嗜热菌株合成长链二元酸的应用方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及两株嗜热菌株合成长链二元酸的方法与应用。

背景技术：

长链二元酸是一种含有10个及以上碳原子的脂肪族二羧酸(简称dcn)，作为化工中重要的中间原料，用于合成麝香、共聚酰胺热溶胶、尼龙工程塑料、高温电介质、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料等精细化工产品，被广泛应用于化工、轻工、农药、医药、液晶材料等领域。由于长链二元酸在自然界中并不单独存在，所以长链二元酸的合成一直是国内外学者的研究热点。

长链二元酸主要合成方法为化学法和生物法。化学法的条件苛刻，成本高，环境污染严重，限制了其商业发展。生物法工艺以来源丰富的石蜡或脂肪酸为原料，经由微生物发酵得到长链二元酸，条件温和，过程环保，是绿色长链二元酸，多种优势的存在使生物法替代化学法成为必然趋势。由于在夏季或者高温地区，难以将发酵温度维持在30℃左右。因此，选育出能够在高温条件下保持其产酸能力的菌株就有着十分重要的意义。

目前未见有报道关于嗜热微生物合成长链二元酸的方法与应用方面的研究。

技术实现要素：

本发明目的在于提供嗜热微生物合成制备长链二元酸的方法。

1本发明提出嗜热菌株合成长链二元酸的应用方法，包括嗜热微生物筛选、分离及鉴定的方法以及嗜热微生物合成制备长链二元酸的方法，

具体步骤如下：

(1)采集的土壤样本则直接采用稀释涂布法在正十二烷选择培养基上进行涂布，于30℃、37℃和45℃水浴中培养3～5天。根据菌落的形态选择有差别的单菌落接种到对应的液体培养基中，同样温度下水浴摇床培养3～5天。

(2)选择能够在正十二烷选择培养基，即以烷烃作为唯一碳源的培养基上能够生长的菌株，在含有甲基红指示剂的指示培养基上进行划线培养。

(3)同时，挑取选择培养基上能够生长的单菌落，接种于不添加甲基红指示剂的50ml指示培养基中，分别在30℃、37℃、45℃条件下进行摇瓶培养，并在培养的第一天起，每天取出1ml培养液，并滴加1～2滴甲基红指示剂，记录培养4天培养过程中的颜色变化情况。

(4)挑选滴入指示剂后发生颜色变化明显的菌株，进行后续发酵、生理生化及分子鉴定实验，最终确定两株菌株分别为食树脂假单胞菌及类产碱假单胞菌。

(5)将筛选出的产酸菌株接入50ml种子培养基中，分别在30℃、37℃、45℃下培养48h。

(6)36h扩大培养过后，加入15％已灭菌的正十二烷，进入产酸期。产酸期持续4天，每隔12h或24h调整ph为7.5。

(7)取经离心、过滤后的发酵清液30ml，分别将15ml加入到2支15ml离心管中，并通过滴定法和分光光度法两种方法进行十二烷二元酸浓度的检测。

本发明优点在于

1.本发明实现了筛选出两株能够在高温条件下，利用烷烃类碳源合成长链二元酸的新菌株(一般发酵温度维持在30℃)。

2.本发明筛选出的高温环境中生长的嗜热微生物在菌体酶活性、对环境的适应性等方面较正常菌株具有突出优势，解决了发酵法生产长链二元酸在高温环境下的难以进行的难题。

3.本发明的工艺简单，经由微生物发酵得到长链二元酸，条件温和，过程环保，是绿色长链二元酸，适合于大规模工业生产。

4.本发明制备的长链二元酸在国内生产起步较晚，以它为原材料合成的下游高档精细化工类产品目前主要以进口为主。长链二元酸是不可替代的原料，在国内为节约能源、使生产能够全年连续进行创造更多经济效益。

附图说明

图130℃下液体摇瓶培养取样滴加甲基红指示剂结果

图237℃下液体摇瓶培养取样滴加甲基红指示剂结果

图345℃下液体摇瓶培养取样滴加甲基红指示剂结果

图42号、6号菌株16srdna电泳结果

图5筛选出的2号、6号菌株生长曲线测定结果

图6十二烷二元酸浓度标准曲线

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

实施例1：

(1)采集的土壤样本则直接采用稀释涂布法在正十二烷选择培养基上进行涂布，于30℃水浴中培养3～5天。根据菌落的形态选择有差别的单菌落接种到对应的液体培养基中，同样温度下水浴摇床培养3～5天。

(2)选择能够在正十二烷选择培养基即以烷烃作为唯一碳源的培养基上能够生长的菌株，在含有甲基红指示剂的指示培养基上进行划线培养。

(3)同时，挑取选择培养基上能够生长的单菌落，接种于不添加甲基红指示剂的50ml指示培养基中，在30℃条件下进行摇瓶培养，并在培养的第一天起，每天取出1ml培养液，并滴加1～2滴甲基红指示剂，记录培养4天培养过程中的颜色变化情况。(见图1)

实施例2：

(1)采集的土壤样本则直接采用稀释涂布法在正十二烷选择培养基上进行涂布，于37℃水浴中培养3～5天。根据菌落的形态选择有差别的单菌落接种到对应的液体培养基中，同样温度下水浴摇床培养3～5天。

(2)选择能够在正十二烷选择培养基即以烷烃作为唯一碳源的培养基上能够生长的菌株，在含有甲基红指示剂的指示培养基上进行划线培养。

(3)同时，挑取选择培养基上能够生长的单菌落，接种于不添加甲基红指示剂的50ml指示培养基中，分别在37℃条件下进行摇瓶培养，并在培养的第一天起，每天取出1ml培养液，并滴加1～2滴甲基红指示剂，记录培养4天培养过程中的颜色变化情况。(见图2)

实施例3：

(1)采集的土壤样本则直接采用稀释涂布法在正十二烷选择培养基上进行涂布，于45℃水浴中培养3～5天。根据菌落的形态选择有差别的单菌落接种到对应的液体培养基中，同样温度下水浴摇床培养3～5天。

(2)选择能够在正十二烷选择培养基即以烷烃作为唯一碳源的培养基上能够生长的菌株，在含有甲基红指示剂的指示培养基上进行划线培养。

(3)同时，挑取选择培养基上能够生长的单菌落，接种于不添加甲基红指示剂的50ml指示培养基中，分别在45℃条件下进行摇瓶培养，并在培养的第一天起，每天取出1ml培养液，并滴加1～2滴甲基红指示剂，记录培养4天培养过程中的颜色变化情况。(见图3)

本实验中所用的样品——土壤、泉水以及沉积物样本均采自50℃～90℃的高温环境下，其中所生活的均是嗜热微生物，而嗜热微生物在菌体酶活性及对环境的适应能力方面较之于常温菌株有着一定的优越性。因此，从这些样本中筛选出能够利用烷烃并且可以转化为长链二元酸的菌株，尤其是能够在较高温度下依旧能够保持其发酵能力的菌株，对于降低工业发酵生产长链二元酸的成本并解决在夏季及高温地区难以进行发酵生产的问题具有重要的价值。

以下通过实施例5、6进一步制备长链二元酸。

实施例4：

挑取实施例1的单菌落经扩大培养后对其生理生化特征分析进行初步分类，检验细菌能否在以烷烃为唯一碳源的培养基中生长、v-p反应类型以及是否产氨，下表为挑选出的2号、6号菌株的实验记录，包括生理生化实验结果(见表1)，并对其进行pcr扩增其16srdna(见图4)和测序分析(见表2)。

表12号、6号菌株形态观察及生理生化实验记录

表22号、6号菌株测序分析结果

实施例5：

(1)将实施例1筛选出的产酸菌株接入50ml种子培养基中，分别在30℃、37℃、45℃下培养48h。

(2)36h扩大培养过后，加入15％已灭菌的正十二烷，进行菌株生长曲线测定(见图5)。进入产酸期产酸期持续4天，每隔12h或24h时调整ph为7.5。

实施例6：

(1)将实施例2筛选出的产酸菌株接入50ml种子培养基中，分别在30℃、37℃、45℃下培养48h。

(2)36h扩大培养过后，加入15％已灭菌的正十二烷，进入产酸期。产酸期持续4天，每隔12h或24h调整ph为7.5。

(3)取经离心、过滤后的发酵清液30ml，分别将15ml加入到2支15ml离心管中，进行发酵产物十二烷二元酸测定(见图6)。