一种多肽及其应用的制作方法

本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
技术领域：
本发明涉及一种可用于治疗前列腺疾病的多肽、编码其的多核苷酸、以及它们的应用。技术背景前列腺癌是西方国家男性最常见的癌症之一(Gronberg,Lancet361:859-64(2003))。关于前列腺癌的治疗，可选用手术、放疗、内分泌治疗和化疗等不同方法。上述疗法对于改善患者远期预后，提高生存率并不理想。许多研究者将注意力转移到了活性高、不良反应小、不易产生耐药性的抗肿瘤多肽的研究。但是抗肿瘤多肽的稳定性、选择性是限制其应用的两个主要因素。由于肾的滤过作用、蛋白酶的降解作用等作用，导致抗肿瘤多肽的稳定性差、半衰期短、血药浓度低、生物利用度低。同时由于抗肿瘤多肽的选择性差，可导致人体正常的细胞和组织损伤，对人体有一定的毒副作用。因此，研究出有效的方法提高多肽药物的选择性和稳定性是抗肿瘤多肽药物研发中急需解决的问题，对其临床应用具有重要意义。科学家致力于靶向肿瘤肽的研究。目前已经发现多种与肿瘤相关的蛋白酶在肿瘤细胞或者胞外基质中发生过表达，已发现的活性酶有基质金属蛋白酶(MMP)及成纤维细胞激活蛋白(FAPot)，还有对前列腺肿瘤特异性和高表达的抗原(PSA)或hK2(humankallikrein2)，这些在肿瘤细胞表面特异性表达或由肿瘤细胞特异性分泌的小分子抗原物质的共同特点是同时具备肿瘤定位和蛋白水解酶两种特性。通常，将具有细胞毒性的母体药物与多肽缩合成该类酶的水解底物，使药物能更好地靶向到肿瘤组织。技术实现要素：本发明涉及一种多肽，其选自下组：(a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸由(a)衍生的多肽。本发明还涉及编码上述多肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、宿主细胞。本发明还涉及包含上述多肽的药物组合物及上述多肽在制备治疗前列腺疾病特别是治疗前列腺癌的药物中的应用。附图说明图1是本发明的由固相合成制备的LASAP-1多肽的ESI质谱图。图2是本发明多肽LASAP-1自组装形态的TEM图。本发明涉及一种多肽，其选自下组：(a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸由(a)衍生的多肽。在本发明的其他实施方式中，本发明提供的多肽是包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的多肽，以及其修饰多肽或其同源多肽。在本发明的其它实施方式中，“包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的多肽”包括，例如，由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的多肽，及在由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中添加信号肽序列构成的多肽，以及由在SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加适当标记序列而得的氨基酸序列构成的多肽。本发明中的“修饰多肽”指的是，包含在SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有治疗前列腺疾病活性的蛋白质。在本发明优选的实施方式中，所述的修饰多肽或其同源多肽中的对氨基酸的修饰是“保守性修饰”。例如“保守性取代”指的是，在不实质性改变蛋白质活性的条件下，将1个或多个氨基酸残基以化学上类似的其它氨基酸取代。可举出，将某疏水性残基以其它疏水性残基取代的情形，将某极性残基以具有相同电荷的其它极性残基取代的情形。可进行这种保守性取代的功能类似的氨基酸，在各氨基酸相应的
技术领域：
都是公知的。具体而言，作为非极性(疏水性)氨基酸，可以举出，丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以举出，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷(碱性)的氨基酸，可以举出，精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为负电荷(酸性)氨基酸，可以举出，天冬氨酸、谷氨酸等。本发明中的“同源多肽”指的是，包含和SEQIDNO：1表示的氨基酸序列具有至少85％，至少优选90％，至少优选92％，至少优选93％，至少优选94％，至少优选95％，至少优选96％，至少优选97％，至少优选98％，至少优选99％，更优选100％同源性(序列同一性)的氨基酸序列。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)本发明多肽可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明的多肽可通过基因工程、通过已知的肽合成或通过用适当的肽酶消化本发明之多肽来生成。优选的是，本发明多肽可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物，也可按照固相合成或液相合成，例如可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，SolidPhasePeptideSynthesis，2ndEd.，PierceChemicalCompany，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成。本发明进一步提供了编码上述多肽的多核苷酸。本发明之多核苷酸可用于在体内或体外生成如上所述的本发明之多肽，或者可用于可归因于编码本发明之蛋白质的基因中遗传异常的疾病的基因疗法。本发明之多核苷酸的任何形式都可使用，只要它编码本发明之多肽，包括mRNA、RNA、cDNA、基因组DNA、及化学合成的多核苷酸。本发明之多核苷酸包括包含指定核苷酸序列及其筒并序列的DNA，只要所得DNA编码本发明之多肽。本发明之多核苷酸可通过本领域技术人员知道的方法来制备。例如，本发明之多核苷酸可如下制备：从表达本发明之多肽的细胞制备cDNA文库，并以本发明之DNA(例如SEQIDNO:1或3)的部分序列作为探针进行杂交。cDNA文库的制备可采用，例如，参见Sambrook等编写的《分子克隆》，参见冷泉港实验室出版社(1989)中所描述的方法；或者，可采用市售cDNA文库。cDNA文库还可如下制备：从表达本发明之多肽的细胞提取RNA,根据本发明之DNA的序列(例如SEQIDNO:1或3)合成寡DNA,以所述寡DNA为引物进行PCR,并扩增编码本发明之蛋白质的cDNA。另外，通过对所得cDNA的核苷酸测序，可常规确定由所述cDNA编码的翻译区，且能容易地得到本发明之多肽的氨基酸序列。还有，以得到的cDNA或其部分作为探针，筛选基因组DNA文库，就能分离得到基因组DNA。本发明还提供一种含有编码本发明多肽的多核苷酸的基因工程载体。所述基因工程载体可以是普通载体或表达载体。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。本发明还提供一种含有本发明的载体的宿主细胞，该宿主细胞可以用于表达本发明多肽，所述宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9，动物细胞如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell23：175，1981)人类细胞系如PC-3细胞系，DU145细胞系及其它能表达相容载体的细胞系。本发明还提供一种药物组合物，其含有本发明治疗有效量的多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞；和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。在本发明优选的实施例中，例如，根据需要，药物可以口服，制成糖衣片、胶嚢、酏剂和微胶嚢；或非口服，注射水或任何其它制药学可接受液体的无菌溶剂或悬浮液的形式。例如，化合物可与制药学可接受栽体或介质混合成可接受的药物执行中的单位剂量形式，具体有灭菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、芳香剂、赋形剂、媒介剂、防腐剂、粘结剂等。这些制剂中活性成分的数量处于所示所需范围内的合适剂量。可制成片剂或胶嚢所用添加剂的例子是，粘结剂诸如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶，赋形剂诸如结晶纤维素，膨胀剂诸如玉米淀粉、明胶和褐藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；甜味剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；芳香剂诸如胡椒薄荷。当单位剂量形式为微胶嚢时，上述成分中还可包括液相栽体，诸如油。注射用无菌组合物可遵循常规的药物执行用媒介剂诸如注射用蒸馏水配制。生理盐水、葡萄糖和其它等渗液体包括佐剂，诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠，可用作注射用水溶液。这些可以与适当的增溶剂结合使用，诸如醇类，具体如乙醇，多元醇类诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯80和HCO-50。芝麻油或大豆油可用作油性液体，并可与作为增溶剂的苯甲酸甲酯、苯甲醇结合使用，且可与缓冲液诸如磷酸盐缓冲液，乙酸纳缓沖液；止痛剂，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇；和抗氧化剂一起配制。制备的注射液可装入合适的安瓿中。可使用本领域技术人员熟知的方法将本发明的药用化合物施用于患者，例如动脉内，静脉内，经皮注射，以及鼻内，经支气管，肌肉内或口服施用。剂量和施用方法根据患者的体重和年龄及施用方法而变化；而本领域技术人员可按常规进行选择。如果所说的化合物可由DNA编码的话，可将该DNA插入用于基因疗法的载体并施用该载体以进行治疗。剂量和施用方法因患者的体重、年龄、和症状而异，但可由本领域技术人员进行适当的选择。本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在说明本发明的几个方面。实施例1：LASAP-1多肽的制备本发明LASAP-1多肽的合成采用固相合成方法，为合成0.25毫摩尔多肽，其步骤如下：(1)活化树脂：将连接Fmoc保护的氨基酸的Wang树脂(购自吉尔生化上海有限公司)称好，倒入干净无水的固相反应器中，加入5mlDCM(二氯甲烷)溶解活化，过夜；(2)清洗树脂：抽干反应器中的液体，加入4mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺)充分震荡1min，抽干，如此反复操作8次；收集少量活化后的树脂留待做Kaiser检测；(3)脱Fmoc保护：抽干溶剂后，加入4ml含有20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡5min后抽干溶剂；再加入4ml含20％哌啶的DMF溶液，置于摇床，震荡20min；(4)清洗树脂、除去哌啶：抽干溶剂后，加入4mlDMF溶液，置于摇床，震荡1min，后抽干；如此反复，重复8次直至哌啶被完全除去；(5)电子天平称取待接入的氨基酸(Fmoc保护的氨基酸)和耦合试剂：将4倍量的氨基酸、3.9倍的HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)、4倍量的HOBT(1-羟基苯并三唑)溶于4mlDMF中，混合至完全溶解后，加入到固相反应器中与树脂充分混合，摇床振荡五分钟；(6)到时后，加入摩尔量为树脂的8倍的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，充分混合后，置于摇床中，计时反应2h，每接一个氨基酸需重复操作步骤2-6；(7)Kaiser检测，茚三酮与氨或一级胺产生紫红色络合物，Kaiser试剂包括：6％的茚三酮乙醇溶液；80％的苯酚乙醇溶液；2％0.001M的KCN吡啶溶液，取少量(6)中反应完成时的树脂，和(2)中的树脂，加Kaiser试剂中的三种成分各2-3滴，100℃加热1-2min，若呈现兰色或红褐色表明还有游离的氨基，相反则表示连接完全；(8)肽链接合完毕时，清洗树脂后，用哌啶脱保护两次；(9)用DMF清洗树脂10次，每次4ml；再用DCM清洗树脂10次，每次4ml；(10)清洗后的样品用氮气吹干，然后加入20％DMSO水溶液，室温下氧化4小时；(11)待反应完成后，真空干燥样品；(12)待样品干燥完毕之后，将树脂转移到鸡心瓶中，装好磁力搅拌器，将鸡心瓶固定好，缓慢加入混合好的切割试剂(三氟乙酸：超纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇＝82.5:5:5:5:2.5)，加入磁子进行充分搅拌，室温下反应12h；(13)待反应完成，将反应物转移至固相反应器中，以反应固相反应器中未转移的树脂，如此静置10min，用TFA(三氟乙酸)冲洗鸡心瓶，将所有树脂和溶液倒入固相反应器中，后将混合物在氮气流下过滤，滤液置于圆底烧瓶中，在氮气流下吹干；(14)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气，在圆底烧瓶中倒入约20ml冰乙醚沉淀多肽，将不溶物充分打散，然后配平，置于冷冻离心机内，4℃下8000rpm/min离心15min，弃上清，再溶于20ml冰乙醚中打散，离心；如此重复操作离心3次，将沉淀真空干燥，得到多肽粗品；(15)多肽粗品利用分析型HPLC进行纯度分析，后用制备型HPLC进行纯化；(16)对纯化后的目标多肽利用ESI高分辨质谱进行鉴定，其质谱图如图1所示，由图测得所合成的LASAP-1多肽的分子量为3074.75，说明其氨基酸序列如本发明SEQIDNO:1所示。实施例2：多肽LASAP-1的自组装形态通过透射电镜观察多肽LASAP-1自组装后的形态，其操作步骤如下：(1)配制浓度为40μM的LASAP-1溶液，在室温下放置过夜使其自组装，配制20mg/mL的磷钨酸(PTA)，磷钨酸染液需用0.1M氢氧化钠调节pH为6.0-7.0；(2)取出TEM专用铜网，滴一滴多肽样品于铜网上，形成水滴，静置1min后，用滤纸在铜网边缘吸取少量液体，时铜网成半湿润状态，然后再滴加一滴磷钨酸染液，染色1.5min左右，用滤纸吸干，然后将铜网放置于培养皿里干燥；(3)利用透射电镜观察LASAP-1多肽自组装后的形态，如图2所示，含有本发明LASAP-1多肽的溶液在室温放置过夜可自组装形成纳米级胶束。参见本发明LASAP-1多肽的氨基酸序列，在位置1处与位置9处的半胱氨酸残基可形成二硫键，而这利于本发明多肽形成自组装多肽，具有自组装能力的多肽LASAP-1在人血清中有着更高的稳定性。实施例3：多肽LASAP-1的活性实验多肽的细胞活性实验采用MTT法检测，其实验步骤如下：(1)配制溶剂：MTT溶液的配制：用PBS(胎牛血清，购自Gibco公司)配制5mg·mL-1的MTT(噻唑蓝，购自Sigma公司)，用锡箔纸包裹好，在室温下搅拌30分钟助溶，完全溶解后用0.22μM的滤膜过滤，最后在4℃下避光保存；三联溶解液的配制：SDS(十二烷基硫酸钠)为10g、异丁醇5mL、10M盐酸的用量为0.12mL，用双蒸水溶解配成100mL溶液；培养基的配制：90％的DMEM培养基(购自Gibco公司)和10％的FBS；DMEM培养基用于培养Hela细胞(人宫颈癌细胞系，购自中科院上海细胞库)和WPMY-1细胞(人正常前列腺基质永生化细胞，购自中科院上海细胞库)；RPMI-1640培养基(购自Gibco公司)用于培养LnCap细胞(人前列腺癌细胞，购自中科院上海细胞库)；(2)培养瓶中的Hela细胞、WPMY-1细胞和LnCap细胞长到80％以上，加入1mL胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃，5％二氧化碳培养箱培养，镜下观察细胞消化完成，加入4mL培养基终止后离心，离心转速、时间分别为900rpm/min，4min；弃上清液，加入培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；(3)用细胞计数器计算细胞个数，并添加培养基调整细胞浓度至5×104mL-1；(4)取细胞悬液铺板，每个孔中加入体积为100μL，每孔细胞数目5000，然后放置5％CO2，37℃培养箱中孵育16-18小时；(5)孵育结束后，用无血清培养基配制不同浓度的多肽药物，加入96孔板，与细胞孵育24小时。空白组仅添加培养基(无细胞)，对照组细胞仅加入培养基，实验组加入不同浓度的多肽药物；(6)反应结束后，吸出培养基。将之前配好的MTT用无酚红的全培养基稀释十倍，然后每孔加入100μL，其中空白组无须添加MTT。将96孔板放入细胞培养箱中；(7)反应4小时后，每孔加入100μL的三联试剂(10％SDS+5％异丁醇+0.012mol/LHCl)，在室温下，放在摇床上12-24小时混匀，用酶标仪检测在570nm的OD值，用SPSS软件计算各种细胞的IC50值。表1LASAP-1多肽对各细胞的毒性细胞IC50(μM)Hela(人宫颈癌细胞)239.83±12.34LnCap(人前列腺癌细胞)44.61±9.28WPMY-1(正常人前列腺细胞)156.51±5.41在上述三种细胞中，人前列腺细胞WPMY-1为正常细胞，不分泌hK2(humankallikrein2)酶；LnCap为人前列腺癌细胞，分泌hK2酶；Hela细胞为人宫颈癌细胞，不分泌hK2酶。如表1所示，本发明LASAP-1多肽对分泌hK-2酶的LnCap细胞的IC50值最低。SEQUENCELISTING<110>北京化工大学<120>一种多肽及其应用<130><160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>28<212>PRT<213>人工序列<400>1CysArgGlyAspLysGlyProAspCysGlyLysAlaPheArgArgPhe151015LeuGlyAlaLeuPheLysAlaLeuSerHisLeuLeu2025当前第1页1 2 3