本申请要求2015年12月4日提交的美国临时专利申请no.62/263,470和2015年12月4日提交的美国临时专利申请no.62/263,573的优先权，两个临时专利申请都以引用的方式整体并入本文中。
有关政府支持的声明
本发明是在政府的支持下依据国立卫生研究院授予的rc2hl101844和美国卫生与公众服务部授予的hhs0100200800064c进行的。政府在本发明中拥有一定的权利。
本发明描述了扩增的脐带血造血干细胞/祖细胞(hspc)的用途。实例包括减少移植排斥反应、诱发免疫耐受性、减少在医疗程序后的全胃肠外营养(tpn)喂养、阿片样物质使用和住院治疗、减少粘膜炎以及减少在同种异体移植后的移植物抗宿主病(gvhd)。
发明背景
us2013/0095079描述了包括cd34+富集和扩增的人类脐带血干细胞(exp-cbsc)的开创性临床产品的研发，此产品可以在患者与临床产品之间无任何程度的免疫学匹配下安全地施用于任何患者。显示exp-cbsc减少免疫抑制患者恢复免疫功能的时间。举例来说，exp-cbsc帮助化学疗法患者比在无exp-cbsc下更快地恢复免疫功能。在习惯于接受脐带血移植作为急性髓细胞性白血病(aml)和急性成淋巴细胞性白血病(all)的治疗后免疫能力严重受损的患者中见到相同的作用。类似地，exp-cbsc帮助这些接受脐带血移植的患者比在无exp-cbsc下更快地恢复免疫功能。通过减少感染、疾病复发和由于免疫功能下降或缺乏而经常致命的其它治疗并发症，exp-cbsc大大地改善了患者效果。
发明概要
本公开提供us2013/0095079中描述的cd34+富集和扩增的人类脐带血干细胞(exp-cbsc)在不同的患者群体中具有额外的不曾预料到的临床益处。举例来说，exp-cbsc减少移植排斥反应，减少在医疗程序后的全胃肠外喂养、阿片样物质使用和住院治疗，减少粘膜炎以及减少在同种异体移植后的移植物抗宿主病(gvhd)。exp-cbsc这些额外的不曾预料到的临床益处还显著地改善患者效果。移植排斥反应、粘膜炎和移植物抗宿主病减少使移植后的存活率和生活质量得到提高。全胃肠外喂养减少避免了可能由这类人工喂养引起的许多并发症。减少患者暴露于阿片样物质使用可以帮助解决正在流行的止痛药滥用问题。最终，减少在医疗程序后的住院治疗使与医疗护理有关的成本下降，且类似地，降低患者在住院治疗时所失去的机会成本。这些用途和益处中的每一个在以下详细描述中更充分地予以描述。个别地和共同地，其提供关于us2013/0095079中描述的exp-cbsc在不同的患者群体中所提供的巨大临床益处的进一步证据。
图示简单说明
图1.显示用于富集cd34+细胞群体并扩增所富集的群体的例示性程序的流程图。
图2.使用本文和us2013/0095079中所述的方法扩增后的细胞表型。
图3.在使用本文和us2013/0095079中所述的方法培养后扩增前和扩增后的绝对细胞数目和扩增倍数。
图4.使用本文和us2013/0095079中所述的方法进行19次全面扩增的开始、结束和扩增后总有核细胞和cd34+细胞数目的扩增倍数。
图5.扩增的人类脐带血干细胞样品中的每一个样品的总有核细胞(tnc)和cd34+细胞计数和在冷冻保存前的细胞活力，以及在使用本文和us2013/0095079中所述的方法扩增后每个冷冻袋中的tnc和cd34+细胞计数。
图6a-6c.delta1ext-igg(dxi)培养的鼠科细胞的输注在主要组织相容性复合体错配的接受者中重建并减轻全身照射(tbi)诱发的死亡率。实验设计(图6a)。对来自b6-ly5a(h-2b，cd45.1)小鼠的lsk进行分选，并在dxi-(5mg/ml)或涂布igg的烧瓶上培养2周。在小鼠用8.5gytbi(137csγ射线)致死性照射之后2-4小时内将新鲜、在培养结束时或预先冷冻保存的dxi或igg培养的细胞静脉内移植到6至8周龄的balb/cj(h-2d，cd45.2)小鼠中。(图6b)：在14天培养结束时igg(上图)和dxi培养(下图)的细胞的流式细胞分析。在移植1×106个新鲜dxi或igg培养的细胞后指示的时间点外周血(pb)和骨髓(bm)中的供体细胞(45.1+)的百分比(图6c)。插图显示在移植后60天来自移植同种异体的dxi培养的细胞的代表性小鼠的pb中的供体细胞的供体(45.1+)细胞(左图)与髓细胞样和t淋巴样谱系分布(右图)的流式细胞分析。pb和bm中供体细胞(45.1+)的百分比±标准平均误差(条)。
图7a-7g.输注冷冻保存的同种异体的dxi培养的细胞诱发供体特异性免疫耐受性并提高皮肤移植物存活率。(图7a)：实验设计。在7.5或8.0-gytbi后2-4小时balb/cj(h-2d)小鼠移植5×106个同基因balb/cj(h-2d)bm细胞(对照小鼠，n＝20)或冷冻保存的同种异体的dxi培养的b6-ly5a(h-2b)细胞(dxi小鼠，n＝33)。(图7b、7c)：在移植后六十天，每只小鼠接受2次皮肤移植物。对照小鼠具有同基因h-2d(n＝9)、同种异体h-2b(n＝13)或第三方h-2k(n＝12)皮肤移植物。dxi小鼠具有同基因h-2d(n＝21)、同种异体h-2b(n＝21)或第三方h-2k(n＝20)皮肤移植物。(图7b)：移植同基因bm细胞的具有h-2d和h-2b或h-2d和h-2k或h-2b和h-2k皮肤移植物的balb/cj(h-2d)小鼠中的代表性皮肤移植物。(图7c)：移植同种异体的dxi培养的细胞的具有h-2d和h-2b或h-2d和h-2k或h-2b和h-2k皮肤移植物的balb/cj(h-2d)小鼠中的代表性皮肤移植物。(图7d)：在外科手术后60天移植dxi培养的细胞的balb/cj小鼠中代表性的健康h-2b(左下图中的箭头和右下图中下面的箭头)和h-2d(右下图中的上面的箭头)皮肤移植物。(图7e–7g)：同基因(h-2d)(对照中的9只和dxi小鼠中的21只)(图7e)、同种异体(h-2b)(对照中的13只和dxi小鼠中的21只)(图7f)和第三方(h-2k)(对照中的12只和20只dxi小鼠)(图7g)皮肤移植物的三十天皮肤移植物存活率。***，p<.001。
图8.在有或者没有离体扩增的祖细胞下接受清髓性脐带血移植的儿科患者的最初住院治疗的平均持续时间。
图9.在有或者没有离体扩增的祖细胞下接受清髓性脐带血移植的儿科患者中的全胃肠外营养(tpn，左图)和阿片剂输注(右图)的平均使用。
图10a-10b.分别为与以未处理的脐带血单元计的总数相比，在离体扩增前后脐带血移植物中所含的cd34+细胞(图10a)和总有核细胞(图10b)的中位数(条)、四分位数间距(盒)和范围(须)。在扩增和组合的未处理的有核细胞数之间有核细胞的数目并非统计学上不同(p＝0.787)；但是，扩增的脐带血中cd34+细胞的数目显著较高(p<0.0001)。与扩增前的值相比，扩增的脐带血中有核细胞和cd34+细胞显著增加(分别p＝0.0006和p<0.0001)。有核细胞扩增1.9的中位倍数(在0.8至6.9范围内)，cd34+细胞扩增40.2的中位倍数(在23.8至123.1范围内)。
图11.接受脐带血移植的患者中离体扩增的细胞和fhcrc历史对照物的接受者中的单元和患者特征。
图12a-12c.3年无病存活率(dfs)(图12a)：离体扩增的细胞的接受者86％(95％ci：56-96)对比对照67％(95％ci：52-78)。按组，累积发生率未复发死亡率(图12b)。在对照组中的患者中移植相关的死亡率(trm)显著较高，离体扩增的细胞的接受者中无trm情况：16％(95％ci：7-27)对比0。按组，累积发生率使死亡率复发(图12c)。2组之间无显著差异：离体扩增的细胞的接受者13％(95％ci：2-34)对比对照16％(95％ci：7-28)。
图13.按组，更严重iii-iv级急性gvhd的累积发生率。接受离体扩增的细胞的患者对比对照组中的患者之间的差异显著：离体扩增的细胞的接受者0％对比对照26％(95％ci：14-38)。
发明详述
us2013/0095079描述了包括cd34+富集和扩增的人类脐带血干细胞(exp-cbsc)的开创性临床产品的研发，此产品可以在患者与临床产品之间无任何程度的免疫学匹配下安全地施用于任何患者。显示exp-cbsc减少免疫抑制患者恢复免疫功能的时间。举例来说，exp-cbsc帮助化学疗法患者比在无exp-cbsc下更快地恢复免疫功能。在习惯于接受脐带血移植作为急性髓细胞性白血病(aml)和急性成淋巴细胞性白血病(all)的治疗后免疫能力严重受损的患者中见到相同作用。类似地，exp-cbsc帮助这些接受脐带血移植的患者比在无exp-cbsc下更快地恢复免疫功能。通过减少感染、疾病复发和由于免疫功能下降或缺乏而经常致命的其它治疗并发症，exp-cbsc大大地改善了免疫抑制后的患者效果。
本公开提供了us2013/0095079中描述的exp-cbsc在不同的的患者群体中具有额外的不曾预料到的临床益处。举例来说，exp-cbsc减少在医疗程序后的移植排斥反应、粘膜炎、全胃肠外喂养、阿片样物质使用和住院治疗，并减少在同种异体移植后的移植物抗宿主病。exp-cbsc在不同的患者群体中的这些额外的不曾预料到的临床益处还显著地改善了患者效果。移植排斥反应、粘膜炎和移植物抗宿主病减少使实体组织和/或同种异体移植后的存活率和生活质量得到提高。全胃肠外喂养减少避免了可能由这类人工喂养引起的许多并发症。减少患者暴露于阿片样物质使用可以帮助解决正在流行的止痛药滥用问题。最终，减少在医疗程序后的住院治疗使与医疗护理有关的成本下降，且类似地，降低患者在住院治疗时所失去的机会成本。这些用途和益处中的每一个在下文中更充分地予以描述。个别地和共同地，其提供关于us2013/0095079中描述的exp-cbsc在不同的患者群体中所提供的巨大临床益处的进一步证据。
在描述exp-cbsc的新用途前，为了完整性，提供有帮助的定义、产生exp-cbsc的方法和其特征。
造血干细胞.造血干细胞是多能的，并最终产生所有类型的终末分化的血细胞。造血干细胞能够自我更新，或者其能够分化成更定型的祖细胞，这些祖细胞不可逆地被确定为仅仅几类血细胞的起源。举例来说，造血干细胞能够分化成(i)髓细胞样的祖细胞，所述髓细胞样的祖细胞最终产生单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红血球、巨核细胞/血小板、树突状细胞，或者(ii)淋巴样祖细胞，所述淋巴样祖细胞最终产生t细胞、b细胞和称为天然杀伤细胞(nk细胞)的淋巴细胞样细胞。一旦干细胞分化成髓细胞样的祖细胞，其后代就无法产生淋巴样谱系细胞，类似地，淋巴样祖细胞无法产生髓细胞样谱系细胞。关于造血和造血干细胞分化的一般论述，参见第17章,differentiatedcellsandthemaintenanceoftissues,alberts等人,1989,molecularbiologyofthecell,第2版,garlandpublishing,newyork,n.y.；regenerativemedicine,departmentofhealthandhumanservices第2章,2006年8月,和hematopoieticstemcells第5章,2009,stemcellinformation,departmentofhealthandhumanservices。
已经研发体外和体内测定来表征造血干细胞，例如免疫缺乏小鼠中的脾集落形成(cfu-s)测定和重建测定。此外，由单克隆抗体识别界定的细胞表面蛋白标志的存在或缺乏已经用于识别和分离造血干细胞。这类标志包括cd34、cd38、cd43、cd45ro、cd45ra、cd59、cd90、cd109、cd117、cd133、cd166和hladr以及其组合。参见regenerativemedicine第2章,departmentofhealthandhumanservices,2006年8月及其中所引用的参考文献。
收集脐带血.人类脐带血和/或人类胎盘血是脐带血干细胞的来源。这类血液可以通过本领域中已知的任何方法获得。脐带血或胎盘血用作干细胞来源提供了许多优点，包括脐带血和胎盘血容易获得并对供体无损伤。关于收集人出生时的脐带血和胎盘血的论述，参见例如美国专利no.5,004,681。在具体的实施方案中，脐带血收集通过颁予goodman等人的美国专利no.7,147,626b2中公开的方法进行。收集应在无菌条件下进行。一旦收集，脐带血或胎盘血应与抗凝剂混合。这类抗凝剂可以是本领域中已知的任何抗凝剂，包括cpd(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖)、acd(酸性柠檬酸盐-葡萄糖)、阿氏液(alsever'ssolution)(alsever等人,1941,n.y.st.j.med.41:126)、德氏液(degowin'ssolution)(degowin等人,1940,j.am.med.ass.114:850)、edglugate-mg(smith等人,1959,j.thorac.cardiovasc.surg.38:573)、劳斯-特纳溶液(rous-turnersolution)(rous和turner,1916,j.exp.med.23:219)、其它葡萄糖混合物、肝素、双香豆乙酸乙酯等等。一般参见hurn,1968,storageofblood,academicpress,newyork,第26-160页)。在具体的实施方案中，可以使用acd。
脐带血可以通过直接从脐带引流和/或通过从娩出的胎盘在根部和扩张静脉进行针抽吸来获得。一般参见美国专利no.5,004,681。
在某些实施方案中，可以按照惯例或者在临床指示下对所收集的血液样品进行以下测试：
(i)细菌培养：为了确保无微生物污染，可以进行已经建立的测定，例如在有氧和缺氧条件下的常规医院细菌培养。
(ii)针对致病微生物的诊断性筛选：为了确保无特定的致病微生物，可以采用多种诊断性测试。针对可通过血液传播的许多病原体中的任一种的诊断性筛选可以通过标准程序来进行。作为一个实例，所收集的血液样品(或者maternal.cndot.blood样品)可以进行针对人类免疫缺陷性病毒-1或2(hiv-1或hiv-2)的存在的诊断性筛选。可以使用许多测定系统中的任一种，基于病毒粒子、病毒编码蛋白、hiv特异性核酸、hiv蛋白质的抗体等的检测。还可以针对其它感染性疾病测试所收集的血液，包括人t细胞亲淋巴病毒i和ii(htlv-i和htlv-ii)、乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒、梅毒、西尼罗病毒(westnilevirus)和如由例如美国食品和药物管理局等相关监管机构指定的其它传染物。
优选地，在收集脐带血前，测定母体健康史以鉴别脐带血细胞在传播例如癌症、白血病、免疫病症、神经病症、肝炎或aids等遗传或感染性疾病中可能造成的风险。所收集的脐带血样品可以进行针对细胞活力、hla分型、abo/rh分型、cd34+细胞计数和总有核细胞计数中的一个或多个进行测试。
脐带血干细胞的富集.一旦从出生的单个人收集到脐带血和/或胎盘血，就对血液进行加工以产生富集的造血干细胞群体或者富集的造血干细胞和祖细胞群体，形成脐带血干细胞群体。相对于其它类型的造血细胞，造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞可以对在造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞上以增加水平表达的特定标志呈阳性。举例来说，这类标志可以是cd34、cd43、cd45ro、cd45ra、cd59、cd90、cd109、cd117、cd133、cd166、hladr或其组合。相对于其它类型的造血细胞，造血干细胞或造血干细胞和祖细胞还可以对特定标志呈阴性。举例来说，lin是用作阴性标志的谱系特异性抗体的组合。cd38也提供了阴性标志的一个实例。优选地，造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞是cd34+细胞。优选地，cb干细胞群体富集cd34+干细胞或者cd34+干细胞和祖细胞(因此t细胞耗尽)。因此，富集是指使样品中的造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞的百分比增加(相对于富集程序前样品中的百分比)的方法。纯化是富集的一个实例。在具体的实施方案中，相对于富集程序前的样品，呈富集样品中细胞百分比的cd34+细胞(或者其它合适的抗原阳性细胞)数目的增加是5倍、50倍、100倍、200倍、350倍或更多倍。在具体的实施方案中，使用cd34之单克隆抗体和将cd34+细胞分离出的磁性细胞分离装置富集cd34+细胞，所述抗体结合于磁性珠粒。
在具体的实施方案中，在进行加工以供富集前，所收集的脐带血和/或胎盘血是新鲜的，且尚未预先冷冻保存。
本领域中已知的用于细胞分离/选择的任何技术都可以用于富集造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞。举例来说，可以使用依赖于细胞表面标志的差异表达的方法。举例来说，表达细胞表面标志cd34的细胞可以使用cd34的单克隆抗体以阳性方式选择，以便表达cd34的细胞保留，而未表达cd34的细胞不保留。此外，所采用的分离技术应将待选择的细胞的活力最大化。所采用的具体技术将取决于分离效率、方法的细胞毒性、执行的容易性和速度以及先进设备和/或专门技能的必要性。
用于分离的程序可以包括使用抗体涂布的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱法、与单克隆抗体接合或结合单克隆抗体使用的细胞毒性剂(例如补体和细胞毒素)和用附接于固体基质、例如平板的抗体“淘选”或者其它适宜的技术。提供准确的分离/选择的技术包括荧光活化细胞分选术，其可以具有不同程度的复杂性，例如多个色彩通道、低角度和钝角光散射检测通道等等。
抗体可以与标志结合，例如允许直接分离的磁性珠粒、可以用结合于载体的抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素去除的生物素、可以与荧光活化细胞分选器一起使用的荧光染料等等以容易地分离具体的细胞类型。可以采用对所选细胞的活力不会过度有害的任何技术。
在具体的实施方案中，对新鲜的脐带血单元进行加工以使用直接或间接结合于磁性粒子的抗cd34抗体，结合磁性细胞分离器，例如
在具体的实施方案中，可以在富集造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞前汇集一个或多个脐带血和/或胎盘血样品。在具体的实施方案中，可以在富集造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞后汇集个别的cb干细胞样品。在具体的实施方案中，所汇集的脐带血和/或胎盘血样品或者cb干细胞样品的数目是2或更多(例如2、3、7、15、35)。在具体的实施方案中，不考虑存在的细胞的hla类型，汇集脐带血和/或胎盘血样品或者cb干细胞样品。在具体的实施方案中，不考虑意指不采取措施来测定池中样品之间的hla匹配程度。在某些实施方案中，池中的样品源自于例如非裔美国人、白种人、亚洲人、拉丁美洲人、美洲土著、澳大利亚土著、因纽特人、太平洋岛民的相同种族的个体的脐带血和/或胎盘血，或者源自于例如爱尔兰人、意大利人、印度人、日本人、中国人、俄罗斯人等相同族群的个体的脐带血和/或胎盘血。
任选地，在富集造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞前，可以分离脐带血的红血球和白血球。一旦已经分离红血球和白血球，那么可以丢弃红血球部分，并可以在如上磁性细胞分离器中加工白细胞部分。可以通过本领域中已知的任何方法，包括离心技术来分离白血球和红血球部分。可以使用的其它分离方法包括使用市售产品ficolltm或者ficoll-paquetm或者percolltm(gehealthcare,piscataway,n.j.)。ficoll-paquetm通常位于锥形管的底部，且全血位于上层。在离心后，以下层将在锥形管中自上而下可见：血浆和其它成分、含有外周血单核细胞的称为白膜层的单核细胞层(白细胞)、ficoll-paquetm以及应呈球粒形式存在的红血球和粒细胞。这项分离技术容易收获外周血单核细胞。
任选地，在cd34+细胞选择前，可以检查新鲜脐带血单元的等分试样的总有核细胞计数和/或cd34+含量。在具体的实施方案中，在cd34+细胞选择后，回收cd34+(“cb干细胞”)和cd34-细胞部分。任选地，可以从cd34-细胞部分的样品提取出dna，以供初始hla分型和将来嵌合性研究，即使未与患者进行hla匹配。随后可以在扩增前加工cd34+富集的干细胞部分(“cb干细胞”)，例如干细胞可以悬浮在适当细胞培养基中以供输送或存储。在具体的实施方案中，细胞培养基包括stemspantm无血清扩增培养基(stemcelltechnologies,vancouver,britishcolumbia)，其补充有重组人类白细胞介素-3(rhil-3；例如10ng/ml或者本文所述的其它浓度)、重组人类白细胞介素-6(rhil-6；例如50ng/ml或本文所述的其它浓度)、重组人类血小板生成素(rhtpo；50ng/ml或本文所述的其它范围)、重组人类flt-3配体(rhflt-3l；例如50ng/ml或本文所述的其它浓度)和重组人类干细胞因子(rhscf；例如50ng/ml或本文所述的其它浓度)。
在具体的实施方案中，脐带血和/或胎盘血样品耗尽红细胞，并计算红细胞耗尽部分中的cd34+细胞数目。在具体的实施方案中，通过上述富集方法可以富集含有超过3.5×106个细胞的脐带血和/或胎盘血样品，但是，也可以使用含有少于3.5×106个细胞的样品。
脐带血干细胞扩增的方法.在根据上述富集方法或者本领域中已知的其它方法从收集自一个或多个人出生时的人类脐带血和/或人类胎盘血分离cb干细胞后，扩增cb干细胞以增加例如cd34+细胞的造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞的数目。可以使用本领域中已知的用于扩增cb干细胞的数目，产生扩增的cb干细胞的任何方法。cb干细胞可以在细胞生长条件(例如促进有丝分裂)下培养，使得cb干细胞生长并分裂(增殖)，获得扩增的cb干细胞群体。在具体的实施方案中，不考虑细胞的hla类型，在扩增技术之前或之后，可以汇集各源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血的个别cb干细胞群体。在具体的实施方案中，扩增的样品不是一池样品。在具体的实施方案中，用于扩增的技术是已经显示以下的技术：(i)相对于未扩增的cb干细胞样品，使扩增样品中造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞、例如cd34+细胞的数目增加；和/或(ii)相对于在未扩增的样品下所见，如输注扩增的样品的nod/scid小鼠中增强的植入所示，通过限制稀释分析确定，扩增的样品中scid再生细胞的数目增加，其中未扩增的样品和扩增的样品来自于相同样品的不同等分试样，其中扩增的样品进行扩增技术，而未扩增的样品不进行扩增技术。在某些实施方案中，相对于未扩增的cb干细胞样品，所述技术使扩增的样品中造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞的数目增加5倍、75倍、100倍、200倍、350倍或500倍。造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞可以对cd34、cd43、cd45ro、cd45ra、cd59、cd90、cd109、cd117、cd133、cd166和hladr中的一个或多个呈阳性，和/或对lin和/或cd38呈阴性。在具体的实施方案中，可以通过检测相对于输注未扩增的样品的等分试样的小鼠，在例如输注后10天、3周或者9周，输注扩增的样品的等分试样的小鼠的骨髓中的人类cd45+细胞百分比的增加，检测增强的植入(参见delaney等人,2010,naturemed.16(2):232-236)。
这类扩增技术包括以下中描述的扩增技术：美国专利第7,399,633号；delaney等人,2010,naturemed.16(2):232-236；zhang等人,2008,blood111:3415-3423；和himburg等人,2010,naturemed.16,475-482，以及利用如wo/2013/086436中所述的芳烃受体拮抗体、如wo/2013/179633中所述的lilrb2激动剂和水凝胶(例如两性离子型水凝胶)的扩增，以及如下所述的扩增技术。
在具体的实施方案中，cb干细胞与生长因子一起培养并暴露于细胞生长条件(例如促进有丝分裂)，使得干细胞增殖，获得扩增的cb干细胞群体。在具体的实施方案中，cb干细胞与有效抑制分化的量的notch功能激动剂一起培养并暴露于细胞生长条件(例如促进有丝分裂)，使得cb干细胞增殖，获得扩增的cb干细胞群体。在具体的实施方案中，cb干细胞与有效抑制分化的量的notch功能激动剂一起并在生长因子存在下培养，并暴露于细胞生长条件(例如促进有丝分裂)，使得cb干细胞增殖，获得扩增的cb干细胞群体。由此获得的扩增的cb干细胞群体可以冷冻并存储以供后面使用。任选地，在移植到患者前，使notch通路激动剂失活或者从扩增的cb干细胞群体去除(例如通过分离、稀释)。
在特定实施方案中，cb干细胞培养2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天或更多天；或者在具体的实施方案中，cb干细胞培养至少10天。
zhang等人,2008,blood111:3415-3423中阐述用于扩增cb干细胞的其它例示性培养条件。在具体的实施方案中，cb干细胞可以在补充有肝素、干细胞因子、血小板生成素、胰岛素样生长因子-2(igf-2)、成纤维细胞生长因子-1(fgf-1)和angpt13或angpt15的无血清培养基中培养。在具体的实施方案中，培养基补充有10μg/ml肝素、10ng/ml干细胞因子、20ng/ml血小板生成素、20ng/mligf-2、10ng/mlfgf-1和100ng/mlangpt13或angpt15，并将细胞培养19-23天。在具体的实施方案中，cb干细胞可以通过在补充有10μg/ml肝素、10ng/ml干细胞因子、20ng/ml血小板生成素、10ng/mlfgf-1和100ng/mlangpt15的无血清培养基中培养cb干细胞11-19天来扩增。在具体的实施方案中，cb干细胞可以通过在补充有50ng/ml干细胞因子、10ng/ml血小板生成素、50ng/mlflt-3受体配体和100ng/ml胰岛素样生长因子结合蛋白-2(igfbp2)或者500ng/mlangpt15的无血清培养基中培养cb干细胞10天来扩增。在具体的实施方案中，cb干细胞可以通过在补充有10μg/ml肝素、10ng/ml干细胞因子、20ng/ml血小板生成素、10ng/mlfgf-1、500ng/mlangpt15和500ng/mligfbp2的无血清培养基中培养cb干细胞11天来扩增。参见zhang等人,2008,blood111:3415-3423。
himburg等人,2010,naturemed.,16,475-482中阐述用于扩增cb干细胞的例示性培养条件。在具体的实施方案中，cb干细胞可以在补充有血小板生成素、干细胞因子、flt-3受体配体和多效生长因子的液体悬浮液培养物中培养。在具体的实施方案中，液体悬浮液培养物补充有20ng/ml血小板生成素、125ng/ml干细胞因子、50ng/mlflt-3受体配体和10、100、500或1000ng/ml多效生长因子并将cb干细胞培养7天。
在具体的实施方案中，在扩增cb干细胞后，测定细胞和活cd34+细胞的总数以测量样品提供造血功能的效力。许多临床研究已经表明干细胞移植物中的总有核细胞剂量和cd34+细胞剂量与嗜中性粒细胞和血小板植入以及干细胞移植后移植物失败和早期移植相关的并发症(主要是致命性感染)的发生率高度相关。举例来说，在扩增期间培养开始后5-8天，可以获取样品，用于测定总的活有核细胞计数。此外，cd34+细胞的总数可以通过多参数流式细胞术测定，因此确定样品中cd34+细胞的百分比。类似地，在冷冻保存前或解冻后，可以获取扩增的cb干细胞样品的等分试样，用于测定总有核细胞和活cd34+细胞的百分比，以计算扩增的cb干细胞样品中总的活cd34+细胞数目。
在具体的实施方案中，总的活cd34+(或者其它抗原阳性)细胞数目可以视为释放最终产物供治疗使用的效力测定。活力可以通过本领域中已知的任何方法，例如通过锥虫蓝排除或者7-aad排除来测定。在具体的实施方案中，总有核细胞计数(tnc)和其它数据用于计算产物效力。活cd34+细胞的百分比可以通过流式细胞术和使用活细胞排除的染剂来评定。活cd34+细胞的百分比＝样品等分试样中排除7-aad(或者其它适当染剂)的cd34+细胞的数目除以等分试样的tnc(活与非活)。样品中的活cd34+细胞可以如下计算：活cd34+细胞＝样品的tnc×样品中的活cd34+细胞％。在富集或扩增期间活cd34+细胞的成比例增加可以如下计算：培养后总的活cd34+细胞/培养前总的活cd34+细胞。将显而易见的是，可以使用除cd34以外或者除cd34外的抗原。
notch激动剂.在具体的实施方案中，通过在notch功能激动剂和一种或多种生长因子或细胞介素存在下培养细胞给定时间段来扩增cb干细胞。可以在本领域中已知的任何合适的培养基/条件下培养cb干细胞(参见例如freshneycultureofanimalcells,wiley-liss,inc.,newyork,n.y.(1994))。培养时间是足以产生如本文中定义的扩增的cb干细胞群体的时间。举例来说，cb干细胞可以在无血清培养基中在notch功能激动剂和一种或多种生长因子或细胞介素存在下培养2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天；或者在具体的实施方案中，培养至少10天。任选地，在培养期期间的任一点，培养基可以替换为新鲜的培养基或者可以添加新鲜的培养基。
notch激动剂是促进，即引起或增加notch通道功能活化的试剂。如本文所用，“notch通道功能”应意指由notch信号传导(信号转导)通道介导的功能，包括notch细胞内结构域的核转位、rbp-jκ或其果蝇同源无毛抑制因子的核转位；活化分裂复合物增强因子的bhlh基因，例如mastermind；活化hes-1基因或kbf2(又称为cbf1)基因；抑制果蝇成神经细胞分离；和notch与delta、jagged/serrate、fringe、deltex或rbp-jκ/无毛抑制因子或者其同源物或类似物的结合。关于notch信号转导通道和其对活化的作用的论述，一般参见kopan等人,2009,cell137:216-233的评论文章；又见jarriault等人,1998,mol.cell.biol.18:7423-7431。
notch活化通过将细胞暴露于notch激动剂来进行。notch激动剂可以是可溶性分子、在细胞表面上重组表达的分子、在前驱细胞暴露于的细胞单层上的分子或者固定在固相上的分子。例示性notch激动剂是细胞外结合配体delta和serrate，其结合于notch的细胞外结构域并活化notch信号转导；或者结合于notch的细胞外结构域并活化notch信号转导的delta或serrate的片段。已经从包括人在内的若干物种，分离delta和serrate的核酸和胺基酸序列，为本领域中已知，并在国际专利公布no.wo93/12141、wo96/27610、wo97/01571、gray等人,1999,am.j.path.154:785-794中公开。在具体的实施方案中，notch激动剂是包括与myc抗原决定基标签(分别deltaext-myc或serrateext-myc)融合的delta或serrate蛋白质的细胞外结构域的所述蛋白质的固定片段；或者包括与igg之fc部分(分别deltaext-igg或serrateext-igg)融合的delta或serrate蛋白质的细胞外结构域的所述蛋白质的固定片段。notch激动剂包括notch蛋白质和其类似物和衍生物(包括片段)；作为notch通道的其它元件的蛋白质和其类似物和衍生物(包括片段)；其抗体和含有结合区的此类抗体的片段或其它衍生物；编码蛋白质的核酸和衍生物或类似物；以及结合或以其它方式与notch蛋白质或notch通道中的其它蛋白质相互作用，以便促进notch通道活性的蛋白质和其衍生物和类似物。这类激动剂包括包括细胞内结构域的notch蛋白质和其衍生物、编码以上的notch核酸和包括notch配体的notch相互作用结构域(例如delta或serrate的细胞外结构域)的蛋白质。其它激动剂包括rbpr/无毛抑制因子或deltex。fringe可以用于提高notch活性，例如与delta蛋白质结合。这些蛋白质、其片段和衍生物可以重组表达和分离或者可以化学合成。
在具体的实施方案中，notch激动剂是重组表达对notch起促效作用的蛋白质或其片段或衍生物的细胞。细胞以对cb干细胞适用的方式表达notch激动剂，在cb干细胞中notch信号转导将被活化，例如其分泌、表达在细胞表面上等。
在具体的实施方案中，notch激动剂是结合于notch信号传导通道的成员的肽模拟物或肽类似物或有机分子。这类激动剂可以通过选自本领域中已知的测定的结合测定，例如rebay等人,1991,cell67:687-699和国际专利公布no.wo92/19734中所述的细胞集合测定鉴别。
在具体的实施方案中，激动剂是至少包括由介导与notch蛋白质或notch片段的结合的notch相互作用基因编码的蛋白质的片段的蛋白质，所述notch片段含有负责与激动剂蛋白质的结合的notch区，例如notch的表皮生长因子样重复11和12。如本文所用，notch相互作用基因应意指基因notch、delta、serrate、rbpjκ、无毛抑制因子和deltex，以及可以根据序列同源性或遗传相互作用鉴别的delta/serrate家族或deltex家族的其它成员，且更通常地，通过分子相互作用(例如体外结合或遗传相互作用(如例如在果蝇中在表型上所描绘)鉴别的“notch级联”或“notch组”基因的成员。美国专利no.5,648,464、5,849,869和5,856,441中描述了含有负责与notch的结合的区域的notch结合蛋白的例示性片段。
notch激动剂可以通过商业获得，通过重组表达而产生，或化学合成。
在具体的实施方案中，细胞暴露于notch激动剂不是通过与在细胞表面上重组表达notch配体的其它细胞一起培育(虽然在其它实施方案中，可以使用这种方法)来进行，而是通过暴露于非细胞notch配体，例如与非细胞notch配体一起培育，所述配体固定在固相表面上，例如固定在组织培养盘的表面上。
在特定实施方案中，通过notch配体(例如delta、serrate)与notch受体的细胞外部分结合来促进notch活性。notch信号传导似乎是由notch的细胞外结构域与其膜结合于相邻细胞上或者固定在固体表面上的配体之间的物理相互作用触发的。全长配体是notch激动剂，因为其在一个细胞上的表达触发了表达notch受体的相邻细胞中此通道的活化。已经固定在例如组织培养板等固体表面上的可溶性的截短的delta或serrate分子，包括蛋白质的细胞外结构域或其notch结合部分，尤其青睐notch通道激动剂。这类可溶性蛋白质可以通过抗体或相互作用蛋白质，例如针对delta或serrate一起表达为融合蛋白的抗原决定基标签(例如myc抗原决定基标签，其由抗体9e10识别)的抗体或与delta或serrate一起表达为融合蛋白的抗原决定基标签(例如免疫球蛋白抗原决定基标签，其由蛋白a结合)相互作用的蛋白质，固定在固体表面上。
在具体的实施方案中并如颁予artavanis-tsakonas等人的美国专利no.5,780,300中所述，notch激动剂包括对介导为notch或notch信号传导通道的成员活化所需的成熟或加工步骤的细胞过程有促进或者活化作用的试剂，例如弗林蛋白酶样转化酶，其为notch加工所需；kuzbanian，其为被认为是notch上游或平行的notch通道活化所需要的金属蛋白酶-解联蛋白(adam)(schlondorff和blobel,1999,j.cellsci.112:3603-3617)；或更通常地，细胞运输和加工蛋白质，例如为细胞隔室之间的移动所需要的gtpase的rab家族(关于rabgtpase的评论参见olkkonen和stenmark,1997,int.rev.cytol.176:1-85)。激动剂可以是增加以上过程中的一种过程的活性的任何分子，例如编码弗林蛋白酶、kuzbanian或rab蛋白质的核酸，或其片段或衍生物或主要活性突变体，或结合以上蛋白质并活化以上蛋白质的功能的肽模拟物或肽类似物或有机分子。
美国专利no.5,780,300进一步公开了可以用于活化notch通道的notch激动剂分子的类别(和其鉴别方法)，例如触发notch锚蛋白重复序列与rbp-jκ的解离，从而促进rbp-jκ从细胞质转位到核的分子。
生长因子/细胞介素.在具体的实施方案中，通过在notch功能促效剂和一种或多种生长因子或细胞介素存在下培养细胞给定时间段来扩增cb干细胞。可替代地，通过在一种或多种生长因子或细胞介素存在下培养细胞给定时间段来扩增cb干细胞。在实现cb干细胞扩增而无分化下，cb干细胞在支持生长而非分化的生长因子存在下培养。生长因子可以是促进细胞增殖和/或存活的任何类型的分子，例如蛋白质或化合物。
cb干细胞暴露于一种或多种生长因子可以在细胞暴露于notch激动剂之前、同时或之后进行。在特定例示性实施方案中，扩增培养基中存在的生长因子包括以下生长因子中的一种或多种：干细胞因子(scf)，又名c-kit配体或肥大细胞生长因子；flt-3配体(flt-3l)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-3(il-3)、白细胞介素-11(il-11)和血小板生成素(tpo)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、血管生成素样蛋白质(angptls)(angptl2、angptl3、angptl5、angptl7和mfap4)、胰岛素生长因子-2(ifg-2)、成纤维细胞生长因子-1(fgf-1)。scf、flt-3l、il-6或tpo的量可以在10-1000ng/ml，在具体的实施方案中，50-500ng/ml，且在具体的实施方案中，100-300ng/ml范围内。在具体的实施方案中，scf、flt-3l、il-6或tpo的量是100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml、300ng/ml、325ng/ml、350ng/ml、375ng/ml、400ng/ml、425ng/ml或450ng/ml。1l-3、il-11、g-csf或gm-csf的量可以在2-200ng/ml，在具体的实施方案中，5-50ng/ml，且在具体的实施方案中，7.5-25ng/ml，且在具体的实施方案中，10-15ng/ml范围内。在具体的实施方案中，1l-3ng/ml、il-11ng/ml、g-csf或gm-csf的量是5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、12.5ng/ml或15ng/ml。
在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在上面结合有细胞外基质蛋白的组织培养盘中培养。在具体的实施方案中，细胞外基质蛋白粘连蛋白(fn)或其片段。这类片段可以是ch-296(dao等人,1998,blood92(12):4612-21)或
在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体(例如delta的细胞外结构域)和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各100ng/ml的scf和tpo以及10ng/mlgm-csf存在下培养。在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各100ng/ml的scf、flt-3l、tpo和il-6以及10ng/mlil-3存在下培养。在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各100ng/ml的scf和flt-3l以及各10mg/ml的g-csf和gm-csf存在下培养。在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各100ng/ml的scf、flt-3l和tpo以及10mg/mlgm-csf存在下培养。在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各300ng/ml的scf和flt-3l、各100ng/ml的tpo和il-6以及10mg/mlil-3存在下培养。在具体的实施方案中，为扩增cb干细胞，将细胞在含有固定的delta配体和粘连蛋白的塑料组织培养盘上在各100ng/ml的scf、flt-3l和tpo以及各10mg/ml的g-csf和gm-csf存在下培养。在具体的实施方案中，粘连蛋白从组织培养盘排除或替代为另一细胞外基质蛋白。关于扩增cb干细胞的另外的例示性培养条件，又见颁予bernstein等人的美国专利no.7,399,633b2。
生长因子可以通过商业获得，通过重组表达而产生，或化学合成。举例来说，flt-3l(人)、igf-1(人)、il-6(人和小鼠)、il-11(人)、scf(人)、tpo(人和鼠科动物)可以从sigma(st.louis,mo.)购得。il-6(人和鼠科动物)、il-7(人和鼠科动物)和scf(人)可以从lifetechnologies,inc.(rockville,md.)购得。
在其它实施方案中，生长因子通过重组表达或通过化学肽合成(例如通过肽合成器)而产生。生长因子核酸和肽序列一般可以从genbank获得。
在具体的实施方案中，用于在notch激动剂存在下扩增cb干细胞的生长因子源自于与cb干细胞相同的物种。
适合于扩增cb干细胞的生长因子的量或浓度将取决于生长因子制剂的活性，以及生长因子与cb干细胞之间的物种对应等。一般地，当生长因子和cb干细胞属于相同物种时，培养基中生长因子的总量在1ng/ml至5μg/ml，在具体的实施方案中，5ng/ml至1μg/ml，且在具体的实施方案中，10ng/ml至200ng/ml范围内。在具体的实施方案中，通过将cb干细胞暴露于notch激动剂和100ng/mlscf来扩增cb干细胞。在具体的实施方案中，通过将cb干细胞暴露于notch激动剂和各100ng/ml的flt-3l、il-6和scf以及10ng/mlil-11来扩增cb干细胞。
冷冻保存和解冻冷冻保存.一旦在从脐带血扩增cb干细胞后获得扩增的cb干细胞群体，扩增的cb干细胞群体就可以冷冻保存。在具体的实施方案中，扩增的cb干细胞群体可以分开并冷冻在一个或多个袋(或单元)中。在具体的实施方案中，可以将两个或更多个扩增的cb干细胞群体汇集，分成单独的等分试样，并冷冻每个等分试样。在具体的实施方案中，扩增的cb干细胞是新鲜的，即其在扩增或冷冻保存前未曾预先冷冻。术语“冷冻(frozen)/冷冻(freezing)”和“冷冻保存(cryopreserved)/冷冻保存(cryopreserving)”在本申请中可互换使用。冷冻保存可以通过本领域中已知的冷冻呈活的形式的细胞的任何方法。冷冻细胞通常具有破坏性。冷却时，细胞内部的水冻住。接着通过细胞膜上的渗透效应、细胞脱水、溶质浓缩和形成冰晶而产生损伤。因为在细胞外面形成冰，所以可用的水分从溶液中除去并从细胞中抽出，引起渗透脱水和溶质浓度升高，最终将破坏细胞。关于论述参见mazur,p.,1977,cryobiology14:251-272。
可以通过以下来防止这些有害的作用发生：(a)使用防冻剂；(b)控制冷冻速率；和(c)在足够低的温度下存储以使降解反应最小。
可以使用的防冻剂包括二甲亚砜(dmso)(lovelock和bishop,1959,nature183:1394-1395；ashwood-smith,1961,nature190:1204-1205)、丙三醇、聚乙烯吡咯烷(rinfret,1960,ann.n.y.acad.sci.85:576)、聚乙二醇(sloviter和ravdin,1962,nature196:548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤藓醇、d-核糖醇、d-甘露糖醇(rowe等人,1962,fed.proc.21:157)、d-山梨糖醇、i-肌醇、d-乳糖、氯化胆碱(bender等人,1960,j.appl.physiol.15:520)、氨基酸(phanthetran和bender,1960,exp.cellres.20:651)、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯(lovelock,1954,biochem.j.56:265)和无机盐(phanthetran和bender,1960,proc.soc.exp.biol.med.104:388；phanthetran和bender,1961,radiobiology,proceedingsofthethirdaustralianconferenceonradiobiology,ilbery编辑,butterworth,london,第59页)。在具体的实施方案中，使用dmso，其为在低浓度下对细胞无毒。作为小分子，dmso自由地渗透细胞并通过与水组合以改变其抗冻性且防止因结冰而损坏，保护细胞内细胞器。添加血浆(例如至20-25％的浓度)可以加强dmso的保护作用。
控制的缓慢冷却速率可能是关键的。不同的防冻剂(rapatz等人,1968,cryobiology5(1):18-25)和不同的细胞类型具有不同的最佳冷却速率(关于冷却速度对骨髓干细胞的存活和对其移植潜能的作用，参见例如rowe和rinfret,1962,blood20:636；rowe,1966,cryobiology3(1):12-18；lewis等人,1967,transfusion7(1):17-32；和mazur,1970,science168:939-949)。应使水结成冰的融结(fusion)阶段的热减至最少。冷却程序可以通过使用例如可编程的冷冻装置或甲醇浴程序进行。
可编程的冷冻设备允许确定最佳的冷却速率并促进标准的可再生的冷却。可编程的控制速率的制冷机，例如cryomed或planar，允许将冷冻方案调至所需冷却速率曲线。举例来说，对于10％dmso和20％血浆中的骨髓细胞，最佳速率是从0℃至-80℃为1℃至3℃/分钟。在具体的实施方案中，此冷却速率可以用于新生细胞。容纳细胞的容器在冷冻温度下必须是稳定的，并允许快速传热以有效控制冷冻与解冻。密封塑料小瓶(例如nunc、wheatoncryules)或玻璃安瓿可以多次少量(1-2ml)使用，而大的体积(100-200ml)可以冷冻在聚烯烃袋(例如dehned)中，聚烯烃袋固定在金属板之间以在冷却期间更好地传热。已经通过放在-80℃下，成功地冷冻骨髓细胞袋，意外地，此得到3℃/分钟的冷却速率。
在具体的实施方案中，可以使用甲醇浴冷却法。甲醇浴法非常适合于多个小项目大规模的日常冷冻保存。所述方法不需要人工控制冷冻速率，也不需要记录器来监测速率。在具体的实施方案中，将dmso处理过的细胞在冰上预先冷却，并转移至含有冷却甲醇的托盘，然后将其放在机械制冷机(例如harris或revco)中-80℃下。甲醇浴和样品的热电偶测量指示1℃至3℃/分钟的所需冷却速率。在至少两小时后，样品到达-80℃的温度，且可以直接放到液氮(-196℃)中以长久存储。
在彻底冷冻后，扩增的cb干细胞可以转移至长期冷冻存储容器中。在具体的实施方案中，样品可以冷冻存储在液氮(-196℃)或其蒸气(-165℃)中。通过利用高效率的液氮制冷机，大大地促进这类存储，所述制冷机类似大的thermos容器，具有极低真空和内部超级绝热，因此保持热漏和氮损失绝对最低。
合适的托架系统可以购得，并可以用于对个别样品进行编目录、存储和检索。
用于操控、冷冻保存和长期存储尤其来自骨髓或外周血的造血干细胞的考虑因素和程序基本上适用于扩增的cb干细胞。这类讨论可以例如在以引用的方式并入本文中的以下参考文献中找到：gorin,1986,clinicsinhaematology15(1):19-48；bone-marrowconservation,cultureandtransplantation,proceedingsofapanel,moscow,1968年7月22-26日,internationalatomicenergyagency,vienna,第107-186页。
可以利用活细胞冷冻保存的其它方法或其改良法并设想其供使用(例如冷金属镜技术；livesey和linner,1987,nature327:255；linner等人,1986,j.histochem.cytochem.34(9):1123-1135；又见senkan等人的美国专利no.4,199,022、schwartz的美国专利no.3,753,357、fahy的美国专利no.4,559,298)。
解冻.冷冻细胞优选的迅速解冻(例如在维持在37℃-41℃的水浴中)并在解冻后立即冷藏。在具体的实施方案中，含有冷冻细胞的小瓶可以在温水浴中沉浸到其颈部；缓缓的旋转将确保在解冻时混合细胞悬浮液的并增加热从温水传递至内部冰体。一旦冰完全融化，小瓶就可以立即放入冰中。
在具体的实施方案中，可以在有需要的人类患者中输注解冻的扩增的cb干细胞样品或其一部分，以提供造血功能。可以利用与加工解冻细胞相关的若干程序，且如果认为需要，那么可以采用所述程序。
如果防冻剂在人类中具有毒性，那么在解冻的扩增的cb干细胞的治疗使用前应除去。在采用dmso作为冷冻保存剂的实施方案中，优选地，省略这一步骤，以免细胞损失，因为dmso没有严重的毒性。但是，在需要除去防冻剂的情况下，优选在解冻后实现除去。
一种除去防冻剂的方式是通过稀释至无关紧要的浓度。这可以通过以下来实现：添加培养基，然后必要时离心一次或多次循环以使细胞成球粒，除去上清液和使细胞再悬浮。举例来说，解冻细胞中的细胞内dmso可以减少至不会不利地影响所回收的细胞的水平(少于1％)。这优选地慢慢进行，以可能最低程度地破坏在dmso除去期间出现的渗透梯度。
在除去防冻剂后，可以进行细胞计数(例如通过利用血球计)和活力测试(例如通过锥虫蓝排除；kuchler,1977,biochemicalmethodsincellcultureandvirology,dowden,hutchinson&ross,stroudsburg,pa.,第18-19页；1964,methodsinmedicalresearch,eisen等人编辑,第10卷,yearbookmedicalpublishers,inc.,chicago,第39-47页)以证实细胞存活。样品中活的抗原(例如cd34)阳性细胞的百分比可以通过计算样品的等分试样中排除7-aad(或活细胞排除的其它合适的染料)的抗原阳性细胞的数目，除以样品的等分试样中有核细胞的总数(tnc)(活与非活)来确定。接着样品中活的抗原阳性细胞的数目可以通过将活的抗原阳性细胞的百分比乘以样品的tnc来确定。
在冷冻保存前和/或解冻后，可以测定有核细胞的总数，或在具体的实施方案中，测定cd34+或cd133+细胞的总数。举例来说，总有核细胞计数可以通过使用血球计和锥虫蓝染料的排除进行。具有高细胞性的样品可以稀释至适合于手工计数的浓度范围。产物的最终细胞计数相对于任何稀释因子进行校正。总有核细胞计数＝每毫升活有核细胞×产物体积(以毫升为单位)。样品中cd34+或cd133+阳性细胞的数目可以例如通过使用流式细胞术，使用结合于荧光染料的抗cd34或抗cd133单克隆抗体来测定。
在某些实施方案中，起始脐带血和/或胎盘血、cb干细胞和冷冻保存前的扩增的cb干细胞或解冻后的扩增的cb干细胞的身份和纯度可以经受多参数流式细胞免疫表型分析，这提供了样品中存在的活的抗原阳性细胞的百分比。使用一组直接结合于荧光染料的单克隆抗体，针对以下细胞表型中的一种或多种，测试每一样品：1.cd34+hpc；2.t细胞(cd3+，包括cd4+与cd8+子集)；3.b细胞(cd19+或cd20+)；4.nk细胞(cd56+)；5.单核细胞(cd14+)；6.骨髓单核细胞(cd15+)；7.巨核细胞(cd41+)；8.树突状细胞(谱系阴性/hla-dr亮和cd123亮，或谱系阴性/hla-dr亮和cd11c亮)。
以下提供了一种基于刚刚描述的方法的特定的例示性方案。可以从出生时的单个人收集脐带血/胎盘血单元。接着可以将所收集的血液与抗凝剂混合以防凝固。血液可以被隔离存储在受监测的制冷机中于4℃下。可以评定所收到的单元，并且可以确定将加工哪些单元用于扩增。可以收集关于单元的以下信息：收到日期、单元时龄、供体胎龄(以周为单位)、供体性别和单元体积。此外，可以确定每一单元的总有核细胞计数和总cd34+细胞计数，且可以计算cd34+细胞百分比。当选择一单元用于扩增时，可以将其除去隔离，并分配独特的批号标识符，其可以在整个制造过程中都保留此批号标识符。
在计划的扩增培养开始前，可以首先将组织培养容器用含2.5μg/mldelta1ext-igg和5μg/ml
可以将cd34+富集的细胞加入特别标记和准备的组织培养容器(例如以≤每平方厘米容器表面积1.8×104总有核细胞)，并接着放入仅仅用于该批产物的个别监测和发警报的孵育箱中。培养2-4天后，可以将原始体积50％的新鲜培养基(如上)加入容器。可以周期性地(每1-3天)从孵育箱除去细胞培养容器，并通过倒置显微镜检查细胞生长和污染迹象。在第5-8天，可以轻轻地搅动容器以将细胞混合，且可以移出1ml样品以供过程中的测试用。可以对细胞的样品进行计数并针对cd34、cd7、cd14、cd15和cd56的表达进行表型分析。在整个培养期内，当细胞密度增加至≥8×105个细胞/毫升时可以根据需要将细胞转移至另外的烧瓶。在收获细胞进行冷冻保存前一天，可以加入新鲜培养基。
在第14天-第16天，可以收获扩增的细胞群体进行冷冻保存。可以搅动容器并将整个内含物转移至无菌的500ml离心管。可以对收获的细胞进行离心，并接着在pbs中通过离心洗涤一次，并再悬浮于含有hsa、normosol-r(hospira,lakeforrest,iii.)和二甲亚砜(dmso)的防冻溶液中。可以获取样品以完成放行测试。可以在控制速率的冷冻机中冷冻扩增的cb干细胞群体产物，并转移至在汽相液氮(ln2)冷冻机中存储。
在培养期结束时，所得到的细胞群体应是非均质的，包括cd34+祖细胞和更成熟的髓细胞样的和淋巴样前驱物，如通过流式细胞分析针对cd34、cd7、cd14、cd15和cd56抗原的存在所证明。图2中呈现了在扩增期结束时通过此过程扩增的细胞的典型流式细胞术表征。
在培养期期间cd34+和总细胞数目显著增加，在cd34+细胞扩增100至387倍并且总细胞数目扩增617至3337倍范围内(n＝每次如上所述的最终临床扩增程序加工9个个别的脐带血单元)。如通过免疫表型分析所测量，基本上完全缺乏t细胞。在功能上，所述细胞能够在nod/scid小鼠模型中进行多谱系人类造血植入。
图3显示来自根据此方案进行的十次全面离体扩增的数据。总细胞数目的平均扩增倍数是1723±230(平均值±sem)，并且cd34+细胞是179±30(平均值±sem)。图4阐述19次全面离体扩增的开始、结束和扩增后总有核细胞和cd34+细胞数目的扩增倍数。这19次扩增的人类脐带血干细胞冷冻保存在一个或多个袋中。图5阐述扩增的人类脐带血干细胞样品中的每一个样品的总有核细胞(tnc)和cd34+细胞计数和在冷冻保存前的细胞活力，以及每个冷冻袋中的tnc和cd34+细胞计数。此外，将富集的cd34+细胞的另外12个样品用delta1ext-igg扩增，并显示在冷冻存储前cd34+细胞平均扩增141倍(sem17)。
在以上描述后，现提供术语的以下定义是有帮助的：
“cb干细胞”在本文中可互换地称为“cb干细胞样品”，是指源自于在出生时收集的人类脐带血和/或人类胎盘血的富集造血干细胞或富集造血干细胞和祖细胞的群体。相对于其它类型的造血细胞，造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞可以对在造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞上以增加水平表达的特定标志呈阳性。举例来说，这类标志可以是cd34、cd43、cd45ro、cd45ra、cd59、cd90、cd109、cd117、cd133、cd166、hladr或其组合。相对于其它类型的造血细胞，造血干细胞或造血干细胞和祖细胞还可以对所表达的标志呈阴性。举例来说，这类标志可以是lin、cd38或其组合。在具体的实施方案中，造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞是cd34+细胞。
“扩增的cb干细胞”在本文中可互换地称为“扩增的cb干细胞样品”和“ex-cbsc”，是指已经经受用于扩增脐带血造血干细胞或造血干细胞和祖细胞的技术的cb干细胞，所述技术已经显示：相对于在未经受扩增技术的样品的等分试样下所见，(i)使扩增的样品的等分试样中造血干细胞或者造血干细胞和祖细胞的数目增加；和/或(ii)如输注扩增的样品的等分试样的nod/scid小鼠中增强的植入所示，通过限制稀释分析确定，scid再生细胞的数目增加。在具体的实施方案中，可以通过检测相对于输注扩增前的样品的等分试样的小鼠，在例如输注后10天、3周或者9周，输注扩增的样品的等分试样的小鼠的骨髓中的人类cd45+细胞百分比的增加，检测在nod/scid小鼠中增强的植入(参见delaney等人,2010,naturemed.16(2):232-236)。在具体的实施方案中，扩增技术引起扩增的样品的等分试样中造血干细胞或造血干细胞和祖细胞增加至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500倍，并在具体的实施方案中，增加至少100倍。
使用ex-cbsc减少实体组织移植排斥反应.存在许多以器官功能障碍或衰竭告终的疾病和病状。在一定条件下，用于治疗器官功能障碍或衰竭的最佳治疗选择是器官移植。另外，对于经历过创伤或退化事件的个体，器官移植是有益的，乃至救命。举例来说，烧伤和/或碰撞受害者可以受益于皮肤移植物。甚至面部移植也在进入临床领域。
主要组织相容性复合体(mhc)分子(人中的人白细胞抗原(hla))存在于细胞表面上，并且这些分子的特定结构对于每个个体来说通常是独特的(除同卵双生外)。
hlai类抗原(hla-a、hla-b和hla-c)是在几乎所有的身体细胞(除了红细胞和中枢神经系统细胞)表面上表达并将肽呈现在细胞表面上的跨膜蛋白，所述肽由在蛋白酶体分解的消化蛋白质产生。
hlaii类抗原(hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr)将抗原从细胞外面呈现至t-淋巴细胞。这些特定的抗原刺激t-辅助细胞繁殖，且这些t-辅助细胞接着产生抗体的b细胞产生针对该特定抗原的抗体。自体抗原被抑制t细胞抑制。
hlaiii类抗原编码补体系统的组分。
hla在人类群体中的多样性是疾病防御的一个方面，因此，两个不相关个体在所有基因座上具有相同hla分子的可能性极低。因此，需要hla分型以确定合适的等位基因匹配，从而避免接受者对供体组织产生排斥反应。大部分组织分型(例如与接受者的免疫学匹配)是使用血清方法，利用对所鉴别的hla抗原具有特异性的抗体进行。基于dna的用于检测hla抗原编码基因中的多态性的方法也用于对hla等位基因进行分型，且迅速变成用于hla分型的优选方法。hla分型可以通过以下进行：(1)通过确定hla等位基因，这通过确定等位基因特异性序列在dna序列水平下进行(高分辨率分型)；和/或(2)通过在血清学上，借助于对hla-抗原具有特异性的抗体，确定hla抗原(低分辨率分型)。
每个个体的免疫系统都被编程成攻击载有外来或“非自身”mhc或hla的组织。因此，治疗移植的一个挑战是接受者(宿主)的免疫系统对移植的破坏作用。如果不处理这些破坏作用，那么可能会出现移植排斥反应，当例如重要器官发生排斥时这可能是致命的。因此，如本文所用，移植排斥反应是指接受者/宿主的免疫系统排斥实体组织移植材料(例如器官、一组细胞(例如胰岛β细胞)、皮肤移植物或毛发)。在具体的实施方案中，移植排斥反应意指由于接受者/宿主免疫反应对移植材料的免疫反应，使得移植材料超过80％或90％的细胞或组织发生坏死。在具体的实施方案中，移植排斥反应意指移植材料的活力下降，使得与移植前移植材料的活力相比，由于接受者/宿主对移植材料的免疫反应，移植材料的预期功能下降80％或90％或更多。
由于移植排斥反应的风险，尝试使供体与接受者之间的mhc/hla匹配程度最佳化。这里，澄清匹配/不匹配移植物与未匹配或未经匹配的移植物之间的区别是有帮助的，因为本文中使用这些术语。涉及“匹配”或“不匹配”的免疫学匹配是指匹配程度。举例来说，当将6个hla抗原分型和匹配时，可以说样品在4/6、5/6或6/6hla抗原匹配。也可以说4/6和5/6同一样品在2/6或1/6hla抗原“不匹配”。在两种情况下，供体与接受者之间高度匹配(>50％匹配)。相反地，“未进行匹配”、“未匹配”或“未经匹配”意指供体与接受者之间的匹配程度是未知的，因为举例来说，供体与接受者都未进行hla分型。
在移植医学中，供体与接受者之间可能的最高程度的免疫学匹配是优选的。这是因为高程度的匹配一般降低接受者的排斥反应程度。还可以使用抑制针对移植的接受者/宿主免疫反应的药物治疗。这类免疫抑制剂(“防排斥药物”)的实例包括泼尼松(prednisone)、环孢霉素(cyclosporine)a和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
尽管进行移植的能力有所发展，但移植维持仍然是一个挑战。举例来说，预防移植排斥反应的免疫抑制提高了机会性感染和癌症的风险。因此，需要更有效的抗排斥医学治疗，其延长移植物(和因此患者)的存活并改善生命质量。
本公开提供ex-cbsc的施用减少移植排斥反应。更具体地说并如实施例1所示，如通过延长的皮肤移植物维持所证明，ex-cbsc的施用显著减少移植排斥反应。ex-cbsc减少同种异体皮肤移植物排斥反应的能力证明ex-cbsc也减少其它类型的实体组织的排斥反应。这是因为皮肤移植物的维持特别困难，因此这类移植物已经成为实验移植研究的“金标”(anderson和matzinger,nat.med.2001.(7)1:80-87)。引起所有组织类型中的实体组织排斥反应的主要机制是由mhc分子所呈现的源自供体的非自身肽引起的t细胞活化。对源自供体的非自身抗原反应的t细胞子集变成记忆t细胞，其随后将组织针对供体组织的调节性免疫的发展。记忆t细胞是皮肤移植物(benichou等人immunotherapy.2011.3(6):757-770)以及其它器官类型，例如肝(donckier等人tranplantation.2013.96(3):306-15)、心脏(azzawi,jheartlungtransplant.1998.17:881-887)和肾(heeger,jimmunol.1999:163:2267-2275)的排斥反应的重要决定因素。不受理论束缚，ex-cbsc诱发对皮肤移植物的耐受性的一个理由是因为其通过在扩增ex-cbsc时耗尽供体特异性记忆t细胞的次级淋巴组织，促进供体特异性调节t细胞的活性。供体特异性记忆t细胞的和调节t细胞的增强可以促进许多器官类型的耐受性。因此，ex-cbsc可用于预防许多类型实体器官和组织的排斥反应。
此外，实施例1还指示减少的实体组织排斥反应可以归于免疫耐受性。在这里，免疫耐受性是指宿主针对移植材料的免疫反应的强度下降。在具体的实施方案中，与尚未接受如本文公开的ex-cbsc的针对移植材料的平均宿主免疫反应相比，免疫反应的强度可以下降5-100％、25-100％或75-100％。在具体的实施方案中，免疫反应的强度可以通过确定移植材料发生排斥的时间点来测量。举例来说，免疫耐受性可以允许移植材料存活并发挥作用更长时间段。在具体的实施方案中，免疫耐受性可以指某些外来抗原不引起或引起减少的免疫反应的免疫系统(宿主)状态。
基于上述，ex-cbsc可以用于诱发不同患者群体和背景中的免疫耐受性。因此，本文公开的特定实施方案包括施用ex-cbsc以使受试者对移植是免疫耐受的。免疫耐受的受试者不会发起显著排斥或破坏移植材料的免疫反应。在具体的实施方案中，免疫耐受的受试者通过产生能够结合于抗原的抗体对抗原不反应，或以降低了统计上显著程度和/或临床显著程度的水平反应。
在具体的实施方案中，本公开内容提供exp-cbsc的施用，其减少脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、干细胞、胃、腱、睾丸、牙齿和椎间盘的排斥反应。
如先前所指示，ex-cbsc减少移植排斥反应的有益作用可以减少接受移植的患者中对免疫抑制的需要。因此，在施用ex-cbsc后，可以向患者施用更少的免疫抑制剂。例示性免疫抑制剂包括环孢菌素(cyclosporin)、环孢菌素a(cyclosporinea)、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松(dexamethasone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、沙利度胺(thalidomide)、fk-506(他克莫司(tacrolimus))、西罗莫司(sirolimus)、全身性类固醇、局部类固醇以及大量抗体、受体激动剂、受体拮抗体和如本领域的技术人员已知的其它这类药剂。免疫抑制剂施用的减少可以反映在较低的剂量、给药之间更多的时间和/或更早地停止施用其上。
在具体的实施方案中，实验移植排斥反应可以通过在肾包膜用移植材料对小鼠(例如c57bl/6小鼠)进行移植并施用ex-cbsc来分析。减少的移植排斥反应可以通过处死移植接受者并针对细胞活力进行染色，或者在移植材料部位(即存在于移植材料的部位的器官或组织)在合适的移植后时间点进行免疫细胞化学染色来证实。对移植材料的部位进行染色(例如苏木精和伊红或免疫染色)的时间点可以例如根据平均存活时间或移植动物的预期存活时间而变化。
在多种模型中，移植部位可以例如通过在移植后1天至10年(即1天、5天、10天、30天、100天或更多天、1年、2年或更多年)，在具体的实施方案中，移植后10天至1年并且在更特定的实施方案中移植后10-100天进行染色来分析。举例来说，如果移植材料引入小鼠的肾包膜，那么可以检查移植小鼠的肾。如果移植材料仍然可检测，和/或在具体的实施方案中，移植材料已经增殖成组织块，那么移植材料成功地被植入(亦未排斥)。
移植材料的检测和移植材料的增殖可以例如通过由移植部位(例如肾)制备的冷冻切片的苏木精/伊红染色和检测非源自于移植接受者(例如非源自宿主肾)的新生长来确定。在异种移植情况下，如果根据本领域中已知的免疫细胞化学染色方法，用对来自获得移植材料的物种的抗原具有特异性的抗血清进行特定免疫染色鉴别出阳性细胞，那么移植材料成功地被植入。可替代地，在进行异种移植的实施方案中，如果在移植接受者的血液中检测到源自于移植物种(即获得移植材料的物种)的分子(即蛋白质或抗原)，那么移植材料成功地被植入。
减少全胃肠外营养.全胃肠外营养(tpn)包括借助于静脉内进给来满足患者的营养需要。tpn有时也称为高营养，提供组织构造所需的所有碳水化合物、蛋白质、脂肪、水、电解质、维生素和矿物质、能量消耗和其它生理活性。
tpn开始时是作为紧急程序，其最初是在针对胃肠道的严重和大规模损伤进行外科手术后使用。胃肠外营养，无论其是全部还是补充，现都用于各种慢性病状中，包括在使患者不能或不愿意进食的医疗介入后。
虽然全胃肠外营养是许多患者的一种救命喂养方案，但是每个患者可能由于对营养混合物中一些元素的敏感性和可能饲管感染而遭遇不良反应。可能出现的其它并发症包括心脏过度负荷、缺乏胆碱、脱水、电解质不平衡、高血糖、心脏机械性创伤、代谢性酸中毒、代谢性骨病、静脉炎、肾脏疾病和腔静脉形成血栓。因此，减少患者接受tpn的时间量具有重要的临床益处。
本公开提供了在医疗程序后使用ex-cbsc减少患者中的tpn。如实施例2中所述，本文公开的ex-cbsc对减少儿科患者中脐带血移植后的tpn具有惊人的作用。惊人地，在施用ex-cbsc后tpn的平均持续时间从30.1天下降到20.7天。这种明显减少可以帮助缓和与tpn有关的并发症。
减少阿片样物质使用.在医疗程序后经常施用阿片样物质以减少与所述程序有关的疼痛。但是，在美国阿片样物质的滥用已经上升到流行的比例。fdaconsumerhealthinformation,fdaactstoreduceharmfromopioiddrugs,2011年4月。fda估计2007年超过3.3×107美国人滥用阿片样物质，比五年前2.9×107有所增加。虽然美国政府计划通过教育和监测方案来阐明这种流行，但是这类策略不能充分地阐明问题的核心，即基础阿片样物质化合物的成瘾性。
如本文所用，阿片样物质包括刺激阿片受体的化合物。阿片受体是通过内源性阿片样肽和通过临床重要的生物碱止痛药物如吗啡而活化的g蛋白偶合受体(gpcr)。存在三个主要类型的阿片受体：δ-阿片受体、κ-阿片受体和μ-阿片受体。阿片样物质的实例包括阿尼利定(anileridine)、烯丙罗定(allylprodine)、阿酚太尼(alfentanil)、阿法罗定(alphaprodine)、苄吗啡(benzylmorphine)、丁丙诺啡(buprenorphine)、贝齐米特(bezitramide)、布托啡诺(butorphanol)、可待因(codeine)、氯尼他秦(clonitazene)、环佐辛(cyclazocine)、地佐辛(dezocine)、地索吗啡(desomorphine)、二氢吗啡(dihydromorphine)、右旋吗酰胺(dextromoramide)、地恩丙胺(diampromide)、二氢可待因(dihydrocodeine)、二乙噻丁(diethylthiambutene)、地美沙多(dimenoxadol)、美沙醇(dimepheptanol)、二甲噻丁(dimethylthiambutene)、地匹哌酮(dipipanone)、吗苯丁酯(dioxaphetylbutyrate)、依他佐辛(eptazocine)、乙基吗啡(ethylmorphine)、乙甲噻丁(ethylmethylthiambutene)、依托尼秦(etonitazine)、依索庚嗪(ethoheptazine)、芬太尼(fentanyl)、氢可酮(hydrocodone)、海洛因(heroin)、6-氢吗啡酮(6-hydroxymorphone)、羟哌替啶(hydroxypethidine)、氢吗啡酮(hydromorphone)、异美沙酮(isomethadone)、凯托米酮(ketobemidone)、莱瓦洛芬(levallorphan)、左芬啡烷(levophenacylmorphan)、洛芬太尼(lofentanil)、利富吩(levorphanol)、吗啡(morphine)、麦罗啡(myrophine)、哌替啶(meperidine)、美普他酚(meptazinol)、美他佐辛(metazocine)、美沙酮(methadone)、美托酮(metopon)、吗啡、罂粟碱(narceine)、纳布啡(nalbuphine)、纳洛芬(nalorphine)、尼可吗啡(nicomorphine)、去甲左啡诺(norlevorphanol)、去甲美沙酮(normethadone)、去甲吗啡(normorphine)、诺匹哌酮(norpipanone)、阿片(opium)、氧可酮(oxycodone)、氧吗啡酮(oxymorphone)、哌腈米特(piritramide)、阿片全碱(papaveretum)、喷他佐辛(pentazocine)、苯吗庚酮(phenadoxone)、非那佐辛(phenazocine)、苯哌利定(phenoperidine)、去痛定(piminodine)、非诺吗烷(phenomorphan)、普罗庚嗪(propheptazine)、二甲度冷丁(promedol)、异丙哌替啶(properidine)、丙吡胺(propiram)、丙氧芬(propoxyphene)、舒芬太尼(sufentanil)、痛立定(tilidine)、曲马多(tramadol)、其立体异构体、其代谢物、其盐、其醚、其酯和/或其衍生物和/或其混合物。
靶向μ阿片受体的阿片样激动剂经常与例如退热药物和/或非类固醇消炎药(nsaid)的第二止痛剂组合施用。在一些情况下，当用于治疗疼痛时，相信这类组合产生累加效应，且在一些情况下，产生协同效应。fda批准的组合的实例包括
尽管如此，仍然需要另外的控制阿片样物质使用的方法，且本公开提供了使用ex-cbsc减少患者中医疗程序后的阿片样物质使用。事实上，如实施例2中所述，本文公开的ex-cbsc对减少儿科患者中脐带血移植后的阿片样物质使用具有惊人的作用。惊人地，在施用ex-cbsc后连续的阿片剂药物治疗的平均持续时间从18.1天下降到9.7天。
减少住院治疗.在美国和已经发展卫生保健系统的其它国家中卫生保健成本显著地上升。减少与医疗程序有关的所需住院治疗时间的任何方法都将帮助减轻这些上升的成本。此外，患者在进行需要长期住院治疗的医疗程序时丧失机会成本。类似地，减少所需住院治疗时间帮助患者返回更令人愉快和/或有盈利性的工作中。因此，减少与医疗程序有关的所需住院治疗时间的任何方法都将提供巨大的社会益处和个人益处。
如实施例2中所述，本文公开的ex-cbsc对儿科患者中脐带血移植后的住院治疗天数具有显著的作用。在施用ex-cbsc后，患者平均早12天出院(医院中的43.2天对比医院中的55.6天)。
不受理论束缚，观察到的在施用ex-cbsc后tpn、阿片样物质使用和住院治疗减少可能与在施用ex-cbsc后同时观察到的减轻的粘膜炎相关，如在患者床边的专业医疗护理提供者所证明。粘膜炎是一种炎症反应，其特征是从口腔到肛门的胃肠道的上皮组织有损害。其可能由暴露于电离辐射或者化学治疗剂引起。口腔炎是影响口腔粘膜的任何炎症反应，伴有或者没有溃疡。可以使用临床公认的标准诊断、测量和监测粘膜炎。因此，本文公开的特定实施方案包括施用ex-cbsc以减轻有需要的患者中的粘膜炎。
维持胃肠道内层(例如肠粘膜)的健康可能通过减少或预防细菌移位而产生本文所述的一些有益临床作用。细菌移位是腔细菌迁移至肠外部位的过程。可以利用本领域的技术人员已知和例如vanminnen等人,jgastrointestsurg.2007年5月；11(5):682-9中描述的动物模型。
在具体的实施方案中，ex-cbsc可以与抗微生物化合物组合施用抗微生物剂的实例包括抗微生物化合物、抗细菌剂(例如抗生素)、抗真菌剂、抗感染剂和抗病毒剂。如本领域的一般技术人员所了解，具体的化合物可以属于这些广义分类中的超过一个分类。
例示性抗微生物剂包括抗微生物化合物，包括抗微生物肽(amp)、氯己定二醋酸盐(chlorhexidinediacetate)和碳酸银。
例示性抗细菌剂(例如抗生素)包括阿柔比星(aclarubicin)、放线菌素d(actinomycind)、放线拉酮(actinoplanone)、阿霉素(adriamycin)、艾罗里辛衍生物(aeroplysininderivative)、氨基糖苷类(aminoglycosides(例如庆大霉素(gentamycin)或新霉素(neomycin))、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、氨柔比星(amrubicin)、蒽环类抗生素(anthracycline)、阿嗪霉素-a(azinomycin-a)、阿奇霉素(azithromycin)、氨曲南(aztreonam)、比苏卡林(bisucaberin)、博莱霉素硫酸盐(bleomycinsulfate)、苔藓虫素-1(bryostatin-1)、卡奇霉素(calichemycin)、头孢吡肟(cefepime)、头孢克肟(cefixime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢菌素c(cephalosporinc)、头孢孟多(cephamandol)、头孢唑啉(cephazolin)、氯霉素(chloramphenicol)、色霉素(chromoximycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克林霉素(clindamycin)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地曲比星b(ditrisarubicinb)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星-纤维蛋白原(doxorubicin-fibrinogen)、去氧羟四环素(doxycycline)、依沙米星-a(elsamicin-a)、表柔比星(epirubicin)、尔伯他汀(erbstatin)、红霉素(erythromycin)、依索比星(esorubicin)、埃斯培拉霉素-al(esperamicin-al)、埃斯培拉霉素-alb(esperamicin-alb)、福司曲星(fostriecin)、格列巴汀(glidobactin)、格瑞加汀-a(gregatin-a)、格瑞克霉素(grincamycin)、除莠霉素(herbimycin)、伊达比星(idarubicin)、隐杯伞素(illudins)、亚胺培南(imipenem)、上总霉素(kazusamycin)、克萨瑞定(kesarirhodins)、美诺立尔(menogaril)、美罗培南(meropenem)、甲硝唑(metronidazole)、丝裂霉素(mitomycin)、新那汀(neoenactin)、奈替米星(netilmycin)、恶溶菌素(oxalysine)、奥诺霉素(oxaunomycin)、青霉素(penicillins)(例如苯唑西林(oxacillin)或美洛西林(mezlocillin))、派来霉素(peplomycin)、皮拉汀(pilatin)、吡柔比星(pirarubicin)、普若霉素(porothramycin)、吡啶安辛a(pyrindanycina)、利福平(rifampicin)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)、替加环素(tigecycline)、托普霉素(tobramycin)和甲氧苄啶(trimethoprim)。
例示性抗真菌剂包括多烯抗真菌剂，例如两性霉素b(amphotericinb)、杀念菌素(candicidin)、菲律宾菌素(filipin)、哈霉素(hamycin)、咪达唑(imidaxole)、游霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)、龟裂霉素(rimocidin)、噻唑抗真菌剂(thiazoleantifungals)和三唑(triazole)。咪唑抗真菌剂包括联苯苄唑(bifonazole)、布霉素(blotrimazole)、布康唑(butoconazole)、益康唑(econazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、酮康唑(ketoconazole)、霉康唑(miconazole)、奥莫康唑(omoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)和噻康唑(tioconazole)。基于三唑的抗真菌剂包括阿巴康唑(albaconazole)、氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、里氟康唑(ravuconazole)、特康唑(terconazole)和伏立康唑(voriconazole)。噻唑抗真菌剂包括阿巴芬净(abafungin)。烯丙胺抗真菌剂的实例包括阿莫洛芬(amorolfin)、布替萘芬(butenafine)、奈替芬(naftifine)和特比奈芬(terbinafine)。棘白霉素抗真菌剂包括阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin)。额外抗真菌剂包括苯甲酸、环吡司(ciclopirox)、结晶紫、氟胞嘧啶(flucytosine)或5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)、卤普罗近(haloprogin)、水蓼二醛(polygodial)、托萘酯(tolnaftate)和十一碳烯酸。具有抗真菌性的精油包括蒜素、香茅油、椰子油、柠檬香桃、卢戈氏碘液(lugol'siodine)、楝树种子油、橄榄叶、橙油、牛至、玫瑰草油、广藿香、硒和茶树油。
例示性抗感染剂包括嘧啶类似物。嘧啶类似物泛指具有经一个或多个原子或化学基团取代或在嘧啶环结构中的一个或多个碳上被氧化的嘧啶环结构(1,3-二嗪)的化合物。在具体的实施方案中，嘧啶类似物在嘧啶环结构中的碳上含有卤素取代基，例如f、cl、br或i。例示性氟嘧啶包括5-氟胞嘧啶、5-氟胸苷(5-fluorothymidine)、5-fu、5-fudr(5-氟-脱氧尿苷；氟尿苷)、卡培他滨(capecitabine)、单磷酸氟脱氧尿嘧啶(5-dfump)、三磷酸氟尿嘧啶核苷(5-futp)、三氟胸苷(trifluorothymidine)和曲氟尿苷(trifluridine)。其它卤代嘧啶类似物包括5-溴胞嘧啶(5-bromocytosine)、5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，5-budr)、5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)、5-氯胞嘧啶(5-chlorocytosine)、5-氯脱氧尿核苷(5-chlorodeoxyuridine)、5-氯尿嘧啶(5-chlorouracil)、5-碘胞嘧啶(5-iodocytosine)、5-碘脱氧尿核苷(5-iododeoxyuridine，5-iudr)和5-碘尿嘧啶(5-iodouracil)。
尿嘧啶类似物是指含有经一个或多个原子或化学基团取代的尿嘧啶环结构的化合物。尿嘧啶类似物含有卤素取代基，例如f、cl、br或i。在某些实施方案中，尿嘧啶类似物含有f取代基，且称为氟尿嘧啶类似物。例示性氟尿嘧啶类似物包括5-fu、卡莫氟(carmofur)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、乙嘧替氟(emitefur)、氟尿苷(floxuridine)和替加氟(tegafur)。
其它例示性抗感染剂包括氯已定、银化合物、银离子、银粒子或其它金属化合物、离子或粒子(例如金)。额外抗感染剂包括2-对磺胺酰基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)、4-磺胺水杨酸(4-sulfanilamidosalicylicacid)、4,4'-亚硫酰基双苯胺(4,4'-sulfinyldianiline)、乙酰砜(acetosulfone)、氨氟沙星(amifloxacin)、阿米卡星(amikacin)、阿莫西林(amoxicillin)、两性霉素b(amphotericinb)、阿帕西林(apalcillin)、阿哌环素(apicycline)、阿布拉霉素(apramycin)、阿贝卡星(arbekacin)、阿扑西林(aspoxicillin)、重氮丝氨酸(azaserine)、叠氮氯霉素(azidamfenicol)、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽(bacitracin)、班贝霉素(bambermycin)、比阿培南(biapenem)、溴莫普林(brodimoprim)、丁酰苷菌素(butirosin)、杀念菌素、卷曲霉素(capreomycin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、碳霉素(carbomycin)、卡芦莫南(carumonam)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢孟多、头孢曲秦(cefatrizine)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢克定(cefclidine)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑(cefditoren)、头孢吡肟(cefepime)、头孢他美(cefetamet)、头孢甲肟(cefinenoxime)、头孢克肟(cefixime)、头孢米诺(cefminox)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢拉尼(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢替坦(cefotetan)、头孢替安(cefotiam)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢沙定(cefroxadine)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢特仑(cefteram)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢唑南(cefuzonam)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢甘酸(cephaloglycin)、头孢菌素c(cephalosporinc)、头孢拉定(cephradine)、氯霉素(chloramphenicol)、氯已定、氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯四环素(chlortetracycline)、环丙沙星、环丙沙星、克拉霉素(clarithromycin)、克林沙星(clinafloxacin)、克林霉素(clindamycin)、氯摩四环素(clomocycline)、粘菌素(colistin)、环青霉素(cyclacillin)、达普松(dapsone)、地美环素(demeclocycline)、制皮菌素(dermostatin)、地百里砜(diathymosulfone)、地贝卡星(dibekacin)、双氢链霉素(dihydrostreptomycin)、地红霉素(dirithromycin)、依诺沙星(enoxacin)、恩维霉素(enviomycin)、依匹西林(epicillin)、红霉素、菲律宾菌素(filipin)、氟罗沙星(fleroxacin)、氟氧头孢(flomoxef)、福提霉素(fortimicin)、制霉色基素(fungichromin)、庆大霉素、格克砜索拉砜(glucosulfonesolasulfone)、金化合物(例如氯化金、金诺芬(auranofin))、金离子、金粒子、短杆菌肽s(gramicidins)、短杆菌肽、格帕沙星(grepafloxacin)、胍甲环素(guamecycline)、海他西林(hetacillin)、亚胺培南、碘、异帕米星(isepamicin)、交沙霉素(josamycin)、卡那霉素(kanamycin)、北里霉素(leucomycin)、林肯霉素(lincomycin)、洛美沙星(lomefloxacin)、鲁斯霉素(lucensomycin)、赖甲四环素(lymecycline)、甲氯环素(meclocycline)、美帕曲星(mepartricin)、美罗培南、甲烯土霉素(methacycline)、小诺霉素(micronomicin)、麦迪霉素(midecamycin)、米诺环素(minocycline)、拉氧头孢(moxalactam)、莫匹罗星(mupirocin)、那氟沙星(nadifloxacin)、游霉素(natamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、诺氟沙星(norfloxacin)、制霉菌素(nystatin)、氧氟沙星(ofloxacin)、竹桃霉素(oleandomycin)、寡霉素(oligomycin)、氧四环素(oxytetracycline)、帕尼培南(panipenem)、巴龙霉素(paromomycin)、帕珠沙星(pazufloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、青霉素n(penicillinn)、表霉素a(perimycina)、匹哌环素(pipacycline)、吡哌酸(pipemidicacid)、多粘菌素(polymyxin)、聚维酮/碘(povidone/iodine)、伯霉素(primycin)、对磺胺酰基苯甲胺(p-sulfanilylbenzylamine)、羧喹青霉素(quinacillin)、核糖霉素(ribostamycin)、利福酰胺(rifamide)、利福平(rifampin)、利福霉素sv(rifamycinsv)、利福喷丁(rifapentine)、利福昔明(rifaximin)、瑞斯托菌素(ristocetin)、利替培南(ritipenem)、罗他霉素(rokitamycin)、罗列环素(rolitetracycline)、罗沙米星(rosaramycin)、罗索沙星(rosoxacin)、罗红霉素(roxithromycin)、水杨基偶氮磺胺二甲嘧啶(salazosulfadimidine)、山环素(sancycline)、氯化银、银化合物(例如银离子、硝酸银、氧化银)、银粒子、紫苏霉素(sisomicin)、司氟沙星(sparfloxacin)、壮观霉素(spectinomycin)、螺旋霉素(spiramycin)、链霉素(streptomycin)、琥珀氨苯砜(succisulfone)、磺胺柯衣酸(sulfachrysoidine)、磺胺洛西酸(sulfaloxicacid)、磺胺柯衣定(sulfamidochrysoidine)、磺胺酸(sulfanilicacid)、阿地砜(sulfoxone)、替考拉宁(teicoplanin)、替马沙星(temafloxacin)、替莫西林(temocillin)、四环素(tetracycline)、四氧普林(tetroxoprim)、甲砜氯霉素(thiamphenicol)、噻唑砜(thiazolsulfone)、硫链丝菌肽(thiostrepton)、替卡西林(ticarcillin)、替吉莫南(tigemonam)、托普霉素(tobramycin)、托氟沙星(tosufloxacin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、丙大观霉素(trospectomycin)、曲氟沙星(trovafloxacin)、结核放线菌素(tuberactinomycin)、杀结核菌素(tubercidin)和万古霉素(vancomycin)。
例示性抗病毒剂包括5-溴尿苷(5-bromouridine)、无环鸟苷(acyclovir)、阿洛夫定(alovudine)、金刚烷胺(amantadine)、抗病毒蛋白、阿比多尔(arbidol)、溴夫定(brivudine)、西多福韦(cidofovir)、达卡他韦(daclatasvir)、二十二烷醇(docosanol)、双链rna(dsrna)活化的胱天蛋白酶低聚物(draco))、泛昔洛韦(famciclovir)、fgi-104、非阿尿苷(fialuridine)、福米韦生(fomivirsen)、膦甲酸(foscarnet)、fv-100、更昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、碘苷、咪喹莫特(imiquimod)、肌苷、异丙肌苷(inosinepranobex)、干扰素(interferon)、马立巴韦(maribavir)、甲吲噻腙(methisazone)、病毒灵(moroxydine)、核苷酸抗病毒剂、奥拉更(oragen)、喷昔洛韦(penciclovir)、普乐康尼(pleconaril)、足叶草毒素(podophyllotoxin)、普罗塞塔(prosetta)、psi-6130、recigen、瑞喹莫德(resiquimod)、利巴韦林(ribavirin)、瑞他莫德(rintatolimod)、塞马莫德(semapimod)、塞曲布韦(setrobuvir)、西咪匹韦(simeprevir)、索非布韦(sofosbuvir)、索利夫定(sorivudine)、他瑞韦林(taribavirin)、特考韦瑞(tecovirimat)、替比夫定(telbivudine)、替诺福韦艾拉酚胺反丁烯二酸盐(tenofoviralafenamidefumarate)、茶黄素(theaflavin)、泰洛伦(tilorone)、曲氟尿苷(trifluridine)、醋胺金刚烷(tromantadine)、缬昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)和阿糖腺苷(vidarabine)。
hspc和抗微生物剂还可以与杀菌剂组合施用。例示性杀菌剂包括醇类(例如乙醇、1-丙醇、2-丙醇)、季铵盐(又名quat或qac)(例如氯化苯甲烃铵(bac)、十六烷基三甲基溴化铵(ctmb)、十六烷基氯化吡啶(cetrim、cpc)和氯化苄乙氧铵(bzt))、硼酸、亮绿、次氯酸钙、氯已定葡糖酸盐、过氧化氢、碘(例如聚维酮-碘和卢戈氏碘液)、汞溴红、奥替尼啶二盐酸盐(octenidinedihydrochloride)、苯酚(石碳酸)化合物、聚盐酸己双胍(聚六亚甲基双胍，phmb)、碳酸氢钠、氯化钠和次氯酸钠。
在同种异体造血细胞移植后减少的移植物抗宿主病造血细胞移植(hct)可以用于延长生命，或者可能是可用于多种不同的血液癌症和疾病的唯一祛病疗法，所述血液癌症和疾病尤其包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合征(分别是all、aml、cml、cll和mds)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、重度再生障碍性贫血和免疫缺陷和自身免疫性病症。
hct和其它器官移植类型更普遍和成功应用的一个主要障碍是移植接受者中移植物抗宿主病(gvhd)的风险。gvhd的特点在于供体组织(移植物或被移植物)包括或产生攻击接受者(宿主)组织的免疫系统细胞。当被移植物中的功能免疫细胞将接受者识别为“外来”并发起免疫攻击时，出现gvhd。许多危急生命的并发症由于gvhd而出现，且当源自于移植材料的免疫细胞攻击并足够地破坏接受者的器官时，gvhd可能是致命的。
gvhd可能是急性的或者慢性的。急性gvhd的特点在于选择性破坏肝脏、皮肤、粘膜、胃肠道(gi)、免疫系统(造血系统，例如骨髓和胸腺)本身和肺(呈特发性肺炎形式)。急性gvhd如下分期：总的等级(皮肤-肝脏-肠)，每个器官个别地从1的低等级(i)到4的高等级(iv)分期。皮肤gvhd产生弥漫性斑丘疹，有时呈花边图案。肝脏gvhd可以通过胆红素水平来测量。肠可以基于肠炎的存在和/或严重度、粘膜的脱落、腹泻、腹痛、恶心和呕吐来评定。肠gvhd可以经由肠活检来分期。肾功能还可以通过测量肌酐和/或bun水平来评定。所述i-iv分期在临床上实行并且普遍接受。
患有iv级gvhd的患者通常具有不良的预后。如果gvhd严重，那么控制疾病可能需要额外的强免疫抑制，包括类固醇和额外药剂，且患者可能由于免疫抑制而出现严重乃至致命的感染。慢性gvhd也攻击以上器官，但在其长期过程中，还会损害结缔组织和外分泌腺。
gvhd的病理生理学包括供体t细胞与宿主抗原呈现细胞相互作用和随后产生促炎性细胞因子(细胞因子风暴)，以及活化引起标靶靶器官破坏的同种异体反应效应性t细胞(t效应子)。相比之下，源自供体的成熟foxp3+t调节细胞(tregs)可以下调同种异体反应性。因此，一种假设是供体t效应子与供体tregs之间的比率在gvhd严重度中起关键作用。但是，在癌症治疗背景下，由于治疗移植物抗白血病(gvl)作用(患者(宿主)中造血细胞植入失败)的丧失和机会性感染率增加，企图通过在移植的造血细胞中的t细胞耗尽减少gvhd已经引起恶性病的明显复发。
同种异体或者基因上不相同并因此错配的造血干细胞移植已经使用脐带血进行，因为此类干细胞更容易获得，带给接受者慢性gvhd的风险较低，对供体来说无痛苦，并且重要的是，需要供体与接受者之间的hla组织类型匹配更少，因此对于无法鉴别匹配的相关成年志愿者供体或足够匹配的无关成年志愿者供体的患者来说扩大了hct的使用。当前在脐带血移植的临床背景下，供体组织和接受者的hla分型涉及确定六个hla抗原或者等位基因，通常各在基因座hla-a、hla-b和hla-dr上两个，或者各在基因座hla-a、hla-b和hla-c上一个以及各在基因座hal-drb1、hla-dqb1和hla-dpb1上一个(参见例如kawase等人,2007,blood110:2235-2241)。4/6或5/6错配或6/6匹配是临床护理的标准。
但是，使用脐带血作为人类血液移植的细胞来源的一个显著障碍是，由于显著延迟的白细胞和血小板恢复(造血重建)以及增加的移植物失败风险，在单个脐带血单元中经常无足够安全进行移植的形成血液的干细胞/祖细胞。因此，这些患者处于显著的移植相关死亡的风险下。因为单个脐带血单元的尺寸(即单个供体捐献内含有的形成血液的细胞的数目)经常无法满足血液移植，所以常常需要两个脐带血单元。虽然使用两个脐带血单元显著降低排斥反应/移植物失败的风险，但造血恢复的时间仍然显著延迟，导致危急生命的感染和出血的风险增加。此外，急性gvhd的风险还随两个脐带血单元方法而增加，且脐带血移植接受者仍然处于较高的早期移植相关死亡的风险下。
假设在实体组织移植背景下在施用ex-cbsc后观察到免疫耐受性，检查是否也可以产生这类免疫耐受性来减少急性gvhd。最初，相信急性gvhd是由于显著的hla错配的可能性而与未经匹配的ex-cbsc施用有关的显著风险。但是，如实施例3中所述，本公开提供了未匹配的ex-cbsc出乎意料地降低接受hla匹配(6/6)或错配(4/6或5/6)脐带血移植以治疗高风险急性白血病、慢性髓细胞性白血病和脊髓发育不良综合征的患者中急性gvhd的发生率和严重度。接受未匹配的ex-cbsc与hla匹配或错配的脐带血单元组合的患者中无一人经历iii-iv级gvhd，而26％的未接受ex-cbsc与脐带血单元组合的患者经历iii-iv级gvhd。此结果是有意义的，因为如先前所指示，患有iv级gvhd的患者通常具有不良预后。降低gvhd的发生率和严重度解除了对强免疫抑制的需要，还降低致命感染和/或癌症出现的风险。此发现还证明ex-cbsc在一系列不同的患者和移植背景中诱发免疫耐受性。
在这里，免疫耐受性是指移植材料针对宿主的免疫反应的强度下降。在具体的实施方案中，与尚未接受如本文公开的ex-cbsc的移植接受者相比，与针对宿主的平均移植物免疫反应相比，免疫反应的强度可以下降5-100％、25-100％或75-100％。在具体的实施方案中，免疫反应的强度可以通过确定gvhd开始的时间点来测量。举例来说，免疫耐受性可以允许宿主和宿主器官存活并发挥作用更长时间段。在具体的实施方案中，免疫耐受性可以指某些外来抗原不引起或引起减少的免疫反应的免疫系统(移植物)状态。
基于上述，本文公开的特定实施方案包括施用ex-cbsc以使同种异体造血细胞移植对宿主是免疫耐受的。免疫耐受的同种异体造血细胞移植(移植物)无法对宿主发起显著的免疫反应，因此宿主中gvhd，在具体的实施方案中急性ghvd并且在更特定的实施方案中急性iii期或iv期gvhd的发生率和/或严重度降低。在具体的实施方案中，免疫耐受的同种异体造血细胞移植通过产生能够结合于抗原的抗体对抗原不反应，或以降低了统计上显著程度的水平反应。
如先前所指示，ex-cbsc的有益作用可以减少接受同种异体造血细胞移植的患者中对免疫抑制的需要。因此，在施用ex-cbsc后，可以向同种异体造血细胞移植接受者施用更少的免疫抑制剂。如先前所指示，免疫抑制剂施用的减少可以反映在较低的剂量、给药之间更多的时间和/或更早地停止施用其上。
值得指出的是存在许多参考文献，描述在脐带血移植后gvhd减少。这些参考文献主要描述了与在更标准的骨髓移植后出现的gvhd相比，在脐带血移植后gvhd减少。此外，gvhd减少一般是慢性gvhd减少。本公开提供了ex-cbsc的施用甚至进一步减少与脐带血移植有关的gvhd。ex-cbsc进一步减少急性gvhd，且更具体地说，急性gvhd的最危险的形式，iii期和iv期。
在临床背景外，还可以使用动物模型证实急性gvhd减少的功效。举例来说，在注射来自健康供体的2106全部外周血单核细胞(pbmc)前可以在2gy下照射免疫缺陷nod.scidуc-/-(nsg)小鼠(例如来自thejacksonlaboratory)。注射小鼠随着时间推移的重量减轻和存活可以作为gvhd出现和严重度的临床参数来评定。重量减轻可以表示为在pbmc注射后的不同时间点相对于注射小鼠的初始重量的百分比。还可以收获血液和脾细胞，并通过流式细胞术，使用人类特异性荧光mab测定t细胞频率。
选择exp-cbsc单元用于患者施用.在整个本公开中，已经描述了实体组织移植材料和脐带血单元的免疫学匹配(例如hla匹配)的重要性。相比之下，exp-cbsc不需要进行免疫学匹配，而是不考虑免疫学匹配，作为可以施用于任何患者的现成产品提供。
在具体的实施方案中，在exp-cbsc的hla类型与患者的hla类型不进行免疫学匹配下施用exp-cbsc。在具体的实施方案中，“hla类型不进行匹配”和“不进行免疫学匹配”意指不采取措施在患者与样品之间进行任何的hla抗原或等位基因匹配。在具体的实施方案中，在不考虑exp-cbsc将施用的患者是否与exp-cbsc在任何hla抗原或等位基因上匹配或错配下，选择exp-cbsc施用于患者。因此，exp-cbsc样品可以具有与患者相同的hla类型，或者exp-cbsc的hla类型可以在所分型的hla抗原和/或等位基因中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个上不同于患者的hla类型。在具体的实施方案中，exp-cbsc样品的hla类型可以在所分型的所有hla抗原和/或等位基因上不同于患者的hla类型。但是，为了避免引起怀疑，在当前临床护理标准内，移植材料(例如实体组织或同种异体造血细胞移植)是免疫学上匹配的。当前临床护理标准可以允许免疫学匹配内一定程度的错配。在具体的实施方案中，exp-cbsc可以分化成髓细胞样谱系细胞。在具体的实施方案中，exp-cbsc可以分化成淋巴样谱系细胞。在具体的实施方案中，exp-cbsc是t细胞耗尽的。t细胞耗尽可能是主动过程的结果，和/或可能是由于在cd34+选择和扩增培养期间的被动除去。
选择未匹配的exp-cbsc所考虑的任选参数可以包括以下中的一个或多个：总有核细胞计数、总cd34+(或者其它合适抗原)细胞计数、样品年龄、患者年龄、供体的种族或族群背景、患者体重、具体患者中所治疗的医学病状类型和其严重水平、患者的群体反应性抗体结果等等。
在具体的实施方案中，为了制备exp-cbsc以供施用于患者，可以从培养基收获细胞，并在载剂中洗涤和浓缩成治疗有效量。例示性载体包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克氏溶液(hanks'solution)、林格氏溶液(ringer'ssolution)、normosol-r(abbottlabs)、plasma-lyte
在具体的实施方案中，载体可以补充人血清白蛋白(hsa)或者其它人血清组分或胎牛血清。在具体的实施方案中，用于输注的载体包括具有5％hsa或葡萄糖的缓冲盐水。额外的等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更多元糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
载体可以包括缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、反丁烯二酸盐缓冲液、葡糖酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和/或三甲胺盐。
稳定剂是指在功能上可以在增量剂至添加剂范围内的一大类赋形剂，期有助于防止细胞粘附至容器壁。典型的稳定剂可以包括多元糖醇；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺酸、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、丙三醇和环多醇，例如肌醇；peg；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代丙三醇、α-单硫代丙三醇和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质，例如hsa、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，例如棉子糖；和多糖，例如葡聚糖。
在需要或有益的情况下，制剂可以包括局部麻醉剂，例如利多卡因(lidocaine)，以在注射部位镇痛。
例示性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、卤化苯甲烃铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
制剂内细胞的治疗有效量可以超过102个细胞、超过103个细胞、超过104个细胞、超过105个细胞、超过106个细胞、超过107个细胞、超过108个细胞、超过109个细胞、超过1010个细胞或超过1011。在具体的实施方案中，制剂可以标准化成在施用于受试者时提供每公斤1×106-2×107个hspc。
在本文公开的制剂中，细胞体积一般是一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或者100ml或更少。因此，施用的细胞的密度通常超过104个细胞/毫升、107个细胞/毫升或108个细胞/毫升或更多(例如109个细胞/毫升)。
本文公开的制剂可以被制成通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用。制剂可以进一步被调配用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴内、腹膜内、损害内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌肉内、肺泡内和/或皮下注射。
exp-cbsc制剂施用于受试者。受试者包括人、兽医动物(犬、猫、爬虫、鸟类等)、家畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究用动物(猴、大鼠、小鼠、鱼等)。exp-cbsc制剂以治疗有效量施用于受试者。
治疗有效量包括提供有效量、预防性治疗和/或治疗性治疗的量。
“有效量”是exp-cbsc在受试者中产生所需生理变化所需要的量。出于研究的目的，经常施用有效量。在实验模型中，本文公开的有效量实现以下中的一个或多个：(i)减少移植排斥反应；(ii)减少tpn；(iii)减少在生理学程序后的阿片样物质使用；(iv)减少代表住院治疗时间的恢复时间；(v)减轻急性gvhd；(vi)诱发免疫耐受性；和/或(vi)减轻粘膜炎。
“预防性治疗”包括施用于未显示病状迹象或症状的受试者的治疗，从而施用治疗以减少、预防所述病状(例如移植排斥反应；gvhd)或降低显现其的风险。因此，预防性治疗充当针对例如移植排斥反应和/或iii期和/或iv期gvhd的预防性治疗。
“治疗性治疗”包括施用于显示病状症状或迹象的受试者的治疗且施用于受试者以降低病状的严重度或减缓其进展。治疗性治疗还可以部分或完全消除病状。在本公开的背景内，病状包括移植排斥反应、使用tpn、在医疗程序后使用阿片样物质、住院治疗、gvhd和粘膜炎中的一个或多个。
在整个本公开中提供评定所提出的病状的存在和/或严重度的方法，以便本领域的一般技术人员容易鉴别治疗有效量。
施用于具体受试者的exp-cbsc的实际量可以由医师、兽医或研究员考虑如下参数来确定：身体和生理学因素，包括标靶；体重；病状类型；移植类型；病状严重度；即将来临的相关事件(在知道时)；先前或同时进行的治疗介入；受试者的特发病；和施用途径。另外，体外和体内测定可以任选地用以帮助鉴别最佳的剂量范围。
施用的治疗有效量可以包括超过102个细胞、超过103个细胞、超过104个细胞、超过105个细胞、超过106个细胞、超过107个细胞、超过108个细胞、超过109个细胞、超过1010个细胞或超过1011个细胞。在具体的实施方案中，治疗有效量包括每公斤1×106-2×107个hspc。
exp-cbsc可以通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用，且更具体地说，可以包括通过以下中的一种或多种来施用：骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴内、腹膜内、损害内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌肉内、肺泡内和/或皮下输注和/或快速浓注。
在具体的实施方案中，在不进行hla匹配(不采取措施来确定受试者与exp-cbsc之间的匹配程度)下施用一定量的exp-cbsc。
exp-cbsc在临床相关的时间窗内施用。在具体的实施方案中，在进行实体组织移植或同种异体造血细胞移植的受试者中，临床相关的时间窗可以在移植12小时内(参见例如wo2006/047569和wo2007/095594)。在具体的实施方案中，临床相关的时间窗可以在例如移植的医疗程序24小时、36小时、48小时或1周内。临床相关的时间窗的极限可以在实验上通过增加医疗介入与施用exp-cbsc之间延迟，直至exp-cbsc不再提供有关临床益处来确定。
试剂盒.试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器包括本文所述的一个或多个exp-cbsc制剂。在具体的实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器含有待与其它细胞、组合物或制剂组合使用的一个或多个exp-cbsc制剂。与这类容器相联的可以是呈管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映了该机构批准制造、使用或销售供人施用。通知可以陈述在未进行免疫学匹配下所提供的exp-cbsc制剂可以施用于受试者。试剂盒可以包括关于使用试剂盒的进一步说明书，例如关于供施用的细胞和/或制剂的制备的说明书；相关废弃物的适当处置等等。说明书可以呈提供在试剂盒内部的印刷说明书的形式，或者说明书可以印刷在试剂盒本身一部分上。说明书可以呈纸张、小册子、手册、cd-rom或计算机可读装置的形式，或者可以在远程位置，例如网点，提供说明书的指导。在具体的实施方案中，试剂盒还可以包括有效地使用试剂盒所需的一些或所有必需医疗用品，例如注射器、安瓿、套管、面罩、无针式流体传送装置、注射帽、海绵、无菌粘合带、chloraprep、手套等等。本文所述的任何试剂盒的内容可以变化。试剂盒的说明书将指导exp-cbsc的使用以实现本文所述的新的临床使用。
例示性实施方案：
1.一种减少有需要的受试者中的同种异体皮肤移植物排斥反应的方法，其包括：
在接受同种异体皮肤移植物的临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少所述受试者中的同种异体皮肤移植物排斥反应。
2.如实施方案1的方法，其中(i)所述同种异体皮肤移植物与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
3.如实施方案1或2的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
4.如实施方案1中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
5.如实施方案1至3中任一实施方案的方法，其中所述受试者由于皮肤受到损伤而有需要。
6.如实施方案5的方法，其中所述损伤是由火、热、压力、刺穿和/或擦伤引起的。
7.如实施方案1至6中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于接受所述同种异体皮肤移植物前。
8.如实施方案1至7中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述同种异体皮肤移植物36小时内。
9.如实施方案1至7中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述同种异体皮肤移植物12小时内。
10.如实施方案1至9中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
11.如实施方案1至10中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
12.如实施方案1至10中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
13.如实施方案1至12中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
14.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减少有需要的受试者中的同种异体皮肤移植物排斥反应。
15.如实施方案14的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
16.如实施方案14或15的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
17.如实施方案14至16中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
18.如实施方案14至17中任一实施方案的用途，其中所述受试者由于皮肤受到损伤而有需要。
19.如实施方案18的用途，其中所述损伤是由火、热、压力、刺穿和/或擦伤引起的。
20.如实施方案15至19中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于接受所述同种异体皮肤移植物前。
21.如实施方案15至20中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在接受所述同种异体皮肤移植物36小时内。
22.如实施方案15至20中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在接受所述同种异体皮肤移植物12小时内。
23.如实施方案14至22中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
24.如实施方案14至23中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
25.如实施方案14至23中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
26.如实施方案15至25中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
27.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于诱发移植接受者中的免疫耐受性。
28.如实施方案27的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
29.如实施方案27或28的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
30.如实施方案27至29中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
31.如实施方案27至30中任一实施方案的用途，其中所述移植接受者是实体组织移植接受者。
32.如实施方案31的方法，其中所述实体组织包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
33.如实施方案27至30中任一实施方案的用途，其中所述移植接受者是造血细胞移植接受者。
34.如实施方案27至33中任一实施方案的用途，其中所述移植接受者是同种异体移植接受者。
35.如实施方案27至30中任一实施方案的用途，其中所述移植接受者是同种异体脐带血移植接受者。
36.如实施方案27至35中任一实施方案的用途，其中所述诱发的免疫耐受性减少免疫抑制药物施用于所述受试者。
37.如实施方案36的用途，其中所述免疫抑制药物包括以下中的一种或多种：环孢菌素、环孢菌素a、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、沙利度胺、锂、fk-506、西罗莫司、atg、英夫利昔单抗和全身性类固醇。
38.如实施方案28至37中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于接受所述移植前。
39.如实施方案28至38中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在接受移植36小时内。
40.如实施方案28至38中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在接受移植12小时内。
41.如实施方案27至40中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
42.如实施方案27至41中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
43.如实施方案27至41中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
44.如实施方案28至43中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
45.一种诱发实体组织移植接受者中对实体组织移植的免疫耐受性的方法，其包括：
在接受实体组织移植的临床相关的时间窗内向所述移植接受者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而诱发所述实体组织移植接受者中对所述实体组织移植的免疫耐受性。
46.如实施方案45的方法，其中(i)所述实体组织移植与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
47.如实施方案45或46的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
48.如实施方案45至47中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
49.如实施方案45至48中任一实施方案的方法，其中免疫耐受性由改善的实体组织移植结果所证明。
50.如实施方案49的方法，其中所述改善的实体组织移植结果由与未接受exp-cbsc的参考群体相比移植排斥反应减少所证明。
51.如实施方案49至50中任一实施方案的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
52.如实施方案49至51中任一实施方案的方法，其中所述改善的实体组织移植结果由与未接受exp-cbsc的参考群体相比免疫抑制药物的施用减少所证明。
53.如实施方案52的方法，其中所述免疫抑制药物包括以下中的一种或多种：环孢菌素、环孢菌素a、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、沙利度胺、锂、fk-506、西罗莫司、atg、英夫利昔单抗和全身性类固醇。
54.如实施方案45至53中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于接受所述实体组织移植前。
55.如实施方案45至54中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述实体组织移植36小时内。
56.如实施方案45至54中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述实体组织移植12小时内。
57.如实施方案45至56中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
58.如实施方案45至57中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
59.如实施方案45至57中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
60.如实施方案45至59中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
61.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减少有需要的受试者中的免疫抑制剂药物的施用。
62.如实施方案61的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
63.如实施方案61或62的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
64.如实施方案61至63中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
65.如实施方案61至64中任一实施方案的方法，其中所述免疫抑制药物包括以下中的一种或多种：环孢菌素、环孢菌素a、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、沙利度胺、锂、fk-506、西罗莫司、atg、英夫利昔单抗和全身性类固醇。
66.如实施方案61至65中任一实施方案的用途，其中所述受试者由于移植程序而正接受免疫抑制药物。
67.如实施方案66的用途，其中所述移植程序包括实体组织移植程序。
68.如实施方案67的用途，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
69.如实施方案66中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括造血细胞移植程序。
70.如实施方案66至69中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括同种异体移植程序。
71.如实施方案66中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括同种异体脐带血移植程序。
72.如实施方案62至71中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植程序前。
73.如实施方案62至72中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在移植程序36小时内。
74.如实施方案62至72中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在移植程序12小时内。
75.如实施方案61至74中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
76.如实施方案61至74中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
77.如实施方案62至76中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
78.一种减少实体组织移植接受者需要的免疫抑制药物的量的方法，其包括：
在接受实体器官移植的临床相关的时间窗内向所述移植接受者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少所述实体器官移植接受者需要的免疫抑制药物的量。
79.如实施方案78的方法，其中(i)所述实体组织移植与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
80.如实施方案78或79的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
81.如实施方案78至80中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
82.如实施方案78至81中任一实施方案的方法，其中所述免疫抑制药物包括以下中的一种或多种：环孢菌素、环孢菌素a、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、沙利度胺、锂、fk-506、西罗莫司、atg、英夫利昔单抗和全身性类固醇。
83.如实施方案78至82中任一实施方案的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
84.如实施方案78至83中任一实施方案的方法，其中所述实体组织移植包括同种异体实体组织移植。
85.如实施方案78至84中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述实体组织移植前。
86.如实施方案78至85中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述实体组织移植36小时内。
87.如实施方案78至85中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述实体组织移植12小时内。
88.如实施方案78至87中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
89.如实施方案78至88中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
90.如实施方案78至88中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
91.如实施方案78至90中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
92.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减少有需要的受试者中的全胃肠外营养(tpn)。
93.如实施方案92的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
94.如实施方案92或93的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
95.如实施方案92至94中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
96.如实施方案92至95中任一实施方案的用途，其中所述受试者在医疗程序后接受tpn。
97.如实施方案96的用途，其中所述医疗程序包括移植。
98.如实施方案97的用途，其中所述移植包括实体组织移植。
99.如实施方案98的用途，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
100.如实施方案97中任一实施方案的用途，其中所述移植包括造血细胞移植程序。
101.如实施方案97至100中任一实施方案的用途，其中所述移植包括同种异体移植程序。
102.如实施方案97中任一实施方案的用途，其中所述移植包括同种异体脐带血移植程序。
103.如实施方案92至102中任一实施方案的用途，其中所述受试者是儿科受试者。
104.如实施方案93至103中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
105.如实施方案93至104中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
106.如实施方案93至104中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
107.如实施方案92至106中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
108.如实施方案92至107中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
109.如实施方案92至107中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
110.如实施方案93至109中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
111.一种方法，其包括：
鉴别在接受同种异体移植后将接受全胃肠外营养(tpn)的儿科患者；
在所述同种异体移植的临床相关的时间窗内向所述儿科患者施用未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)；
从而减少所述儿科患者在所述同种异体移植后的全胃肠外营养(tpn)使用。
112.如实施方案111的方法，其中(i)所述同种异体移植与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
113.如实施方案111或112的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
114.如实施方案111至113中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
115.如实施方案111至114中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括实体组织移植。
116.如实施方案115的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
117.如实施方案111至114中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括造血细胞移植。
118.如实施方案111至114中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括脐带血移植程序。
119.如实施方案111至118中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
120.如实施方案111至119中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
121.如实施方案111至119中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
122.如实施方案111至121中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
123.如实施方案111至122中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
124.一种减少在医疗程序后受试者的全胃肠外营养(tpn)使用的方法，其包括在所述医疗程序的临床相关的时间窗内向所述受试者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少在医疗程序后受试者的tpn使用。
125.如实施方案124的方法，其中在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
126.如实施方案124或125的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
127.如实施方案124至126中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
128.如实施方案124至127中任一实施方案的方法，其中所述医疗程序包括移植。
129.如实施方案128的方法，其中所述移植包括实体组织移植。
130.如实施方案129的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
131.如实施方案128中任一实施方案的方法，其中所述移植包括造血细胞移植。
132.如实施方案128至131中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体移植。
133.如实施方案128中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体脐带血移植。
134.如实施方案124至133中任一实施方案的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
135.如实施方案124至134中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
136.如实施方案124至135中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
137.如实施方案124至135中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
138.如实施方案124至137中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
139.如实施方案124至138中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
140.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减少有需要的受试者中的阿片样物质使用。
141.如实施方案140的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
142.如实施方案140或141的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
143.如实施方案140至142中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
144.如实施方案140至143中任一实施方案的用途，其中所述阿片样物质是选自以下中的一种或多种：阿尼利定、烯丙罗定、阿酚太尼、阿法罗定、苄吗啡、丁丙诺啡、贝齐米特、布托啡诺、可待因、氯尼他秦、环佐辛、地佐辛、地索吗啡、二氢吗啡、右旋吗酰胺、地恩丙胺、二氢可待因、二乙噻丁、地美沙多、美沙醇、二甲噻丁、地匹哌酮、吗苯丁酯、依他佐辛、乙基吗啡、乙甲噻丁、依托尼秦、依索庚嗪、芬太尼、氢可酮、海洛因、6-氢吗啡酮、羟哌替啶、氢吗啡酮、异美沙酮、凯托米酮、莱瓦洛芬、左芬啡烷、洛芬太尼、利富吩、吗啡、麦罗啡、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、美托酮、吗啡、罂粟碱、纳布啡、纳洛芬、尼可吗啡、去甲左啡诺、去甲美沙酮、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、氧可酮、氧吗啡酮、哌腈米特、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、苯哌利定、去痛定、非诺吗烷、普罗庚嗪、二甲度冷丁、异丙哌替啶、丙吡胺、丙氧芬、舒芬太尼、痛立定、曲马多、其立体异构体、其代谢物、其盐、其醚、其酯和/或其衍生物和/或其混合物。
145.如实施方案140至144中任一实施方案的用途，其中所述阿片样物质与第二活性成分混合。
146.如实施方案145的用途，其中所述阿片样物质与所述第二活性成分包括氧可酮与醋氨酚或氢可酮与醋氨酚。
147.如实施方案140至146中任一实施方案的用途，其中所述受试者在医疗程序后接受阿片样物质。
148.如实施方案147的用途，其中所述医疗程序包括移植。
149.如实施方案148的用途，其中所述移植包括实体组织移植。
150.如实施方案149的用途，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
151.如实施方案148中任一实施方案的用途，其中所述移植包括造血细胞移植。
152.如实施方案148至151中任一实施方案的用途，其中所述移植包括同种异体移植。
153.如实施方案148中任一实施方案的用途，其中所述移植包括同种异体脐带血移植。
154.如实施方案141至153中任一实施方案的用途，其中所述受试者是儿科受试者。
155.如实施方案142至154中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
156.如实施方案142至155中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
157.如实施方案142至155中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
158.如实施方案141至157中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
159.如实施方案141至158中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
160.如实施方案141至158中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
161.如实施方案142至160中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
162.一种方法，其包括：
鉴别在接受同种异体移植后将接受阿片样物质的儿科患者；
在所述同种异体移植的临床相关的时间窗内向所述儿科患者施用未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)；从而减少在所述同种异体移植后所述儿科患者的阿片样物质使用。
163.如实施方案162的方法，其中(i)所述同种异体移植与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
164.如实施方案162或163的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
165.如实施方案162至164中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
166.如实施方案162至165中任一实施方案的方法，其中所述阿片样物质是选自以下中的一种或多种：阿尼利定、烯丙罗定、阿酚太尼、阿法罗定、苄吗啡、丁丙诺啡、贝齐米特、布托啡诺、可待因、氯尼他秦、环佐辛、地佐辛、地索吗啡、二氢吗啡、右旋吗酰胺、地恩丙胺、二氢可待因、二乙噻丁、地美沙多、美沙醇、二甲噻丁、地匹哌酮、吗苯丁酯、依他佐辛、乙基吗啡、乙甲噻丁、依托尼秦、依索庚嗪、芬太尼、氢可酮、海洛因、6-氢吗啡酮、羟哌替啶、氢吗啡酮、异美沙酮、凯托米酮、莱瓦洛芬、左芬啡烷、洛芬太尼、利富吩、吗啡、麦罗啡、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、美托酮、吗啡、罂粟碱、纳布啡、纳洛芬、尼可吗啡、去甲左啡诺、去甲美沙酮、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、氧可酮、氧吗啡酮、哌腈米特、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、苯哌利定、去痛定、非诺吗烷、普罗庚嗪、二甲度冷丁、异丙哌替啶、丙吡胺、丙氧芬、舒芬太尼、痛立定、曲马多、其立体异构体、其代谢物、其盐、其醚、其酯和/或其衍生物和/或其混合物。
167.如实施方案162至166中任一实施方案的方法，其中所述阿片样物质与第二活性成分混合。
168.如实施方案167的方法，其中所述阿片样物质与所述第二活性成分包括氧可酮与醋氨酚或氢可酮与醋氨酚。
169.如实施方案162至168中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括实体组织移植。
170.如实施方案169的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
171.如实施方案162至168中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括造血细胞移植。
172.如实施方案162至168中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括脐带血移植程序。
173.如实施方案162至172中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
174.如实施方案162至173中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
175.如实施方案162至173中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
176.如实施方案162至175中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
177.如实施方案162至176中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
178.一种减少在医疗程序后受试者的阿片样物质使用的方法，其包括在所述医疗程序的临床相关的时间窗内向所述受试者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少所述受试者在所述医疗程序后的阿片样物质使用。
179.如实施方案178的方法，其中在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
180.如实施方案178或179的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
181.如实施方案178至180中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
182.如实施方案178至181中任一实施方案的方法，其中所述阿片样物质是选自以下中的一种或多种：阿尼利定、烯丙罗定、阿酚太尼、阿法罗定、苄吗啡、丁丙诺啡、贝齐米特、布托啡诺、可待因、氯尼他秦、环佐辛、地佐辛、地索吗啡、二氢吗啡、右旋吗酰胺、地恩丙胺、二氢可待因、二乙噻丁、地美沙多、美沙醇、二甲噻丁、地匹哌酮、吗苯丁酯、依他佐辛、乙基吗啡、乙甲噻丁、依托尼秦、依索庚嗪、芬太尼、氢可酮、海洛因、6-氢吗啡酮、羟哌替啶、氢吗啡酮、异美沙酮、凯托米酮、莱瓦洛芬、左芬啡烷、洛芬太尼、利富吩、吗啡、麦罗啡、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、美托酮、吗啡、罂粟碱、纳布啡、纳洛芬、尼可吗啡、去甲左啡诺、去甲美沙酮、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、氧可酮、氧吗啡酮、哌腈米特、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、苯哌利定、去痛定、非诺吗烷、普罗庚嗪、二甲度冷丁、异丙哌替啶、丙吡胺、丙氧芬、舒芬太尼、痛立定、曲马多、其立体异构体、其代谢物、其盐、其醚、其酯和/或其衍生物和/或其混合物。
183.如实施方案178至182中任一实施方案的方法，其中所述阿片样物质与第二活性成分混合。
184.如实施方案183的方法，其中所述阿片样物质与所述第二活性成分包括氧可酮与醋氨酚或氢可酮与醋氨酚。
185.如实施方案178至184中任一实施方案的方法，其中所述医疗程序包括移植。
186.如实施方案185的方法，其中所述移植包括实体组织移植。
187.如实施方案186的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
188.如实施方案185至184中任一实施方案的方法，其中所述移植包括造血细胞移植。
189.如实施方案185至188中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体移植。
190.如实施方案185中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体脐带血移植。
191.如实施方案178至190中任一实施方案的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
192.如实施方案178至191中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
193.如实施方案178至192中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
194.如实施方案178至192中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
195.如实施方案178至194中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
196.如实施方案178至195中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
197.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减少有需要的受试者的住院治疗。
198.如实施方案197的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
199.如实施方案197或198的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
200.如实施方案197至199中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
201.如实施方案197至200中任一实施方案的用途，其中所述受试者因移植程序而住院治疗。
202.如实施方案201的用途，其中所述移植程序包括实体组织移植。
203.如实施方案202的用途，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
204.如实施方案201中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括造血细胞移植。
205.如实施方案201至204中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括同种异体移植。
206.如实施方案201中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括同种异体脐带血移植。
207.如实施方案197至206中任一实施方案的用途，其中所述受试者是儿科受试者。
208.如实施方案198至207中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
209.如实施方案198至208中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
210.如实施方案198至208中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
211.如实施方案197至210中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
212.如实施方案197至211中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
213.如实施方案197至211中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
214.如实施方案198至213中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
215.一种方法，其包括：
鉴别在接受同种异体移植后将住院治疗的儿科患者；
在所述同种异体移植的临床相关的时间窗内向所述儿科患者施用未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)；
从而减少在所述同种异体移植后所述儿科患者的住院治疗时间。
216.如实施方案215的方法，其中(i)所述同种异体移植的移植物与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
217.如实施方案215或216的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
218.如实施方案215至217中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
219.如实施方案215至218中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括实体组织移植。
220.如实施方案219的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
221.如实施方案215至218中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括造血细胞移植。
222.如实施方案215至218中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括脐带血移植程序。
223.如实施方案215至222中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
224.如实施方案215至223中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
225.如实施方案215至223中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
226.如实施方案215至225中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
227.如实施方案215至226中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
228.一种减少在医疗程序后受试者的住院治疗时间的方法，其包括在所述医疗程序的临床相关的时间窗内向所述受试者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少所述受试者在所述医疗程序后的住院治疗时间。
229.如实施方案228的方法，其中在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
230.如实施方案228或229的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
231.如实施方案228至230中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
232.如实施方案228至231中任一实施方案的方法，其中所述医疗程序包括移植。
233.如实施方案232的方法，其中所述移植包括实体组织移植。
234.如实施方案233的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
235.如实施方案232中任一实施方案的方法，其中所述移植包括造血细胞移植。
236.如实施方案232至235中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体移植。
237.如实施方案228至231中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体脐带血移植。
238.如实施方案228至237中任一实施方案的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
239.如实施方案228至238中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
240.如实施方案228至239中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
241.如实施方案228至239中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
242.如实施方案228至241中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
243.如实施方案228至242中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
244.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减轻有需要的受试者的粘膜炎。
245.如实施方案244的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
246.如实施方案244或245的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
247.如实施方案244至246中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
248.如实施方案244至247中任一实施方案的用途，其中所述受试者因移植程序而有需要。
249.如实施方案248的用途，其中所述移植程序包括实体组织移植。
250.如实施方案249的用途，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
251.如实施方案248的用途，其中所述移植程序包括造血细胞移植。
252.如实施方案248至251中任一实施方案的用途，其中所述移植程序包括同种异体移植。
253.如实施方案248的用途，其中所述移植程序包括同种异体脐带血移植。
254.如实施方案244至253中任一实施方案的用途，其中所述受试者是儿科受试者。
255.如实施方案245至254中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
256.如实施方案245至255中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
257.如实施方案245至255中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
258.如实施方案244至257中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
259.如实施方案244至258中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
260.如实施方案244至258中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
261.如实施方案245至260中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
262.一种方法，其包括：
鉴别起源于接受同种异体移植而处于出现粘膜炎的风险下的儿科患者；
在所述同种异体移植的临床相关的时间窗内施用未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)；
从而减少所述处于风险下的儿科患者中的粘膜炎。
263.如实施方案262的方法，其中(i)所述同种异体移植的移植物与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
264.如实施方案262或263的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
265.如实施方案262至264中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
266.如实施方案262至265中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括实体组织移植。
267.如实施方案266的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
268.如实施方案262至265中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括造血细胞移植。
269.如实施方案262至265中任一实施方案的方法，其中所述同种异体移植包括脐带血移植程序。
270.如实施方案262至269中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述移植前。
271.如实施方案262至270中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
272.如实施方案262至270中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
273.如实施方案262至272中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
274.如实施方案262至273中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
275.一种减少在医疗程序后受试者的粘膜炎的方法，其包括在所述医疗程序的临床相关的时间窗内向所述受试者施用治疗有效量的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)，从而减少在所述医疗程序后所述受试者的粘膜炎。
276.如实施方案275的方法，其中在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
277.如实施方案275或276的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
278.如实施方案275至277中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
279.如实施方案275至278中任一实施方案的方法，其中所述医疗程序包括移植。
280.如实施方案279的方法，其中所述移植包括实体组织移植。
281.如实施方案280的方法，其中所述实体组织移植包括脂肪组织、血管、骨、骨髓、心脏细胞、软骨、软骨质细胞、软骨细胞、耳蜗、结缔组织、角膜、培养的细胞单层、牙齿组织、眼睛、面部、筋膜、纤维组织、足、脊柱功能单位、毛发、手、心脏、心脏瓣膜、肠、胰岛细胞、肾、晶状体、韧带、肝、肺、半月板、肌-腱移植物、肌肉组织、神经细胞、神经组织、骨软骨细胞、骨原细胞、卵巢、胰腺、半腱组织、皮肤、脾、胃、腱、睾丸、牙齿或椎间盘。
282.如实施方案279中任一实施方案的方法，其中所述移植包括造血细胞移植。
283.如实施方案279至282中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体移植。
284.如实施方案279中任一实施方案的方法，其中所述移植包括同种异体脐带血移植。
285.如实施方案275至284中任一实施方案的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
286.如实施方案275至285中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
287.如实施方案275至286中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植36小时内。
288.如实施方案275至286中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在接受所述移植12小时内。
289.如实施方案275至288中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
290.如实施方案275至289中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
291.一种未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)的用途，其用于减轻有需要的受试者的急性移植物抗宿主病。
292.如实施方案291的用途，其中所述用途包括在临床相关的时间窗内向所述有需要的受试者施用治疗有效量。
293.如实施方案291或292的用途，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
294.如实施方案291至293中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
295.如实施方案291至294中任一实施方案的用途，其中所述减轻的急性gvhd包括减轻的iii期急性gvhd。
296.如实施方案291至295中任一实施方案的用途，其中所述减轻的急性gvhd包括减轻的iv期急性gvhd。
297.如实施方案291至296中任一实施方案的用途，其中所述受试者因同种异体造血细胞移植而有需要。
298.如实施方案297的用途，其中所述同种异体造血细胞移植包括脐带血移植。
299.如实施方案298的用途，其中所述脐带血移植与所述受试者在4/6、5/6或6/6hla抗原上匹配。
300.如实施方案291至299中任一实施方案的用途，其中所述受试者是儿科受试者。
301.如实施方案292至300中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
302.如实施方案292至301中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
303.如实施方案292至301中任一实施方案的用途，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
304.如实施方案291至303中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
305.如实施方案291至304中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
306.如实施方案291至304中任一实施方案的用途，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
307.如实施方案292至306中任一实施方案的用途，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
308.一种方法，其包括：
鉴别起源于接受同种异体移植而处于急性移植物抗宿主病(gvhd)的风险下的患者；
在所述同种异体移植的临床相关的时间窗内施用未匹配的cd34+富集和扩增的脐带血样品(exp-cbsc)；
从而减少所述处于风险下的患者的急性gvhd。
309.如实施方案308的方法，其中(i)所述同种异体移植的移植物与所述受试者是免疫学上匹配的，并且(ii)在未进行免疫学匹配下向所述受试者施用所述exp-cbsc。
310.如实施方案308或309的方法，其中所述exp-cbsc预先冷冻保存。
311.如实施方案308至310中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc不包括t细胞。
312.如实施方案308至311中任一实施方案的方法，其中所述减轻的急性gvhd包括减轻的iii期急性gvhd。
313.如实施方案308至312中任一实施方案的方法，其中所述减轻的急性gvhd包括减轻的iv期急性gvhd。
314.如实施方案308至313中任一实施方案的方法，其中所述受试者因同种异体造血细胞移植而有需要。
315.如实施方案314的方法，其中所述同种异体造血细胞移植包括脐带血移植。
316.如实施方案315的方法，其中所述脐带血移植与所述受试者在4/6、5/6或6/6hla抗原上匹配。
317.如实施方案308至316中任一实施方案的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
318.如实施方案308至317中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗发生于所述医疗程序前。
319.如实施方案308至318中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序36小时内。
320.如实施方案308至318中任一实施方案的方法，其中所述临床相关的时间窗在所述医疗程序12小时内。
321.如实施方案308至320中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括至少7.5×107个cd34+细胞。
322.如实施方案308至321中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc源自于单个人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
323.如实施方案308至321中任一实施方案的方法，其中所述exp-cbsc包括一池两种或更多种不同的扩增的人类脐带血干细胞样品，所述池中的每种不同样品源自于不同的人在出生时的脐带血和/或胎盘血。
324.如实施方案308至323中任一实施方案的方法，其中所述治疗有效量包括每公斤所述受试者1×106-2×107个cd34+细胞。
实施例1.在接受notch扩增的鼠科造血干细胞和祖细胞的mhc错配的接受者中减少的移植排斥反应.将离体扩增的鼠科造血干细胞和祖细胞(hspc)输注至完全主要组织相容性复合体错配的接受者中提高源自供体而非第三方的皮肤移植物的存活率。此发现说明在鼠科h-ars模型中离体扩增的错配的hspc传递供体特异性免疫耐受性。
同种异体造血干细胞移植(hct)促进供体特异性免疫耐受性且随后降低实体器官移植接受者中急性和慢性移植物排斥反应的风险(millan等人,2002,transplantation；73:1386-1391；scandling等人,2008,nengljmed358:362–368；granados等人,2015,curropinorgantransplant.20:49-56)。已经在肾脏移植接受者中观察到在具有持续混合嵌合性的非清髓性hct背景中同种异体移植物免疫耐受性的成功传递和免疫抑制药物的完全退出(kawai等人,amjtransplant2014,14:1599-1611；scandling等人,amjtransplant2015,15:695-704；sorof等人,transplantation1995,59:1633-1635)。有趣地，已经在非人类灵长类动物和人类中诱发肾脏同种异体移植物耐受性，即使有暂时嵌合性(sorof等人,transplantation1995,59:1633-1635,kawai和sachs,curropinorgantransplant2013,18:402-407)。kawai假设，这种现象是由例如不成熟树突状细胞或t细胞的供体造血细胞的暂时扩增引起的，这可能引起供体反应性接受者t细胞的胸腺缺失或者诱发供体特异性调节t细胞。
本实施例报导在致死量的辐射后输注mhc错配的冷冻保存的离体扩增的小鼠hspc(lin-sca1+ckit+[lsk]细胞)产物诱发供体特异性免疫耐受性，使得供体皮肤同种异体移植物的存活更长。这些数据加强了以下结论：这种临床相关的冷冻保存的万能供血者的现成细胞产物可以在器官移植接受者中诱发供体特异性耐受性，减少移植排斥反应。
方法.小鼠.将雌性或雄性b6-ly5a(h-2b、cd45.1+)小鼠在弗莱德哈钦森癌症研究中心动物卫生资源中心(animalhealthresourcescenterofthefredhutchinsoncancerresearchcenter，fhcrc)中在特定的无病原体的条件下繁殖和供养。雌性balb/cj(h-2d、cd45.2+)和c3h(h-2k、cd45.2+)小鼠是从jacksonlaboratory(barharbor,me)购得。小鼠供养在标准条件下，并且所有实验都在fhcrc实验动物照护与使用委员会(iacuc)的批准和指导下进行。
小鼠造血干细胞和祖细胞的分离和扩增.来自b6-ly5a小鼠骨髓的lsk细胞通过使用荧光活化的细胞分选器(facs)aria(bectondickinson[bd],franklinlakes,nj)，如先前所描述来富集(varnum-finney等人,blood1998,91:4084-4091)。在每次分选后，证实所分选的群体的纯度并超过90％。在37℃下将未用组织培养物处理的6孔板用5mg/ml的浓度的工程化的notch配体(delta1ext-igg；dxi)或人类igg涂布2小时，接着用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤并用含有2％牛血清白蛋白的pbs阻断至少30分钟。将分选好的lsk细胞在dxi或igg存在下在伊斯科夫改良达贝科培养基(iscove’smodifieddulbeccomedium)(thermofisherscientificlifesciences,waltham,ma)培养，所述培养基补充有20％胎牛血清(hyclonefbs,thermofisherscientificlifesciences)、1％青霉素-链霉素及以下细胞因子：鼠科干细胞因子、人类flt-3配体、人类il-6(各100ng/ml)和人类il-11(10ng/ml；所有细胞因子都从peprotech,rockyhill,nj购得)(varnum-finney等人,2003,101:1784-1789)。在14天培养期间细胞密度维持在1×106个细胞/毫升下。在14天结束时，收获扩增的lsk细胞并且新鲜的细胞用于移植实验或者冷冻保存在90％fbs+10％二甲亚砜中。在移植当天，通过分别使用锥虫蓝染料排除和流式细胞术，确定解冻后的细胞恢复和lsk表型的保存。
照射、造血干细胞移植和追踪供体嵌合性.使用铯源(jlshepherd&associates,sanfernando,ca)，在81.4cgy/min的速率下，6-8周龄的雌性balb/cj小鼠接受单一剂量的6.5-8.5gyγ-照射。4至72小时后，将小鼠静脉内注射igg或dxi扩增的新鲜或冷冻保存的lsk细胞(如所指示，1×106、3×106、5×106和15×106个细胞)。为了省去性别的作用、避免令人混淆的变量和降低实验规模，仅仅雌性小鼠用作接受者。一旦证实igg扩增的细胞未产生供体重建，则在后续实验中给对照小鼠注射盐水溶液。每日观察小鼠，并处死满足由iacuc批准的方案建立的特定准则的垂死动物，且证明期为由辐射诱发的毒性引起的实验死亡。在照射后，通过流式细胞术，在单独一群小鼠中的外周血(pb)和bm中证明供体嵌合性(％cd45.1+细胞)和淋巴髓细胞样谱系分布。
流式细胞术.来自ly5a小鼠骨髓的lsk细胞通过使用facs，如先前所述来富集(varnum-finney等人,blood1998,91:4084-4091)。简单地说，来自b6-ly5a小鼠的bm细胞与自制的谱系(lin)混合物一起培育。lin混合物包括针对cd2(克隆rm2-5)、cd3(克隆17a2)、cd5(克隆53-7.3)、cd8a(克隆53-6.7)、cd11b(克隆m1/70)、gr1(克隆rb6-8)、b220(克隆ra3-6b2)和ter-119(克隆ter-119)的抗体。所有抗体都来自于bdbiosciences并在大鼠中培养。在与lin混合物培育10分钟后，洗涤样品并加入绵羊抗大鼠igg珠粒(dynabeads,thermofisherscientificlifesciences)。使用dynamag磁铁(thermofisherscientificlifesciences)分离lin阳性细胞。将lin阴性细胞用sca1-pe(克隆e13-161.7)和c-kit-异硫氰酸荧光素(fitc)(克隆2b8)染色，并使用facsariaii细胞分选器分离lsk细胞。
通过使用眼眶后技术收集血液样品，并在全身麻醉下从右股骨或左股骨吸出bm细胞。在溶解红细胞后，将pb和bm细胞与阻断试剂(具有2％fbs之pbs)、抗cd16/cd32抗体(2.4g2)一起培育，并用以下抗小鼠特异性抗体(除非提出，否则都来自bd)染色；cd45.1-pe-cy7(克隆a20)、cd45.2-别藻蓝蛋白(apc)-cy7(克隆104)、cd3-fitc(克隆17a2)、gr1-apc(克隆rb6-8c5)、b220-apc(克隆ra3-6b2)。通过使用lsrii(bdbiosciences)进行流式细胞分析。所有流式细胞术数据都通过使用flowjo软件9.0版(treestar,ca)分析。
皮肤移植物程序.在存活>40的小鼠子集中，通过使这些小鼠经受双侧同种异体和同基因皮肤移植来评估供体特异性耐受性。双侧同种异体和同基因皮肤移植在两组balb/cj小鼠中进行。第一组在左边接受balb/cj皮肤移植物，并且在右边接受b6-ly5a或c3h(h-2k、cd45.2)皮肤移植物。第二组balb/cj小鼠在左边接受b6-ly5a皮肤移植物并在右边接受c3h皮肤移植物。这项技术是由先前报导的方法(mcfarland和rosenberg,currprotocimmunol2009,第4章:第4.4单元)修改而来。简单地说，处死供体balb/cj、b6-ly5a和c3h小鼠，并收集腹部和侧面的躯体皮肤，切成小的正方形，并保持在冷pbs中。将对照(用balb/cj大量骨髓细胞重新组成)和嵌合balb/cj小鼠用异氟烷麻醉，在背侧胸上两侧制备7至10mm的移植物床，将皮肤移植物放到原位并修整到应有的尺寸，并用间断缝合术(5.0涂蜡的编织丝线)固定角。将移植物用非粘连的吸收性纱布垫、纸带和兽医用包裹物包扎。在7天后，除去敷料和缝线，并其后每日对移植物进行评分。排斥反应日被定义为>80％移植物坏死，结疤或者从移植物床移去。
统计分析.通过使用prism软件6.0f版(graphpad,sandiego,ca)进行所有统计分析，且p值<.05被认为表示统计上显著的差异。实验结果表示为平均值6sem。通过使用标准化学生t检验来分析植入数据，并通过使用卡普兰-梅耶存活曲线分析(kaplan-meiersurvivalcurveanalyse)分析总体存活率和移植物存活率。逻辑回归用于计算预计在30天内引起50％暴露群体死亡和30天内引起70％暴露群体死亡的辐射剂量(ld70/30)。通过使用分层威尔科克森(wilcoxon)(布雷斯洛(breslow))检验，针对存活者功能的同等性，分析皮肤移植物的存活数据。
在致命辐射后输注错配的扩增的鼠科祖细胞产生快速的髓细胞样恢复。先前已经显示在含有粘连蛋白片段和固定的notch配体的培养物中扩增的小鼠和人类hspc有效地在同基因和异基因的接受者中再生(varnum-finney等人,2003,101:1784-1789；delaneyc等人,blood2005,106:2693-2699)。这项研究测试在致命辐射后当输注至mhc错配的接受者时扩增的鼠科hspc是否可以类似地提供快速的造血重建。为了实现此，将用igg或delta1ext-igg扩增14天的新鲜的1×106个b6-ly5a(h-2b、cd45.1)lsk细胞注射到致死照射(8.5gy)的6至8周龄的雌性balb/cj(h-2d、cd45.2)小鼠中(图6a)。正如所料，在14天培养期结束时，76％的delta1ext-igg培养的细胞是sca-1+c-kit+(图6b，左下图)，且很少表达粒细胞相关(gr-1和cd11b)的抗原(图6b，右下图)。相比之下，用对照igg培养的少数细胞是sca-1+c-kit+，且大部分是gr-1+和cd11b+粒细胞，这表明分化(图6b，左上图和右上图)。
早在输注新鲜的dxi培养的细胞后7天，在mhc错配的小鼠的pb与bm中观察到高水平的植入(图6c)。在这些小鼠中，在8周内供体细胞继续减少，导致到移植后60天pb中低水平的供体细胞(4.5％60.6％)。相比之下，在输注对照igg培养的细胞的小鼠中第7天的供体植入低(24％64％)，且仅仅在bm中检测到。至第14天，在这组中未检测到供体植入(图6c)。利用dxi培养的细胞的早期的源自供体的造血重建主要是髓细胞样(数据未显示)，而在移植后2个月，源自供体的造血主要是t-淋巴样细胞，其为离体扩增的短期再生细胞的后代(图6c，插图)。
输注错配的dxi培养的细胞诱发供体特异性耐受性并提高皮肤移植物存活率(即减少移植排斥反应)。低水平的供体t细胞在移植了dxi培养的细胞的小鼠的pb中的长期存留且无移植物抗宿主病(gvhd)的证据表明了存在跨越全部mhc障碍的供体特异性的移植耐受性。为了阐明这些小鼠是否已经发展供体特异性耐受性，通过在其已经移植对照同基因bm或dxi培养的细胞后60天手术放置同基因(balb/cj、h-2d)、供体(b6-ly5a、h-2b)或第三方(c3h、h-2k)皮肤移植物来激发其。每只小鼠植入两个皮肤移植物，一个各在侧腹的一侧；每一侧腹上移植物的来源是同基因/供体、同基因/第三方或供体/第三方(图7a)。对照组和dxi组中分别存在由技术问题引起的六例和四例移植物失败。在先前移植同基因bm(图7b、7e)或同种异体dxi培养的细胞(图7c、7e)的小鼠中未有同基因皮肤移植物被排斥，而在所有小鼠中在移植物放置后的头13天内所有的第三方皮肤移植物都被排斥，留下感染的疤痕组织(图7b、7c、7g)。
相比之下，在dxi组中供体移植物的30天存活率显著延长；至第30天，48％(21个中的10个)皮肤移植物看似健康且未显示排斥迹象(结硬皮和结疤)(图7c、7f；p≤.001)。此外，14％的这些移植物显示完全植入，证据是在手术部位在白发背景下生长黑发(图7d)。这些小鼠中延长的移植物存活不是因为免疫缺陷，而是因为小鼠排斥所有第三方皮肤移植物(图7c、7g)。完全相反地，在移植同基因bm细胞的小鼠中所有供体移植物都被排斥(图7b、7f)。有趣地，在皮肤移植时pb中持续供体植入的水平与移植物存活不相关。不受理论束缚，这些结果证明以下观点；提高的皮肤移植物存活率是由通过输注冷冻保存的同种异体的dxi培养的细胞诱发供体特异性的免疫耐受性而引起。在tbi后存活超过最初30天的小鼠中无一只小鼠在实验(90天)期间显现辐射暴露的任何长期并发症。
本实施例证明尽管细胞与接受者之间存在重大错配，但在mhc错配的鼠科接受者中在大范围致命tbi剂量后用冷冻保存的离体dxi扩增的鼠科hspc处理使得源自供体的骨髓细胞到输注扩增的细胞产物后的第7天快速恢复。本实施例还证明在完全错配的小鼠中bm和pb中持续的混合的供体嵌合性可能跨越主要h2组织相容性障碍且无任何gvhd证据。重要地，本研究未使用移植后免疫抑制或者抗宿主抗体疗法，在先前研究中发现需要其(cobbold等人,nature1986,323:164-166；yamada等人,amjtransplant2015,15:3055-3066；devries-vanderzwan等人,bonemarrowtransplant1998,22:91-98)。
在致死照射的小鼠中，源自供体的植入在第7天达到最高值，主要是骨髓细胞。其后，供体植入水平下降，且到第60天，供体植入稳定在低水平下，几乎仅仅源自主要cd3+t淋巴细胞，无任何gvhd证据。在移植mhc错配的细胞的这些小鼠中t淋巴样供体嵌合性类似于先前在移植mhc匹配的dxi扩增的细胞的小鼠中报导的情况(varnum-finney等人,2003,101:1784-1789)，且所述细胞是离体产生的短期淋巴样髓细胞样再生细胞的后代。似乎notch信号传导对从扩增的再生细胞产生的后代t细胞的发育无影响，因为notch配体delta1用于诱发增殖，同时抑制lsk分化。不受理论束缚，通过移植dxi扩增的细胞的小鼠中显著较高的皮肤移植物存活率，证明诱发跨越全部mhc障碍的免疫耐受性。在嵌合性水平与移植物存活率之间未观测到任何相关性，如先前他人所报导(sorof等人,transplantation1995,59:1633-1635；ildstad等人,jexpmed1985,162:231-244)。低水平的t细胞嵌合性(3.4％65％；范围0.2％-11.2％)足够传递供体特异性的免疫耐受性至皮肤移植物。但是，在暴露于8.0-gytbi的小鼠中(40％)移植物存活率高于暴露于7.5-gytbi的小鼠中，其中仅仅10个皮肤移植物中的1个在第30天不被排斥。本研究证明，通过显示对第三方(c3h)抗原有反应并迅速排斥第三方皮肤移植物，这些小鼠中延长的皮肤同种异体移植物存活具体是由于接受者缺乏针对特定供体抗原的反应。
本实施例最先显示在用冷冻保存的离体扩增的同种异体和错配的hla-hspc处理的接受者中供体特异性耐受性的诱发。
实施例2.在医疗程序后的阿片样物质使用、tpn喂养和住院治疗天数。在接受清髓性脐带血移植的儿科患者中输注离体扩增的脐带血祖细胞减少住院天数和阿片剂输注和全胃肠外营养的利用。
方法：接受清髓性预处理(flu/cy/13.2gytbi)且有或无扩增的cbhspc(新鲜或冷冻保存)的儿科患者(<21岁，n＝34)包括在本实施例中。在最初的住院治疗期间，针对每名患者，确定阿片剂疼痛药物治疗的使用(通过连续输注或pca)和tpn的使用。利用未配对的双尾t检验进行各组之间的统计比较。
结果：除1-2个未处理的cb单元外，11名患者还接受扩增的cbhspc，同时一群23名患者接受相同预处理方案而不输注扩增的细胞。在医疗程序后最初住院治疗的平均持续时间是43.2天对比55.6天(p＝0.05)(图8)，连续阿片剂药物治疗的平均持续时间是9.7天对比18.1天(p＝0.07)，并且接受tpn的平均时间是20.7天对比30.1天(p＝0.06)(图9)。
本实施例证明exp-cbsc重要的额外益处。全胃肠外喂养减少避免了可能由于这类人工喂养而引起的许多并发症。减少患者暴露于阿片样物质使用可以帮助解决正在流行的止痛药滥用问题。最终，减少在医疗程序后的住院治疗使与医疗护理有关的成本下降，且类似地，降低患者在住院治疗时所失去的机会成本。
实施例3.减轻的急性gvhd.进行一项有希望的开放标记的单臂研究，以评定在进行单个或双倍cbt、接着输注未进行hla匹配的先前进行离体扩增和冷冻保存的cb祖细胞产物的患者中的安全性、可行性和初步功效。
患者.合格的患者是6个月至≤45岁并具有高风险急性白血病、慢性髓细胞性白血病或脊髓发育不良综合征。额外入选要求包括足够的行为状态，足够的器官功能，和可利用通过针对hlai类等位基因(a和b)进行中等程度分辨或者通过针对hlaii类drb1等位基因进行高分辨率分型，在四个或更多个hla基因座上匹配的一个或两个cb单元。对于6/6单元，允许单个单元cbt具有总有核细胞计数(tnc)≥2.5×107/kg，对于5/6和4/6单元，tnc≥4.0×107/kg。如果这些阈值未满足，那么进行双倍单元cbt(dcbt)，其中每个单元要求具有tnc≥1.5×107/kg。
离体扩增的祖细胞产物：细胞加工和制造。简单地说，在机构审查委员会批准下从正常的足月儿获得人cb样品并通过pugetsound血液中心脐带血库，根据21cfr1271确定供体合格性。cb单元耗尽红细胞，并使用miltenyiclinimacs，根据制造商的说明书，对cd34+细胞进行临床等级选择。丢弃阴性部分。
培养物用纯化的cd34+细胞开始并在未用组织培养物处理的75-225cm2组织培养烧瓶(nunc,thermofisherscientific,pittsburg,usa)中培养14-16天。将培养容器用2.5μg/ml(先前显示对于产生nod/scid再生细胞来说最佳的密度)的临床级notch配体(delta1ext-igg，在fredhutchinson’sbiologicsproductionfacility中制备,dmfbb-mf12366)连同5ng/ml粘连蛋白片段ch-296(takarashuzoco.ltd.,otsu,japan)预涂布，在37℃下2小时或者在4℃下过夜，用pbs洗涤。将细胞在具有临床级重组人il-3(10ng/ml)、il-6、血小板生成素(tpo)、flt-3配体和干细胞因子(scf)(50ng/ml)(cellgenixfreiburg,germany)的无血清培养基(stemspansfem,stemcelltechnologies,vancouver,bc,canada)中培养。细胞分到新的培养容器以维持每毫升培养基<1×106个总细胞的细胞密度。
在培养第14天-第16天，收获全部体积的细胞，并进行最终放行测试，包括最终细胞计数以及cd34和tnc扩增倍数的计算、免疫表型分析、细菌和真菌无菌性和内毒素。图10a和10b描绘在收获扩增的细胞产物时cd34+细胞的平均扩增倍数(图10a)和总有核细胞数目的平均扩增倍数(图10b)。接着将产物冷冻保存在控制速率的冷冻机中。
最终收集的hspc产物.值得注意的是，没有成熟t细胞与扩增的移植物一起输注，因为产物由在培养从单个cb单元分离的cd34+hspc后产生的全部后代组成。阴性部分中所含的t细胞未保留，且在14天培养期内未产生或维持t细胞。源自于exp-cbsc的中值冷冻前tnc和cd34+细胞剂量分别是5.8×107/kg(范围2.2至10.9)和0.26×106/kg(范围3.1至11.6)。源自于未处理的移植物的中值冷冻前tnc和cd34+细胞剂量分别是6.1×107/kg(范围4.3至17.1)和0.26×106/kg(范围0.08至0.98)。与对照组中患者的tnc相比，在未处理的单元中接受exp-cbsc的患者具有显著较高的tnc(图11)。
统计分析.使用卡普兰和梅耶的方法得出无疾病存活(dfs)的概率[macmillan等人,blood2009；113:2410-15]。使用累积发生率估计，概述复发、非复发死亡(nrm)和急性gvhd的累积发生率，其中分别地，复发被认为是nrm的竞争风险，nrm是复发的竞争风险，并且没有每个其它终点失败的死亡被认为是每一个的竞争风险。
将接受exp-cbsc的患者组中的dfs、nrm、急性gvhd与接受cbt而无epc的50名患者的结果相比。所有患者都接受相同的预处理方案和gvhd预防。使用法恩与格雷法(fineandgraymethod)比较复发、nrm和急性gvhd的发生率。
结果.存活患者的中值随访期是4.2年(范围2.9至4.8年)。患者是5-45(中值21)岁且体重达23-89(中值59)kg。疾病包括aml(n＝6)、all(n＝8)、mds(n＝1)。六名患者(40％)在移植时具有微小残留病，微小残留病被定义为通过十色多参数流式细胞术，对作为hct前常规基线获得的骨髓抽出物进行评定的疾病的存在。除了4名(27％)以外的所有患者接受2个cb单元以实现所需细胞剂量。与对照组相比，在性别、年龄、体重、cmv血清状态和移植时疾病状态方面未看到差异。
移植结果.在exp-cbsc的接受者中3年dfs的概率是86％(95％ci：57-97)并且对照组中是67％(95％ci：52-78)(p＝0.16)(图12a)。图6b和图12c分别显示与对照组相比，exp-cbsc的接受者中nrm和复发的累积发生率。在整个研究期中，未观察到nrm，而在移植后53天和219天2名患者复发，并随后在进一步疗法后死亡。在53天复发的患者在移植时处于明显复发中。
急性和慢性gvhd.在32天的中值时间(14-86)，所有患者经诊断患有最大ii级急性gvhd，未观察到iii-iv级agvhd。相比之下，在对照组中iii-iv级agvhd的累积发生率是26％(p＝0.005)(图13)。在接受exp-cbsc的组(n＝12)中皮肤是最常受影响的器官。在6天的中值时间(范围4-9)，针对植入前综合征，治疗八名(53％)患者，并且在第100天后五名(33％)患者患有gvhd。在第100天后，在可评估的13名患者中，3名(23％)具有晚期agvhd特征或重叠综合征，而无人被诊断为具有经典cgvhd的特征。在2年，九名患者(70％)取消免疫抑制。
在本研究上在15名患者中未观察到移植相关的死亡；但是，出现由于疾病复发而引起的2例死亡，产生优良的总存活率。所观察到的阳性结果可以归于克服了进行cbt的患者所经历的植入延迟；但是，还可能的是输注现成exp-cbsc加强了移植物对移植物的相互作用并因此增加移植物抗白血病作用。虽然少数的患者不允许得出决定性结论，但患者的特征(其中一半在移植时是mrd+)和长的随访期使得这些结果非常鼓舞人心。
未观察到输注相关的毒性并且无严重不良事件归于现成exp-cbsc产物。更意外地，研究中入选的患者中无一名患者经历iii-iv级agvhd，这表明现成产物的免疫调节性。可能在现成的扩增产物存在下，来自未处理单元的同种异体反应t细胞将在体内扩增，并分化成能减轻agvhd的特定细胞子集。如果证实，那么此观测结果可能具有重要的临床含义。考虑到agvhd的重度形式与增加的发病和死亡风险有关[brunstein等人,blood2007；110:3064-70；macmillan等人,blood2009；113:2410-15]，现成产物的用途可以扩大到使用不同的干细胞来源的目标是减轻agvhd的其它类型的hct。
如本领域的一般技术人员所了解，本文公开的每个实施方案可以包含其具体陈述的要素、步骤、成分或组分，基本上由其具体陈述的要素、步骤、成分或组分组成或者由其具体陈述的要素、步骤、成分或组分组成。“包括(includes或including)”意指“包含、基本上由……组成或由……组成”。过渡术语“包含(comprise或comprises)”意指包括(但不限于)，并允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，甚至是较大量。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制于指定的要素、步骤、成分或组分和实质上不影响实施方案的要素、步骤、成分或组分。实质影响将引起exp-cbsc施用的以下有效性在统计上显著和临床上有意义的减少：(i)减少移植排斥反应、(ii)减少在医疗程序后tpn、阿片样物质使用和住院治疗天数；(iii)减轻粘膜炎；或者(iv)降低在根据本文所述的方案进行脐带血移植后iii级和iv级急性gvhd的发生率和/或严重度。
除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所用的表述成分的量、性质(例如分子量、反应条件)等的所有数值都应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则说明书和随附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以视设法通过本发明获得的所需性质而变化。至少且不试图将等同原则的应用限于权利要求书的范围，每个数字参数将至少按照所报导的有效数字和通过应用常规舍入技术来解释。当需要进一步明了时，术语“约”具有在结合所述数值或范围使用时本领域的技术人员适当归于其的含义，即表示略多于或略少于所述值或范围，在所述值±20％、所述值±19％、所述值±18％、所述值±17％、所述值±16％、所述值±15％、所述值±14％、所述值±13％、所述值±12％、所述值±11％、所述值±10％、所述值±9％、所述值±8％、所述值±7％、所述值±6％、所述值±5％、所述值±4％、所述值±3％、所述值±2％或所述值±1％范围内。
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但特定实施例中阐述的数值尽可能精确地报导。但是，任何数值都固有地含有一定的由相应测试测量中存在的标准偏差必然会引起的误差。
除非本文另外指示或上下文明显相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a/an)”、“所述”以及类似指示物将被视为涵盖单数与复数。本文中对值的范围的叙述仅仅意图用作个别提及所述范围内的每个单独值的一种速记方法。除非本文中另外指示，否则每一个别值如同其在本文中个别地叙述一般并入说明书中。除非本文中另外指示或与上下文另外明显相矛盾，否则本文所述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则关于本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅是为了更好地说明本发明，而非对本发明的范围施加限制。说明书中的语言不应视为指示任何未要求的要素对实施本发明来说是必不可少的。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应看作是限制。每个组成员可以个别地或以与所述组的其它成员或本文中发现的其它要素的任何组合提及和要求。预期出于方便和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组内或自组中删除。当出现任何此类包括或删除时，认为说明书含有经过修改的所述组，因此满足随附权利要求书中所用的所有马库什组(markushgroup)的书面描述。
本文描述了本发明的具体实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，本领域的一般技术人员在阅读以上描述后，将显而易见所述这些实施方案的变体。本发明人预期熟练技术人员视情况采用这类变体，并且本发明人意图本发明以除本文特别描述外的方式实施。因此，本发明包括随附权利要求书中叙述的主题物质的为适用法律所允许的所有修改和同等物。此外，除非本文中另外指示或上下文另外明显相矛盾，否则本发明涵盖上述要素呈所有可能变体的任何组合。
此外，本说明书中已经大量提及书籍、杂志文章、论文、专利、印刷出版物等(统称为“参考文献”)。上文所引用的每篇参考文献针对其引用的教示内容，都以引用的方式个别地并入本文中。
最后，应了解本文公开的本发明的实施方案说明本发明的原理。可以采用的其它修改在本发明的范围内。因此，举例来说(但不限制)，可以根据本文中的教示内容利用本发明的替代配置。因此，本发明不限于如准确所示及所述的内容。
本文中所示的细节是举例而已，且仅仅是为了说明性论述本发明的优选实施方案，并用于提供被认为是本发明的各种实施方案的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述的内容。在这点上，不尝试展示比基本理解本发明所需的内容更详细的本发明的结构细节，描述与图式和/或实施例一起使本领域的技术人员显而易见在实践中如何将本发明的若干形式具体实施。
除非在以下实施例中清楚且明确地修改或当含义的应用使得任何构造无意义或基本上无意义时，用于本公开中的定义和说明意味着且意指在任何将来的构造中为准。如果术语的构造将使得期无意义或基本上无意义，那么定义将取自韦氏词典(webster'sdictionary)第三版或本领域的一般技术人员已知的词典，例如oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology(anthonysmith编,oxforduniversitypress,oxford,2004)。