本发明涉及植物次生代谢产物生物合成途径中相关酶类的解析方法。
背景技术：
植物的初生代谢和次生代谢之间并没有清晰的界限。初生代谢提供了许多小分子物质作为次生代谢途径的前体，而很多情况下次生代谢产物的前体同样也用于初生代谢产物的合成。次生代谢产物的生物合成代谢途径多种多样，许多途径目前仍然很不清楚。
传统生物学研究原核生物次生代谢产物的生物合成途径的方法主要是通过cdna克隆测序及表达序列标签(ests)特性分析，此外，由于原核生物中催化功能相近的蛋白的基因同源性高，并且成簇存在，在使用上述方法时更为方便快速。但在研究真核生物体系次生代谢产物的生物合成途径时，由于真核生物复杂的机体状态和不同的环境条件，次生代谢产物的生物合成途径也会千差万别，再使用和原核生物一样的方法进行研究，不仅工作量巨大，并且对于复杂生物体中的蛋白催化反应可能并不适用。因为rna的水平不会直接对应于蛋白的丰度，更别说更为重要的蛋白和酶的活性；细胞中的蛋白水平可能并不对应负责细胞代谢、调控和信号传导的酶活性，例如一些反应可能需要几种不同的蛋白协同作用，共同催化反应的进行，而基因组转录不一定能够发现这些蛋白；再者，由于蛋白质的活性被很多翻译后修饰事件所控制，如磷酸化、甲基化、糖基化等，这些修饰后的活性蛋白的含量才能真正反映蛋白质在生理条件下的功能状态；因此，仅仅研究蛋白的表达水平是不全面的。
技术实现要素：
本发明第一方面提供下式(i)所示的化合物：
l-b(i)
式中，
l是被点击化学功能基团和/或光亲和基团取代的连接基团；
b为功能蛋白的底物。
在一个或多个实施方案中，l为烷基，如c1-10烷基或c1-6烷基。
在一个或多个实施方案中，l为-[(ch2)mo]n-或-[(ch2)mo]n-nh-，其中m和n各自独立为1－4的整数。
在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白是植物、动物或微生物来源的功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白是具有物质运输、催化功能、信息交流和/或免疫功能的功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白是植物次生代谢合成酶。
在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白是来自甜叶菊甜菊糖合成途径的次生代谢合成酶。
在一个或多个实施方案中，所述点击化学功能基团选自炔基、叠氮基、醛基、酮基、酰肼基、氨氧基和炔-1,3-偶极环，优选为炔基或叠氮基。
在一个或多个实施方案中，所述光亲和基团为通过紫外光照而使所述底物与所述功能蛋白共价结合的基团。
在一个或多个实施方案中，所述光亲和基团选自苯基叠氮基、双吖丙啶基、二苯甲酮基和苯甲酰基。
在一个或多个实施方案中，所述点击化学功能基团为炔基，所述光亲和基团为双吖丙啶基。
在一个或多个实施方案中，所述l为：
在一个或多个实施方案中，所述b为甜菊醇、甜菊醇单甙、甜菊醇双甙甜菊醇甙或莱鲍迪甙a。
在一个或多个实施方案中，所述式(i)化合物为：
本发明第二方面提供一种探针分子，所述探针分子由本发明式(i)化合物与报告基团形成，其中，所述报告基团经由所述点击化学功能基团与所述底物共价连接。
在一个或多个实施方案中，所述报告基团来自用于富集蛋白的报告分子，如生物素。
在一个或多个实施方案中，所述报告基团来自用于示踪蛋白的报告分子，如荧光染料。
在一个或多个实施方案中，所述荧光染料选自：羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、氟硼荧染料、花菁类染料(如cy3、cy5)、alexafluro系列染料(如alexafluro488、alexafluro568)。
在一个或多个实施方案中，所述探针分子的式(i)化合物中，所述b为甜菊醇、甜菊醇单甙、甜菊醇双甙甜菊醇甙或莱鲍迪甙a，所述点击化学功能基团为炔基，所述光亲和基团为双吖丙啶基；所述报告分子为生物素或羧基四甲基罗丹明。
在一个或多个实施方案中，所述探针分子中，式(i)化合物为：
所述报告分子为生物素或羧基四甲基罗丹明，所述报告分子通过该化合物的炔基与该化合物共价连接。
本发明第三方面提供一种鉴定功能蛋白的方法，所述方法包括：
(1)提供含有与探针分子结合的目标功能蛋白的蛋白混合物；
(2)富集与探针分子结合的蛋白质；和
(3)分离、鉴定与探针分子结合的蛋白质；
其中，所述探针分子含有所述目标功能蛋白的底物经点击化学功能基团和/或光亲和基团修饰的衍生物，该衍生物保留了与所述目标功能蛋白的亲和性。
在一个或多个实施方案中，所述探针分子如本文第二方面所述。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：实施竞争对照实验和/或空白对照实验的步骤；其中，所述竞争对照实验中，使用所述底物与所述探针分子处理所述含有目标功能蛋白的蛋白混合物；所述空白对照中，未使用所述底物与所述探针分子处理所述含有目标功能蛋白的混合物。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：表达所述目标功能蛋白，进行亲和性实验，确认所述目标功能蛋白为待鉴定的功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述步骤(1)包括，混合本发明式(i)化合物与含有目标功能蛋白的蛋白质混合物，孵育一段时间后进行紫外光照，然后在混合物中加入报告分子，利用点击化学反应将报告分子接入式(i)化合物，从而提供步骤(1)所述的含有与探针分子结合的目标功能蛋白的蛋白混合物。
在一个或多个实施方案中，所述含有目标功能蛋白的蛋白混合物经高效液相色谱法、高效液相色谱与质谱联用法、气相色谱法、气相色谱与质谱联用法、核磁共振法和高效液相色谱与核磁共振联用法中的一种或多种验证含有目标功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述报告分子为用于示踪靶蛋白的荧光染料，所述步骤(2)包括：通过sds-page分离富集与所述探针分子结合的蛋白质。
在一个或多个实施方案中，所述报告分子用于富集蛋白，所述步骤(2)包括，通过与该报告分子的特异性结合分子结合而富集与所述探针分子结合的蛋白质。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)所述的鉴定包括联用定量蛋白质组学和质谱技术进行鉴定。
在一个或多个实施方案中，所述联用定量蛋白质组学和质谱技术进行鉴定包括样品前处理、利用超高分辨质谱进行数据采集和对数据结果进行分析。
在一个或多个实施方案中，所述样品前处理包括：富集蛋白的酶解、肽段标记和脱盐。
在一个或多个实施方案中，所述对数据结果进行分析包括通过对比竞争对照实验结果和/或空白对照实验结果，结合生物信息学分析确定目标功能蛋白。
在一个或多个实施方案中，利用选自非标定量法、tmt、itraq、silac、mrm(mrmhr)和swath的方法进行蛋白定量，优选采用tmt法。
本发明还涉及本发明式(i)化合物和探针分子在鉴定功能蛋白中的应用。
附图说明
图1：基于活性/亲和性的分子探针的结构通式。
图2：化合物1的1hnmr谱图。
图3：化合物1的13cnmr谱图。
图4：化合物1的hplc纯度分析。
图5：化合物1的质谱分析。
图6：提取的甜叶菊蛋白电泳后银染显色分析。ft：flowthrough，流出的组分；wash：清洗的组分；e1-6：洗脱的组分1-6。
图7：提取的甜叶菊蛋白活性测试。1：甜菊醇单甙(steviolmonoside)；2：甜菊醇双甙(steviolbioside)；3：甜菊醇甙(stevioside)；4：莱鲍迪甙a(rebaudiosidea)。
图8：提取的甜叶菊蛋白电泳后的蛋白质谱分析。
图9：提取的甜叶菊蛋白与探针分子结合后的荧光标记。
图10：体外重组表达的甜叶菊蛋白ugt85c2与探针分子的亲和性验证试验。
图11：ugt85c2蛋白与两种甜菊醇探针的体外亲和结合比较结果。
具体实施方式
为解决现有研究植物次生代谢产物合成方法的瓶颈，本发明设计了一种新的植物次生代谢合成酶捕获方法，即基于植物次生代谢产物及其类似物骨架设计的基于活性/亲和性的分子探针(activity/affinity-basedprobe)对蛋白质的功能与结构进行研究，它不仅可应用于鉴别与活性分子相互作用的蛋白质，同时也可对其相互作用模式进行研究，在经典蛋白质组学与功能蛋白质组学间起到桥梁作用。探针分子能够在复杂的生物样品中特异性地标记处于功能状态下的蛋白质，因此，本发明的技术更能反映蛋白质在生命体中的功能状态。本发明的技术也可应用于任何植物次生代谢途径以外的其它各种来源的功能蛋白的鉴别及相互作用模式的研究。例如，功能蛋白可以是各种植物来源、动物来源或微生物来源的功能蛋白，也可以是具有本领域周知各种功能，包括但不限于具有物质运输、催化功能、信息交流和/或免疫功能的功能蛋白，例如可以是运输蛋白、催化蛋白、免疫蛋白和调节蛋白等。在某些实施方案中，适用于本发明的功能蛋白是植物来源的功能蛋白(如甜叶菊来源的功能蛋白)，如植物次生代谢合成酶。在某些具体实施例中，所述功能蛋白是甜菊糖合成途径中的具有转糖酶功能的植物次生代谢合成酶。
本发明的探针分子基于功能蛋白的作用底物而设计，含所述底物经点击化学功能基团和/或光亲和基团修饰的衍生物。该探针分子保留了与功能蛋白的亲和性。通常，在设计探针分子时，先根据所选底物的结构特点以及所述底物与功能蛋白之间的作用模式，确定不影响底物与功能蛋白间的亲和性的位点，用于与化学功能基团和/或光亲和基团连接。可根据不同的底物和不同的化学功能基团和/或光亲和基团而采用相应的本领域周知的化学合成方法或化学反应将化学功能基团和/或光亲和基团连接到底物上，或合成本发明的底物衍生物。
换言之，本发明的底物衍生物具有本文式(i)所示的结构，其中l是被点击化学功能基团和/或光亲和基团取代的连接基团；b为所述底物。
l可以是被点击化学功能基团和/或光亲和基团取代的烷基，如c1-10烷基、c1-8烷基、c1-6、c2-8烷基或c2-6烷基。或者，l是被点击化学功能基团和/或光亲和基团取代的-[(ch2)mo]n-或-[(ch2)mo]n-nh-，其中m和n各自独立为1－4的整数。取代通常发生在c上。在某些实施方案中，l如下式所示：
*表示l于该处与底物连接。
点击化学功能基团是点击化学反应中常用的官能团。点击化学反应为本领域周知的反应，其代表反应是铜催化的叠氮-炔基环加成反应。适用于本发明的点击化学功能基团可选自炔基、叠氮基、醛基、酮基、酰肼基、氨氧基和炔-1,3-偶极环，优选为炔基或叠氮基。
光亲和基团是通过紫外光照而使所述底物与所述功能蛋白共价结合的基团。可使用本领域已知的各种光亲和基团，如苯基叠氮基、双吖丙啶基、二苯甲酮基和苯甲酰基。
如前文所述，底物是功能蛋白的底物。从来源上，所述功能蛋白可以是植物、动物或微生物来源的功能蛋白。从功能上，所述功能蛋白可以是具有物质运输、催化功能、信息交流和/或免疫功能的功能蛋白。在某些实施方案中，所述功能蛋白是植物次生代谢合成酶。在某些实施方案中，所述功能蛋白是来自甜叶菊甜菊糖合成途径的次生代谢合成酶。在某些实施方案中，所述底物为甜菊醇、甜菊醇单甙、甜菊醇双甙甜菊醇甙或莱鲍迪甙a。
本发明的探针分子可由本发明式(i)化合物(即所述的底物衍生物)与报告基团形成。通常，所述报告基团经由所述点击化学功能基团与所述底物共价连接。图1显示了本发明探针分子的结构示意图，其中，活性基团即为底物。
适用于本发明的报告基团可来自本领域周知的用于富集目的的报告分子(如生物素)或各种用于示踪蛋白目的的报告分子(如荧光染料)。应理解的是，“报告基团”为“报告分子”中用于报告目的的部分。荧光染料的例子包括但不限于羧基荧光素(fam)、异硫氰酸荧光素(fitc)、四乙基罗丹明、羧基四甲基罗丹明(tamra)、氟硼荧染料(bodipy)、花菁类染料(如cy3、cy5等)和alexafluro系列染料(如alexafluro488、alexafluro568等)。
通常，对报告分子进行修饰，使其携带有能与式(i)化合物中所存在的点击化学功能基团发生点击化学反应的点击化学功能基团。例如，当式(i)化合物中所存在的点击化学功能基团为炔基时，可修饰报告分子，使其携带有叠氮基，从而允许所述报告分子通过点击化学反应与式(i)化合物共价连接。
本发明的式(i)化合物和探针分子可用于鉴定功能蛋白。本发明鉴定功能蛋白的方法包括：
(1)提供含有与本发明探针分子结合的目标功能蛋白的蛋白混合物；
(2)富集与探针分子结合的蛋白质；和
(3)分离、鉴定与探针分子结合的蛋白质。
对于步骤(1)，可混合所述本发明的式(i)化合物与含有待测的功能蛋白(本文也称为靶蛋白或靶蛋白质)的蛋白质混合物，孵育一段时间，使探针分子与靶蛋白通过亲和作用充分结合后，紫外光照一段时间，使得式(i)化合物通过其光亲和基团与靶蛋白发生共价连接。然后再添加经修饰的报告分子，利用点击化学反应将报告基团接入探针分子。之后可进行富集、分离和/或鉴定。
紫外激发波长和光照时间可根据光亲和基团的性质而容易确定。例如，紫外激发波长范围为200～400nm，时间为10～30分钟。
可根据式(i)化合物所带的点击化学功能基团而在报告分子上连接上相应的点击化学功能基团，以使该报告分子可通过点击化学反应而与式(i)化合物上相应的基团发生反应，从而将报告基团连接到式(i)化合物上。例如，当式(i)化合物上的点击化学功能基团为炔基时，通常修饰报告分子，使其含有叠氮基。这类反应通常在含有修饰的报告分子、硫酸铜、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺和抗坏血酸钠的反应混合物中进行。反应温度通常为35～40℃，时间通常在1～3小时。在某些实施方案中，本发明使用的报告分子是亲和素或羧基四甲基罗丹明，为使其与式(ii)所示的光亲和基团发生点击化学反应，分别将亲和素和羧基四甲基罗丹明修饰成亲和素叠氮和羧基四甲基罗丹明叠氮。
对于不同的报告基团，可采用不同的分离和检测方法。例如，若报告基团来自用于示踪靶蛋白的报告分子，则可通过sds-page(例如一维或二维sds-page)分离富集与所述探针分子结合的蛋白质，然后可在荧光检测器下检测探针分子标记靶标蛋白的情况，和/或使用考马斯亮蓝染色或者银染与荧光检测结果进行比对，检测有差异的条带，并由此推断探针与靶蛋白的结合效率。
若报告基团来自用于富集靶蛋白的报告分子，则可利用可与该报告分子特异性结合的分子富集靶蛋白，然后运用定量蛋白质组学和质谱技术联用的方法快速鉴定差异蛋白。
可仅利用其报告基团来自用于示踪靶蛋白的报告分子的探针分子进行检测，或仅利用其报告基团来自用于富集靶蛋白的报告分子进行检测。在优选的实施方案中，先利用其报告基团来自用于示踪靶蛋白的报告分子的探针分子进行检测，快速鉴定差异蛋白的存在；然后再利用其报告基团来自用于富集靶蛋白的报告分子进行检测，对差异蛋白进行定量和定性分析。
通常，可通过与竞争对照实验结果和/或空白对照实验的结果进行对比，可确定实验的差异蛋白，即在竞争对照实验和/或空白对照实验以及本实验中表现出差异的蛋白。通常，竞争对照实验中使用底物与探针分子处理含有靶蛋白质的混合物，而空白对照不使用所述底物与所述探针分子处理所述含有靶蛋白质的混合物。例如，具体到定量蛋白质组学上，通过比较同一蛋白质同一肽段在竞争对照实验结果和/或空白对照实验结果间的比值来发现有明显差异的蛋白，并由此推测出可能的功能蛋白，无差异或差异很小的蛋白可以认为是蛋白质组学中的背景。
联用定量蛋白质组学和质谱技术进行鉴定可包括样品前处理、利用超高分辨质谱进行数据采集和对数据结果进行分析。样品前处理通常包括富集蛋白的酶解、肽段标记和脱盐。对数据结果进行分析可包括通过对比竞争对照实验结果和/或空白对照实验结果，结合生物信息学分析确定目标功能蛋白。样品前处理可采用常规的方法实施。另外，可利用选自非标定量法(label-free)、串联质谱标签标记法(tmt)、同重同位素标签标记法(itraq)、细胞培养稳定同位素标记(silac)、质谱多反应监测mrm(mrmhr)和顺序采集所有的理论质谱(swath)的方法进行蛋白定量，优选采用tmt法。例如，在富集获得蛋白与探针分子的复合物之后，进行后续的清洗、酶切等处理，得到靶标蛋白的相应肽段。肽段可由tmt试剂对赖氨酸和肽段的n端进行修饰，然后可利用超高分辨质谱进行数据采集和分析。
在某些实施方案中，本发明方法还可包括表达该差异蛋白质，进行相应的亲和性实验，以确认该差异蛋白质为待鉴定的功能蛋白。
通常情况下，在实施本发明上述步骤之前，可先采用常规的方法获得待测的蛋白混合物，并验证该蛋白混合物中是否含有感兴趣的功能蛋白。例如，可采用常规的提取技术从动物细胞、植物细胞或微生物细胞中提取得到蛋白质混合物，然后在该蛋白质混合物中加入感兴趣的功能蛋白的底物，验证该底物是否被该蛋白质混合物作用，例如结合、催化合成或水解成相应产物等，从而确定该蛋白混合物中是否含有感兴趣的功能蛋白。可利用本领域周知的技术进行该验证，这些技术包括但不限于高效液相色谱法(hplc)、高效液相色谱与质谱联用法(lc-ms)、气相色谱法(gc)、气相色谱与质谱联用法(gc-ms)、核磁共振法(nmr)和高效液相色谱与核磁共振联用法(lc-nmr)中的一种或多种。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各实施方案中的各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，在此不一一累述。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。
实验例1：探针分子1的合成
1、实验材料和试剂
化合物1-1根据参考文献的方法(angewandtechemieinternationaledition，2013，52(33):8551-8556.)在本实验室合成；化学合成使用的试剂分别从sigma-aldrich、tci或aladdin购买而得。
2、探针分子1的合成
探针分子1的合成路线如下：
干燥的烧瓶中加入甜菊醇(30mg，0.1mmol)，k2co3(27mg，0.2mmol)，抽换氮气，加入2ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，3-(丁-3-炔基)-3-(2-碘乙基)-3h-双吖丙啶(1-1)(33mg，0.13mmol)溶于1mln，n-二甲基甲酰胺，冰浴下加入反应，升温至70℃，反应6hr，薄层层析(tlc)检测，分别用10％hcl，饱和食盐水洗后用无水硫酸钠干燥，通过柱层析分离得到分子探针1(白色固体，34mg，92％收率)。
hr-esims：实测值439.2949[m+h]+(计算值：439.2882[c27h38n2o3+h])。
1hnmr(500mhz，cdcl3)δ4.98(s，1h)，4.82(s，1h)，3.90(d，2h)，2.11(m，7h)，1.85，1.84，1.80(m，18h)，1.31(m，2h)，1.22(s，3h)，1.05(m，4h)0.85(s，3h)。
13cnmr(125mhz，cdcl3)δ177.24，156.11，102.92，82.50，80.24，69.36，58.73，56.94，53.75，47.42，47.01，43.82，41.66，41.34，40.67，39.33，39.23，37.99，32.23，32.15，28.78，26.32，21.93，20.44，19.07，15.52，13.28。
分子探针1的1hnmr谱图如图2所示，13cnmr如图3所示，hplc纯度分析如图4所示，质谱分析如图5所示。
实验例2：提取有活性的甜叶菊植物蛋白
1、实验材料和试剂
甜叶菊(steviarebaudiana)采集自中国山东省济宁市。deae柱料购自aogma。
植物细胞提取液：50mmhepes(ph7.8)，150mm氯化钠，5mm氯化镁，1mm乙二胺四乙酸，10mm二硫苏糖醇，1g抗坏血酸钠，10g交联聚乙烯吡咯烷酮，5g聚乙烯吡咯烷酮。
2、有活性的甜叶菊植物蛋白的提取
使用液氮研磨的方法将新鲜的甜叶菊叶片和茎组织研碎，按每1g茎和叶片组织加入2ml添加了蛋白酶抑制剂的预冷的植物细胞裂解液，冰上孵育充分溶解甜叶菊蛋白后，使用硫酸铵梯度盐析，得到蛋白沉淀，再使用预冷的蛋白溶解液复溶沉淀的蛋白，透析脱盐后，使用deae填料按不同氯化钠(nacl)浓度层析分离复溶的蛋白，得到的有活性的甜叶菊蛋白组分，得到的蛋白可以立即使用，也可以分装后冻存在-80℃。
实验例3：验证甜叶菊蛋白催化活性
1、实验材料和试剂
甜菊醇由本实验室合成，产物标准品和试剂购自sigma，tci、国药和源叶。
2、甜叶菊蛋白催化活性的验证
取实施例2制备得到的蛋白液300μl，加入1mm甜菊醇，5mm尿苷二磷酸葡糖(udpg)，30℃反应4hr，正丁醇萃取，旋干，甲醇复溶，lc-ms分析，甜菊醇单甙(steviolmonoside)、甜菊醇双甙(steviolbioside)，甜菊醇甙(stevioside)，莱鲍迪甙a(rebaudiosidea)均有生成。
进行凝胶电泳，染色。图6显示了提取的甜叶菊蛋白电泳后银染显色分析。切下50kd附近大小的胶块胶内酶切后，进行蛋白质谱分析。图8显示了提取的甜叶菊蛋白电泳后的蛋白质谱分析。图7则显示该甜叶菊蛋白的催化活性测试结果。
实验例4：链霉亲和素树脂联合分子探针1从甜叶菊裂解液中捕获糖基转移酶蛋白
1、材料和试剂
链霉亲和素树脂：streptavidinsepharosehp(amersham/ge)。
结合缓冲液：50mmhepes，5mm氯化镁，1mm乙二胺四乙酸，2mm二硫苏糖醇，ph8.0。
生物素叠氮(biotin-n3)、羧基四甲基罗丹明叠氮(tamra-n3)：invitrogen，thermofisherscientific。
胰蛋白酶：trypsingold，massspectrometrygrade(promega)。
tmt试剂盒：tmt2-plexisobaricmasstaggingkit,thermofisherscientific。
脱盐柱：milliporeziptippipettetips，merk。
2、靶标捕获
使用实施例3验证得到的有生物活性的甜叶菊蛋白提取液，分别加入实施例1制备得到的分子探针1作为正对照组，加入了甜菊醇与分子探针1作为竞争对照组，不加入分子探针1作为空白对照组进行孵育；孵育完成后，360纳米波长的紫外光下照射20分钟。
探针分子与靶标蛋白结合完成后，分成两个组分，利用点击化学反应分别添加报告基团：生物素叠氮(biotin-n3)或者羧基四甲基罗丹明叠氮(tamra-n3)，在37℃反应2小时。
报告基团接上的为羧基四甲基罗丹明(tamra)的组分，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完毕后在荧光检测器下检测探针分子标记靶标蛋白的情况，并使用考马斯亮蓝染色或者银染与荧光检测结果进行比对。
报告基团接上的为生物素的组分，通过与固相载体(streptavidinsapharose)进行特异性结合而实现靶标蛋白的富集。生物素与链霉亲和素树脂的结合时间为2小时。洗去链霉亲和素树脂上未结合的蛋白，并对链霉亲和素树脂上结合的蛋白进行还原烷基化后，加入5μg胰蛋白酶进行酶切，37℃过夜。
酶切过夜的样品用0.22μm滤膜过滤后冻干，复溶于100mm的三乙基碳酸氢铵中，正对照组的样品加入tmt2-127试剂，竞争对照组和/或空白对照组加入tmt-2-126试剂，25℃反应2小时；加入5％羟胺，反应15分钟，冻干样品，复溶于含有5％乙腈的水中，脱盐柱除去多余的盐，样品冻干后由液质联用分析仪进行检测。
3、蛋白质谱对探针分子结合的蛋白进行识别
tmt试剂标记过的样品使用orbitrapfusionlumostribridproteomicmassspectrometer(thermoscientific)液质联用分析仪进行lc-ms/ms检测，并使用分析软件proteomediscovererv2.1(thermoscientific)进行数据分析，数据库使用pubmed上已经公布的甜叶菊蛋白质序列，fdr设置为1％，precursor-ionmasstolerance设置为10ppm，fragment-ionmasstolerance设置为0.02da，正对照组的样品设置肽段标记值为127，争对照组和/或空白对照组设置肽段标记值为126，127肽段除以126肽段的比值，即为同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值，依据该比值，结合生物信息分析，对检测到的蛋白进行定量和定性的分析。
4、靶标蛋白的确认
通过比对经亲和富集的蛋白与竞争对照的差异，发现分子探针1能够结合大部分已知的甜叶菊转醣酶蛋白。下表1显示了提取的甜叶菊蛋白与探针分子结合后的定量蛋白质组学分析。
表1
实验例5：靶标蛋白的验证
体外重组表达探针1钓取的甜叶菊转醣酶蛋白ugt85c2，并进行亲和性验证。
1.材料和试剂：
pcr产物纯化试剂盒、小量胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自axygen；dna引物由上海生工合成；限制性内切酶和核酸分子量标准generulertm1kbdnaladderplus购自fermentas，dl5000核酸分子量标准购自东盛；fast-pfudna聚合酶购自transgen；t4dnaligase及dntp等pcr试剂购自takara。
2.合成甜叶菊cdna
2.1甜叶菊总rna的提取与检测
剪下甜叶菊叶片100mg，液氮中将组织研磨成粉末，液氮挥发后加1mltrizol-x-100，用移液器吹吸5-8次，室温静置5分钟；用等体积氯仿抽提2次，7500×g离心15分钟；上清液加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置30分钟，4℃10000×g离心10分钟；沉淀加入1ml75％乙醇进行清洗，4℃10000×g离心10分钟；沉淀室温干燥10分钟后溶于25μldepc处理的水中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，用eppendorf核酸定量仪测定a260、a280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。
2.2反转录合成cdna
采用takara公司提供的primescript反转录试剂盒，合成甜叶菊mrna第一条互补链。
2.3ugt85c2的基因的克隆
从ncbi中搜索甜叶菊糖基转移酶基因相关的核苷酸序列和est序列，通过比对分析，利用vectornti软件设计一对扩增引物ugt85c2-for(seqidno:3))和ugt85c2-rev(seqidno:4)。以甜叶菊的cdna为模板扩增ugt85c2基因，扩增结果于1％琼脂糖凝胶电泳检测。利用axygen公司的agarosegelfragmentrecoverykitver.2.0纯化pcr产物，然后克隆至pmd19-t载体，筛选阳性克隆提取的质粒测序，获得ugt85c2相关基因序列(seqidno:1)。
2.4原核表达载体的构建
以t载体中的ugt85c2基因为模板，利用引物ugt85c2-for和ugt85c2-rev进行pcr扩增，扩增产物经电泳检测和纯化后，用限制性内切酶于37℃酶切2小时，采用胶回收试剂盒纯化酶切产物，同时利用限制性内切酶在37℃酶切质粒载体pet-21a(+)2小时，利用试剂盒回收。将回收的两个片段混合，在dna连接酶作用下连接12小时，连接产物利用cacl2法转化大肠杆菌bl21(de3)，在氨苄霉素抗性平板上进行筛选，挑取阳性克隆子。
2.5诱导表达纯化
将质粒pet21a-ugt85c2转入大肠杆菌bl21(de3)，涂氨苄霉素抗性平板，待长出后挑取单克隆菌落，接入1000ml的摇瓶中，接种量5‰，37℃培养至od600大致为0.45，加入诱导剂iptg0.3mm，16℃培养20小时。收菌，高压破碎仪破菌后离心，上清使用ni-ntaagarose亲和层析纯化，得到蛋白ugt85c2(seqidno:2)。
2.6ugt85c2体外标记
取iptg诱导前和诱导后继续生长20小时的大肠杆菌菌体各500mg，加入2ml菌体裂解液(pbs，ph7.4)破碎离心，收集上清蛋白液，取50μl蛋白液加入探针分子1，孵育30分钟后，紫外光照20分钟，利用点击化学反应接入荧光基团tamra[tamra-n3，cuso4，thbta，navc]，37℃反应2小时后，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后在荧光扫描仪下检测探针分子1的标记情况，荧光扫描后的电泳胶用考马斯蓝染色检测。结果如图9所示。
取纯化得到的ugt85c2蛋白，配制成0.1mg/ml的浓度，各取50μl蛋白液加入探针分子1，浓度分别为0.01μm、0.1μm、1μm、10μm和100μm，孵育30分钟后，紫外光照20分钟，利用点击化学接入报告基团tamra-n3[tamra-n3，cuso4，thbta，navc]，37℃反应2小时后，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后在荧光扫描仪下检测探针分子1的标记情况，荧光扫描后的电泳胶用考马斯蓝染色检测。结果如图10所示。
取纯化得到的ugt85c2蛋白，配制成0.1mg/ml的浓度，取50μl蛋白液加入探针分子1，浓度为10μm，作为正对照，另取50μl蛋白液加入探针分子1，浓度为10μm同时加入甜菊醇100μm，作为竞争对照，另外取50μl蛋白液不加入探针分子1，作为空白对照。孵育30分钟后，365nm紫外光照20分钟，利用点击化学接入报告基团tamra-n3[tamra-n3，cuso4，thbta，navc]，37℃反应2小时后，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后在荧光扫描仪下检测探针分子1的标记情况，荧光扫描后的电泳胶用考马斯蓝染色检测。结果如图10所示。
取诱导后继续生长20小时的大肠杆菌菌体500mg，加入2ml菌体裂解液(pbs，ph7.4)破碎离心，收集上清蛋白液取50μl蛋白液加入探针分子1，浓度为10μm，作为正对照，另取50μl蛋白液加入探针分子1，浓度为10μm同时加入甜菊醇100μm，作为竞争对照，另外取50μl蛋白液不加入探针分子1，作为空白对照。孵育30分钟后，紫外光照20分钟，利用点击化学接入报告基团tamra-n3[tamra-n3，cuso4，thbta，navc]，37℃反应2小时后，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后在荧光扫描仪下检测探针分子1的标记情况，荧光扫描后的电泳胶用考马斯蓝染色检测。结果如图10所示。
体外重组蛋白与探针分子的结合验证实验结果可以证明探针分子1具有标记其催化合成途径上的蛋白的能力。
实施例6：下式所示的生物素-甜菊醇探针分子的合成
按如下反应流程制备生物素-甜菊醇探针分子：
甜菊醇(100mg,0.33mmol)溶于5ml二氯甲烷，加入10μln,n-二甲基甲酰胺。草酰氯(400μl,5mmol)溶于1ml二氯甲烷中，缓慢滴加入反应。室温反应2小时，旋干。
干燥的烧瓶中加入溶解在2ml二氯甲烷的底物2-1(50mg，0.15mmol)，加入20μln,n-二异丙基乙胺，底物2-2(100mg，0.4mmol)。反应升至室温，过夜反应。加入10ml水淬灭反应，二氯甲烷萃取水相，有机相用饱和食盐水萃取后用无水硫酸钠干燥，旋干。硅胶纯化dcm/meoh1.7％-5％。
干燥的烧瓶中加入溶解在2ml二氯甲烷的底物2-3(55mg，0.1mmol)，加入2ml三氟乙酸，反应2小时，旋干。
干燥的烧瓶中加入溶解在2mln,n-二甲基甲酰胺的底物2-4(20mg，0.05mmol)，加入生物素(20mg,0.08mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(24mg，0.12mmol)，1-羟基苯并三唑(16mg，0.12mmol)，n,n-二异丙基乙胺(35μl，0.2mmol)，室温反应过夜，硅胶纯化。
纯化得到的产物的1hnmr、13cnmr和hr-esims如下：
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.92(s,1h),6.70(s,1h),6.10(s,1h),4.97(s,1h),4.79(s,1h),4.50(brs,1h),4.33(brs,1h),3.60(m,16h),3.14(m,1h),2.89(dd,1h),2.87(s,1h),2.74(t,2h),2.09(m,3h),1.85(m,4h),1.69(m,4h),1.64(s,3h),1.44(m,8h),1.14(s,3h),1.06(m,1h),0.90(s,3h),0.84(m,1h)；
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ176.87,173.44,163.85,157.46,102.83,80.26,70.10,70.08,69.91,69.65,61.81,60.19,57.47,55.57,54.66,54.19,48.72,48.43,43.69,41.68,40.18,39.51,39.08,38.12,38.01,37.30,35.87,30.08,28.19,28.08,25.59,22.12,20.34,19.83,19.14,13.44；
hr-esims：实测值675.4210[m+h]+，计算值：675.4155[c36h58n4o6s+h]。
实施例7：ugt85c2蛋白与两种甜菊醇探针的体外亲和结合比较
取纯化得到的ugt85c2蛋白，配制成0.1mg/ml的浓度，各取50μl蛋白液加入探针分子生物素-甜菊醇探针分子和实施例1制备得到的探针分子1(浓度各为10μm)，0℃孵育30分钟。与生物素-甜菊醇孵育的ugt85c2蛋白直接与链霉亲和素树脂结合。与探针分子1孵育的ugt85c2蛋白用紫外光照20分钟，利用点击化学接入报告基团生物素叠氮〔生物素叠氮，cuso4，thbta，navc〕，37℃反应2小时后与链霉亲和素树脂结合。生物素与链霉亲和素树脂的结合时间为2小时。洗去链霉亲和素树脂上未结合的蛋白，用1mm的甜菊醇洗脱结合在链霉亲和素树脂上的蛋白，洗脱液浓缩后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉和0.1％吐温20的tbs溶液在室温下封闭1小时，再与抗生物素或抗his的抗体在4℃孵育过夜，之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育2小时，免疫印迹用化学发光试剂检测，通过荧光扫描仪检测成像。
结果如图11所示。使用探针分子1能够检出ugt85c2蛋白，而利用亲和作用的生物素-甜菊醇未能检出ugt85c2蛋白。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>植物次生代谢产物生物合成途径中相关酶类的解析方法
<130>168068
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1446
<212>dna
<213>甜叶菊（steviarebaudiana）
<400>1
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