原发性纤毛运动障碍患者的LRRC6基因突变形式及其应用的制作方法

本发明涉及原发性纤毛运动障碍患者的LRRC6基因突变形式及其应用。

背景技术：

原发性纤毛运动障碍(primaryciliarydyskinesia，PCD)，属常染色体隐性遗传，是各种遗传性原发纤毛结构缺陷引起的纤毛功能异常，常见的是呼吸道纤毛功能异常，引起反复的呼吸道感染。原发性纤毛运动障碍包括纤毛不动综合征、Kartagener综合征、纤毛运动不良和原发性纤毛定向障碍等几种类型。由于纤毛结构和(或)功能异常引起一系列临床表现，包括慢性支气管炎、慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、支气管扩张和不孕。约50％的PCD患者合并有内脏转位，男性患者常出现生育能力下降。

与纤毛相关的蛋白有200多个，如果编码这些蛋白的基因缺陷，或者编码组装蛋白的基因突变，就可以导致纤毛结构和(或)功能的异常，从而引起PCD的相关症状。PCD临床罕见，发病率大约1/10000-1/20000，由于临床表现不典型，儿童PCD患者尤其是未合并有内脏转位的患者经常被延误诊断。

鼻刷或支气管粘膜活检电镜检查发现纤毛超微结构异常通常被认为是PCD诊断的“金标准”，最常见的是外动力臂(outer dynein arm，ODA)或内动力臂(inner dynein arm，IDA)缩短或缺失。但有报道28％的PCD患者纤毛超微结构正常，因而增加了PCD诊断的难度。

技术实现要素：

本发明的目的是提供原发性纤毛运动障碍患者的LRRC6基因突变形式及其应用。

本发明保护一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)：

(a1)LRRC6第1-179位氨基酸残基组成的蛋白质；

(a2)LRRC6第1-249位氨基酸残基组成的蛋白质。

LRRC6的全称为富含亮氨酸重复6(leucine rich repeat containing 6)。

LRRC6具体如序列表的序列1所示。

编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区为序列表的序列2第1-540位核苷酸的DNA分子；

(b2)编码区为序列表的序列2第1-750位核苷酸的DNA分子；

(b3)将序列表的序列2所示的DNA分子第538位核苷酸由C突变为T得到的DNA分子；

(b4)将序列表的序列2所示的DNA分子第749位核苷酸由G突变为A得到的DNA分子。

本发明还保护用于检测特异突变甲的物质和/或用于检测特异突变乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述特异突变甲为：人基因组中序列表的序列3所示DNA分子中的第109位核苷酸由C突变为T；所述特异突变乙为：人基因组中序列表的序列4所示DNA分子中的第96位核苷酸由G突变为A；

所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：

(c1)评价待测者患原发性纤毛运动障碍的风险性；

(c2)评价待测者或待测夫妻的后代患原发性纤毛运动障碍的风险性；

(c3)诊断或辅助诊断待测者是否为原发性纤毛运动障碍患者。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为评价待测者患原发性纤毛运动障碍的风险性。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(d1)和/或(d2)和/或(d3)的载体：(d1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高；(d2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高；(d3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为评价待测者的后代或待测夫妻的后代患原发性纤毛运动障碍的风险性。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(e1)和/或(e2)和/或(e3)和/或(e4)的载体：(e1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者的后代相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高；(e2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者的后代相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高；(e3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者的后代相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高；(e4)如果所述待测夫妻中的一位携带所述特异突变甲、另一位携带所述特异突变乙，待测夫妻的后代相对正常人患原发性纤毛运动障碍的风险性增高。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断待测者是否为原发性纤毛运动障碍患者。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(f1)和/或(f2)和/或(f3)的载体：(f1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者为或候选为原发性纤毛运动障碍患者；(f2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者为或候选为原发性纤毛运动障碍患者；(f3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者为或候选为原发性纤毛运动障碍患者。

所述正常人为两条染色体均携带序列表的序列1所示的LRRC6的编码基因的人。

所述序列表的序列1所示的LRRC6的编码基因具体如序列表的序列2所示。

所述序列表的序列1所示的LRRC6的编码基因具体如GENBANKACCESSION NO.NM_012472所示。

本发明对于原发性纤毛运动障碍患者的诊断具有重大应用价值。

附图说明

图1为辅助检查结果照片。

图2为辅助检查结果照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

基因组中，LRRC6基因的核苷酸序列见GENBANKACCESSION NO.NM_012472所示。

LRRC6基因编码的蛋白质，如序列表的序列1所示。

LRRC6基因的cDNA中的读码框如序列表的序列2所示。

基因组中，LRRC6基因的第5外显子的核苷酸序列如序列表的序列3所示，第6外显子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。

LRRC6的全称为富含亮氨酸重复6(leucine rich repeat containing 6)。

实施例、

一、患儿的相关信息

患儿的基本情况：男，6个月26天；因“反复咳喘2月”入院。

患儿病程：入院前2月，患儿无明显诱因出现咳喘，晨起明显，喉中有痰声，于当地医院抗感染治疗后好转；此后间断出现咳喘表现，病情反复，每次均予抗感染治疗后好转；患儿自发病以来神志清，精神反应可，纳食尚可，二便正常。

患儿家族情况：否认家族有哮喘病史，否认家族中类似疾病史。

入院查体结果：体温36.9℃，体重9kg，呼吸37次/min，脉搏130次/min，血压90/60mmHg；神志清楚，精神反应可，呼吸促，未见吸气性三凹；全身浅表淋巴结未触及肿大；双侧瞳孔等大等圆，结膜无充血，咽充血，双侧扁桃体无肿大；两肺呼吸音粗，可及痰鸣及喘鸣；心律齐，心音有力，无杂音；腹软，无压痛及反跳痛，未触及包块，肝脾未及；四肢肌张力肌力正常，神经查体未见明显异常。

辅助检查结果：血气分析、血常规、血电解质、肝肾功能、大便常规、体液、细胞免疫功能正常；胸部增强CT显示：双侧副鼻窦内软组织密度影，两肺支气管血管束增多、毛糙，两肺透亮度欠均匀，左上肺透亮度略高，双肺散在磨玻璃影，左上肺内带脊柱左缘可见片状致密影，左上肺可见索条影，左肺中间段支气管起始处稍细，局部软组织影稍著，右肺可见少许淡片影，右肺为2叶结构，左肺为3叶结构；气管居中，隆突形态未见异常，降主动脉位于脊柱右缘，心尖向右，腔静脉后软组织增厚且轻度强化，前上纵隔见小儿胸腺影，心影不大；全内脏转位(见图1和图2；图1显示，双肺散在磨玻璃影，左上肺内带脊柱左缘可见片状致密影，右肺可见少许淡片影；图2显示，降主动脉位于脊柱右缘，心尖向右,全内脏转位)；肺功能检测显示：阻塞性通气功能障碍；腹部B超：全内脏转位，肝内回声稍强，余腹部实质脏器未见异常，数枚系膜淋巴结，大者1.2×0.5cm；支气管镜检查显示：气管、支气管内膜炎症，广泛粘稠分泌物附着，支气管树转位；支气管黏膜病理：(支气管)极少许支气管黏膜，黏膜上皮部分脱落，上皮下可见少许黏膜及纤维组织，组织略挤压；免疫组化：AE1/AE3(+),CD34(+)。

治疗过程：入院后予红霉素抗感染治疗，雾化对症，行1次电子支气管镜灌洗及其他对症支持治疗，13天好转出院。

二、患儿的全基因组测序

1、提取患儿的基因组DNA。

2、取步骤1得到的基因组DNA，进行二代测序。

患儿的LRRC6基因发生了复杂杂合突变，一条染色体中的LRRC6基因发生了538C＞T突变(编码LRRC6第180位氨基酸残基的密码子由“cga”突变为了终止密码子“tga”；造成LRRC6第179位氨基酸残基以后的氨基酸残基均缺失，形成第1至179位氨基酸残基组成的截短体)、其它位置均未发生突变，另一条染色体中的LRRC6基因发生了749G＞A突变(编码LRRC6第250位氨基酸残基的密码子由“tgg”突变为了终止密码子“tag”；造成LRRC6第249位氨基酸残基以后的氨基酸残基均缺失，形成第1至249位氨基酸残基组成的截短体)、其它位置均未发生突变。

其它与纤毛相关的蛋白的编码基因均未发生任何突变。

538C＞T突变即基因组中LRRC6基因的第5外显子的第109位核苷酸由C突变为了T。

749G＞A突变即基因组中LRRC6基因的第6外显子的第96位核苷酸由G突变为了A。

综合步骤一的病症和步骤二的测序结果，该患儿确诊为原发性纤毛运动障碍患者。

三、患儿父母的全基因组测序

1、分别提取患儿的父亲和母亲的基因组DNA。

2、取步骤1得到的基因组DNA，进行二代测序。

结果表明：患儿父亲的一条染色体上的LRRC6基因发生了538C＞T突变，另一条染色体上的LRRC6基因未发生突变，其它与纤毛相关的蛋白的编码基因均未发生任何突变；患儿母亲的一条染色体上的LRRC6基因发生了749G＞A突变，另一条染色体上的LRRC6基因未发生突变，其它与纤毛相关的蛋白的编码基因均未发生任何突变；患儿获得了父亲LRRC6基因发生了538C＞T突变的染色体和母亲LRRC6基因发生了749G＞A突变的染色体，因此发生了原发性纤毛运动障碍。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京儿童医院

<120> 原发性纤毛运动障碍患者的LRRC6基因突变形式及其应用

<130> GNCYX170323

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Gly Trp Ile Thr Glu Asp Leu Ile Arg Arg Asn Ala Glu His Asn

1 5 10 15

Asp Cys Val Ile Phe Ser Leu Glu Glu Leu Ser Leu His Gln Gln Glu

20 25 30

Ile Glu Arg Leu Glu His Ile Asp Lys Trp Cys Arg Asp Leu Lys Ile

35 40 45

Leu Tyr Leu Gln Asn Asn Leu Ile Gly Lys Ile Glu Asn Val Ser Lys

50 55 60

Leu Lys Lys Leu Glu Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Asn Asn Ile Glu Lys

65 70 75 80

Ile Glu Asn Leu Glu Gly Cys Glu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Leu Thr

85 90 95

Val Asn Phe Ile Gly Glu Leu Ser Ser Ile Lys Asn Leu Gln His Asn

100 105 110

Ile His Leu Lys Glu Leu Phe Leu Met Gly Asn Pro Cys Ala Ser Phe

115 120 125

Asp His Tyr Arg Glu Phe Val Val Ala Thr Leu Pro Gln Leu Lys Trp

130 135 140

Leu Asp Gly Lys Glu Ile Glu Pro Ser Glu Arg Ile Lys Ala Leu Gln

145 150 155 160

Asp Tyr Ser Val Ile Glu Pro Gln Ile Arg Glu Gln Glu Lys Asp His

165 170 175

Cys Leu Lys Arg Ala Lys Leu Lys Glu Glu Ala Gln Arg Lys His Gln

180 185 190

Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asp Lys Arg Ser Asn Ala Gly Phe Asp Gly

195 200 205

Arg Trp Tyr Thr Asp Ile Asn Ala Thr Leu Ser Ser Leu Glu Ser Lys

210 215 220

Asp His Leu Gln Ala Pro Asp Thr Glu Glu His Asn Thr Lys Lys Leu

225 230 235 240

Asp Asn Ser Glu Asp Asp Leu Glu Phe Trp Asn Lys Pro Cys Leu Phe

245 250 255

Thr Pro Glu Ser Arg Leu Glu Thr Leu Arg His Met Glu Lys Gln Arg

260 265 270

Lys Lys Gln Glu Lys Leu Ser Glu Lys Lys Lys Lys Val Lys Pro Pro

275 280 285

Arg Thr Leu Ile Thr Glu Asp Gly Lys Ala Leu Asn Val Asn Glu Pro

290 295 300

Lys Ile Asp Phe Ser Leu Lys Asp Asn Glu Lys Gln Ile Ile Leu Asp

305 310 315 320

Leu Ala Val Tyr Arg Tyr Met Asp Thr Ser Leu Ile Asp Val Asp Val

325 330 335

Gln Pro Thr Tyr Val Arg Val Met Ile Lys Gly Lys Pro Phe Gln Leu

340 345 350

Val Leu Pro Ala Glu Val Lys Pro Asp Ser Ser Ser Ala Lys Arg Ser

355 360 365

Gln Thr Thr Gly His Leu Val Ile Cys Met Pro Lys Val Gly Glu Val

370 375 380

Ile Thr Gly Gly Gln Arg Ala Phe Lys Ser Met Lys Thr Thr Ser Asp

385 390 395 400

Arg Ser Arg Glu Gln Thr Asn Thr Arg Ser Lys His Met Glu Lys Leu

405 410 415

Glu Val Asp Pro Ser Lys His Ser Phe Pro Asp Val Thr Asn Ile Val

420 425 430

Gln Glu Lys Lys His Thr Pro Arg Arg Arg Pro Glu Pro Lys Ile Ile

435 440 445

Pro Ser Glu Glu Asp Pro Thr Phe Glu Asp Asn Pro Glu Val Pro Pro

450 455 460

Leu Ile

465

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

atgggctgga tcacagaaga tcttattaga cggaatgctg aacacaacga ctgtgtcatt 60

ttttccctgg aggaactctc gttgcatcag caagaaatag aaagactaga acacattgat 120

aaatggtgcc gggatttaaa aattctctat cttcaaaata atcttattgg gaaaattgaa 180

aatgttagca aactcaagaa acttgaatat ttgaatttag ctttaaacaa cattgaaaaa 240

atagaaaact tggaaggatg tgaagagctg gcaaaacttg acctgactgt gaatttcatt 300

ggagagctga gcagcattaa aaacttgcag cacaatatcc atctgaagga gctctttctc 360

atggggaacc catgtgcttc ctttgaccac tatagggagt tcgtggtagc aactcttcca 420

caattaaagt ggttggatgg taaagaaata gagccttcag aaaggattaa ggcattgcag 480

gactattcag taattgaacc acaaatcaga gagcaggaaa aagatcactg tcttaaacga 540

gccaaactca aggaagaggc tcagaggaaa caccaagaag aggataaaaa tgaagacaag 600

agaagtaacg caggctttga tggacgttgg tacacagaca tcaatgctac tctttcctct 660

ttagagagca aagaccacct acaggcacca gacacagagg aacacaacac aaagaaatta 720

gacaacagtg aagatgactt ggaattctgg aataagccct gtttgtttac tcctgaatca 780

agattggaaa ctcttagaca catggaaaaa caacggaaga aacaggaaaa attaagtgaa 840

aaaaagaaga aagtgaaacc acccaggact ttgatcactg aagatgggaa agccctaaat 900

gtgaatgagc ccaaaattga cttctctttg aaagataacg aaaagcagat catcctggac 960

cttgctgtct ataggtatat ggatacctct ttaatcgatg ttgatgtgca accaacttac 1020

gtgcgagtaa tgatcaaagg aaagccattt cagcttgtcc ttcctgcaga agtgaaaccc 1080

gatagtagtt ctgctaaaag atctcagaca acgggtcatt tggtcatctg catgcccaag 1140

gtaggagaag taatcacagg tggtcagcga gcattcaaat ctatgaaaac tacctcggac 1200

aggagcagag aacaaacaaa tacaagaagc aagcacatgg agaaactaga agtagaccct 1260

agcaagcact cattccctga tgtgactaac atagttcaag agaaaaaaca cacacccaga 1320

agacgacctg aacccaaaat tataccaagt gaggaagacc caacctttga agacaaccct 1380

gaagtgcctc cgctgatttg a 1401

<210> 3

<211> 224

<212> DNA

<213> 人

<400> 3

tggttggatg gtaaagaaat agagccttca gaaaggatta aggcattgca ggactattca 60

gtaattgaac cacaaatcag agagcaggaa aaagatcact gtcttaaacg agccaaactc 120

aaggaagagg ctcagaggaa acaccaagaa gaggataaaa atgaagacaa gagaagtaac 180

gcaggctttg atggacgttg gtacacagac atcaatgcta ctct 224

<210> 4

<211> 183

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

ttcctcttta gagagcaaag accacctaca ggcaccagac acagaggaac acaacacaaa 60

gaaattagac aacagtgaag atgacttgga attctggaat aagccctgtt tgtttactcc 120

tgaatcaaga ttggaaactc ttagacacat ggaaaaacaa cggaagaaac aggaaaaatt 180

aag 183