一种用于鉴定米象和玉米象的试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及生物检测鉴定技术领域，尤其涉及一种用于鉴定米象和玉米象的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

米象和玉米象同属鞘翅目象甲科米象属，是该属中分布最广、为害最严重、经济意义最大的两种仓储害虫。现有研究表明，米象和玉米象在我国各地均有分布，其幼虫和成虫可危害谷物、豆类、油料等多种农产品与其加工产品，大量发生时能造成严重的经济损失，是毁灭性储粮害虫。近年来研究发现，米象和玉米象在生活习性上有很多区别。例如，玉米象的耐寒力显著强于米象，表明低温杀虫技术对米象的防治效果好，而对玉米象无效。此外，在生殖力、野外生存能力、对药剂抗性遗传等方面也存在着显著差异。因此，快速识别害虫种类，对于合理选择防治措施具有重要的意义。然而，米象和玉米象的外部形态非常相似，目前还没有公认的外部形态特征对两种害虫进行分类鉴定，只能依靠解剖成虫的外生殖器进行鉴别，这就对鉴定人员的技术提出了较高的要求，不能满足快速、准确鉴定的需求。

目前未见有关米象和玉米象的分子鉴定方法研究，而通过传统的分子检测方法，利用DNA测序技术虽然能够准确鉴定，但一方面测序成本比较高，另一方面测序过程所需时间周期比较长，达不到快速的要求。因此目前需要尽快建立一套快速灵敏的鉴定检测方法，以便对米象和玉米象作出准确、快速的鉴定，从而为害虫防治技术的合理选择提供依据，确保我国储粮安全。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供了一种用于鉴定米象和玉米象的试剂盒，所述试剂盒包括以下两对引物对中的至少一对：引物对1由序列1和序列2两条单链脱氧核糖核酸组成，序列1：5’-TTGATTACTTCCACCCTCC-3’，序列2：5’-AAGTATAGTGATTGCTCCT-3’；引物对2由序列3和序列4两条单链脱氧核糖核酸组成,序列3：5’-TTATTAGTTACGAAAGAGGA-3’序列4：5’-ATCAAAGGGATGTAGGAGAA-3’；所述序列1由20个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成，序列3由19个核苷酸组成；序列4由19个核苷酸组成。

进一步地，所述试剂盒还包括聚合酶链式反应缓冲液、脱氧核糖核酸聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸。

进一步地，所述引物对1和引物对2中的两条单链脱氧核糖核酸的摩尔数相等。

进一步地，所述引物对1特异于米象，引物对2特异于玉米象。

本发明还提供了一种试剂盒应用于鉴定米象和玉米象的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)提取米象或玉米象的基因组脱氧核糖核酸，将提取的脱氧核糖核酸置于-20℃下，备用；

(2)以步骤(1)中备用的脱氧核糖核酸为模板，分别对引物对1和引物对2进行聚合酶链式反应，即可得到相应的聚合酶链式反应产物；

(3)将步骤(2)中的聚合酶链式反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统中观察并成像分析。

进一步地，聚合酶链式反应体系由2.5μL的浓度为2.5mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μL的浓度为2.5U/μL的脱氧核糖核酸聚合酶，1μL的基因组脱氧核糖核酸，16.8μL的双蒸水，1μL的浓度为10μmol/L的引物对，2.5μL含镁离子的缓冲液组成。

进一步地，聚合酶链式反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；引物对1在60℃的条件下退火30s，引物对2在58℃的条件下退火30s；72℃延伸1min；将此过程进行35个循环。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

(1)本发明中针对米象和玉米象这2种外观特征极为相似的常见害虫，基于mtDNA COⅠ基因序列分别设计了特异引物，可直接鉴别以上2种仓储害虫，从而为害虫防治技术的合理选择提供依据，确保我国储粮安全。

(2)本发明中的鉴定方法与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态的鉴定；该技术通用性强，对仪器设备要求不高，因此在实际工作中容易推广和应用；

(3)本发明中的鉴定方法在实际鉴定过程中，耗时较短，便于操作，并且该方法还具有灵敏度高等优点，因此，该鉴定方法适合在生物鉴定领域推广和应用。

附图说明

以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明中引物对1扩增米象和玉米象的电泳检测图谱；

图2是本发明中引物对2扩增米象和玉米象的电泳检测图谱。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明通过在GenBank中搜索查询米象和玉米象的mtDNA COⅠ序列，用DNAMAN软件对目标种的mtDNA COⅠ序列进行比对分析，根据引物设计原则及注意事项，利用Primer Premier5.0引物设计软件在米象和玉米象的mtDNA COⅠ序列内设计特异引物，并用Oligo6.71软件对引物进行评价和修改，检查引物Tm值、GC％、错配、二聚体和发夹结构等，以避免存在引物内或引物间二聚体以及引物错配位点的出现等，最终设计出2对引物，如表1所示。

表1本研究设计的2对引物序列

实施例1

一种用于鉴定米象和玉米象的试剂盒，所述试剂盒包括由序列1和序列2两条单链DNA组成的引物对1，序列1：5’-TTGATTACTTCCACCCTCC-3’，序列2：5’-AAGTATAGTGATTGCTCCT-3’；所述序列1由20个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成。

在本实施例中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸。

在本实施例中，所述引物对1特异于米象，。

本发明还提供了一种试剂盒应用于鉴定米象和玉米象的方法，具体步骤如下：

(1)分别提取米象和玉米象的基因组DNA后，将提取的米象和玉米象的基因组DNA置于-20℃下，备用；

(2)分别以步骤(1)中备用的米象和玉米象的基因组DNA为模板，对引物对1进行PCR扩增，即可得到相应的PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)中的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统中观察并成像分析。

在本实施例中，PCR反应体系由2.5μL的浓度为2.5mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μL浓度为2.5U/μL的DNA聚合酶，1μL的基因组DNA，16.8μL的双蒸水，1μL的浓度为10μmol/L的引物对，2.5μL含镁离子的缓冲液组成。

在本实施例中，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；将此过程进行35个循环。

实施例2

一种用于鉴定米象和玉米象的试剂盒，所述试剂盒包括由序列3和序列4两条单链DNA组成引物对2，序列3：5’-TTATTAGTTACGAAAGAGGA-3’序列4：5’-ATCAAAGGGATGTAGGAGAA-3’；序列3由19个核苷酸组成；序列4由19个核苷酸组成。

在本实施例中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸。

在本实施例中，引物对2特异于玉米象。

本发明还提供了一种试剂盒应用于鉴定米象和玉米象的方法，具体步骤如下：

(1)分别提取米象和玉米象的基因组DNA后，将提取的米象和玉米象的基因组DNA置于-20℃下，备用；

(2)分别以步骤(1)中备用的米象和玉米象的基因组DNA为模板，对引物对2进行PCR扩增，即可得到相应的PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)中的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统中观察并成像分析。

在本实施例中，PCR反应体系由2.5μL的浓度为2.5mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μL的浓度为2.5U/μL的DNA聚合酶，1μL的基因组DNA，16.8μL的双蒸水，1μL的浓度为10μmol/L的引物对，2.5μL含镁离子的缓冲液组成。

在本实施例中，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min；将此过程进行35个循环。

将实施例1中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，泳道1-3号为米象，4-6号为玉米象，7号为阴性对照(ddH₂O)，M为Marker DL 2000。引物对1得到322bp的PCR产物，而引物对2没有PCR产物，说明引物对1可用于特异鉴定米象。

将实施例2的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道1-3号为米象，4-6号为玉米象，7号为阴性对照(ddH2O)，M为Marker DL 2000。引物对2得到252bp的PCR产物，而引物对1没有PCR产物，说明引物对2可用于特异鉴定玉米象。

综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在本发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。