本发明属于亚硝态氮污染检测技术领域，具体涉及一种黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因及其应用。
背景技术：
黄姑鱼(nibeaalbiflora)主要分布在中国沿海、日本及朝鲜西南岸，是我国重要经济鱼类之一，在近海鱼类资源中占有重要地位。近年来，随着人工繁育技术的不断突破，黄姑鱼海水网箱养殖在我国东南沿海迅速发展，然而，受农业径流及养殖水体内有机物(包括养殖动物排泄物、残饵及动植物尸体等)分解的影响，氨氮及其在细菌硝化作用下的中间产物亚硝态氮不断积累，研究表明，即使低浓度的亚硝态氮存在于血液中也是致死性的，并引起许多生理过程紊乱，制约黄姑鱼养殖业的发展。
超氧化物歧化酶(sod，ec1.15.1.1)是抗氧化系统的关键酶，在清除活性氧(ros)的过程中发挥重要的作用，能将ros快速歧化为普通分子氧和过氧化氢。截至目前，自然界中已发现6种sod，按其所含金属辅基不同可分为：cu/znsod、mnsod、fesod、nisod、mn/fesod和fe/znsod(张克烽，张子平，陈芸，等.动物抗氧化系统中主要抗氧化酶基因的研究进展[j].动物学杂志，2007，42(2)：153-160)，但是，目前只有前两种sod在鱼类中有发现。其中，根据亚细胞定位的不同，cu/znsod又可以分为存在于细胞质的胞质型cu/znsod(iccu/znsod)和细胞外间隙(如血浆、淋巴液、滑液)中的胞外型cu/znsod(eccu/znsod)。当前针对eccu/znsod的研究主要集中在哺乳动物疾病方面，很少有关于其在鱼类中的研究。目前，eccu/znsod基因已在少数鱼中克隆出来，但是，亚硝态氮攻毒对黄姑鱼中eccu/znsod基因mrna的表达情况的研究还尚未报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因。
本发明的另一目的在于提供上述黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因的应用。
本发明的技术方案如下：
一种黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因，其cdna包括如seqidno01所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述cdna以黄姑鱼肝脏组织总cdna为模板，以正向引物f1和反向引物r1为扩增引物对，通过pcr反应获得，其中，f1包括seqidno02所示的序列，r1包括如seqidno03所示的序列。
一种亚硝态氮污染pcr检测试剂盒，基于实时荧光定量pcr，以黄姑鱼组织中的上述黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因为检测对象，包括检测引物对和内参引物对，其中，检测引物对包括正向引物f2和反向引物r2，内参引物对包括用于检测黄姑鱼管家基因β-actin的正向引物f3和反向引物r3。
在本发明的一个优选实施方案中，所述黄姑鱼组织为黄姑鱼的肝脏组织、鳃组织和头肾组织。
在本发明的一个优选实施方案中，所述正向引物f2和反向引物r2分别包括如seqidno04和05所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述正向引物f3和反向引物r3分别包括如seqidno06和07所示的序列。
上述亚硝态氮污染pcr检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取不同的黄姑鱼组织，提取相应的总rna，然后反转录得到相应的cdna，以此为模板，通过实时荧光定量pcr扩增所述黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因；
(2)采用2-δδct法对上述黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因的mrna的时相差异表达进行分析。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次从黄姑鱼的肝脏组织中克隆到一种超氧化物歧化酶eccu/znsod基因的cdna。
2、采用本发明试剂盒首次研究亚硝态氮急性攻毒后，黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因mrna表达的时相变化，该mrna表达水平的检测在亚硝态氮对黄姑鱼的污染检测中作为一种生物标记，在黄姑鱼对亚硝态氮环境预警中有重要的应用前景，并为黄姑鱼的健康状态和生长环境安全的检测奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例2的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1超氧化物歧化酶eccu/znsod基因的克隆
1.黄姑鱼肝脏总rna的提取：用手术剪刀解剖活的黄姑鱼，取少量肝脏组织置于rna保护液中用于rna的提取。肝脏总rna的提取使用北京全式金生物技术有限公司的transzolupplusrnakit，提取方法参照使用说明书，并采用rnase-freednase(promega，usa)除去其中的dna杂质，产物于1％琼脂糖凝胶电泳以检测rna质量。
2.黄姑鱼cdna：cdna第一条链的合成采用goscripttmreversetranscriptionkit(promega，usa)并参照其实验说明具体操作。
3.黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因克隆
(1)通过pcr技术扩增黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因，其中正向引物f1：5’atgcgtctacacggatc3’(seqidno02)，反向引物r1：5’ttaatttctcctcagtcgc3’(seqidno03)：
pcr的试剂与条件：
10xtaqdna聚合酶缓冲液(mg2+浓度为20mm)2μl
模板肝脏cdna1μl
正向引物f1(10μm)1μl
反向引物r1(10μm)1μl
脱氧核苷酸混合物(dntp，10mm)1.6μl
taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl
灭菌双蒸水12.9μl；
pcr反应程序为：94℃预变性5min；然后30个下列循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)反应产物纯化：利用北京全式金生物技术有限公司产品(easypurequickgelextractionkit)对pcr产物进行纯化，操作步骤按产品说明书进行。
(3)cdna序列：纯化后的pcr产物与pmd19-t载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，之后采用转化dh5α(天根公司)菌株进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，以f1、r1为引物对所提取的质粒做pcr检测，确认插入及片段大小后进行测序验证。测序结果显示，黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因cdna全长共1101bp(seqidno01)，包括224bp的5’非编码区、229bp的3’非编码区和648bp的开放阅读框，该阅读框编码215个氨基酸。
实施例2
本实施例根据实施例1克隆方法得到的黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因cdna序列，设计相应引物，检测被亚硝态氮攻毒后，该基因在肝脏、鳃和头肾组织中的mrna表达变化。
1.试验健康黄姑鱼体长为8.8±0.5cm，体重为10±0.5g/尾。实验前在温度为24-26℃，盐度为27-28psu和ph为7.7-7.9的充气海水中驯养两周，备亚硝态氮毒性试验。20尾试验黄姑鱼，暴露于亚硝酸钠(96h半致死浓度99.08mg/l)溶液中，试验过程不投饵，每12h用99.08mg/l的亚硝酸钠溶液换水1次，换水量为50％。在攻毒0、12、24h后随机捞取5尾鱼，分别取鳃、肝和头肾组织，液态氮冷冻，存放于-80℃超低温冰箱备rna提取。实验重复3次。
2.按照实施例1中组织总rna提取方法和cdna第一条链的合成方法，分别提取亚硝态氮毒性试验黄姑鱼鳃、肝和头肾的总rna并且合成cdna第一条链，以此为qrt-pcr的模板。
3.根据实施例1克隆方法得到的黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因cdna序列，设计定量引物，其中正向引物f2：5’cccaaggtctgcccaaagtgtac3’(seqidno04)，反向引物r2：5’gaagccgttgaaccgaagaagga3’(seqidno05)：同时以黄姑鱼管家基因β-actin为内参，其内参正向引物f3：5’ttatgaaggctatgccctgcc3’(seqidno06)，反向引物r3：5’tgaaggagtagccacgctctgt3’(seqidno07)。qrt-pcr实验采用
qrt-pcr反应体系为20μl，其试剂与条件：
2×
正向引物f2(10μm)0.5μl，
反向引物r2(10μm)0.5μl，
cdna模板5μl
灭菌双蒸水4μl
qrt-pcr扩增程序为：95℃预变性5min；然后40个下列循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s。
每个样品分别进行3次重复。
4.采用2-δδct法进行eccu/znsod基因在肝脏、鳃和头肾三个组织中的时相差异表达分析。结合spss19.0中的one-wayanova及s-n-k法(student-newman-keulsmethod)分析该基因表达的差异显著性(p＜0.05)。
结果见图1，亚硝态氮对黄姑鱼攻毒12h和24h后，与没有攻毒的0h对照相比，eccu/znsod基因在黄姑鱼的肝脏、鳃和头肾组织中mrna的表达量均有显著提高(p＜0.05)。
综上可知，本发明提供一种黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因，与此同时，在亚硝态氮对黄姑鱼攻毒12h和24h后，eccu/znsod基因在黄姑鱼肝脏、鳃和头肾组织中的mrna表达量均有显著提高(p＜0.05)，该基因mrna在黄姑鱼的肝脏、鳃和头肾组织中的上调表达可作为检测亚硝态氮污染的一种生物标记物，为黄姑鱼的健康状态和生长环境安全的检测奠定基础。
以上述实施例1和2为基础制成一种亚硝态氮污染pcr检测试剂盒，基于实时荧光定量pcr，以实施例1所得的黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因为检测对象，包括检测引物对和内参引物对，其中，检测引物对包括实施例2中的正向引物f2和反向引物r2，内参引物对包括实施例2中的用于检测黄姑鱼管家基因β-actin的正向引物f3和反向引物r3。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110>厦门市产品质量监督检验院
集美大学
<120>一种黄姑鱼超氧化物歧化酶eccu/znsod基因及其应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1101
<212>dna
<213>黄姑鱼(nibeaalbiflora)
<400>1
cagcagcagctggagaagaacaggctacggagccgtgaaaataaaaaatgaaaagcaaac60
attaaaaaaaaaaccttcctgttcgttatattgaaaaaacctctgctccaccctgagaaa120
acaacgcctccggccacgttcagacaggactttatgaaacacatttcatcttgactcctc180
agaagatcaacgacttaaacggactgagcgtgtttctgctgaccatgcgtctacacggat240
cattgagtatattgggagcactgttggccctcctggccggctgtcaacaatgtgtctcag300
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ggtatcagatatacaatgaatgaatgatcacaaagactaaatctataagatgacctactg1080
tatataccacttctgtgagat1101
<210>2
<211>17
<212>dna
<213>homosapiens
<400>2
atgcgtctacacggatc17
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>homosapiens
<400>3
ttaatttctcctcagtcgc19
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>homosapiens
<400>4
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<211>23
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<210>6
<211>21
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<213>homosapiens
<400>6
ttatgaaggctatgccctgcc21
<210>7
<211>22
<212>dna
<213>homosapiens
<400>7
tgaaggagtagccacgctctgt22