本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其涉及一种新鲜间充质干细胞的制备方法。
背景技术：
当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymalstemcell,msc）可以应用于多种疾病的治疗和康复，但是，在研究和应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，胚胎干细胞的应用存在伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；自体骨髓单个核细胞存在成分复杂，具有多向分化潜能的干细胞含量低、分化潜能有限等问题；自体骨髓间充质干细胞来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降，体外长期扩增降低体内分化归巢潜能。
与自体间充质干细胞相比，脐血、脐带、胎盘间充质干细胞来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，无社会、伦理和法律方面的争议，但脐带、胎盘分离细胞纯度低，常混有血管内皮细胞，临床不能应用。
另外，现有从脐带分离的msc在使用前均冷冻保存在-196℃的液氮中，并需要加入冷冻剂dmso（二甲基亚砜），使用时，再经过复温、解冻，解冻后的msc存在如下不足：1）活性下降；2）回收率下降，大约15%的细胞死亡；3）冷冻剂有大量的副作用，如血压升高、心率改变，头痛等；4）运输不方便，需要液氮罐运输；5）输注不方便，需要解冻设备，如水浴箱等；6）容易造成污染。
技术实现要素：
为了解决现有技术中间充质干细胞在使用前需冻存在-196℃极冷温度下的问题，本发明的目的是提供一种新鲜间充质干细胞的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种新鲜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1，从脐带沃顿胶质中分离原代细胞，接种于培养皿，放置于培养箱中培养；
s2，差速贴壁，分离提纯脐带间充质干细胞；
s3，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；
s4，加入胰酶进行贴壁生长细胞传代；
s5，弃去培养皿中的第一培养基，换成新鲜的第一培养基；
s6，将s5处理后的细胞加入细胞冷冻保护液，置于-80℃温度下保存；
s7，将s6冷冻后的细胞进行复苏；
s8，将s7复苏后的细胞中加入第二培养基，洗脱细胞冷冻保护液，提取细胞悬液并进行培养；
s9，将s8培养后的细胞进行离心，弃去上清液，加入保养液中。
其中，所述s1步骤包括
s10步骤：从脐带中剥离沃顿胶质的步骤；
s11步骤：采用磷酸盐缓冲液对沃顿胶质进行清洗的步骤；
s12步骤：向离心管中加入s11处理后的沃顿胶质和胶原酶、放入摇床进行消化，获取原代细胞的步骤；
s13步骤：将s12获取的原代细胞进行离心、洗涤的步骤。
其中，所述s12步骤中的消化温度为37℃，摇床速度为250rpm，消化时间为2h。
其中，所述s2步骤包括
s20步骤，弃去培养皿中的培养基，加入pbs进行漂洗的步骤；
s21步骤，加入培养基，于培养箱中培养的步骤；
s22步骤，弃去培养皿中的培养基，加入pbs进行漂洗的步骤；
s23步骤，加入胰酶进行消化的步骤；
s24步骤，加入第一培养基终止消化的步骤；
s25步骤，接种于新培养皿，继续培养的步骤。
其中，所述第一培养基主要由氨基酸、维生素、无机盐和胎牛血清组成。
其中，所述第二培养基主要由氨基酸、维生素、无机盐组成。
其中，所述培养箱为37℃5%的co2培养箱。
其中，所述s4步骤中传代时的消化时间为1-2min，贴壁时间为24-48h。
其中，所述s7步骤中复苏温度为37℃，复苏时间为2分钟。
其中，所述s9步骤中保养液为由生理盐水、白蛋白和谷氨酰胺组成的溶液，其中白蛋白和谷氨酰胺的质量分数分别为1%。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明制备的间充质干细胞在传代后于-80℃下保存，待使用时在37℃的水浴箱中晃动2分钟进行复苏，复苏后继续培养48小时供患者使用，不需要在极低温度下进行冻存，避免防冻剂的使用及解冻环节，减少冷冻和解冻环节导致细胞活性的降低、死亡率增加和细胞回收率减少的风险；本发明制备的间充质干细胞置于生理盐水、白蛋白和谷氨酰胺组成的保养液中，保证间充质干细胞在72小时内处于新鲜状态，方便患者使用；本发明制备的间充质干细胞细胞活性为100%，回收率为100%，同时由于不需要冷冻剂，大大增加了细胞的正作用；本发明制备的间充质干细胞在-80℃温度下冷冻后、复苏、再进行培养，培养后的新鲜细胞直接供患者使用，改变了传统观念。
具体实施方式
一、第一培养基成分
1、氨基酸类
30mg/l甘氨酸、85mg/ll-盐酸精氨酸、60mg/ll-胱氨酸二盐酸、585mg/ll-谷酰胺、45mg/ll-组氨酸盐酸一水物、105mg/ll-异亮氨酸、105mg/ll-亮氨酸、150mg/ll-赖氨酸盐酸、30mg/ll-甲硫氨酸、65mg/ll-苯丙氨酸、40mg/ll-丝氨酸、95mg/ll-苏氨酸、18mg/ll-色氨酸、105mg/ll-酪氨酸二钠盐、95mg/ll-缬氨酸。
2、维生素类
4mg/l氯化胆碱、4mg/ld-泛酸钙、5mg/l叶酸、4mg/l烟酰胺、4mg/l盐酸吡哆醛、0.5mg/l核黄素、4mg/l盐酸硫胺素、8mg/l肌醇。
3、无机盐类
200mg/l无水氯化钙、0.1mg/l九水合硝酸铁、98mg/l无水硫酸镁、400mg/l氯化钾、3700mg/l碳酸氢钠、6400mg/l氯化钠、125mg/l水合磷酸二氢钠。
4、其他组分
1×105mg/l胎牛血清、1080mg/l葡萄糖、15mg/l酚红、110mg/l丙酮酸钠、1mg/l双抗青链霉素。
二、第二培养基
与第一培养基相比，第二培养基不含胎牛血清。
三、洗脱液
洗脱液与第二培养基的成分相同。
三、实施例
新鲜间充质干细胞的制备方法：
1、从脐带沃顿胶质中分离原代细胞
1）取一个直径100mm培养皿，向培养皿中加入5ml无菌pbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
2）用无菌手术镊从脐带无菌储液瓶中取出脐带，漂洗脐带去除残留血液，用无菌手术镊、无菌医用剪刀将脐带剪成<5cm若干段，用两个无菌止血钳剥离沃顿胶质，同时丢弃不需要的其他组织，漂洗去除残留血液，同时用无菌手术镊、无菌医用剪刀将沃顿胶质剪成黄豆大小，并转入培养皿中，向培养皿中加入10mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）将2)处理后的脐带组织块转入50ml离心管中，每个离心管容纳10ml组织块；
4）向每个离心管中加入20ml0.2%的胶原酶ⅱ；
5）将上述离心管放入摇床中，37℃，250rpm条件下消化2小时；
6）关闭摇床电源，将1个50ml离心管中的组织块分入两个50ml离心管中，加入洗脱液至50ml刻度，于300rpm下离心5min；
7）将6）离心后的上清液转入各管对应编号的50ml离心管中，补加洗脱液至50ml刻度，上下颠倒混匀，2000rpm下离心10min；
8）将7）中上清液弃置后，每个离心管中加入15ml洗脱液，用3ml无菌滴管重悬细胞，将各管细胞悬液并入一个50ml离心管后，补加洗脱液至50ml刻度，2000rpm下离心5min；
9）将8）中上清液弃置后，加入5ml洗脱液，用3ml无菌滴管重悬细胞，补加洗脱液至50ml刻度，1200rpm下离心5min；
10）将离心后的细胞悬液进行细胞计数，测定细胞浓度，并调整细胞浓度到0.8×106~1.0×106/ml；
11）将每个直径100mm的培养皿中加入1ml、0.8×106~1.0×106/ml的细胞悬液，和10ml培养基，并放入37℃5%的co2培养箱中培养。
2、差速贴壁
1）细胞在co2培养箱中培养12小时后取出，转入生物安全柜；
2）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入10mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）每皿添加10ml第一培养基，并放入37℃5%的co2培养箱中培养3-4天；
4）从co2培养箱中取出细胞培养皿，转入生物安全柜；
5）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入5mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
6）每个培养皿中加入1ml0.25%的胰酶，控制消化时间为1min，加入2ml第一培养基，调整细胞浓度到50%-60%；
7）将6）处理后的细胞1ml接种到含有10ml第一培养基的新培养皿中，放入37℃5%的co2培养箱中培养2小时。
3、换液
1）从co2培养箱中取出要换液的培养皿，转入生物安全柜；
2）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入5mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）每皿添加10ml第一培养基，并放入37℃5%的co2培养箱中培养2-3天。
4、传代
1）从co2培养箱中取出细胞培养皿，转入生物安全柜；
2）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入5mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）每个培养皿中加入1ml0.25%的胰酶，控制消化时间为2min，加入2ml培养基，调整细胞浓度到50%-60%，；
4）将3）处理后的细胞1ml接种到含有10ml培养基的新培养皿中，放入37℃5%的co2培养箱中培养1-2天。
5、换液
1）从co2培养箱中取出要换液的培养皿，转入生物安全柜；
2）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入5mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）每皿添加10ml第一培养基，并放入37℃5%的co2培养箱中培养2-3天
4）重复1）-3）的步骤2-3次。
6、冷冻
1）从co2培养箱中取出细胞培养皿，转入生物安全柜；
2）弃去细胞培养皿中的第一培养基，向细胞培养皿中加入5mlpbs，漂洗一遍后，弃去pbs；
3）每个培养皿中加入1ml0.25%的胰酶，控制消化时间为2min，加入1ml第一培养基;
4）把培养皿中的细胞放入50ml离心管，1200转离心5分钟;
5）弃去上清液，向离心管中加入pbs到50ml，1200转离心5分钟；
6）重复5）的步骤；
7）弃去上清液，加入细胞冷冻保护液（stemcellbanker公司生产，不含dmso），放入-80℃冰箱冷冻保存。（冷冻保存时间不超过6个月。）
7复苏
1）从-80℃冰箱中取出细胞，在37℃的水浴箱中晃动2分钟；
2）细胞转移到50ml离心管中，加入pbs，1200转离心5分钟，弃去上清液；
3）取0.1ml细胞加入10ml第二培养基，放入37度5%的co2培养箱中培养48小时；
4）把培养皿中的细胞放入50ml离心管，1200转离心5分钟；
5）弃去上清液，把细胞加入生理盐水、白蛋白和谷氨酰胺组成的混合溶液中，其中白蛋白、谷氨酰胺所占质量百分数分别为1%。
将实施例制备的间充质干细胞通过流式细胞仪检测细胞的膜表面抗原，以确定细胞种类和纯度，检测结果如表1所示。
表1
从表中可以看出，本发明制备的间充质干细胞表达cd90、cd105、cd73，它们含量均在95%以上，不表达cd34、cd45，含量均在2%以下。
将实施例制备的间充质干细胞进行微生物检测，检测结果如表2所示。
表2
从表2中可以看出，本发明制备的间充质干细胞，细胞活性达到100%；本发明制备的间充质干细胞安全，无感染病毒，细菌等风险。
将实施例制备的间充质干细胞分别置于生理盐水和本发明的保养液中，细胞活力比较如表3所示，其中细胞活力采用台盼蓝染色法。
表3
从表3中可以看出，生理盐水保养的间充质干细胞，在0-18h保养时间范围内，细胞活力几乎为100%，当保养时间为24h时，细胞活力降为95%，随着保养时间继续延长，细胞活力急剧下降，至72h时，细胞活力降为40%，此时细胞已无法正常使用；本发明的保养液保养的间充质干细胞，在0-48h保养时间范围内，细胞活力接近100%，随着保养时间延长，细胞活力略有下降，至保养72h时，细胞活力仍为92%；本发明的保养液提高了细胞的新鲜度，为细胞的新鲜使用奠定了基础。
传统方法制备的间充质干细胞采用-196℃极冷温度下的冻存处理，待需要使用时再进行复苏，细胞活性下降了15%左右，且冷冻液中的dmso可能产生一些不良反应，如血压升高、心率改变、头痛；本发明制备的间充质干细胞在传代后于-80℃下保存，待使用时在37℃的水浴箱中晃动2分钟进行复苏，复苏后继续培养48小时供患者使用，此时细胞活性达到100%；本发明采用生理盐水、白蛋白和谷氨酰胺组成的保养液，可有效保持新鲜细胞的活力长达72h。
传统方法制备的间充质干细胞在运输时为了保持冻存温度，需要用到-196℃的液氮保温，液氮属于危险品，运输风险相对较大；本发明制备的间充质干细胞只需使用4℃的运输箱，冰袋保温，航空运输、铁路运输均可实现，方便客户使用。
本发明新鲜间充质干细胞的制备方法，避免了冻存环节，制备出新鲜的msc，使msc的活性和数量明显增多，副作用更小，运输和使用更方便。
上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。