿气氛中于37℃在合适的培养基中培养。
可如本文在任何合适的系统中培养γδt细胞，系统包括搅拌罐式发酵罐、气升式发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿以及其他生物反应器，特别是中空纤维生物反应器。这种系统的使用是本领域中众所周知的。
用于培养淋巴细胞的方法和技术是本领域中众所周知的(36-39)。
在培养期间，淋巴细胞不与基质细胞或上皮细胞直接接触。这是因为淋巴细胞与基质细胞或上皮细胞的直接接触似乎抑制组织驻留γδt细胞的扩增。
基质细胞是任何器官的非造血结缔组织细胞，并支持该器官的实质(parenchymal)细胞的功能。基质细胞的实例包括成纤维细胞、周皮细胞、间充质细胞、角质形成细胞、内皮细胞和非血液肿瘤细胞。优选地，在培养期间淋巴细胞不与成纤维细胞直接接触。
上皮细胞是非造血细胞，其遍布全身标示(line)血管和器官的腔体和表面。它们通常是鳞状、柱状或立方体形状，并且可以排列成单层细胞或两层或多层细胞。
成纤维细胞和/或其他基质细胞或上皮细胞优选存在于淋巴细胞的培养过程中，因为由这些细胞分泌的因子可促进非造血组织驻留γδt细胞的扩增，但不与淋巴细胞直接接触，如直接接触抑制非造血组织驻留γδt细胞的扩增。例如，可以在transwell中培养淋巴细胞，其允许淋巴细胞和成纤维细胞的物理分离。可以使用的成纤维细胞细胞系的实例包括人包皮成纤维细胞(例如，bj(
使用clark方案，可以收获非造血组织驻留淋巴细胞并例如通过固定移液将其与基质细胞如真皮成纤维细胞分离。可以通过40μm尼龙网进一步洗涤淋巴细胞收获物，以保留在该过程期间可能变松的成纤维细胞聚集体。使用例如cd45抗体，也可以使用荧光或磁相关细胞分选来分离淋巴细胞。为了使t细胞的激活最小化，也可仅根据其前向和侧向散射特性的标准将它们分选。然后，可以与基质细胞(例如，成纤维细胞)分离或在它们的存在但不直接接触的情况下下生长淋巴细胞。例如，淋巴细胞可以在细胞培养物中良好融合的单层成纤维细胞的transwell篮中生长，以允许成纤维细胞产生的可溶性生长因子交换，而不允许任何直接接触。或者，成纤维细胞可以在transwell篮中培养，淋巴细胞在细胞培养物中生长良好。也可以使用非造血细胞(例如，成纤维细胞)的条件培养基来补充淋巴细胞扩增。
条件培养基含有非造血细胞(例如，基质细胞，如成纤维细胞)分泌的可溶性因子。条件培养基可以包含或不包含分泌因子的细胞。例如，可以在γδt细胞培养期间分泌调节因子的细胞的存在下培养γδt细胞。或者，可以在γδt细胞培养之前从培养基中除去非造血细胞，在培养基中留下它们分泌的因子。条件培养基还包括补充有先前已经制备的非造血细胞因子(例如，以浓缩物或冻干粉形式)的培养基。
虽然在淋巴细胞培养过程中优选存在基质细胞或上皮细胞(但不与淋巴细胞直接接触)，但可以将它们除去，使得在不存在基质细胞或上皮细胞的情况下培养淋巴细胞，例如，在不存在成纤维细胞的情况下。
在一些实施方式中，在不存在激活t细胞信号传导的试剂如外源添加的t细胞受体途径激动剂的情况下扩增非造血组织的γδt细胞后，可以进一步在一种或多种激活t细胞信号传导的试剂如外源添加的t细胞受体途径激动剂和/或一种或多种生长因子如细胞因子的存在下培养扩增的γδt细胞。在如本文所描述的扩增和可选的进一步培养后，可根据需要将非造血组织的γδt细胞分离或进一步纯化、储存、与其他试剂如药学上可接受的赋形剂混合和/或使用。
可以将通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞与其他血液来源的γδt细胞区分开，因为它们在没有任何t细胞受体刺激配体的情况下响应于与恶性肿瘤强烈相关的nkg2d配体(mica)，例如通过增加tnfα、ifnγ和cd107a的产生(图2a至图2d、图10a和图10b)。它们也执行细胞毒性t细胞应答而不经历任何外源药理学或配体介导的t细胞受体激活，因此在缺乏刺激的情况下具有细胞毒性(图3和图5)。这意味着与其他γδt细胞、αβt细胞或nk细胞相比，通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞在不存在添加的任何激活t细胞受体信号传导的外源性试剂的情况下响应和增殖的能力是独特的(图3)。通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞也对cd69和pd-1染色阳性，缺乏cd28表达，并且仅显示低水平的cd25(参见图1d)。这种标志物的组合不能被血液来源的γδt细胞表达。此外，与血液来源的扩增的vd2γδt细胞相比，它们显示组织归巢受体如ccr4和ccr8的更高表达(图7b)。通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞可以在没有tcr激动剂或其他生长因子的情况下在il2和/或il15存在下培养。例如，非造血组织驻留γδt细胞可以在由补充有il-2的rpmi1640培养基组成的培养基中生长。
因此，由本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞可以具有以下性质中的一种或多种：
(i)表现出表型cd69高、icos高、tim3高和cd28低/缺乏
(ii)上调ccr3、cd39、cd11b和cd9中的一种或多种
(iii)在不存在tcr激动剂的情况下响应nkg2d配体产生ifn-γ，
(iv)在不存在tcr激动剂的情况下产生il-13，
(v)响应tcr激活而产生ifn-γ、tnf-α和gm-csf中的一种或多种，
(vi)响应tcr激活而不产生或基本上不产生il-17，
(vii)在含有il-2而没有另外的生长因子的培养基中生长，
(viii)在不存在tcr激动剂的情况下显示细胞毒性t细胞应答和/或
(ix)表现出相对于正常细胞针对肿瘤细胞的选择性细胞毒性。
优选地，通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞在不存在tcr激动剂的情况下产生il-13和/或在不存在tcr激动剂的情况下响应nkg2d配体产生ifn-γ。
通过本发明的方法获得的γδt细胞可以在筛选非造血组织驻留γδt细胞的检查点调节剂的方法中使用。由于检查点调节剂是癌症治疗的潜在靶标，因此这些检查点调节剂的识别对于开发癌症免疫疗法可能有用。
为了确定测试化合物是否为检查点调节剂，在存在或不存在测试化合物的情况下，可以在与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)直接接触的情况下体外培养非造血组织驻留γδt细胞。在存在和不存在测试化合物的情况下测定非造血组织驻留γδt细胞的增殖速率或激活程度。如果与不存在测试化合物的情况相比，在存在测试化合物的情况下的增殖速率或激活程度更高，则测试化合物很可能是候选检查点调节剂。这是因为测试化合物能够减轻基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)的接触抑制。
基于测试化合物调节组织驻留t细胞检查点的潜力来选择它。
在非造血组织驻留γδt细胞增殖方面的明显增加也可能是由于细胞死亡的抑制，并且可以通过增加t细胞计数或其标志物以及通过减少程序性细胞死亡标志物的表达来测量。可以通过测量由激活的组织驻留γδt细胞分泌的细胞因子如ifn-γ的释放来评估激活的增加。
或者，可以在与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)直接接触的情况下体外培养非造血组织驻留γδt细胞，其中在γδt细胞和/或基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)或者两种细胞类型中测试基因的表达都被改变。例如，可以通过rna靶向试剂如小干扰rna(sirna)或小发夹rna(shrna)或通过基因编辑，例如使用crispr/cas系统改变γδ细胞和/或基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)内的测试基因的表达。在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中存在或不存在测试基因的表达改变的情况下，测定非造血组织驻留γδt细胞的增殖速率或激活程度。如果与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中不存在测试基因的改变的情况相比，在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中存在测试基因的表达改变的情况下的增殖或激活的速率更高，则测试基因可能是候选检查点基因。
或者，如果基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)的杀伤速率为与不存在测试化合物的情况相比、在存在测试化合物的情况下更高，或者与基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中不存在测试基因的改变的情况相比、在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中存在测试基因的表达改变的情况下更高，则测试化合物很可能是检验点调节剂或测试基因很可能是候选检查点基因。例如，可以通过定量由死亡细胞释放的分子来测量杀伤速率。在测试化合物的存在下或在基质细胞或上皮细胞(例如，成纤维细胞)和/或γδt细胞中存在测试基因的表达改变的情况下，细胞杀伤率较高表明抑制细胞杀伤的检查点已被减轻，因此可以得出结论，测试化合物很可能是检查点调节剂或测试基因很可能是候选检查点基因。
在各个实施方式中可以使用的成纤维细胞系的实例包括人包皮成纤维细胞(例如，bj(
为了识别测试化合物作为候选检查点调节剂或为了识别测试基因作为候选检查点基因，在存在测试化合物或在存在测试基因的改变的情况下，γδt细胞的增殖和/或激活速率可以比不存在测试化合物或不存在测试基因改变的情况高至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。可以通过许多方法测量细胞周期，如第0天和第7天的绝对细胞数，ki-67和cd25表达水平(其为细胞周期标志物)和使用细胞培养染料如cfse或celltracetm紫罗兰。可以通过产生效应物蛋白如ifn-γ来测量细胞激活。非造血组织驻留γδt细胞增殖的明显增加也可能是由于细胞死亡的抑制，并且可以通过增加t细胞计数或其标志物以及通过减少程序性细胞死亡标志物的表达来测量。
通过本发明的方法获得的γδt细胞可以用作药物，例如用于过继性t细胞治疗。这涉及将通过本发明的方法获得的γδt细胞转移至患者中。治疗可以是自体的，即γδt细胞可以被转移回到从其获得它们的相同患者中，或者治疗可以是同种异体的，即来自一个人的γδt细胞可以被转移到不同的患者中。治疗方法可以包括：
提供从供体个体获得的非造血组织样品，
如上所述培养来自样品的γδt细胞以产生扩增的群体，并且；
将扩增的γδt细胞的群体施用给受体个体。
供体个体和受体个体可以相同或不同。
可以通过任何合适的方法将γδt细胞施用于需要治疗的患者或受试者。例如，可以将γδt细胞静脉内或肿瘤内施用于需要治疗的患者或受试者。
待治疗的患者或受试者优选为人癌症患者或病毒感染患者，例如cmv感染的或hiv感染的患者。
由于γδt细胞是非mhc限制性的，因此它们不将它们被转移到其中的宿主识别为外来物，这意味着它们不太可能引起移植物抗宿主疾病。这意味着它们可以以“现成品”使用并转移到任何受体中，例如用于同种异体过继性t细胞疗法。
因为它们通常驻留在非造血组织中，因此组织驻留的vδ1t和dnγδt细胞也比其全身血液驻留的对应物更容易归巢并保留在肿瘤块中，并且这些细胞的过继转移可能在靶向实体瘤和潜在的其他非造血组织相关免疫病理学方面更有效。
在一些实施方式中，治疗个体的非造血组织中的肿瘤的方法可以包括：
提供从供体个体获得的所述非造血组织样品，
如上所述培养来自样品的γδt细胞以产生扩增的群体，并且；
向具有肿瘤的个体施用扩增的γδt细胞的群体。
通过本发明方法获得的非造血组织驻留γδt细胞表达nkg2d并响应于与恶性肿瘤强关联的nkg2d配体(例如，mica)。它们在没有任何激活的情况下也表达细胞毒素谱，因此可能有效杀伤肿瘤细胞。例如，如本文所述获得的非造血组织驻留γδt细胞可以在没有任何激活的情况下表达以下各项中的一种或多种，优选全部：ifn-γ、tnf-α、gm-csf、ccl4、il-13、粒溶素、粒酶a和b，以及穿孔素。il-17a可能不被表达。
因此，本文报道的发现为通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞作为“现成品”免疫治疗试剂的临床应用的实用性和适用性提供了令人信服的证据。这些细胞具有先天样杀伤作用，不具有mhc限制，并且与其他t细胞相比，在肿瘤内显示出提高的归巢和/或滞留。
通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞也可以用于car-t疗法。这涉及产生工程化t细胞受体(tcr)以用新的特异性例如单克隆抗体的特异性重新编程t细胞。工程化的tcr可以使t细胞对恶性细胞具有特异性，因此可以用于癌症免疫治疗。例如，t细胞可以识别表达肿瘤抗原的癌细胞，例如来自受试者组织的正常体细胞不表达的肿瘤抗原，例如肿瘤相关抗原(taa)。因此，car-修饰的t细胞可以用于例如癌症患者的过继性t细胞治疗。
已经描述了将血液驻留γδt细胞用于car。然而，通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞对于car-t方法来说可能是特别好的媒介物(vehicle)，因为它们可以用嵌合抗原特异性tcr转导，同时保持其识别转化的细胞的天然样能力，并且可能比血液驻留γδt细胞或常规全身性αβt细胞具有更好的肿瘤渗透和保留能力。此外，它们缺乏mhc依赖性抗原呈递降低了移植物抗宿主疾病的可能性并且允许它们靶向表达低水平mhc的肿瘤。同样，它们不依赖于常规共刺激，例如通过cd28的接合增强了针对共刺激受体表达低水平配体的肿瘤的靶向。
癌症可能以恶性癌细胞的异常增殖为特征，并且可能包括白血病、如急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)和慢性淋巴细胞白血病(cll)，淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤，以及实体癌如肉瘤、皮肤癌、黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食道癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌。
癌症患者内的癌细胞可以与个体中的正常体细胞免疫学上不同(即，癌性肿瘤可以是免疫原性的)。例如，癌细胞可能能够在癌症患者中引发针对一种或多种由癌细胞表达的抗原的全身性免疫应答。引发免疫应答的抗原可以是肿瘤抗原或可以由正常细胞共享。根据本领域已知的临床标准，患有癌症的患者可显示足以诊断癌症的至少一个可识别的征兆、症状或实验室发现。这些临床标准的实例可以在医学教科书中找到，如哈里森内科学原理(40)。在一些情况下，个体中的癌症的诊断可包括识别从个体获得的体液或组织样本中的特定细胞类型(例如，癌细胞)。
适于如上所述进行治疗的患者、受试者或个体可以是哺乳动物，例如啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)，鼠科动物(例如，小鼠)，犬科动物(例如，狗)，猫科动物(例如，猫)，马科动物(例如，马)，灵长类动物，猿猴(例如，猴或猿)，猴(例如，狨猴或狒狒)，猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿)，或人类。
在一些优选的实施方式中，患者、受试者或个体是人。在其他优选的实施方式中，可以使用非人类哺乳动物，特别是通常用作证明在人类中治疗功效的模型(例如，鼠科动物、灵长类动物、猪、犬科动物或兔子)的哺乳动物。
在一些实施方式中，患者、受试者或个体在初始癌症治疗后可能具有微小残留病(mrd)。
无论是人类还是动物(例如，在兽医应用中)的治疗可以是任何治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如抑制或延缓病症发展，并且包括减少进展速度，进展速度的停止，状况的改善，状况的治愈或缓解(无论部分或全部)，预防、延缓、减轻或抑制病状的一种或多种症状和/或体征或将受试者或患者的存活延长超过在不存在治疗的情况下预期的存活。
也包括作为预防措施的治疗(即，预防)。例如，可以如本文所描述的那样治疗对癌症的发生或再次发生敏感或有风险的患者、受试者或个体。这种治疗可以预防或延迟患者、受试者或个体中癌症的发生或再发生。
特别地，治疗可以包括抑制癌症生长，包括完全的癌症缓解和/或抑制癌症转移。癌症生长通常是指指示癌症内部变为更发展的形式的多种指标中的任何一种。因此，测量癌症生长抑制的指标包括癌细胞存活率降低、肿瘤体积或形态减少(例如，如使用计算机断层摄影(ct)、超声或其他成像方法测定的)、延迟的肿瘤生长、肿瘤脉管系统的破坏、迟发性超敏反应皮肤试验中的改善的表现、细胞溶解性t淋巴细胞活性的增加以及肿瘤特异性抗原水平的降低。减少个体中的癌性肿瘤中的免疫抑制可以提高个体抵抗癌症生长的能力，特别是癌症的生长已经存在于个体中和/或降低个体中癌症生长的倾向。
本发明的其他方面和实施方式提供了上面描述的方面和实施方式，其中术语“包括”被术语“由...组成”替换，并且上文描述的方面和实施方式使的术语“包括”被术语“基本上由...组成”替换。
应该理解的是，除非上下文另有要求，否则本申请公开了上述任何方面和上述实施方式的彼此所有组合。类似地，本申请公开了优选的和/或可选的特征的单独或与任何其他方面一起的所有组合，除非上下文另有要求。
对于本领域技术人员来说，在阅读本公开时上述实施方式，其他实施方式及其修改的变化是显而易见的，因此这些都在本发明的范围内。
出于所有目的，本说明书中提及的所有文献和序列数据库条目通过引用其全部内容并入本文。
如本文所使用的，“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开。例如，“a和/或b”被视为(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，正如每个在本文中单独阐述一样。
现在将通过举例并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方式。
方法
通过三维外植体培养从人皮肤分离淋巴细胞
如别处所描述的(29)，建立了三维皮肤外植体方案。将9mm×9mm×1.5mm的cellfoammatrices(细胞泡沫基质)(cytomatrixptyltd,victoria,australia)高压灭菌，然后在室温下在100mg/ml大鼠尾部胶原蛋白i(bdbiosciences)的pbs溶液中温育30分钟，随后在pbs中冲洗一次。在皮肤手术3-6小时内获得成人皮肤样品。去除皮下脂肪，将剩余的皮肤组织切碎成约1mm×1mm的碎片。将约5个皮肤碎片/外植体放置并向下压在每个基质的表面上。将每个基质置于含有2ml的含有10％的热灭活的胎牛血清(lifetechnologies)、l-谷氨酰胺(292μg/ml；lifetechnologies)、青霉素(100单位/ml；lifetechnologies)、链霉素(100μg/ml；lifetechnologies)、n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸(lifetechnologies)、丙酮酸钠(1mm；lifetechnologies)、最小必需培养基(mem)非必需氨基酸(1x；lifetechnologies)和3.5μl/l的2-巯基乙醇(lifetechnologies)的“皮肤-t”培养基(iscove改良的杜氏培养基(imdm；lifetechnologies))的24孔平板(corning)的单个孔中。在培养的第一个7天，将两性霉素(2.5μg/ml；lifetechnologies)加入到培养基中。每周更新培养基三次。为了喂养，从每个孔中吸出上部1ml的培养基并用新鲜培养基更换。从开始培养和每次培养基改变时加入il-2和il-15，直到21天时分离淋巴细胞。以100iu/ml加入人重组il-2(proleukin；novartispharmaceuticalukltd)。以20ng/ml添加人重组il-15(biolegend)。对于每个供体在培养基中建立高达96个孔(4个24孔板)。
为分离淋巴细胞，将基质转移到含有10ml的含0.01mm的hepes的hanks平衡盐溶液(hbss；lifetechnologies)的50ml的离心管(corning)中(最多12个基质/管)。用10ml的移液管用细胞悬浮液冲洗基质，并使细胞悬浮液通过70-μm的过滤器(bdbiosciences)进入新鲜的50ml离心管(corning)中。基质的“洗涤”再重复两次。培养孔中的培养基也被吸出，并通过70-μm的过滤器(bdbiosciences)进入新鲜的50ml离心管(corning)中。用1ml的0.01mm的hepes/hbss将孔再洗涤两次并通过70μm的过滤器(bdbiosciences)。随后通过离心(1600rpm，15分钟)分离细胞。将沉淀物重新悬浮在“皮肤-t”培养基中。将最终的细胞沉淀物重悬于“皮肤-t”培养基中用于随后的流式细胞术分析或功能研究。当需要细胞计数时，在这一阶段通过以下任一方法计数白细胞；(1)台盼蓝染色(0.4％)(lifetechnologies)和血细胞计数器，或(2)
为了分离淋巴细胞，将基质转移到含有10ml的含0.01mm的hepes的hanks平衡盐溶液(hbss；lifetechnologies)的50ml的离心管(corning)中(最多12个基质/管)。使用10ml的移液管用细胞悬浮液冲洗基质，并使细胞悬浮液通过70-μm的过滤器(bdbiosciences)进入新鲜的50ml离心管(corning)中。基质的“洗涤”再重复两次。培养孔中的培养基也被吸出，并通过70-μm的过滤器(bdbiosciences)进入新鲜的50ml离心管(corning)中。用1ml的0.01mm的hepes/hbss将孔再洗涤两次并通过70-μm的过滤器(bdbiosciences)。随后通过离心(1600rpm，15分钟)分离细胞。将沉淀物重新悬浮在“皮肤-t”培养基中。将最终的细胞沉淀物重悬于“皮肤-t”培养基中用于随后的流式细胞术分析或功能研究。当需要细胞计数时，在这一阶段通过任一方法计数白细胞；(1)台盼蓝染色(0.4％)(lifetechnologies)和血细胞计数器，或(2)
由于原代肠道样本更容易受到污染，因此在切碎并置于网格上之前，首先在含有10％的fcs、青霉素500u/ml、链霉素500μg/ml、庆大霉素100μg/ml、两性霉素b12.5μg/ml和甲硝唑5μg/ml的imdm中将获得的活组织检查洗涤两次。在肠道-t培养基(imdm，10％fcs，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml，庆大霉素20μg/ml，甲硝唑1μg/ml)中生长肠道网格培养物。对于生长的第一周，与皮肤类似，我们也使用了两性霉素b2.5μg/ml。培养基含有il-2(100iu/ml)和il-15(20ng/ml)，并且每周更换3次。因为肠道结构比皮肤更松散，因此可以在一周后收获淋巴细胞。
组织γδt细胞的扩增
为了扩增人皮肤来源的γδt细胞，在pbs中洗涤在网格培养3至4周后收获的混合淋巴细胞，旋转沉降并以1x106/ml的密度重悬于含有10％的热灭活的胎牛血清(lifetechnologies)、l-谷氨酰胺(292μg/ml；lifetechnologies)，青霉素(100单位/ml；lifetechnologies)、链霉素(100μg/ml；lifetechnologies)、n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸(lifetechnologies)、丙酮酸钠(1mm；lifetechnologies)、最小必需培养基(mem)非必需氨基酸(1x；lifetechnologies)和10μl/l的2-巯基乙醇(lifetechnologies)，并且补充有单独的il-2(100iu/ml)或il-2加il-15(20ng/ml)。将细胞以2x105/孔接种到96孔平底板(corning)中或以2x106/孔接种到12孔板(corning)中进行扩增。通过显微镜每天监测细胞，每周添加3次新鲜培养基和细胞因子。在完全融合并且细胞聚集体可见时，将细胞分别以1:1拆分到另外的孔和板中。收获细胞并使用流式细胞术分析或取决于测定在7、14或21天后用于功能测定。如果需要纯γδt细胞，将细胞重悬于1ml的facs缓冲液(含有2％的热灭活的胎牛血清和0.01m的edta的pbs)中，并针对αβt细胞受体(biolegend，克隆ip26，1:50)在冰上黑暗中放置30分钟进行染色，使用运行diva的aria分选仪(bdbiosciences)分选所有阴性细胞。
与成纤维细胞共培养
对于每个网格培养的设置，我们准备了两个培养皿(100x25mm，corning)，用手术刀在几个地方划擦。将切碎的皮肤片放在划痕上。在空气中干燥5至10分钟后，通常将皮肤片粘在培养皿上并加入10ml的皮肤-t培养基。每周更换一次培养基，并且在生长3周后用
流式细胞术
使用以下与所示荧光染料偶联的抗体进行流式细胞术：ki-67-bv421、cd3-bv510、vδ1-pevio770、tim-3-pe、cd9-pe、ccr3-bv421、cd39-bv421。使用efluor770nir，总是针对生存力将所有样品染色。商业抗体购自biolegend或miltenyi。生存力染料(近红外)来自ebioscience。对使用foxp3染色缓冲液组(ebioscience)固定和透化的细胞进行ki-67染色。一旦每个实验结束，就将细胞的群体在pbs中洗涤并分成两半。细胞用efluor770nir染色用于生存力并洗涤，然后truestain(biolegend)以避免染色抗体的非特异性结合。一半样品用指定的表面标志物进行染色，而将另一半仅针对谱系标志物(cd3，vδ1)染色并且使用所用的表面标志物的等价同种型对照进行染色。这意味着以相同浓度使用结合至相同荧光染料的匹配小鼠同种型抗体。同种型对照不结合已知的人抗原，因此表明非特异性结合或假阳性。这也被称为真正阴性。显示与其相应的同种型对照(开放、虚线)比较的每个直方图(黑色)。数据总结表明所比较的指示标志物的染色阳性的细胞百分比，因此处于高于同种型的水平。在flowjo(版本10.1)上进行流式细胞术数据分析。
rna测序
将来自人皮肤和人血vδ1t细胞(t细胞受体引发的扩增后)的vδ1t细胞分选(facs)，离心并将细胞沉淀物重新悬浮于rlt缓冲液中。使用rna-micro-plus试剂盒(qiagen)制备rna。使用带有riboerase(hmr)的kapastrandedrna-seq试剂盒(kapabiosystems)产生rna文库。在hiseq2500(illumina)上使用快速运行化学进行配对末端测序(读数长度：100bp)。使用具有bowtie2的rsem(v1.2.11)对101个碱基对配对末端读数进行比对和定量。将读数与人类转录组比对，计数值经过log2转换和分位数归一化。
细胞因子定量
来自人皮肤的vδ1t细胞用pma和离子霉素或平板结合的抗cd3mab(okt3,5μg/ml)刺激24小时。然后，取上清液并使用来自ebioscience的procartaplexhumancytokine&chemokinepanel1a(人细胞因子和趋化因子板1a)(34重(plex))进行分析。使用luminexflexmap3d(luminexcorp)分析测定。在microsoftexcel中分析数据，显示3个供体的平均值(一式二份地运行)。误差条表示标准偏差。
血液来源的γδt细胞的扩增
如果使用tcr配体(在vδ2的情况下，例如ipp、hmbpp、双膦酸盐)(41、42)刺激或抗体补充以交联tcr受体(mabs)或tcr相关激酶cd3(43)，则仅扩增pbmc内的血液来源的γδt细胞。使用凝集素如pha也可以实现tcr交联的相同效果。在没有添加这种tcr刺激剂的情况下，pbmc中的γδt细胞存活数日但未能扩增并保持其t细胞亚基的初始组成并且具有较小的变化。
通过将全血分层到ficoll上，然后在400g下离心20分钟以分离红细胞、血浆和白色淋巴细胞/单核细胞，将健康志愿者的血液用于来分离pbmc。通过stripett小心收集白血细胞并在冷的pbs中洗涤四次。将细胞以1x106/ml的密度重悬于含有10％的热灭活的胎牛血清(lifetechnologies)、l-谷氨酰胺(292μg/ml；lifetechnologies)、青霉素(100单位/ml；lifetechnologies)、链霉素(100μg/ml；lifetechnologies)、n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸(hepes；0.01m；lifetechnologies)、丙酮酸钠(1mm；lifetechnologies)、最小必需培养基(mem)非必需氨基酸(1x；lifetechnologies)的rpmi-1640培养基(lifetechnologies)中，并且补充有il-2(100iu/ml)。在细胞转移之前90分钟，将细胞转移到用泛γδtcr单克隆抗体(20μg/ml，克隆b1，biolegend)涂覆的24孔板中。将细胞生长14天，每2-3天更换培养基，并加入新鲜的细胞因子。达到融合时，将细胞以1:1分开。在这些条件下，在14天后，γδt细胞的原始小群体通常通过它们的tcr被高度激活(如通过cd69和cd25的上调表示的)并且大部分富集主要由vδ2t细胞组成而且也包括vδ1t细胞(多达所有γδt细胞的30％)。随后，可以使用facs分离vδ1t细胞用于功能、表型或遗传分析。
结果
人γδt细胞在皮肤中是丰富的，表达非vδ2tcr并参与人类淋巴应激监视反应
使用clark方案(29)，我们使用了补充有il-2和il-15的人类残留皮肤样品，使得在3周的过程中组织驻留淋巴细胞的外生长能够获得平均每格240,000个细胞的淋巴细胞的群体。与以前的报道(29)一致，我们可以识别不同的皮肤驻留淋巴细胞亚群，其中大多数细胞表达常规αβtcr，大部分是组织驻留的“trm”类型。总体而言，59.9％(±8.6)的cd45+细胞是cd4+和18.3％(±2.8)的cd8+αβt细胞，其中的nk细胞分数为8.7％(±3.6)。此外，我们在我们的供体中发现了大量的γδt细胞的群体(平均8.513％的cd45+细胞，±6.564％)(图1a和图3d)。器官型培养后的该淋巴细胞的亚群代表在约100个供体中高度可重现，并且与新鲜消化的皮肤样品相当，仅在略有增加的γδ群体方面不同，但具有实际效用，与标准组织消化方案相比提供更大和更纯的淋巴细胞的群体。根据基于其tcrδ链的有关人类γδt细胞的隔离区划的的文献，大多数人类皮肤γδt细胞表达与通过流式细胞术识别的各种γ链配对的vδ1tcr链。这与大多数外周血γδt细胞相反，其显示与vγ9连接的vδ2链的单个特异性tcr异二聚体，并且在人类皮肤样品中几乎不存在。然而，重要的是要注意，一个实质的子集既不表达vδ1tcr也不表示vδ2tcr，引起名字“双阴性”γδt细胞(图1c)。
以这种方式生长的皮肤驻留γδt细胞显示缺乏cd45ra表达和表达可变水平的共刺激分子ccr7的非终末分化记忆表型。通过与常规系统性t细胞比较，表面蛋白cd69与程序性死亡受体1(pd-1)的表达一起强烈表达；低至无il-2受体α(cd25)水平；并且缺乏共刺激分子cd28绘制了先前激活的或慢性激活的t细胞的图片(图1d)。与它们的组织定位一致，vδ1和dn细胞显示皮肤和组织归巢标志物如cla、ccr4、ccr8和整合素αe(cd103)的表达(参见图7)。这种组织归巢标志物组可能在免疫治疗环境中令人信服地证明是有益的。此外，皮肤驻留γδt细胞显示出高水平的活化受体nkg2d的表达(图2a)，这意味着这些细胞可能在淋巴应激监测反应中的可能作用。nkg2d配体，例如mica、micb和ulbp分别由响应dna损伤、egf-受体激活和氧化应激的细胞上调，并且因此可允许表达nkg2d的t细胞识别和根除应激或转化的细胞，从而维持组织稳态。根据这一原理，我们发现，在暴露于nkg2d受体(mica，ulbp2)的重组配体时，证明通过本发明方法扩增的皮肤驻留γδt细胞显示脱粒，如通过溶酶体相关膜蛋白cd107a的上调测量的(图2a)。与其他组织驻留t细胞一样，这种天然样特征对vδ1+和dnγδt细胞是排他的，因为其他组织驻留t细胞(图2c)和系统性γδt细胞缺乏这种反应(图10b)。
总体而言，当通过pma/离子霉素或通过nkg2d配体例如重组mica蛋白(图2a和图2b)激活时，激活的皮肤驻留vδ1+和dnγδt细胞执行促炎性th1偏向性细胞因子程序(对ifn-γ、tnf-α和gm-csf呈阳性染色)，从而主张细胞的天然样反应。事实上，通过用抗体阻断nkg2d受体几乎完全废止了对mica的应答(图2b和图2c)。
已知γδt细胞在某些疾病背景如牛皮癣和某些类型的肿瘤内分泌il-17。通过本发明的方法扩增的γδt细胞即使在广泛激活时也产生低水平或不产生il-17(图2b和图8)。相反，组织驻留cd4表达的αβt细胞在tcr激活后确实产生il-17(图2b)。通常，与vδ1+和dnγδt细胞相比，αβt细胞对pma/离子霉素的反应显示出更多不同的细胞因子谱，其仅限于与宿主保护相关的th1偏向程序。
从组织中分离引起人组织γδt细胞的激活和大量增殖
为了进一步研究人体组织、γδt细胞及其生物学，我们将混合的皮肤淋巴细胞转移到细胞培养孔中并补充il-2以维持随时间的生存力。有趣的是，我们很快发现，通过与器官型培养物中存在的基质和上皮细胞分隔开，vδ1t细胞独特地显示激活和增殖迹象，没有任何其他添加的刺激物。在不到7天的时间内，vδ1+和dnγδt细胞独特地和大规模地上调核因子ki-67并增加il-2受体α(cd25)的表面表达(图3b和图4b)。引人注目地，在3周的过程中并且仅在存在il-2的情况下，组织来源的vδ1+和dnγδt细胞生长超过了所有其他t细胞亚群，从而占据高达全部皮肤淋巴细胞的65％，数量增加平均为127.18倍，而如通过绝对细胞数量测量的，αβt细胞仅倍增5.21倍(p＝0.0124)(图3a)。在vδ1+和dnγδt细胞中，细胞周期相关核因子ki-67的mfi在14天内从2664.5(±1876.1)增加到8457.7(±4574.2)，而在相同的时间过程中，在αβt细胞中，mfi从592.8(±390.5)降低到284.7(±140.1)(图3c)。使用另外的重组il-15可以进一步支持这种选择性，皮肤驻留γδt细胞外生长的现象，其增加了淋巴细胞的存活力和总数。
成纤维细胞以接触依赖性方式主动抑制皮肤γδt细胞
前段描述的vδ1+和dnγδt细胞的显著扩增从未在其中具有大量成纤维细胞生长的器官型培养系统中发生。因此，我们培养出自体成纤维细胞，以便直接测试它们与vδ1+和dnγδt细胞的共培养是否会抑制t细胞的扩增。在3周的网格培养后，我们将混合的皮肤淋巴细胞接种到空的或含有先前建立的融合单层成纤维细胞的孔中，并在每种情况下向培养基中补充外源性il-2以维持t细胞生长。此外，我们使用transwells，其阻止t淋巴细胞与相同孔内的成纤维细胞直接接触，但允许它们受成纤维细胞产生的任何可溶性因子的影响。在共培养的14天中，vδ1+和dnγδt细胞在其中没有成纤维细胞的孔以及在其中t细胞被免于与成纤维细胞直接接触的那些孔中开始增殖。如前，在所有条件下αβt细胞增殖都很低。明显地，当允许t细胞与成纤维细胞直接接触时，vδ1+和dnγδt细胞在两周内的生长速率显著降低，从没有成纤维细胞接触的孔中的22.6(sem8.07)倍降低到3.3(sem0.17)倍(图4a)。与单独生长的淋巴细胞相比，这种接触介导的抑制作用进一步得到证实：其中在7天的过程中vδ1中没有cd25、ki-67和转录因子t-bet的上调(图4b)。免疫系统的某些形式的组织介导的控制似乎是维持组织稳态的基础，因为没有这一点，就会存在持续炎症的可能性。基质成纤维细胞对vδ1+和dnγδt细胞的抑制性调节似乎是这种控制的一个实例。
总之，皮肤驻留vδ1+和dnγδt细胞的表型及其惊人的功能潜力反映了预激活的t细胞，其通常通过其邻近的真皮成纤维细胞通过待表征的接触依赖的机制保持在检查中。通过释放与成纤维细胞接触的t细胞来灭活该机制选择性地允许vδ1+和dnγδt细胞的显著扩增，而皮肤中的其他t细胞不受影响。
释放接触介导的抑制作用引起由皮肤vδ1t细胞的细胞毒性th1偏向的细胞因子应答
将混合的皮肤来源的淋巴细胞扩增14天，并且将荧光相关细胞分选用于从γδt细胞中去除αβt细胞，由此可以获得纯度高达90％的γδt细胞。将那些高度富集的细胞以在含有10％的fcs的rpmi培养基中150,000个细胞/孔的浓度沉积到细胞培养孔中，然后在24小时后收集上清液并使用
此外，细胞在扩增过程中产生大量与特应性应答相关的自发性il-13，并与新鲜分离的皮肤来源的tcr激活的γδt细胞形成对照；以非常低的水平产生或根本不产生其他细胞因子(图8)。在用重组mica(nkg2d配体)，抗cd3交联或用pma/离子霉素刺激后，细胞的高效应物电位可以进一步增加。为了评估扩增的γδt细胞对恶性靶细胞的细胞毒性潜力，我们在24小时共培养实验中使用建立的转化细胞系。vδ1+和dnγδt细胞以剂量依赖方式显示出对hela细胞(宫颈)和caco2(结肠)的非常高的细胞毒活性，远优于常规的组织αβt细胞(图5b)。此外，通过使用可溶性单克隆抗体阻断nkg2d受体可强烈抑制γδ-细胞介导的细胞毒性，表明该受体至少部分参与脱阻抑的人皮肤来源的γδt细胞的肿瘤监测。我们还使用其他靶标证实了这些细胞的细胞毒性潜力：hct1954、mdamb231(乳腺癌)和hct116(结肠)(图9)。
人类肠道中的组织驻留γδt细胞
我们还识别了在来自人结肠的网格培养物中表达vδ1t细胞受体的γδt细胞的非造血组织驻留群体(图6)。在3个供体中，在4至5周的时间进程中我们能够使用与用于15个皮肤细胞相同的方法扩增这些细胞。在扩增期间，结肠来源的vδ1+和dnγδt细胞在从富含成纤维细胞的器官型细胞培养物中分离后显示出类似的ki-67上调模式。同样，通过提供nkg2d受体的配体强烈刺激结肠驻留的vδ1+和dnγδt细胞。据报道，在此之前，血液来源的γδt细胞被充分装备以通过cd16表达实现抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，证明与利妥昔单抗联用时靶向cd20阳性b谱系淋巴瘤的细胞毒性增强。类似地，当用单克隆抗体靶向时，慢性淋巴细胞白血病(cll)和her2阳性乳腺癌细胞被更有效地杀伤(31)。为了评估皮肤衍生的vδ1t细胞靶向抗体调理的靶细胞的潜力，我们检查了三种igg1相关的fc受体cd16、cd32和cd64的表达水平。皮肤来源的vδ1t细胞表达少量水平的fc受体cd16，但对高亲和力igg受体cd64显示出良好的表达水平(图11)。因此，组织来源的vδ1t细胞可被充分装备以用作单克隆抗体疗法例如cd20或her2疗法的佐剂，因为它们将被抗体引导至恶性肿瘤和转移瘤的旁边，识别调理的肿瘤细胞并通过adcc杀伤靶标。
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