本发明属于微生物领域，具体涉及烷烃氧载体在提高出芽短梗霉菌的聚苹果酸产量中的应用。
背景技术：
聚苹果酸(polymalicacid)是一种以苹果酸为唯一单体、相互之间通过酯键连接而成的高分子聚合物，它最早是由shimada等在1969年从圆弧青霉菌(pencilliumcyolopium)中分离得到，1979年vert等在首次用化学合成制备了该聚合物。聚苹果酸具有良好的水溶性，其水解后的单体苹果酸，可通过参与到生物体内的三羧酸循环而被吸收，对人体无任何的毒副作用。聚苹果酸的较好水溶性、生物可降解性和生物相容性等性能，使聚苹果酸及其衍生物在生物医药、生物材料和食品工程等众多领域具有相当广泛的应用前景。微生物发酵法制备的聚苹果酸具有很高的化学纯度和光学纯度，这是化学合成法难以达到的。聚苹果酸主要由出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、绒泡黏菌(physarumpolycephalum)等真核微生物合成，其中a.pullulans具有较强的聚苹果酸合成能力。
普鲁兰糖是一种线性聚合的高分子多糖，其化学结构是葡萄糖以α-1,4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α-1,6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成。普鲁兰糖作为低能量的食品添加剂，获得美国fda权威认证，此外，普鲁兰糖良好的成膜性和安全无毒的特点，使其在制药工业中也具有广泛用途。
聚苹果酸和普鲁兰糖可同时由出芽短梗霉发酵合成。中国发明专利zl201110430053.5公开了一种出芽短梗霉联产聚苹果酸和普鲁兰糖的方法。我们实验室筛选的一株出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d(保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmccno.7.208)合成聚苹果酸能力较强，但是该菌同时合成一种胞外多糖副产物，经鉴定该副产物为普鲁兰糖。由于普鲁兰糖粘度较大，它的存在会严重影响聚苹果酸的分离提取，因此如何降低产物中普鲁兰糖的浓度成为我们关心的问题。邹祥等公开了一种通过外源添加吐温提高聚苹果酸产量、抑制普鲁兰糖的方法(专利申请号：201410073783.6)，但是未见其他提高聚苹果酸产量、抑制普鲁兰糖合成的报道。
技术实现要素：
本发明公开了烷烃氧载体在提高出芽短梗霉菌的聚苹果酸产量中的应用，以解决现有技术存在的降低产物中普鲁兰糖的浓度效果不佳的问题。
烷烃氧载体是一种与水不互溶、对微生物无毒的有机物，其溶氧能力是水的15～20倍。在发酵液中引入烷烃氧载体，可以减少气液传氧阻力，提高发酵体系溶氧水平。我们在前期研究中发现，菌株a.pullulansha-4d联产聚苹果酸和普鲁兰糖受到溶氧调控，高溶氧条件有利于聚苹果酸合成，不利于普鲁兰糖合成。因此本发明通过烷烃氧载体调控溶氧，调节代谢流向聚苹果酸合成方向进行。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
烷烃氧载体在提高出芽短梗霉菌的聚苹果酸产量中的应用在本发明的保护范围之内。
其中，所述的烷烃氧载体为正己烷，正庚烷，正十二烷或正十六烷，优选正己烷。
其中，所述的出芽短梗霉菌的菌株号为a.pullulansha-4d，保藏编号为cgmccno.7.208。
其中，所述的应用方法为：将出芽短梗霉菌活化后在含有烷烃氧载体的培养基中发酵。
其中，将出芽短梗霉菌活化的方法为：将出芽短梗霉菌接种于种子培养基中，在25～30℃，转速180～250rpm的条件下摇床培养24～48小时；其中，所述的种子培养基的配方为：葡萄糖50～100g/l，酵母提取物0.5～2g/l，硝酸钠1～3g/l，磷酸二氢钾0.05～0.2g/l，硫酸镁0.05～0.2g/l，氯化钾0.3～1.5g/l，碳酸钙10～20g/l。
其中，所述的含有烷烃氧载体的培养基的配方为：葡萄糖100～200g/l，硝酸钠1～3g/l，磷酸二氢钾0.05～0.2g/l，硫酸镁0.05～0.2g/l，氯化钾0.3～1.5g/l，硫酸锌0.05～0.2g/l，碳酸钙20～40g/l；其中，烷烃氧载体体积占培养基总体积的0.3～1.5％。
其中，优选配方为：
葡萄糖120g/l，硝酸钠2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸锌0.1g/l，碳酸钙30g/l，正己烷载体1.5％。
其中，
所述的发酵的方法为：在25～30℃，转速为180～250rpm的条件下，摇床培养120～168小时；
或者，在25～30℃，转速300～600rpm，通气比1：1～2的条件下在机械搅拌式发酵罐培养96～168小时。
优选的发酵方法为：
在25℃，转速200rpm的条件下摇床培养144小时；
或者，在25℃，转速400rpm，通气比1：1.5的条件下在机械搅拌式发酵罐培养168小时。
有益效果：
与现有技术相比，本发明公开了利用烷烃氧载体提高聚苹果酸产量、抑制普鲁兰糖合成的方法。采用低浓度烷烃氧载体建立定向调控策略，实现对聚苹果酸和普鲁兰糖合成的碳代谢流向调控，抑制副产物普鲁兰糖的合成，提高主产物聚苹果酸的产量，同时添加此浓度范围的烷烃氧载体不会对出芽短梗霉细胞生长造成抑制。
附图说明
图1为实施例8和9中发酵全程溶氧变化曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中使用的种子培养基各组分为：葡萄糖50g/l，酵母提取物1g/l，硝酸钠2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，氯化钾0.5g/l，碳酸钙20g/l。
本发明中使用的基础发酵培养基各组分为：葡萄糖120g/l，硝酸钠2g/l，磷酸二氢钾0.1g/l，硫酸镁0.1g/l，氯化钾0.5g/l，硫酸锌0.1g/l，碳酸钙30g/l。
本发明中检测发酵液中普鲁兰糖含量的方法：收集发酵液，将发酵液8000rpm离心10min，收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至相当于原体积的1/2，然后加入4℃预冷的无水乙醇至乙醇体积分数为50％，4℃静止过夜，然后8000rpm离心10min收集沉淀，80℃烘干称重。
本发明中检测发酵液中聚苹果酸含量的方法：收集发酵液，将发酵液8000rpm离心10min，收集上清液。取1ml上清液，加入1ml浓度为2mol/l的硫酸，90℃水解9h。采用高效液相色谱(hplc)检测，色谱柱spursilc18-ep(7.8×300mm，5μm)；以a相(25mmkh2po4ph2.5)：b相(甲醇)＝90:10为流动相，柱温：30℃；紫外检测波长：210nm。使用苹果酸标准品配置标准溶液，通过hplc检测后绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算发酵液中聚苹果酸含量。
实施例1
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h。然后取种子液10ml，接种于500ml摇瓶中，摇瓶中装有90ml基础发酵培养基，并额外添加1ml正庚烷，然后在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养144小时。结果显示，本实施例中聚苹果酸产量33.8g/l，普鲁兰糖产量2.5g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正庚烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为30.3g/l，普鲁兰糖产量为5.9g/l。
实施例1与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了11.6％，普鲁兰糖产量降低了57.6％。
实施例2
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h，种子液制备3瓶。然后取种子液300ml，接种于5l机械搅拌式发酵罐中，发酵罐中装有2.7l基础发酵培养基，并额外添加30ml正庚烷，在温度25℃、转速400rpm、通气比1：1.5的条件下进行发酵，当发酵液中残糖浓度低于10g/l时，以12ml/h的流速向罐内持续流加300g/l葡萄糖，168小时后结束发酵。本实施例中聚苹果酸产量102.8g/l，普鲁兰糖产量8.7g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正庚烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为82.5g/l，普鲁兰糖产量为18.3g/l。
实施例2与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了24.6％，普鲁兰糖产量降低了52.5％。
实施例3
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h。然后取种子液10ml，接种于500ml摇瓶中，摇瓶中装有90ml基础发酵培养基，并额外添加1ml正十二烷，然后在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养144小时。结果显示，本实施例中聚苹果酸产量32.9g/l，普鲁兰糖产量2.7g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正十二烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为30.3g/l，普鲁兰糖产量为5.9g/l。
实施例3与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了8.6％，普鲁兰糖产量降低了54.2％。
实施例4
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h，种子液制备3瓶。然后取种子液300ml，接种于5l机械搅拌式发酵罐中，发酵罐中装有2.7l基础发酵培养基，并额外添加30ml正十二烷，在温度25℃、转速400rpm、通气比1:1.5的条件下进行发酵，当发酵液中残糖浓度低于10g/l时，以12ml/h的流速向罐内持续流加300g/l葡萄糖，168小时后结束发酵。本实施例中聚苹果酸产量100.5g/l，普鲁兰糖产量10.2g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正十二烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为82.5g/l，普鲁兰糖产量为18.3g/l。
实施例4与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了21.8％，普鲁兰糖产量降低了44.3％。
实施例5
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h。然后取种子液10ml，接种于500ml摇瓶中，摇瓶中装有90ml基础发酵培养基，并额外添加1.5ml正十六烷，然后在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养144小时。结果显示，本实施例中聚苹果酸产量33.5g/l，普鲁兰糖产量2.4g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正十二烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为30.3g/l，普鲁兰糖产量为5.9g/l。
实施例5与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了10.6％，普鲁兰糖产量降低了59.3％。
实施例6
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h，种子液制备3瓶。然后取种子液300ml，接种于5l机械搅拌式发酵罐中，发酵罐中装有2.7l基础发酵培养基，并额外添加45ml正十六烷，在温度25℃、转速400rpm、通气比1:1.5的条件下进行发酵，当发酵液中残糖浓度低于10g/l时，以12ml/h的流速向罐内持续流加300g/l葡萄糖，168小时后结束发酵。本实施例中聚苹果酸产量105.2g/l，普鲁兰糖产量8.2g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正十六烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为82.5g/l，普鲁兰糖产量为18.3g/l。
实施例6与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了27.5％，普鲁兰糖产量降低了55.2％。
实施例7
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h。然后取种子液10ml，接种于500ml摇瓶中，摇瓶中装有90ml基础发酵培养基，并额外添加0.5ml正己烷，然后在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养144小时。结果显示，本实施例中聚苹果酸产量34.2g/l，普鲁兰糖产量2.2g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正己烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为30.3g/l，普鲁兰糖产量为5.9g/l。
实施例7与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了12.9％，普鲁兰糖产量降低了62.7％。
实施例8
取保藏号为cgmccno.7.208的出芽短梗霉菌a.pullulansha-4d接种于含有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在温度25℃、转速200rpm的条件下摇床培养48h，种子液制备3瓶。然后取种子液300ml，接种于5l机械搅拌式发酵罐中，发酵罐中装有2.7l含基础发酵培养基，并额外添加15ml正己烷，在温度25℃、转速400rpm、通气比1:1.5的条件下进行发酵，当发酵液中残糖浓度低于10g/l时，以12ml/h的流速向罐内持续流加300g/l葡萄糖，168小时后结束发酵。本实施例中聚苹果酸产量107.6g/l，普鲁兰糖产量7.8g/l。
同时按照与上述相同方法进行对比实验，区别在于使用的是基础发酵培养基，未加入正己烷。结果显示，本对比实施例中聚苹果酸产量为82.5g/l，普鲁兰糖产量为18.3g/l。
实施例8与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了30.4％，普鲁兰糖产量降低了57.4％。
实施例9
按照与实施例8相同方法进行平行实验，区别在于正己烷添加量分别为0.3％(9ml)、1％(30ml)和1.5％(45ml)。5l发酵罐内溶氧变化曲线见图1，聚苹果酸和普鲁兰糖产量见表1。结果表明，正己烷添加量为0.5％时调控效果最佳，主产物聚苹果酸增加量和副产物普鲁兰减少值最高。
表1