本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种促溶分子伴侣sumo引导下的靶向人类表皮生长因子受体her-2的单链抗体与一种超抗原sag融合基因及其制备。
背景技术：
靶向融合蛋白是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新型的治疗策略，由靶向分子和细胞毒性分子结合而成。靶向分子常选用抗体或者基因工程抗体可变区片段，单链抗体片段(singlechainvariablefragment,scfv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。因其分子量小、肿瘤穿透力强、血液清除快、半衰期短和易于基因工程化改造等特点而被广泛的应用于药物靶向载体的研究。靶向分子的引入可显著提高细胞毒性分子抗肿瘤的特异性，提高效应分子的作用效率，且符合现代精准医疗的目标，现已广泛应用于肿瘤治疗。
人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，her-2)是一种肿瘤特异性抗原，表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤靶向治疗的合适靶点，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30％的过表达，并且其过表达与患者的不良预后相关。以her-2作为靶点对her-2过表达的肿瘤进行靶向性治疗已经成为研究热点。于是将靶向her-2单链抗体应用为融合蛋白的靶向分子。
超抗原(superantigen，sag)是一组种在极低浓度下对t淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子，其可在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与mhcii(组织相容性复合物)分子和t细胞vβ区结合形成复合物，从而激发大量的t淋巴细胞增殖，使体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物。由于其作用的非特异性，所以设计引入单链抗体后，可提高其靶向性，增强其对肿瘤的杀伤效率。
小分子泛素样修饰蛋白sumo(smallubiquitin-likemodifier),是一种分子伴侣,具有同泛素相似的结构，参与蛋白质翻译后修饰等多种生理进程。因为其具有一个高度疏水的核心，能为融合蛋白的折叠提供成核位点，从而作为分子伴侣和融合标签用于提高外源蛋白稳定性和可溶性，且sumo蛋白三级结构能够被sumo蛋白酶完整识别，经过特异性的酶切后的目的蛋白具有天然的n末端，保证了目的蛋白的活性。在表达水平和产物的可溶性方面sumo表达系统明显优于传统表达系统。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可溶性单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag的基因及其制备，本发明以抗her-2单链抗体作为靶向分子，以sag作为效应分子，经短肽连接构建成靶向融合蛋白b-l-sag，并在其n端设计sumo，从而实现在原核表达载体中，以大肠杆菌为宿主菌，获得较大量可溶性表达的融合蛋白。该融合蛋白可特异性识别结合her-2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种可溶性单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag的编码基因sumo-b-l-sag，具有序列表seqidno:1中碱基序列。编码可溶性单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag，具有序列表seqidno:2中蛋白序列。
所述融合蛋白sumo-b-l-sag的编码基因sumo-b-l-sag的制备，是将人源性抗her-2的单链抗体基因b和sag编码基因sag通过编码连接短肽的dnalinker以限制性核酸内切酶连接技术连接成b-l-sag基因，并将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白sumo编码基因sumo使用overlappcr方法同b-l-sag的n端相连接，其特征在于：具有seqidno:1中碱基序列。
所述连接短肽dnalinker的碱基序列为，
ggccgcaggttccggatctggcagcggttccggatctgaattc；
采用引物：
正向引物:5’-tataccatgggcagcagccatc-3
反向引物:5’-agctgcacctgggcaccaatctgttctctgtgagc-3
通过pcr技术扩增出sumo基因片段
采用引物：
正向引物:5’-acagagaacagattggtgcccaggtgcagc-3
反向引物:5’-gtgctcgagttatccattctttgttg-3
通过pcr技术扩增出b-l-sag基因片段
采用引物：
正向引物:5’-tataccatgggcagcagccatc-3
反向引物:5’-gtgctcgagttatccattctttgttg-3
通过overlappcr技术构建融合基因sumo-b-l-sag。
所述的融合蛋白编码基因sumo-b-l-sag通过原核表达载体，优选为pet-28a表达载体；以大肠杆菌为宿主菌，优选为大肠杆菌bl21(de3)，实现异源表达有活性的融合蛋白sumo-b-l-sag蛋白。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用在单链抗体超抗原融合基因上游引入sumo基因，使用原核表达载体在大肠杆菌宿主菌中进行蛋白表达，可有效促进融合蛋白的正确折叠,提高可溶性表达量，克服一般的单链抗体融合蛋白表达效果不理想的情况。且sumo蛋白三级结构能够被sumo蛋白酶完整识别并切割。相较于一般载体的肠激酶酶切位点等，sumo酶切更准确，效率更高。并且由于融合标签和蛋白酶都具有组氨酸标签，在通过层析柱时两者均可被吸附,达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了纯化的时间和成本。
2.本发明中所述融合蛋白在超抗原的基础上引入了只有普通抗体分子量的1/6的单链抗体，不仅能够提高超抗原抗肿瘤的靶向性，而且克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，显著提高了超抗原的抗肿瘤效率。
3.引用本发明，可进一步提供直接用于生产b-l-sag融合蛋白的工程菌株。
附图说明
图1为构建pet-28a-sumo-b-l-sag酶切验证以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析
结果，其中：1.dl10000marker；2.未经酶切的pet-28a-sumo-b-l-sag质粒；
3.4.分别经过ncoi和xhoi单酶切的pet-28a-sumo-b-l-sag质粒；5.dl2000dna分子量标准；5.经过ncoi和xhoi双酶切的pet-28a-sumo-b-l-sag质粒；
图2为pet-28a-sumo-b-l-sag诱导前后表达的10％sds-page电泳分析图，其中：
1.为蛋白marker：；2.诱导前菌体全蛋白；3.30℃诱导4h后菌体全蛋白；4.30℃诱导4h后菌体的可溶性蛋白；5.16℃诱导16h后菌体全蛋白；6.16℃诱导16h后菌体的可溶性蛋白；
图3为经akta纯化后的可溶性表达的单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag经10％的sds-page电泳分析图，其中：
1.为经ni柱层析纯化后再透析除盐后的融合蛋白，纯度(265ng/μl)；
图4为融合蛋白b-l-sag体外抗her-2受体过表达的肿瘤细胞的实验结果。
图5为融合蛋白b-l-sag体外抗her-2受体非表达的肿瘤的实验结果。
图6为本发明所构建表达融合蛋白sumo-b-l-sag的三维结构示意图。
具体实施方式
实施例1
一种促可溶表达分子伴侣sumo的编码基因sumo，其具有序列表
seqidno：3中所示的碱基序列：
(1)seqidno：3的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：354bp
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cdna
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：lifesensors公司psumo质粒dna
(2)sumo基因的pcr扩增
(a)pcr引物设计及反应条件：
根据sumo基因序列设计一组引物：
正向引物:5’-tataccatgggcagcagccatc-3(由北京华大基因公司合成)
反向引物:5’-agctgcacctgggcaccaatctgttctctgtgagc-3(由北京华大基因公司合成)
pcr反应体系为：10xpyrobestbuffer(购自大连宝生物公司)5μl、dntp(购自大连宝生物公司)250μmol、上下游引物各25pmol、模板
psumo质粒dna(购自lifesensors公司)0.1μg/、pyrobestdna聚合酶(购自大连宝生物公司)2u，无菌超纯水补齐体积至50μl。
pcr反应条件为：
第一阶段：95℃，5min；
第二阶段：94℃，55s；60℃，2min；72℃，1mins；共30个循环；
第三阶段：72℃，10min；
(b)pcr产物回收：pcr扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收374bp的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。
实施例2
人源性抗her-2的单链抗体基因b和超抗原sag编码基因sag通过编码连接短肽的dnalinker以限制性核酸内切酶连接技术连接得到b-l-sag，具有序列表seqidno:4中碱基序列：
(1)seqidno:4的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：1533碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cdna
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工序列
(2)融合基因b-l-sag的pcr扩增：
融合基因b-l-sag全序列由北京华大基因公司合成
(a)pcr引物设计及反应条件：
根据b-l-sag基因序列设计一组引物：
正向引物:5’-acagagaacagattggtgcccaggtgcagc-3(由北京华大基因公司合成)反向引物:5’-gtgctcgagttatccattctttgttg-3(由北京华大基因公司合成)
pcr反应体系为：10xpyrobestbuffer5μl、dntp250μmol、上下游引物各25pmol、模板为含b-l-sag基因的质粒dna(由北京华大基因公司合成)0.1μg、pyrobestdna聚合酶2u，无菌超纯水补齐体积至50μl。
pcr反应条件为：
第一阶段：95℃，5min；
第二阶段：94℃，55s；55℃，2min；72℃，2min；共30个循环；
第三阶段：72℃，10min；
(b)pcr产物回收：pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收1533bp的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。
实施例3
将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白sumo编码基因sumo使用overlappcr方法同b-l-sag的5’端相连接成融合基因sumo-b-l-sag，具有序列表seqidno:1的碱基序列。
(1)seqidno:1的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：1887碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cdna
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工序列
由seqidno:1中核苷酸所编码的融合蛋白，具有seqidno:2中的氨基酸序列。
(2)seqidno:2的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：630残基
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工序列
(3)sumo-b-l-sag融合基因的制备
(a)pcr引物设计及反应条件：
根据设计使用sumo基因的正向引物和b-l-sag基因的反向引物进行overlappcr：
正向引物:5’-tataccatgggcagcagccatc-3(由北京华大基因公司合成)
反向引物:5’-gtgctcgagttatccattctttgttg-3(由北京华大基因公司合成)
第一轮：
pcr反应体系为：10xpyrobestbuffer2.5μl、dntp250μmol、模板sumo和b-l-sag基因各0.1μg、pyrobestdna聚合酶1u，无菌超纯水补齐体积至25μl。
pcr反应条件为：
第一阶段：95℃，5min；
第二阶段：94℃，55s；63℃，1min；72℃，2min；共5个循环；
第三阶段：72℃，2min；
第二轮：
overlap补充体系为：10xpyrobestbuffer10μl、dntp250μmol、上下游引物各25pmol、pyrobestdna聚合酶1u，无菌超纯水补齐体积至25μl。
第一阶段：95℃，5min；
第二阶段：94℃，50s；56℃，1min；72℃，2min；共30个循环；
第三阶段：72℃，10min；
(b)pcr产物回收：pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收1911bp大片段的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。
实施例4
可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag利用原核表达载体pet-28a，在大肠杆菌中表达可溶性单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag
将融合基因sumo-b-l-sag连接入表达载体pet-28a(购自novagen公司)中：将表达载体pet-28a的质粒dna和sumo-b-l-sag的基因dna片段分别使用ncoi(购自大连宝生物公司)和xhoi(购自大连宝生物公司)双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收sumo-b-l-sag片段和质粒pet-28a的dna大片段，以t4dna连接酶(购自大连宝生物公司)16℃连接过夜，构建单链抗体超抗原融合蛋白表达载体pet28a-sumo-b-l-sag。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自大连宝生物公司)。以卡那青霉素(购自sigma公司)抗性筛选转化子，挑选重组单克隆扩培，提取质粒dna，经ncoi和xhoi双酶切鉴定正确重组克隆(图1)。并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往上海生工进行测序。将测序正确的质粒转化进入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中(购自北京天根生化科技公司)
(1)融合蛋白sumo-b-l-sag的表达：接种转化重组质粒pet28a-sumo-b-l-sag的bl21(de3)单菌落于60μg/ml卡那青霉素的液体lb中37℃过夜，次日按1：100转接到下一代，37℃培养至od6000.8，加入终浓度为10mmiptg(购自sigma公司)16℃诱导12h。
(2)利用akta工作站(美国ge公司产品)纯化外源融合蛋白：离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml平衡缓冲液(20mmtirs-hcl，500mmnacl，50mm咪唑，ph＝7.9)，于0℃超声破碎至菌液变得清亮，100000rpm10min超高速离心，收集上清。
(3)分别取离心前和离心后的上清液，作为诱导后全细胞蛋白和诱导后全细胞可溶性蛋白的样品，以12％的sds-page分析可溶性表达量，结果如图2所示。
(4)离心后的上清液上样于aktani亲和层析柱(美国ge公司产品)，使用平衡缓冲液(20mmtirs-hcl，500mmnacl，50mm咪唑，ph＝7.9)漂洗十个柱体积，至uv检测数值稳定。最后使用洗脱缓冲液(20mmtirs-hcl，500mmnacl，250mm咪唑，ph＝7.9)洗脱目的蛋白，在uv检测数值开始拉升后进行收集，直至uv平稳。将收集的蛋白洗脱液使用millipore超滤管(美国merckmillipore公司产品，截留分子量30000)，以4000g离心20min进行超滤并使用pbs稀释后再次超滤除盐，最终收集得到较纯的sumo-b-l-sag蛋白液，并经过sds-page分析纯度(图3)。
实施例5
可溶性单链抗体超抗原融合蛋白sumo-b-l-sag的生物学活性研究。
将通过转染使her-2过表达的鼠源性黑色素瘤细胞b16和相同状态的未表达her-2的b16细胞(购自上海生化细胞所)，以5×104cells/well加入96孔板，分别将融合蛋白sumo-b-l-sag及单独表达的sag蛋白(制备过程见参考文献：王洪波等.2011肠毒素c2中met24对其超抗原活性无重要作用.生物技术.21(4)：67-70)分别以不同浓度加入各孔，同时设空白对照孔(仅加培养基rpmi-1640，美国gibco公司产品)、肿瘤细胞对照孔(仅加肿瘤细胞)，每样3个复孔。同样方法以牛血清白蛋白bsa(购自sigma公司)为阴性对照设各孔。按常规条件(37℃、5％co2浓度)培养72h，加入50ul/well的mts液(购自sigma公司)。继续培养3h后，震荡10min，酶标仪上以490nm测定各孔的吸光值。
抑瘤率(tumorgrowthinhibition,％)＝100-[(实验孔－空白对照孔)/(肿瘤细胞对照孔－空白对照孔)]×100。
实验结果显示(图4，图5)，表达的可溶性融合蛋白sumo-b-l-sag可以对her-2受体过表达的肿瘤细胞产生特异性的靶向杀伤作用，其作用效果明显强于单独sag蛋白。
实施例6
融合蛋白sumo-b-l-sag的分子三维结构分析
经过ni亲和层析纯化、分子排阻、离子交换法并超滤浓缩的sumo-b-l-sag融合蛋白纯品(方法参考分子克隆实验指南第三版.萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。在室温下通过悬滴法获得融合蛋白的晶体。以稀疏矩阵采样法确定结晶条件。最终的结晶条件如下：b-l-sag蛋白溶液(20mg/ml)和等体积的母液(0.1mtris-hcl(ph7.4),0.08m醋酸镁,26％(w/v)聚乙二醇6000)混合，约15-18天时出现晶体。用多波长反常散射法(mad)确定位相，mad数据在adscquantum-4rccd探测器上收集，所有数据用dps软件包进行统一，用ccp4软件包进行坐标修正与处理。模型用xtalview4.0软件在silicongraphicsoctane上构建和校正，用refmac程序进行精化。融合蛋白b-l-sag的三维结构参见图6。
sequencelisting
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用
<130>
<160>9
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1887
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>dna
<222>(1)..(1887)
<400>1
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcgct60
agcatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaag120
cctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatc180
aaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaa240
atggactccttaagattcttgtacgacggtattaggatacaagctgatcagacccctgaa300
gatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtatggcc360
caggtgcagctggtgcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatc420
tcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcgcctgggtgcgccagatg480
cccgggaaaggcctggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacaccaaatac540
agcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcactgcctac600
ttgcaatggagcagtctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgagacatgac660
gtgggatattgcaccgaccggacttgcgcaaagtggcctgaatacttccagcattggggc720
cagggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggc780
ggtggcggatcgcagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacag840
aaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctgg900
taccagcagctcccaggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaatcggccc960
gcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatc1020
agtgggttccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactacaccctc1080
tcgggctgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggtgcggccgcaggttcc1140
ggatctggcagcggttccggatctgaattcgagagtcaaccagaccctacgccagatgag1200
ttgcacaaatcaagtgagtttactggtacgatgggtaatatgaaagtattatatgatgat1260
cattatgtatcagcaactaaagttatgtctgtagataaatttttggcacatgatttaatt1320
tataacattagtgataaaaaactaaaaaattatgacaaagtgaaaacagagttattaaat1380
gaagatttagcaaagaagtacaaagatgaagtagttgatgtgtatggatcaaattactat1440
gtaaactgctatttttcatccaaagataatgtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgt1500
atgtatggaggaataacaaaacatgaaggaaaccactttgataatgggaacttacaaaat1560
gtacttataagagtttatgaaaataaaagaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgat1620
aagaaaagtgtaacagctcaagaactagacataaaagctaggaattttttaattaataaa1680
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<213>人工序列
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<221>prt
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valseraspglysersergluilephephelysilelyslysthrthr
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