专利名称：文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因(cDNA全长序列和氨基酸序列)的扩增、表达及其应用。
背景技术：
文蛤(Meretrix meretrix)是一种重要的海水增养殖滩涂贝类，主要分布于朝鲜、日本、越南、印度和中国沿海。在我国主要分布于辽宁辽河口、山东黄河口、江苏长江口和广西的北海等海区，是我国主要的出口鲜活水产品之一。近十年来，由于病害等原因，特别是红肉病的蔓延，文蛤增养殖业的发展受到严重制约。因此，对文蛤病害特别是其自身免疫抗性的研究，已经成为解决文蛤产业瓶颈的重要途径。
作为一种重要的免疫相关基因,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),是生物体内一种重要的抗氧化酶，对于清除活性氧自由基(reactiveoxygenspecies, R0S),防止活性氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用，对生物体防御毒性起着关键作用。SOD按其结合的金属离子的不同，主要可分为3类Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe_S0D，其中铜锌超氧化物歧化酶在生物体内分布相对广泛，也是目前为止研究得最多的超氧化物歧化酶。已有研究表明铜锌超氧化物歧化酶在生物体内有胞内形式(icCu/Zn-SOD)和胞外形式(EC-SOD)两种。Cu/Zn-S0D与贝类免疫水平密切相关，能够增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能，使细胞免受ROS的毒害。由于Cu/Zn-S0D的存在，健康水生动物体内环境中的活性氧自由基能够维持在有利无害的较低水平。但是当Cu/Zn-S0D活性降低时，生物体内自由基量就会过多，势必打破这种有利状态，因此，Cu/Zn-SOD在贝类中是一种十分重要的免疫相关基因。孙虎山等对栉孔扇贝中的铜锌超氧化物歧化酶的活性和性质进行了研究，证明了 Cu/Zn-SOD的高稳定性和栉孔扇贝可作为SOD的提取材料。Ni等通过同源克隆的方法得到了栉孔扇贝铜锌超氧化物岐化酶cDNA全长，并通过菌刺激后的RT-PCR实验得出了Cu/Zn-SOD是一种诱导型急性免疫蛋白，并能在鳗弧球菌属及光球菌感染的免疫反应中发挥重要作用。包永波等通过研究，得到了海湾扇贝Cu/Zn-SOD基因的全长，并分析出海湾扇贝Cu/Zn-SOD基因包含4个外显子和3个内含子，并通过菌刺激实验和体外表达证实了海湾扇贝Cu/Zn-SOD在免疫防御中的重要作用。Li等人2010年通过同源克隆及RACE克隆得到了菲律宾蛤仔的细胞内铜锌超氧化物岐化酶(VpSOD) cDNA全长，并通过鳗弧菌刺激实验得出了 VpSOD蛋白为诱导型急性免疫蛋白的结论。而目前还未见文蛤Cu/Zn-SOD基因方面的研究报道。
发明内容
本发明利用构建cDNA文库、EST分析和3' RACE技术，对文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因进行了研究，首次从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，本发明通过以下技术方案实现
本发明从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，它具有SEQ ID NO. I所示的喊基序列，其编码蛋白具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列。本发明克隆得到的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，该基因cDNA全长1383bp，5' UTR为45bp，3' UTR为876bp，有一个462bp开放阅读框，编码153个氨基酸，Cu原子分别与 His46、His48、His63、Hisll9 配位，Zn 则与 His63、His71、His80 和 Asp83 配位，半胱氨酸Cys57和Cysl45之间形成唯一的链内二硫键。蛋白质结构中心是由8条反向平行的β折叠围成的圆桶状结构。有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴；该基因在文蛤免疫防御方面具有重要功能。本发明的另一方面在于，构建一种重组文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的质粒，其将SEQ ID NO. I的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-30a中，构建重组表达质粒。本发明的另一方面在于，构建一种表达文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的基因工程菌，其将SEQ ID NO. I的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-30a中，构建重组 表达质粒。并将所述的质粒转化大肠杆菌DH5a宿主细胞获得重组基因工程菌。本发明的另一方面在于，公开一种从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其具体步骤包括(I)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；其中,所述文蛤总RNA的提取的模板是从感染了鳗弧菌的文蛤血淋巴中提取的总RNA。(2)文蛤cDNA文库构建及序列的测序；(3)用基因特异性引物 Mm-icCuZnSOD-F :5' -TTTCCCGAAGCCCTATTG— 3' (SEQIDNO. 3)和3' RACE克隆到文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA全长序列。上述方法中，所述的文蛤cDNA文库构建及序列的测序等技术内容，还包括EST序列(表达序列标签)的大规模测序、软件分析同源性等试验方法，以及CDNA3'快速扩增技术(RACE)均为本领域技术人员常规使用的技术，本发明的实施例中也有各试验方法的进一步描述。本发明利用表达序列标签(EST)技术、CDNA3'快速扩增技术(RACE)从文蛤中克隆得到了胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，可用于胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的重组表达和基因转移，并为文蛤病害防治、基因辅助选育及进一步开发为药物产品奠定基础。所指定得到的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的序列可在文蛤遗传选育中应用；也可在细菌、酵母和昆虫细胞系的表达；例如克隆到PQE系列、pET等系列表达载体中，再将构建成的重组表达载体转化大肠杆菌和酵母，筛选阳性克隆并以IPTG诱导重组蛋白的表达。利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得体外重组表达的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶。该产品可作为药物、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂使用。本发明的另一方面在于，具有文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶序列(SEQ ID NO. I)的基因在制备文蛤免疫学药品、文蛤病害防治药品中的应用本发明的另一方面在于，具有文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶序列(SEQ ID NO. I)的基因在文蛤遗传选育中的应用。即本发明还可以根据序列表SEQ ID NO. I的序列设计PCR和RT-PCR引物，对文蛤不同个体和不同地理群体的胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的部分序列进行扩增和序列测定，比较不同个体在胞内铜锌超氧化物歧化酶基因序列上的差异，同时比较不同个体和地理群体的胞内铜锌超氧化物歧化酶基因mRNA表达的差异，以此指导文蛤的遗传选育。有益效果本发明所获得文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因(SEQ ID NO. I)可以用于基因转移等方面的研究，也可以用于胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的体外重组表达相应蛋白，在医药产品制备、文蛤免疫学研究、遗传选育和改良、病害防治等方面有广阔的应用前景。
图I :SDS_PAGE电泳检测重组蛋白1泳道为PET_30a空载体，2泳道为大肠杆菌BL21 (DE3)粗提物的上清液(表达载体IPTG诱导)，3泳道为大肠杆菌BL21粗提物的沉淀， 4泳道为大肠杆菌BL21 (DE3)粗提物未诱导表达载体，图中箭头所示为目的条带。图2 SDS-PAGE电泳检测重组蛋白纯化结果M是takara低分子量蛋白Marker, I泳道为纯化前的重组蛋白，2泳道为纯化后的重组蛋白，此结果证明纯度很高。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆本发明中，实施例所用感染了鳗弧菌的文蛤采自辽宁省盘山县双台子河口。文蛤总RNA是从其血淋巴中提取的。(I)文蛤总RNA的提取和mRNA的纯化用注射器从感染了鳗弧菌的文蛤的闭壳肌中采集血淋巴，4°C 700g离心10分钟，利用Omega公司的E. Z. N. A. Total RNA Midi Kit试剂并参照其说明提取总RNA。(2)文蛤cDNA文库构建利用QIAGENE 公司的 01igotex -dT30〈Super>mRNA 纯化试剂盒(Takara),进行mRNA的分离纯化。根据Creator SMART cDNA文库构建试剂盒(Clontech)说明书，取3 μ L总 RNA，加入 I μ L SMART IV Oligonucleotide, I μ L CDS III /3，PCR Primer ;在 72°C下作用2min，然后加入第I链合成试剂，42°C反应Ih后，在冰上终止反应。双链cDNA的合成按照试剂盒操作说明书加入反应试剂和Ily L第I链合成产物，在PCR仪器中进行如下反应72 °C预变性lOmin，95 V预变性20s后，95 °C 30s,68°C 8min,进行20个循环。反应结束后取5 μ L合成产物在I. 1%的TBE琼脂凝胶上，IOOv电泳30min,拍照。蛋白酶K消化取50 μ L ds DNA，加入2(^1^蛋白酶1(，混匀，451孵育201^11，加入50 μ L去离子水，等体积苯酚/氯仿、氯仿/异丙醇各抽提I次，乙醇沉淀，80%乙醇洗涤后，溶于79μ L水中。按照试剂盒操作说明书操作，在反应管中加入SFi I酶切试剂和纯化的cDNA，50°C水浴酶切2h，然后加入2 μ L 1% 二甲苯胺染料，混匀备用。将上述SFi I酶切产物经过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离，收集16管，每管I滴。分别取3 μ L于I. 1%凝胶琼脂糖电泳，收集符合条件的3管，加糖原沉淀后，溶于7 μ L超纯水中。
cDNA与XTriplEx 2载体的连接反应体积比分别采用1:0. 5、1:1和1:2，于16°〇连接12h。在连接好的DNA样品中加入50 μ L的包装蛋白，轻轻混匀并快速离心，室温放置3h，加入445 μ L噬菌体缓冲液，轻轻混匀，再加入25 μ L氯仿，缓慢颠倒混匀，离心取出氯仿，获得文蛤原始cDNA文库。(3)文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定文库送上海美季生物公司，MegaBACElOOO测序仪上，使用载体通用引物T3 5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGAA-3’进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abi, *. abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq)和质量文件(*. seq. qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大于95%)且长度大于IOObp的序列作为EST数据。(4)文蛤EST序列的同源性分析及文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获得的Contigs和Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析,根据相似性分析结果寻找出与胞内铜锌超氧化物歧化酶基因同源的EST序列，Cu/Zn-SOD氨基酸序列同源性比对结果如下表证明文蛤icCu/Zn-SOD与紫贻贝等其他9种海洋贝类的Cu/Zn-SOD具有较高的同源性。经过上述对比分析的结果表明Mm-Cu/Zn-S0D与其他海洋贝类Cu/Zn-SOD具有较高的相似性，也具有较高的同源性。同时，由于Cu/Zn-SOD在氨基酸组成上有缺乏色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的特点，而已经得到的Mm-Cu/Zn_S0D在氨基酸组成上，不含色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，这进一步证明该蛋白质是铜锌超氧化物歧化酶，该基因是Cu/Zn-SOD 的 cDNA。Mm-Cu/Zn-SOD 可推测为文蛤的 Cu/Zn-SOD 基因。
登录号rm~同源性/%~
地中海贻贝 Mytilus galloprovincialisCAQ68509. I3e-54 71%
紫贻贝 Mytilus edulisCAE46443. I8e-53 70%
皱纹盘鲍 Haliotis discus discusABG88844. Ile-51 69%
褶纹冠蚌 Cristaria plicataACI28282. Ile-52 69%
近江牡顿 Crassostrea ariakensisABF14366. I2e-54 68%
太平洋牡顿 Crassostrea gigasCAD42722. I6e-53 68%
才节孔扇贝 Chlamys farreriABD58974. I2e-52 66%
海湾扇贝 Argopecten irradiansACE769546e-50 66%
菲律宾給仔 Venerupis philippinarumACU83236. I2e-49 65%
(5)文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA全长序列的克隆从文库中分别筛选出I条Contigs和I条Singletons与胞内铜锌超氧化物歧化酶基因同源的EST序列，发现已获得5'全长；现利用3' RACE技术克隆文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA全长序列，根据与胞内铜锌超氧化物歧化酶基因同源的EST序列设计基因特异性引物 Mm-icCuZnSOD-F (SEQ ID NO. 3) 5/ 一TTTCCCGAAGCCCTATTG— 3'，结合载体通用引物M13Reverse Primer进行3'末端的扩增，PCR产物用I. 5%琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行PCR产物的回收和纯化，送大连宝生物工程有限公司克隆测序，测得序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。3'端PCR扩增所用体系以及反应条件25yL反应体系2.5yL IOXPCR (含Mg2+)，2. O μ IdNTP (各 2·5πιΜ)，1·0μ1 cDNA 模板，O. 5μ I 弓丨物 M13Reverse Primer(lOpmole/μ I )，O. 5μ I 引物 Mm-icCuZnSOD-F (SEQ ID NO :3) (lOpmole/μ I), rTaq DNA聚合酶(Takara 公司)(5U/μ I) 0. 2 μ 1，超纯水 17. 3 μ I。
反应在PTC_200(MJ公司)中进行，反应程序为预变性94°C 5min ;然后94°C 30s，55°C 45s, 72°C 45s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统检测，并送至宝生物工程大连有限公司测序。通过上述试验方法，克隆获得一种文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，具有以下序列(SEQ ID NO. 1)，序列特征长度1383碱基对；类型核酸；链型双链；拓扑结构线形；来源文蛤(Meretrix meretrix)；其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)的序列特征如下长度153个氨基酸；类型氨基酸；链型单链；拓扑结构线形；来源文蛤(Meretrix meretrix)。开放阅读框共编码153个氨基酸。按照标准密码子翻译后的蛋白质推测分子式为C685Hlltl5N199O221S5，分子量计算值为15. 82kD，理论等电点为6. 03 ;氨基酸组成中带正电荷的氨基酸(Arg+Lys+Arg)25个，占16. 34%,带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)21个，占13. 73%。极性与极性带电氨基酸共76个占49. 67%，非极性氨基酸77个占50. 33%，极性氨基酸比例较大，决定了文蛤超氧化物歧化酶在水中有较好的溶解性。实施例2.文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的重组表达及重组表达产物的应用(一)引物根据序列表SEQ ID NO. 2中文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶对应cDNA序列设定引物，引入两个不同的限制性内切酶突变位点，设计带有Ecor I限制性酶切位点的正向引物SEQ IDN0. 4和带有Xho I限制性内切酶位点的反向引物SEQ ID NO. 5，用来扩增Mm-Cu/Zn-SOD 的 ORF。SEQ ID NO. 4 CGRaattcatRtcRttaataRatRcaRtRtRtR 正向引物SEQ ID NO. 5 CcgctOgagttatttcttcttaattccaatgacacc 反向引物(二)构建克隆载体 PMD-Mm-Cu/Zn-S0D将扩增产物切胶回收(TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O :宝生物工程大连有限公司)，(I)与 PMD-IOT 载体连接(PMD-IOT simple vector, Ligation Mix :宝生物工程大连有限公司)，连接体系pMD19-T载体1μ I ；DNA4 μ I ； Solution I 5μ I ;16摄氏度过夜。(2)配sob培养基100ml，其中50ml不加抗生素备用，50ml铺成2个平板，铺平板之前按IOOuL: IOOmL比例加氨苄抗生素。SOB培养基液体培养基是3. 05g sob: IOOml纯水，固体培养基是在此基础上再加入I. 5g琼脂粉，煮沸灭菌。(3)将连接好的克隆载体PMD-Mm-Cu/Zn-SOD转入感受态细胞DH5 α。冰浴30min，42°C热激I分50秒，冰浴2_3min，加IOOOul不含抗生素的液体培养基，37 °C 培养 45min。(4)涂平板
在无菌操作台中吸出200-300ul培养液，均匀涂布在之前准备好的平板上，待培养液深入平板以后，37摄氏度倒置过夜培养。(5)挑菌每个I. 5ml离心管中加入IOOOuI含有氨苄抗生素的液体培养基，用灭菌枪头轻蘸一下菌落插入带有培养基的离心管中，轻轻搅动后移出枪头。37°C下200转摇菌6个小时左右，期间摇2-3个小时做一份PCR检测是否有片段插入。(6)选结果较好的一管，取出200ul菌液加200ul甘油_80°C冻存，同一管其余的用来测序，保留测序结果为阳性的菌液。(三)构建表达载体PET-Mm-Cu/Zn-S0D(I)取IOul保存的阳性菌液，加入IOOOul含有氨苄抗生素的液体培养基(每个做五管)，37摄氏度摇菌过夜(摇目的菌和相应的载体菌)。(2)用质粒小提试剂盒(北京天根生化科技公司)提目的菌和载体菌的质粒。提出来以后检测产物浓度X/ul，用于计算酶切反应体系。目的片段和PET_30a载体经过内切酶EcoRI酶切反应后，切胶回收目的片段，纯化后与表达用质粒载体PET-30a连接。连接体系(IOul)(保证目的DNA0. 3pmol :载体0. 03pmol)T4连接酶lul, T4连接酶 Bufferl. 6ul, 16°C过夜。(3)将构建成的表达载体，转化到克隆感受态大肠杆菌DH5a上(同步骤2)(4)培养经测序正确的克隆菌株，提取ρΕΤ-Mm-Cu/Zn-SOD表达载体质粒，转化到表达感受态BL21中，剩下的表达载体质粒_20°C保存，涂平板，所用抗生素为卡纳(用的抗生素是根据所用表达载体的抗性决定的)。转化时用3ul质粒，转化一个不带目的片段的空载体质粒作对照。(5)分别挑取对照菌和重组菌单菌落接于3ml加有卡纳抗生素的的新鲜培养基中，37°C，过夜培养。期间做PCR检测进行验证，取200ul菌液加200ul甘油_80°C保存，留做大量表达用。(四)诱导培养诱导时菌液与培养基比例为500ul菌液25ml含有卡纳抗生素的液体培养基，此步骤需要通气培养，所以用锥形瓶摇菌时最好在瓶内留有较多空间。37°C，培养2个半小时左右，0D600值达到0. 4-0. 6时，一个加入IPTG (IPTG浓度为24mg/ml，终浓度为0. Immo I/ml)诱导，一个不加IPTG作对照，在37 °C下200转摇菌3小时，然后4000转离心5min,弃上清。
(五)SDS-PAGE蛋白电泳后染色所用染色液为天根生化科技有限公司的蛋白胶快速染色液。将胶放入50ml蒸馏水中煮沸后保持lmin，然后摇lOmin。倒掉蒸馏水，加入染色液，没过胶面即可，煮沸后保持lmin，再摇IOmin (将染色液倒回回收瓶留待下次使用)，再次倒入蒸懼水煮沸保持lmin,摇5min,倒掉蒸懼水,加入清水观看即可。SDS-PAGE分析周质蛋白表明，在表达的条带中出现一条相对分子量约为21kD的条带(I条带)，是含有文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的片段，与理论计算值相符，如图I所示。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白考马斯亮蓝染色，I泳道为PET-30a空载体，2泳道为大肠杆菌BL21 (DE3)粗提物的上清液(表达载体IPTG诱导)，3泳道为大肠杆菌BL21粗提物的沉淀，4泳道为大肠杆菌BL21 (DE3)粗提物未诱导表达载体，图中箭头所示为目的条带。(六)大量诱导(I)取_80°C保存的用来做大量诱导的菌放到冰上融化，以IOul菌液1ml培养基(含抗生素)比例摇20ml菌过夜。
(2)将上一步过夜摇的菌液加入含氨苄抗生素的液体培养基。IL的锥形瓶中诱导摇菌300-400ml，共摇菌3瓶，进行通气培养。(3)在大摇床上摇菌，培养室温度在22°C，摇菌三个小时OD值可达到O. 4-0. 6，测好OD值加入IPTG诱导(ImlIPTG IOOOml菌液)，继续摇6个小时，收集菌体分装后_80°C冻存，留做纯化。Mm-Cu/Zn-SOD蛋白片段出现在上清中，未形成包涵体，具有生物学活性，为可溶性蛋白，表达量较大，可进行后续活性测定实验。同时也证明了 Mm-Cu/Zn-SOD为胞质蛋白。(七)蛋白纯化采用镍柱层析方法。预处理(I)从_80°C冰箱中取出大量诱导后收集的菌体2克，冰上解冻。(2)加Lysis Buffer至9ml,加入溶菌酶(每毫升加入I毫克溶菌酶)。(3)超声破碎，每隔10秒工作10秒至澄清，功率200W。(4)如果液体过于粘稠加入RNA酶,每毫升加入IOug,冰上反应10_15min。(此步骤为选择性操作，一般情况下不做)。(5) 10000 转离心 30min，取上清。(6)取 IOul 上清加入 5ul 2 X SDS Buffer，煮沸 5min 于 _20°C冻存留作 SDS PAGE分析。过柱子(I)加2ml 50%镍柱(Ni-NTA)至8ml上清液中，轻轻混匀，4摄氏度下放置一个小时，期间，间歇性轻轻混匀。Lysis Buffer中的咪唑起到抑制杂质蛋白与镍柱结合的作用，如果组氨酸标记的目的蛋白吸附不上，应将咪唑含量减少至10mM。(2)将上述混合液加入层析柱，等待里面的镍柱沉至柱低。(3)打开底盖收集2-3滴液体，加入相应量的2 X SDS Buffer煮沸于_20°C冻存留作PAGE分析，其余液体流掉。(4)用4ml Wash buffer洗6次，每次将Wash buffer加入后先流掉一点，再收集2-3滴，加入相应量的2 X SDS Buffer于_20°C冻存留作PAGE分析，分析第I次和第5、6次的液体，确定有没有洗掉杂蛋白，和是否有目的蛋白流失，其余流掉。(5)洗脱用O. 5ml Elution buffer洗8-9次,每次的都收集到一个单独的管里,从第I管和第7、8、9管中分别取出IOul加入5ul 2 X SDS Buffer煮沸做PAGE分析。(6) SDS蛋白电泳分析，结果的判断参考所述步骤(六)。(A)透析目的去除小于目的片段的小分子蛋白和离子，主要是过柱中引入的咪唑。防止影响后续实验，例如小分子蛋白会影响蛋白浓度检测，咪唑会影响蛋白活性测定。(I)透析液的选择I XPBS缓冲液。(2)上海宝曼生物有限公司的纤维素透析袋(MWCO 5000)，4°C下透析48个小时，期间换透析液3-4次，透析容器最好要大。经SDS蛋白电泳分析，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白纯化结果如图2 :M是takara低分子量蛋白Marker，I泳道为纯化前的重组蛋白，2泳道为纯化后的重组蛋白，此结果证明纯度很高。(九)重组表达蛋白活性测定超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，购于南京建成生物有限公司。纯化蛋白的定量(I)试剂准备考马斯亮蓝贮备液60ml X瓶，用时5倍稀释，现用现配。4°C下6个月蛋白标准液0. 563g/L O. 5ml 一支，4°C下I个月_20°C 3个月，用前分装。(2)操作按表配制待测样品。
权利要求
1.文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，其特征在于具有SEQID NO. I所示的碱基序列。
2.如权利要求I所述的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因所编码的蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.—种重组文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的质粒，其特征在于，将权利要求I所述的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-30a中，构建重组表达质粒。
4.一种表达文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的基因工程菌，其特征在于，将权利要求3所述的质粒转化大肠杆菌DH5 a宿主细胞获得重组基因工程菌。
5.权利要求I所述碱基序列的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于，包括 (1)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；其中,所述文蛤总RNA的提取的模板是从感染了鳗弧菌的文蛤血淋巴中提取的总RNA ； (2)文蛤cDNA文库构建及序列的测序； (3)用引物SEQID NO. 3以及3' RACE方法克隆到文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA全长序列。
6.具有权利要求I所述碱基序列的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因在制备文蛤免疫学药品、文蛤病害防治药品中的应用。
7.具有权利要求I所述碱基序列的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因在文蛤遗传选育中的应用。
全文摘要
本发明公开一种文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法及其应用，本发明利用构建cDNA文库、EST分析和3′RACE技术，对文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因进行了研究，首次从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，它具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该基因可以用于胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的体外重组表达和基因转移，为医药产品开发、文蛤免疫学研究、遗传选育和改良、病害防治奠定了基础。
文档编号C12N9/08GK102807987SQ20121030754
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者高祥刚, 赫崇波, 李宏俊, 刘卫东, 王志松, 李云峰, 鲍相勃 申请人:辽宁省海洋水产科学研究院