一种组氨酸荧光探针及其制备方法和应用与流程
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种组氨酸荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
组氨酸是20种基本氨基酸之一，是一种重要氨基酸，由于其侧链的pKa为6.0(Nelson DL等,Germany:Springer 2009)，使得其侧链在中性环境下可以从非质子化的状态变成质子化的状态。根据这一特性，组氨酸残基在许多细胞内的反应中既可以作为质子受体也可以作为质子供体(Rebek J等，Struct Chem 1:129–131 1990；Polgár L.等，Cell Mol Life Sci 62:2161–2172 2005)。并且，它含有高反应活性的咪唑环，在生物体系中金属离子的传输等方面起着重要的作用(Creighton TE.等，The encyclopedia of molecular biology 1999；Kusakari Y等，Curr Eye Res[J]1997,:600-604.)。所以，生物体液中组氨酸的选择性测定对生物化学的研究具有重要意义。
有研究表明组氨酸含量的异常通常与一些疾病相关，包括慢性肾病(Watanabe M等，American Journal of Clinical Nutrition 2008,87(6):1860-1866)、急性肝衰竭(Rama Rao KV等，The American Journal of Pathology 2010,176(3):1400-1408)、类风湿关节炎(Gerber DA等，The Journal of Clinical Investigation 1975,55(6):1164-1173)、晚期肝硬化(The American Journal of Medicine 73(2):A29)、艾滋病(Jones AL等，Immunol Cell Biol 2005,83(2):106-118)、哮喘(Morgan WT等，Biochemical Medicine and Metabolic Biology 1986,36(2):210-213)及疟疾(Sullivan DJ等，Science 1996,271(5246):219-222)等。研究表明(Watanabe M等，American Journal of Clinical Nutrition 2008,87(6):1860-1866)，慢性肾病患者血浆中的组氨酸含量很低；相应的研究(Rama Rao KV等，The American Journal of Pathology 2010,176(3):1400-1408)表明，组氨酸是一种已知的抑制线粒体内谷氨酰胺转运的物质，阻断了急性肝衰竭病人中的氧化应激、线粒体通透性变化以及脑水肿的形成。另外，若血清或尿液中的组氨酸水平较高，可引起代谢紊乱如组氨酸血症。
正是由于组氨酸具有上述重要的作用，因此组氨酸含量的检测也尤为重要。组氨酸的常用检测方法是毛细管电泳法(Li X-t等，Chem Res Chin Univ 2013,29(3):434-438；Meng J等，The Analyst 2010,135(7):1592-1599)、高效液相色谱法(Tateda N等，Analytical sciences:the international journal of the Japan Society for Analytical Chemistry 2001,17(6):775-778；Wadud S等，Journal of chromatography B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2002,767(2):369-374)、紫外可见光分光光度法(Hortala MA等，J Am Chem Soc 2003,125(1):20-21；Pu F等，Anal Chem 2010,82(19):8211-8216；Du J等，Chemical communications(Cambridge,England)2013,49(47):5399-5401；Engeser M等，Chemical Communications 1999,(13):1191-1192)和荧光光谱测定法(Engeser M等，Chemical Communications 1999,(13):1191-1192)，但是在活细胞研究中这些检测方法存在很大的缺陷，需要经过耗时的样品处理过程：细胞破碎、分离提取纯化等，不能对完整细胞进行实时准确的检测。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种在细胞内外实时定位、高通量、定量检测组氨酸的组氨酸荧光探针。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种组氨酸荧光探针，包括对组氨酸敏感的多肽B和荧光蛋白A；所述的荧光蛋白A插入到多肽B中，将B分为多肽B1和多肽B2两个部分，形成B1-A-B2式的探针结构；
所述多肽B为HBP及其突变体。
优选的，所述HBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述的荧光蛋白A为黄色荧光蛋白cpYFP，所述黄色荧光蛋白cpYFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述荧光蛋白A替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.10所示绿色荧光蛋白cpGFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11所示蓝色荧光蛋白cpBFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示青色荧光蛋白cpTFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示橘黄色荧光蛋白cpmOrange、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示苹果红荧光蛋白cpmApple、氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.13所示红色荧光蛋白cpmKate和氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示红色荧光蛋白mcherry中的一种。
优选的，所述荧光蛋白A插入多肽B形成B1-A-B2式的探针结构，所述插入位点为多肽B的89/90，89/91，89/92，89/93，90/91，90/92，90/93，91/92，91/93，92/93，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，185/192，185/193，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，186/192，186/193，187/188，187/189，187/190，187/191，187/192，187/193，188/189，188/190，188/191，188/192，188/193，189/190，189/191，189/192，189/193，190/191，190/192，190/193，191/192，191/193或192/193位点。
优选的，所述荧光蛋白A插入多肽B的插入位点为90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191，190/193时，对应的B1-A-B2式的探针结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.14～22所示。
本发明还提供了编码所述B1-A-B2式探针的核苷酸序列。
本发明还提供了上述组氨酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1)将编码所述B1-A-B2式探针的核苷酸序列与pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体；2)将大肠杆菌重组表达载体转移到宿主细胞中；3)培养宿主细胞并分离组氨酸荧光探针。
本发明还提供了包括上述组氨酸荧光探针的组氨酸检测试剂盒。
本发明还提供了上述组氨酸荧光探针在组氨酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的组氨酸荧光探针，包括对组氨酸敏感的多肽B和荧光蛋白A；所述的荧光蛋白A插入到多肽B中，将B分为多肽B1和多肽B2两个部分，形成B1-A-B2式的探针结构；本发明提供的B1-A-B2式组氨酸荧光探针，易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测组氨酸。省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本申请所提供的的组氨酸荧光探针对组氨酸的最高相应达到6倍以上，可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、细胞外膜、细胞内膜、高尔基体和溶酶体等亚细胞结构中对细胞进行定位检测；并且可以进行高通量的化合物筛选。
附图说明
图1为实施例1中组氨酸荧光探针的SDS-PAGE分析图；
图2为黄色荧光蛋白cpYFP在HBP不同插入位点形成的组氨酸荧光探针对组氨酸响应变化图；
图3为蓝色荧光蛋白cpBFP在HBP不同插入位点形成的组氨酸荧光探针对组氨酸响应变化图；
图4为苹果红荧光蛋白cpmApple在HBP不同插入位点形成的组氨酸荧光探针对组氨酸响应变化图；
图5为组氨酸荧光探针的荧光光谱性质图；
图6为不同组氨酸荧光探针对不同浓度组氨酸的滴定曲线；
图7为组氨酸荧光探针在哺乳动物细胞中亚细胞器定位分析图；
图8为组氨酸荧光探针Hisensor D对不同亚细胞器中的组氨酸定量分析图；
图9为组氨酸荧光探针Hisensor D对不同亚细胞器内组氨酸跨膜运输动态分析图；
图10为在活细胞水平基于组氨酸荧光探针Hisensor D进行高通量化合物筛选分析图；
图11为组氨酸荧光探针Hisensor D对培养基以及血液中的组氨酸定量分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种组氨酸荧光探针，包括对组氨酸敏感的多肽B和对组氨酸进行表现的荧光蛋白A；所述的荧光蛋白A插入到多肽B中，将B分为B1和B2两个部分，形成B1-A-B2式的探针结构；所述多肽B和组氨酸相互作用导致荧光蛋白A荧光信号变强；所述多肽B为HBP及其突变体。
在本发明中所述HBP蛋白来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，或来源于沙门氏菌和HBP蛋白有90％以上同源性的HBP蛋白，含有周质结合蛋白所具有的典型的两个α/β球状结构域通过铰链连接的结构，可以结合组氨酸。HBP蛋白可以感应周质中组氨酸浓度的变化，在组氨酸浓度动态变化的过程中HBP蛋白的空间构象也会发生很大改变。HBP蛋白专一性的对生理浓度的组氨酸结合后产生的构象变化引起的荧光蛋白的构象变化，进而导致荧光蛋白的荧光发生改变，并借助不同组氨酸浓度下测定的荧光蛋白的荧光绘制标准曲线，进而检测并分析组氨酸的存在和/或水平。
在本发明中编码所述HBP蛋白的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.1所示，所述HBP蛋白的氨基酸序列优选的如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中所述的荧光蛋白A为能够显示荧光的蛋白，所述荧光蛋白A优选的为黄色荧光蛋白cpYFP，所述黄色荧光蛋白cpYFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中，所述黄色荧光蛋白cpYFP是将GFP的原始N端和C端通过一段柔性的短肽链连接，在原始GFP近生色团位置制造一个新的N端和C端，将原第145～238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1～144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过5～9个具有柔性的短肽链连接获得。在本发明中，近生色团位置优选为Y144和N145位氨基酸处；所述具有柔性的短肽链优选为VDGGSGGTG或GGSGG。
在本发明其他的具体实施方式中，所述荧光蛋白A还可以优选为氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.10所示绿色荧光蛋白cpGFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.11所示蓝色荧光蛋白cpBFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示青色荧光蛋白cpTFP、氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示橘黄色荧光蛋白cpmOrange、氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示苹果红荧光蛋白cpmApple、氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.13所示红色荧光蛋白cpmKate和氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示红色荧光蛋白mcherry中的一种。
绿色荧光蛋白GFP最初是从维多利亚发光水母(Aequorea Victoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由12条β-折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽(Ser65-Tyr66-Gly67)。当在氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光。
在本发明中,所述红色荧光蛋白cpmKate最初是从海洋中的珊瑚中提取的，野生的RFP是寡聚体蛋白不利于生物体的融合表达，随后在RFP的基础上进一步衍生出了不同颜色波段的红色荧光蛋白，其中最常用的是mcherry和mKate。
在本发明中，所述荧光蛋白A插入多肽B形成B1-A-B2式的探针结构，所述插入位点位于多肽B的柔性区域，所述的柔性区域是指蛋白质高级结构中存在的一些特定的如环状结构域等结构，这些结构域相比于蛋白质的其他高级结构具有更高的移动性和柔性，并且该区域可以在该蛋白质和配体结合后，空间结构构象发生动态变化。本发明中所述的柔性区域主要指HBP蛋白中的插入位点所在区域，如89-93和185-193区域。本发明所述插入位点位于HBP蛋白氨基酸序列的89/90，89/91，89/92，89/93，90/91，90/92，90/93，91/92，91/93，92/93，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，185/192，185/193，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，186/192，186/193，187/188，187/189，187/190，187/191，187/192，187/193，188/189，188/190，188/191，188/192，188/193，189/190，189/191，189/192，189/193，190/191，190/192，190/193，191/192，191/193或192/193位点；优选的为90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191或190/193。在本发明中，当插入位点优选为90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191或190/193时，对应的B1-A-B2式的探针结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.14～22所示。
本发明还提供了编码上述B1-A-B2式的探针的核苷酸序列。
本发明还提供了上述组氨酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1)将编码所述的B1-A-B2式探针的核苷酸序列与pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体；2)将大肠杆菌重组表达载体转到宿主细胞中；3)培养宿主细胞并分离组氨酸荧光探针。
在本发明中，所述编码B1-A-B2式探针核苷酸序列的合成采用PCR扩增法或人工合成的方法。采用PCR扩增法时，根据本发明中所述的核苷酸序列设计引物，以市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增获得。当核苷酸序列大于2500bp时，优选的进行2～6次PCR扩增，然后将各次扩增的片段按正确次序拼接在一起。本发明对所述的PCR扩增的程序和体系没有特殊限定，采用本领域常规的PCR扩增程序和体系即可。
在本发明中，优选的在B1-A-B2式探针核苷酸序列小于2500bp时，采用人工合成方法来合成。所述人工合成方法为本领域常规的DNA的人工合成方法，无其他特殊要求。具体的可通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得全长序列。
本发明在获得编码B1-A-B2式探针的核苷酸序列后，将编码所述的
B1-A-B2式探针的核苷酸序列与pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体。在本发明中，所述pRSETb载体采用市售的pRSETb载体即可，无其他特殊要求。在本发明实施例中，优选的采用BamHI和HindIII分别对编码所述的B1-A-B2式探针的核苷酸序列和pRSETb载体进行双酶切，然后将二者双酶切后的产物连接得到大肠杆菌重组表达载体。本发明对所述双酶切和连接的具体步骤和参数没有特殊限定，采用本领域常规的步骤和参数即可。本发明在获得大肠杆菌重组表达载体后，将大肠杆菌重组表达载体转到宿主细胞中，本发明所述的宿主细胞是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。具体的可为大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO、COS、HEK293、HeLa细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，在本发明实施例中所述宿主细胞优选的为大肠杆菌JM109-DE3菌株。
本发明所述的转入宿主细胞的方法为本领域常规的方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，所述方法优选的为CaCl2法或MgCl2法处理，所用的步骤为本领域公知。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明在将大肠杆菌表达载体转入宿主细胞后，对转入大肠杆菌表达载体的宿主细胞进行扩增表达培养，分离得到组氨酸荧光探针。所述宿主细胞扩增表达培养采用常规的方法即可。根据所用的宿主细胞种类，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在本发明中，所述的组氨酸荧光蛋白在细胞内、细胞膜上表达、或分泌到细胞外。本发明对分离所述组氨酸荧光蛋白的方法没有特殊限定，采用本领域常规的融合蛋白的分离方法即可。具体的在本发明中可用常规的复性处理、盐析方法、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析方法及这些方法的结合。优选的采用带His-tag标签的亲和层析法进行。
本发明还提供了所述组氨酸荧光探针在组氨酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用。在本发明中，所述的组氨酸荧光探针优选的与细胞不同部位的信号肽连接，转入到细胞中，通过检测细胞中荧光信号的强弱，进行组氨酸的实时定位；通过组氨酸标准滴加曲线进行相应组氨酸的定量检测。本发明中所述的组氨酸标准滴加曲线是根据组氨酸荧光探针在不同浓度组氨酸的情况下的荧光信号绘制而成。本发明所述组氨酸荧光探针直接转入细胞中，在组氨酸实时定位和定量检测过程中，不需要耗时的样品处理过程，更加准确。本发明组氨酸荧光探针在进行高通量化合物筛选时，将不同的化合物添加到细胞培养液中，测定组氨酸含量的变化，从而筛选出对组氨酸含量变化有影响的化合物。在本发明中所述的组氨酸荧光探针在组氨酸实时定位、定量检测以及高通量化合物筛选中的应用，均是非诊断和治疗目的，不涉及疾病的诊断和治疗。
下面结合实施例对本发明提供的组氨酸荧光探针进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料和试剂
实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；费雷谢尼等的《动物细胞培养:基本技术指南》(第五版)，章静波，徐存拴等译；J.S.博尼费斯农，M.达索等的《精编细胞生物学实验指南》，章静波等译。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例中所用的基于pRSETb-cpYFP，pRSETb-HBP质粒由华东理工大学蛋白质实验室构建，pRSETb质粒载体购自Invitrogen公司。所有用于PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，primeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BamHI、BglII、HindIII、NdeI、XhoI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4 PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。转染试剂Lip2000Kit购于Invitrogen公司。组氨酸等均购自Sigma公司。除非特别声明，无机盐类等化学试剂均购自sigma-aldrich公司。HEPES盐，氨苄青霉素(Amp)和嘌呤霉素购自Ameresco公司；96孔检测黑板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。
实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株Mach1购自Invitrogen公司。镍柱亲和层析柱和脱盐柱填料均来自GE healthcare公司。
实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，超声破碎仪(宁波新芝公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)，荧光分光光度计(美国Varian公司)，CO2恒温细胞培养箱(SANYO)，倒置荧光显微镜(日本尼康公司)。
II.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法
(一)聚合酶链式反应(PCR)：
1.目的片段扩增PCR：
该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。所述PCR扩增的反应体系如表1所示，扩增程序如表2所示。
表1.PCR扩增反应体系
表2.PCR扩增程序2.长片段(>2500bp)扩增PCR：
本发明中使用的长片段扩增，主要是反向PCR扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。长片段扩增PCR反应体系如表3所示，扩增程序如表4或表5所示。
表3.长片段(>2500bp)扩增PCR反应体系
表4.长片段(>2500bp)扩增PCR扩增程序
表5.长片段(>2500bp)扩增PCR扩增程序
(二)核酸内切酶酶切反应：
对质粒载体进行双酶切的体系如表6所示，其中n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量。
表6质粒载体双酶切体系
(三)DNA片段5’端磷酸化反应
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。磷酸化反应体系如表7所示，其中T4 PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。
表7.磷酸化反应体系
(四)目的片段和载体的连接反应
不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了三种连接方法
1.平末端短片段和线性化载体的平末端连接
该方法的原理是PCR获得的平末端产物在T4 PNK作用下对DNA片段的5’末端进行磷酸化反应后，与线性化的载体在PEG4000和T4 DNA连接酶的作用下连接获得重组质粒。同源重组连接体系如表8所示。
表8.同源重组连接体系
2.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接
通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。连接反应体系如表9所示。
表9.连接反应体系
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。
3.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应
将5’端磷酸化的DNA片段通过自身环化连接反应将线性化载体的3’端和5’端连接反应得到重组质粒。自身环化连接反应体系如表10所示。
表10.自身环化连接反应体系
(五)感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备：
1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养3至5h，直到OD600达到0.5。
3.冰浴预冷细胞2h。
4. 4℃4000rpm离心10min。
5.弃上清，用5ml预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。
6.冰浴45min。
7. 4℃4000rpm离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。
8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。
重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)
储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL 80％甘油、1mL 10×CaCl2(1M)、1mL 10×MgCl2(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O转化：
1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。
4.加入500μl LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。
5.将菌液4000rpm离心3min，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
(六)蛋白质的表达，纯化和荧光检测
1.将pRSETb为基础的组氨酸探针质粒转化到JM109(DE3)中，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250ml锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD＝0.4～0.8，加入1/1000(v/v)的IPTG(1M)，18℃诱导表达24～36h。
2.诱导表达完成后，4000rpm，30min离心收菌，加入50mM的磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎至菌体澄清。9600rpm，4℃离心20min。
3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白，镍柱亲和层析后的蛋白再通过自装的脱盐柱获得溶解在20mM MOPS缓冲液(pH 7.4)或者磷酸盐缓冲液PBS中的蛋白。
4.纯化的HBP突变蛋白经过SDS-PAGE鉴定后，使用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)或者磷酸盐缓冲液PBS稀释探针成终浓度为5～10μM的蛋白溶液。用测定缓冲液(20mM MOPS，pH 7.4)或者磷酸盐缓冲液PBS将组氨酸配制成终浓度为1M的储液。
取100μl 5μM的蛋白溶液，37℃温育5min，分别加入组氨酸混匀后至终浓度为100mM，利用多功能荧光酶标仪测定蛋白在340nm下的光吸收。
取100μl 1μM的荧光探针溶液，37℃温育5min，加入组氨酸滴定，测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。
取100μl 1μM的荧光探针溶液，37℃温育5min，加入组氨酸，测定探针蛋白的吸收光谱和荧光光谱。对样品的吸收光谱和荧光光谱的测定是通过分光光度计和荧光分光光度计完成。
(七)哺乳动物细胞荧光检测
1.将pCDNA3.1+为基础的组氨酸探针质粒通过转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)转染到HeLa中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。待外源基因充分表达24～36h后进行荧光检测。
2.诱导表达完成后，将贴壁的HeLa细胞，用PBS冲洗三次，置于HBSS溶液中分别进行荧光显微镜和酶标仪检测。
实施例1
pRSETb-HBP质粒的构建
通过PCR扩增大肠杆菌基因中的HisJ基因，PCR产物凝胶电泳后回收后用BamHI和HindIII酶切，同时对pRSETb载体进行相同的双酶切。用T4 DNAligase连接后，连接产物转化MachI，转化的MachI涂布于LB平板(氨苄青霉素100ug/mL)，置于37℃培养过夜。将生长MachI转化子进行质粒抽提后，进行PCR鉴定。阳性质粒经过测序正确后进行后续的质粒构建。
pRSETb-HBP质粒的构建引物序列如Seq ID NO.39～40所示。
pRSETb-HBP-cpFP荧光探针不同插入位点的质粒构建和检测
本实施例中，我们以pRSETb-HBP为基础质粒根据HBP晶体结构选择了89/90，89/91，89/92，89/93，90/91，90/92，90/93，91/92，91/93，92/93，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，185/192，185/193，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，186/192，186/193，187/188，187/189，187/190，187/191，187/192，187/193，188/189，188/190，188/191，188/192，188/193，189/190，189/191，189/192，189/193，190/191，190/192，190/193，191/192，191/193，192/193。其中检测对组氨酸响应超过3倍的有90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191，190/193位(如SEQ ID NO 14-22所示)或者其家族蛋白的对应氨基酸位点。
利用PCR产生cpYFP的DNA片段，对该DNA片段使用5’末端的加磷操作后灭活，同时通过反向PCR扩增产生含有不同断裂位点的pRSETb-HBP线性化载体，将线性化的pRSETb-HBP和5’末端磷酸化的cpYFP片段在PEG4000和T4 DNA ligase的作用下连接产生重组质粒，将这些平板在Kodak多功能活体成像系统，挑取在FITC通道激发下有黄色荧光的克隆，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。
利用PCR产生cpYFP的DNA片段所用引物如Seq ID NO.41～42所示。
反向扩增产生线性化载体所用引物如Seq ID NO.23～38所示。
经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，并纯化蛋白质，通过SDS-PAGE电泳大小在60KDa附件。该大小符合pRSETb-HBP-cpYFP表达出的含His-tag纯化标签的HBP-cpYFP融合蛋白质的大小。结果如图1所示。
将纯化的HBP-cpYFP融合蛋白质进行组氨酸响应筛选，将含有100mM组氨酸的融合荧光蛋白质的检测信号除以无组氨酸的融合荧光蛋白质的检测信号。
结果图如2所示，检测结果显示对组氨酸响应超过3倍的有90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191，190/193。186/191，197/191，189/191，190/191的420nm激发528nm发射处荧光强度随着组氨酸浓度升高。189/190，189/191，189/193，190/191，190/193的485nm激发528nm发射处荧光强度随着组氨酸浓度降低。其中189/191，190/191两个样在420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度随着组氨酸浓度表现出相反的变成。
实施例2
按照实施例1中的方法将cpYFP替换为蓝色荧光蛋白cpBFP，融合到HBP中构建组氨酸蓝色荧光蛋白荧光探针。结果如图3所示，荧光检测结果显示对组氨酸响应超过3倍的有90/91，186/191，187/191，189/190，189/191，190/191，190/193。
实施例3
按照实施例1中的方法将cpYFP替换为苹果红荧光蛋白cpmApple，融合到HBP中构建组氨酸红色荧光蛋白荧光探针，结果如图4所示，荧光检测结果显示对组氨酸响应超过3倍的有90/91，91/92，186/191，187/191，189/190，189/191，189/193，190/191，190/192，190/193，191/193。
实施例1～3的结果说明HBP的linker区89～93和185～193都适合融合cpFP荧光蛋白获得对组氨酸响应的融合荧光蛋白组氨酸探针。
实施例4.HBP-cpYFP荧光探针性质检测
将纯化的HBP-cpYFP，分别进行0mM和100mM组氨酸处理10min后，使用荧光分光光度计进行荧光谱的检测。对激发谱的测定：固定发射在530nm处，进行380～510nm区间的激发谱检测；对发射谱的测定，固定激发在485nm处，进行510～550nm区间的发射谱进行检测。HBP-cpYFP荧光探针的光谱曲线如图5所示，以上结果说明HBP-cpYFP荧光蛋白的荧光光谱性质与cpYFP荧光蛋白荧光光谱性质类似(Nagai,T.等，Proc Natl Acad Sci U S A.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)。
选取其中的对组氨酸检测范围在0.1μM～1mM的四个探针Hisensor A，Hisensor B，Hisensor C和Hisensor D进行浓度梯度(0～1mM)的组氨酸检测。分别对纯化的HBP-cpYFP进行处理10min后，检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值的变化，这4种组氨酸荧光探针的Kd(结合常数)依次为4μM、13μM、3.4μM和22μM，变化幅度依次为4.2倍、4.5倍、3.4倍和6.2倍，结果如图6所示。这样可以针对样品中组氨酸含量水平，选择更加合适的组氨酸探针进行定量检测。
实施例5.Hisensor D荧光探针在不同亚细胞器的定位和亚细胞器内组氨酸定量分析
本实施例中，我们使用不同的定位信号肽与Hisensor D进行融合，将Hisensor D组氨酸荧光蛋白探针定位到不同的细胞器中。
将融合不同定位信号肽的Hisensor D基因的质粒转染HeLa细胞36hours后，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中使用倒置荧光显微镜进行FITC通道下进行荧光检测。我们发现Hisensor D通过与不同的特异定位信号肽融合能够定位到包括细胞浆，细胞核，线粒体，细胞膜内膜，细胞膜外膜，高尔基体，溶酶体亚细胞器中。结果如图7所示，不同的亚细胞结构中都显示有荧光，并且荧光的分布和强度各不相同。
本实施例中，我们使用组氨酸探针Hisensor D分别对细胞胞浆和线粒体内的组氨酸进行定量分析。
将经过转染Hisensor D基因的HeLa细胞，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中使用酶标仪检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值。通过Hisensor D的组氨酸标准滴加曲线(图6)进行相应的组氨酸浓度测定，结果如图8所示，发现细胞胞浆中组氨酸含量在150μM左右，线粒体中的组氨酸含量在50μM左右。
实施例6.组氨酸荧光探针Hisensor D对不同亚细胞器内组氨酸跨膜运输进行动态分析
本实施例中，我们使用组氨酸探针Hisensor D分别对细胞胞浆和线粒体内的组氨酸进行动态检测分析。
将经过转染Hisensor D基因的HeLa细胞，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中(无组氨酸)处理2hours后，分别在第2min时滴加组氨酸。使用酶标仪记录420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值变化，结果如图9所示，发现细胞外组氨酸能够快速进入到细胞内，大约在4min内细胞内的组氨酸含量到达生理最高值。
实施例7.活细胞水平基于组氨酸荧光探针Hisensor D进行高通量化合物筛选
本实施例中，我们使用组氨酸探针Hisensor D胞浆表达的HeLa细胞进行了高通量化合物筛选。
将经过转染Hisensor D基因的HeLa细胞，使用PBS冲洗之后，置于HBSS溶液中(无组氨酸)处理1hours后，使用10μM的化合物进行处理1hours。分别滴加组氨酸。使用酶标仪记录420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值变化。以未用任何化合物处理的样品为标准。结果如图10所示，我们发现使用500种化合物处理的细胞中，绝大部分的化合物对组氨酸进入细胞影响极小。有9种化合物能够提高细胞对组氨酸的摄取能力，另外有6中化合物能够明显降低细胞对组氨酸的摄取。
实施例8.Hisensor D荧光探针对DMEM培养基和血液上清的组氨酸进行定量检测
在本实施中，还分别使用纯化的Hisensor D荧光蛋白质对细胞DMEM培养基和小鼠的血液上清中组氨酸进行了分析。
将Hisensor D荧光蛋白质与稀释处理的DMEM培养基和血液上清进行混合处理10min后，使用酶标仪检测420nm激发528nm发射处荧光强度和485nm激发528nm发射处荧光强度比值。结果如图11所示，发现DMEM培养基中组氨酸含量在790μM左右，小鼠血液中的组氨酸含量在80μM左右。
由以上实施例可知，本发明提供的组氨酸荧光探针，蛋白分子量相对较小且易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、定量检测组氨酸；并且能够进行高通量的化合物筛选。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种组氨酸荧光探针及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atggcgattc cgcaaaacat ccgcatcggt accgacccga cctatgcgcc atttgaatca 60
aaaaattcac aaggcgaact ggttggcttc gatatcgatc tggcaaagga attatgcaaa 120
cgcatcaata cgcaatgtac gtttgtcgaa aatccgctgg atgcgttaat cccgtcctta 180
aaagcgaaga agattgacgc catcatgtca tcgctttcca ttacggaaaa acgtcagcaa 240
gaaatagcct tcaccgacaa actgtacgct gccgattctc gtttggtggt ggcgaaaaat 300
tctgacattc agccgacagt cgagtcgctg aaaggcaaac gggtaggcgt attgcagggc 360
accacccagg agacgttcgg taatgaacat tgggcaccaa aaggcattga aatcgtctcg 420
tatcaggggc aggacaacat ttattctgac ctgactgccg gacgtattga tgccgcgttc 480
caggatgagg tcgctgccag cgaaggtttc ctcaaacaac ctgtcggtaa agattacaaa 540
ttcggtggcc cgtctgttaa agatgaaaaa ctgtttggcg tagggaccgg catgggcctg 600
cgtaaagaag ataacgaact gcgcgaagca ctgaacaaag cctttgccga aatgcgcgct 660
gacggtactt acgagaaatt agcgaaaaag tacttcgatt ttgatgttta tggtggctaa 720
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Ser Arg Leu Val
85 90 95
Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr Val Glu Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Gln Glu Thr Phe Gly Asn
115 120 125
Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Tyr Gln Gly Gln
130 135 140
Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly Arg Ile Asp Ala Ala Phe
145 150 155 160
Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Val Gly
165 170 175
Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val Lys Asp Glu Lys Leu Phe
180 185 190
Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys Glu Asp Asn Glu Leu Arg
195 200 205
Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met Arg Ala Asp Gly Thr Tyr
210 215 220
Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe Asp Val Tyr Gly Gly
225 230 235
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
20 25 30
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
35 40 45
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser
50 55 60
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
65 70 75 80
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
100 105 110
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
115 120 125
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
130 135 140
Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
145 150 155 160
Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr
165 170 175
Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
180 185 190
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
210 215 220
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
225 230 235 240
His Lys Leu Glu Tyr Asn
245
<210> 4
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asn Val Tyr Ile Lys Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn
1 5 10 15
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr
20 25 30
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
35 40 45
Asp Asn His Tyr Leu Ser Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn
50 55 60
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser
85 90 95
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln
100 105 110
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
115 120 125
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
130 135 140
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
145 150 155 160
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
165 170 175
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu
180 185 190
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
195 200 205
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
210 215 220
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Asn
<210> 5
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asn Val Tyr Ile Lys Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn
1 5 10 15
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Gly Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr
20 25 30
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
35 40 45
Asp Asn His Tyr Leu Ser Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn
50 55 60
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser
85 90 95
Glu Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro
100 105 110
Ile Gln Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys
130 135 140
Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val
145 150 155 160
Thr Thr Leu Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His
165 170 175
Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Gly Gly Tyr Ile
180 185 190
Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg
195 200 205
Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu
210 215 220
Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu
225 230 235 240
Glu Tyr Asn
<210> 6
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn
1 5 10 15
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp
20 25 30
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
35 40 45
Asp Asn His Tyr Leu Ser Ile Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn
50 55 60
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser
85 90 95
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
100 105 110
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
115 120 125
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
130 135 140
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
145 150 155 160
Phe Ser Tyr Gly Val Met Val Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
165 170 175
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
180 185 190
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
195 200 205
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
210 215 220
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Asn
<210> 7
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Val Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Ser Glu Ile
1 5 10 15
Lys Lys Gly Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val
20 25 30
Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr
35 40 45
Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr
50 55 60
Ile Val Glu Gln Cys Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Pro Thr Gly Gly
65 70 75 80
Arg Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys
85 90 95
Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
100 105 110
Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
115 120 125
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Ala Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys
130 135 140
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
145 150 155 160
Gln Phe Thr Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Ile Lys His Pro Ala Asp Ile
165 170 175
Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg
180 185 190
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ile Ile His Val Asn Gln Asp Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Asp Gly Val Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
210 215 220
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
225 230 235 240
Glu Ala
<210> 8
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Val Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Glu Ile
1 5 10 15
Lys Lys Gly Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val
20 25 30
Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr
35 40 45
Ile Val Asp Ile Lys Leu Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr
50 55 60
Ile Val Glu Gln Cys Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly
65 70 75 80
Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys
85 90 95
Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
100 105 110
Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
115 120 125
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Ala Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys
130 135 140
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
145 150 155 160
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Ile Lys His Pro Ala Asp Ile
165 170 175
Pro Asp Tyr Phe Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg
180 185 190
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ile Ile His Val Asn Gln Asp Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Asp Gly Val Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
210 215 220
Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
225 230 235 240
Glu Ala
<210> 9
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Gly Gly Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly
1 5 10 15
Val Tyr Tyr Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys
20 25 30
Glu Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp
35 40 45
Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn Gly Gly Thr Gly Gly Ser
50 55 60
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys
65 70 75 80
Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser
85 90 95
Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys
100 105 110
Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr
115 120 125
Ser Phe Met Tyr Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile
130 135 140
Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
145 150 155 160
Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr
165 170 175
Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val
180 185 190
Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly
210 215 220
Arg Ser Asp Met Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys
225 230 235 240
Asn Leu Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys
245 250
<210> 10
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Val Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Asn Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
50 55 60
Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Tyr Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Met Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Gly Asp Lys Pro Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Lys Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Arg Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 11
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Ser His Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Ser His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 12
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 13
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Ser Glu Leu Ile Thr Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu
1 5 10 15
Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly
20 25 30
Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr
50 55 60
Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe
65 70 75 80
Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr
85 90 95
Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp
100 105 110
Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser
115 120 125
Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Met Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ala Asp Met
145 150 155 160
Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Leu Lys Thr
165 170 175
Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val
180 185 190
Tyr Tyr Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu
195 200 205
Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu
210 215 220
Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn
225 230
<210> 14
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Tyr Asn Ser Asp Asn
85 90 95
Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe
100 105 110
Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His
115 120 125
Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
130 135 140
Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu
145 150 155 160
Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
165 170 175
Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
195 200 205
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
210 215 220
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile
225 230 235 240
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
245 250 255
Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
260 265 270
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
275 280 285
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
290 295 300
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
305 310 315 320
Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
325 330 335
Asn Asp Ser Arg Leu Val Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr
340 345 350
Val Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr
355 360 365
Gln Glu Thr Phe Gly Asn Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile
370 375 380
Val Ser Tyr Gln Gly Gln Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly
385 390 395 400
Arg Ile Asp Ala Ala Phe Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe
405 410 415
Leu Lys Gln Pro Val Gly Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val
420 425 430
Lys Asp Glu Lys Leu Phe Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys
435 440 445
Glu Asp Asn Glu Leu Arg Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met
450 455 460
Arg Ala Asp Gly Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe
465 470 475 480
Asp Val Tyr Gly Gly
485
<210> 15
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Tyr Asn Ser Asp
85 90 95
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn
100 105 110
Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
115 120 125
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
130 135 140
Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn
145 150 155 160
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
165 170 175
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly Gly Ser Gly
180 185 190
Gly Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
195 200 205
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser
210 215 220
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu
225 230 235 240
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
245 250 255
Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met
260 265 270
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
275 280 285
Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala
290 295 300
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
305 310 315 320
Gly Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
325 330 335
Tyr Asn Ser Arg Leu Val Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr
340 345 350
Val Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr
355 360 365
Gln Glu Thr Phe Gly Asn Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile
370 375 380
Val Ser Tyr Gln Gly Gln Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly
385 390 395 400
Arg Ile Asp Ala Ala Phe Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe
405 410 415
Leu Lys Gln Pro Val Gly Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val
420 425 430
Lys Asp Glu Lys Leu Phe Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys
435 440 445
Glu Asp Asn Glu Leu Arg Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met
450 455 460
Arg Ala Asp Gly Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe
465 470 475 480
Asp Val Tyr Gly Gly
485
<210> 16
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Ser Arg Leu Val
85 90 95
Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr Val Glu Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Gln Glu Thr Phe Gly Asn
115 120 125
Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Tyr Gln Gly Gln
130 135 140
Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly Arg Ile Asp Ala Ala Phe
145 150 155 160
Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Val Gly
165 170 175
Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val Lys Tyr Asn Ser Asp Asn
180 185 190
Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe
195 200 205
Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His
210 215 220
Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
225 230 235 240
Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu
245 250 255
Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
260 265 270
Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
290 295 300
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
305 310 315 320
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile
325 330 335
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
340 345 350
Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
355 360 365
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
370 375 380
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
385 390 395 400
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
405 410 415
Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
420 425 430
Asn Phe Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys Glu Asp Asn Glu
435 440 445
Leu Arg Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met Arg Ala Asp Gly
450 455 460
Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe Asp Val Tyr Gly
465 470 475 480
Gly
<210> 17
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Ser Arg Leu Val
85 90 95
Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr Val Glu Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Gln Glu Thr Phe Gly Asn
115 120 125
Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Tyr Gln Gly Gln
130 135 140
Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly Arg Ile Asp Ala Ala Phe
145 150 155 160
Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Val Gly
165 170 175
Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val Lys Asp Tyr Asn Ser Asp
180 185 190
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn
195 200 205
Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
210 215 220
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
225 230 235 240
Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn
245 250 255
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
260 265 270
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
290 295 300
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser
305 310 315 320
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu
325 330 335
Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
340 345 350
Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met
355 360 365
Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
370 375 380
Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala
385 390 395 400
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
405 410 415
Gly Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
420 425 430
Tyr Asn Phe Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys Glu Asp Asn
435 440 445
Glu Leu Arg Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met Arg Ala Asp
450 455 460
Gly Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe Asp Val Tyr
465 470 475 480
Gly Gly
<210> 18
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Ser Arg Leu Val
85 90 95
Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr Val Glu Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Gln Glu Thr Phe Gly Asn
115 120 125
Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Tyr Gln Gly Gln
130 135 140
Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly Arg Ile Asp Ala Ala Phe
145 150 155 160
Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Val Gly
165 170 175
Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val Lys Asp Glu Lys Tyr Asn
180 185 190
Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
195 200 205
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
210 215 220
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
225 230 235 240
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp
245 250 255
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
260 265 270
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Val Asp Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Thr Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val
290 295 300
Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser
305 310 315 320
Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu
325 330 335
Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu
340 345 350
Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp
355 360 365
His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr
370 375 380
Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu
405 410 415
Leu Lys Gly Ile Gly Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys
420 425 430
Leu Glu Tyr Asn Leu Phe Gly Val Gly Thr Gly Met Gly Leu Arg Lys
435 440 445
Glu Asp Asn Glu Leu Arg Glu Ala Leu Asn Lys Ala Phe Ala Glu Met
450 455 460
Arg Ala Asp Gly Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Phe Asp Phe
465 470 475 480
Asp Val Tyr Gly Gly
485
<210> 19
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Met Ala Ile Pro Gln Asn Ile Arg Ile Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Phe Glu Ser Lys Asn Ser Gln Gly Glu Leu Val Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Asp Leu Ala Lys Glu Leu Cys Lys Arg Ile Asn Thr Gln Cys Thr Phe
35 40 45
Val Glu Asn Pro Leu Asp Ala Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ala Lys Lys
50 55 60
Ile Asp Ala Ile Met Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Lys Arg Gln Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ala Phe Thr Asp Lys Leu Tyr Ala Ala Asp Ser Arg Leu Val
85 90 95
Val Ala Lys Asn Ser Asp Ile Gln Pro Thr Val Glu Ser Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Arg Val Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Gln Glu Thr Phe Gly Asn
115 120 125
Glu His Trp Ala Pro Lys Gly Ile Glu Ile Val Ser Tyr Gln Gly Gln
130 135 140
Asp Asn Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Ala Gly Arg Ile Asp Ala Ala Phe
145 150 155 160
Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Glu Gly Phe Leu Lys Gln Pro Val Gly
165 170 175
Lys Asp Tyr Lys Phe Gly Gly Pro Ser Val Lys Asp Glu Lys Tyr Asn
180 185 190
Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
195 200 205
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
210 215 220
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
225 230 235 240
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp
245 250 255
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
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Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser
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Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp
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Gly Gly
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165 170 175
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gttgtactcc agcttgtg 18
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