与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽。

背景技术：

噬菌体展示技术(phage display technology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。

肿瘤细胞的靶向治疗一直是研究的热点。Hela细胞，是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞，诞生至2016年已经整整65年了。在医学界，Hela细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。这种细胞是现有来自人体的组织培养中最早的分离细胞，在世界各地的研究室继续培养，广泛应用于各种研究。它们在体外容易增殖形成上皮性的细胞排列。因此，探索能与Hela细胞特异性结合的多肽分子作为蛋白标签对于探索肿瘤细胞的靶向治疗具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽。

为此，本发明提供的技术方案为：

与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽，该多肽为耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子提供蛋白标签的功能性，该多肽选自如下氨基酸序列中的一种：SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

优选的是，所述的与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽中，该多肽选自如下氨基酸序列中的一种：SEQ ID NOs：1、2、3、4和5。

一种核酸，其编码所述多肽，其中，该核酸选自如下碱基序列中的一种：SEQ ID NOs：11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。

优选的是，所述的核酸，其中，该核酸选自如下碱基序列中的一种：SEQ ID NOs：11、12、13、14和15。

所述的多肽或所述的核酸在与耐药宫颈癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合和肿瘤靶向治疗中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的上述多肽，对肿瘤细胞的亲和力强，可作为靶向特定肿瘤细胞的靶向头基；而且，该多条多肽与肿瘤细胞结合会抑制细胞膜的某些功能，可能会抑制肿瘤细胞的生长或者与化疗药物有协同作用，具有治疗效果，可用于肿瘤的靶向治疗。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中第一轮淘选中噬菌体滴度测定时的噬菌体培养的照相；

图2为本发明其中一个实施例中第二轮淘选中噬菌体滴度测定时的噬菌体培养的照相；

图3为本发明其中一个实施例中第三轮淘选中噬菌体滴度测定时的噬菌体培养的照相；

图4为Elisa检测第三轮筛选噬菌体克隆与HeLa耐药细胞的亲和力检测结果(OD值)；

图5为Elisa检测第三轮筛选噬菌体克隆与HeLa耐药细胞的相对亲和力(P/N值)；

图6为DNA提取结果检测示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1～6所示，本发明提供与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽，该多肽为耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子提供蛋白标签的功能性，该多肽选自如下氨基酸序列中的一种：SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与耐药宫颈癌癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合的多肽，其中，该多肽选自如下氨基酸序列中的一种：SEQ ID NOs：1、2、3、4和5。

本发明还提供一种核酸，其编码所述多肽，其中，该核酸选自如下碱基序列中的一种：SEQ ID NOs：11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的核酸，其中，该核酸选自如下碱基序列中的一种：SEQ ID NOs：11、12、13、14和15。

所述的多肽或所述的核酸在与耐药宫颈癌细胞系Hela细胞膜表面分子结合和肿瘤靶向治疗中的应用。

为使本领域技术人员更清楚地了解本发明的技术方案，本发明还提供如下实施例：

实施例

一、主要试剂及仪器

(1)人宫颈上皮细胞 (天津赛尔生物技术有限公司)

(2)HeLa耐药细胞株 (新疆军区总医院药剂科实验室构建)

(3)噬菌体随机七肽库(Ph.D-7TM phage display peptide library) (Biolabs，英国)

(4)PRIM 1640培养基 (Gibco，美国)

(5)优级胎牛血清 (Gibco，美国)

(6)胰蛋白酶 (Amresco，美国)

(7)二甲基亚砜(DMSO) (Sigma，美国公司)

(8)胰蛋白胨、酵母浸粉 (OXOID，英国)

(9)琼脂糖、琼脂粉 (广东环凯微生物科技有限公司)

(10)PEG8000、Tris、BSA (北京鼎国生物有限公司)

(11)IPTG、Xgal (北京鼎国生物有限公司)

(12)12孔培养板，T25培养瓶 (Orange Scientific,比利时)

(13)四环素 (北京鼎国生物有限公司)

(14)Tween 20 (天津市福晨化学试剂厂)

(15)多聚甲醛 (北京鼎国生物有限公司)

(16)HRP/anti-M13antibody (Amersham Biosciences，美国)

(17)NaI (北京鼎国生物有限公司)

(18)EDTA (北京鼎国生物有限公司)

(19)NaCl (北京鼎国生物有限公司)

(20)NaHCO₃ (北京鼎国生物有限公司)

(21)NaN₃ (北京鼎国生物有限公司)

(22)LB培养基：每升含：10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl。高压灭菌，室温贮存。

(23)LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。

(24)顶层琼脂：每升含：10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl,7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。

(25)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于乙醇:水(1:1)中。-20℃避光贮存。用前摇匀。

(26)LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。

(27)封阻缓冲液：0.1M NaHCO3(pH 8.6),5mg/ml BSA,0.02％NaN3。过滤除菌，4℃贮存。

(28)TBS:50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。

(29)PEG/NaCl:20％(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl。高压灭菌，室温贮存。

(30)碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI。室温避光贮存。(31)IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ–D-thiogalactoside)和1g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25ml二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存

(32)CO₂培养箱 (Thermo，美国)

(33)SW-CJ-1FD细胞超净工作台 (苏州净化设备有限公司)

(34)BHC-1600A/B3生物安全柜 (苏州安泰空气技术有限公司)

(35)THZ-C恒温振荡器 (广州深华生物技术有限公司)

(36)-80℃超低温冰箱 (Thermo，美国)

(37)C3i-CR3i低温高速离心机 (Thermo，美国)

(38)EDLTA 320pH计 (Mettler Toledo，美国)

(39)SK-1快速混匀器 (江苏国华仪器厂)

(40)HY-5回旋式振荡器 (江苏省金坛市宏华仪器厂)

(41)立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-30SII (上海博讯实业有限公司医疗设备厂)

(42)FA1004型电子天平 (上海良平仪器仪表有限公司)

(43)DK-8D型电热恒温水槽 (上海一恒科技有限公司)

(44)6131生物分光光度计 (Eppendorf，德国)

(45)酶联免疫检测仪 (上海尤尼柯仪器有限公司)

二、实验方法及步骤

(一)肽库筛选：

1.将对数生长期的人宫颈上皮细胞及耐药HeLa细胞接种于12孔板中，24h密度为70-80％细胞量。

2.挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10mlLB液体培养基中。

3.PBS洗人宫颈上皮细胞一次，每孔加入1ml封闭液，37℃作用至少1h。

4.除去封阻液。再用PBS快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，此操作要快以避免板干燥。

5.用1ml细胞培养液稀释释4×10¹⁰的噬菌体(即10μl的原始文库)，然后加到已细胞板上，室温温和摇动60min。

6.PBS洗HeLa耐药细胞，每孔加入1ml封闭液，37℃作用至少1h，PBS快速洗板6次。

7.将孵育过人宫颈上皮细胞的噬菌体混合液转移至HeLa耐药细胞板，室温温和摇动60min。

8.按4中所述方法用PBS缓冲液洗板10次，用非特异性缓冲液1ml0.2MGlycine-HCl(pH2.2)，1mg/mlBSA来分离已结合的分子：温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150μl 1MTris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。

9.将洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20ml LB中(用250ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5h，继续第11步)。

10.剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5h。

11.将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。

12.将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60min，最好过夜。

13.4℃10,00 0rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

14.沉淀物重悬于1mlTBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。

15.上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

16.沉淀物重悬于200μl TBS,0.02％NaN₃中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。

17.根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

18.将对数生长期的人宫颈上皮细胞接种于12孔板中，进行第二轮淘选。

19.噬菌体滴度的测定：

受体菌ER2738培养至对数中期(OD600大约0.5)，分成200μL每等份；将待测噬菌体用LB培养基进行10倍比稀释后，每浓度取10μL与对数生长早期的ER2738菌液200μL混匀，加入到3mL于45℃保温的LB顶层琼脂后迅速倾倒于含有IPTG/Xgal的LB固体平板，37℃过夜，计数蓝色噬菌斑。计算公式：噬菌体效价(pfu/10μL)＝噬斑数×稀释倍数，即每10μL的噬菌体形成单位。如图1所示，

噬菌体滴度测定结果为：116个克隆；1.16×10¹⁵pfu

20.计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-2×10¹¹pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至10⁹pfu的噬菌体加入量进行试验。

21.进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2×10¹¹pfu的噬菌体量进行淘选。

22.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。如图2所示，

噬菌体滴度测定结果为：112个单克隆；1.12×10¹⁵pfu

23.再接种1块12孔板的HeLa耐药细胞，进行第三轮淘选。

24.进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹pfu的噬菌体量。

25.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4℃贮存。如图3所示。

噬菌体滴度测定结果为：86个克隆；8.6×10¹⁴pfu。

(二)ELISA鉴定噬菌体对HeLa耐药细胞的亲和力

1.将HeLa耐药细胞细胞按1×10⁴/孔的密度接种于96孔板，置37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，对细胞进行无血清处理1h，清洗细胞，再用4％多聚甲醛固定20min；

2.PBS稍洗，0.1％TritonX-100处理10min，PBST-0.05％洗3次，1min/次；

3.2％PBS-BSA封闭1h后，加入滴度约10¹²pfu的噬菌体，37℃孵育2h，PBST-0.05％

洗3次，1min/次；

4.加HRP-anti M13抗体，37℃孵育1h，PBST-0.05％洗3次，1min/次；

5.用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数。随机挑取噬菌体原库蓝斑作为对照，P/N>2.1为阳性。

6.噬菌体肽库经过连续三轮筛选后，随机挑选30个噬菌体克隆，分别命名为phage-1、phage-2、phage-3、…、phage-30。噬菌体原库蓝斑作为对照，利用ELISA初步鉴定噬菌体克隆对HeLa耐药细胞的亲和力，可得出各噬菌体克隆的OD值，如图4所示。

当P/N(OD克隆/OD随机对照克隆)>2.1时，即可说明此克隆对HeLa耐药细胞有高亲和力。ELISA结果显示P/N>2.1的阳性克隆有17个。P/N>2.5以上的有16个克隆，其中P/N>3.0的克隆有2个，分别是phage-4、phage-22，如图5所示。P/N值代表与肿瘤细胞的亲和力，P/N值越大结合能力越强。挑选P/N值最大的10个噬菌体，按照如下方法进行扩增测序。

(三)噬菌斑的扩增测序

1.将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管(选取十个亲和力最高的克隆)。

2.37℃摇床培养4.5h。

3.培养物转入微量离心管中，14000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存。

4.将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。

5.加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。

6.4℃14000rpm离心10min，弃上清液。

7.短暂离心，小心吸去残余上清。

8.沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

9.4℃14000rpm离心10min，弃上清。用500μl 70％的乙醇(-20预冷)洗沉淀，短暂真空干燥。

10.沉淀重悬于30μl TE[10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA]中。

11.琼脂糖凝胶电泳定量。5μl(约为0.5ug纯化的单链M13mp18DNA)的上述模板溶液足够进行测序用肽库自带测序引物-96gⅢ引物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。图6中，凝胶鉴定结果表面各克隆DNA提取质量较好，可以用于后续测序分析。

经过本发明，共得到10条可与Hela细胞膜表面分子结合的多肽分子作为蛋白标签。

1:测序结果：AS:CTCAGGCATAGGACGCTGAAC

S:GTTCAGCGTCCTATGCCTGAG(SEQ ID NO：11)

Peptide:Val Gln Arg Pro MET Pro Glu(VQRPMPE)(SEQ ID NO：1)

P/N＝2.800613497，为图5中的phage-2。

2:测序结果：AS:AGCATACAAAGACGCCAAAGA

S:TCTTTGGCGTCTTTGTATGCT(SEQ ID NO：12)

Peptide:Ser Leu Ala Ser Leu Tyr Ala(SLASLYA)(SEQ ID NO：2)

P/N＝3.171779141，图5中的phage-4。

3:测序结果：AS:ATGCGCCCGCGTCACATAAGA噬菌体(bacteriophage,phage)

S:TCTTATGTGACGCGGGCGCAT(SEQ ID NO：13)

Peptide:Ser Tyr Val Thr Arg Ala His(SYVTRAH)(SEQ ID NO：3)

P/N＝2.898773006，图5中的phage-5。

4:测序结果：AS:CGAATCATGAGCATACTGCGT噬菌体(bacteriophage,phage)

S:ACGCAGTATGCTCATGATTCG(SEQ ID NO：14)

Peptide:Thr Gln Tyr Ala His Asp Ser(TQYAHDS)(SEQ ID NO：4)

P/N＝2.947852761，图5中的phage-8。

5:测序结果：AS:AGCCGGAGGAGCCGCAAGACT噬菌体(bacteriophage,phage)

S:AGTCTTGCGGCTCCTCCGGCT(SEQ ID NO：15)

Peptide:Ser Leu Ala Ala Pro Pro Ala(SLAAPPA)(SEQ ID NO：5)

P/N＝2.8343558281，图5中的phage-12。

6:测序结果：AS:CGTAGGCCCCGGCGAAAGCTT

S:AAGCTTTCGCCGGGGCCTACG(SEQ ID NO：16)

Peptide:Lys Leu Ser Pro Gly Pro Thr(KLSPGPT)(SEQ ID NO：6)

P/N＝2.662576687，图5中的phage-14。

7:测序结果：AS:CCGAAACGGAGGCGGCGACAT

S:ATGTCGCCGCCTCCGTTTCGG(SEQ ID NO：17)

Peptide:Met Ser Pro Pro Pro Phe Arg(MSPPPFR)(SEQ ID NO：7)

P/N＝2.825153374，图5中的phage-16。

8:测序结果：AS:AGGAAGCGAAATCGTACGCTC噬菌体(bacteriophage,phage)

S:GAGCGTACGATTTCGCTTCCT(SEQ ID NO：18)

Peptide:Glu Arg Thr Ile Ser Leu Pro(ERTISLP)(SEQ ID NO：8)

P/N＝3.208588957，图5中的phage-22。

9:测序结果：AS:CTGCGCACCCGAATTCAAAGC

S:GCTTTGAATTCGGGTGCGCAG(SEQ ID NO：19)

Peptide:Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln(ALNSGAQ)(SEQ ID NO：9)

P/N＝2.76380368，图5中的phage-23。

10:测序结果：AS:CTACGTCGGCCCACCACCCAG

S:CTGGGTGGTGGGCCGACGTAG(SEQ ID NO：20)

Peptide:Leu Gly Gly Gly Pro Thr-(LGGGPT-)(SEQ ID NO：10)

P/N＝2.650306748，图5中的phage-26。

其中，Peptide:Ser Leu Ala Ser Leu Tyr Ala(SLASLYA)(SEQ ID NO：2)

Peptide:Ser Tyr Val Thr Arg Ala His(SYVTRAH)(SEQ ID NO：3)

Peptide:Thr Gln Tyr Ala His Asp Ser(TQYAHDS)(SEQ ID NO：4)

Peptide:Ser Leu Ala Ala Pro Pro Ala(SLAAPPA)(SEQ ID NO：5)

Peptide:Glu Arg Thr Ile Ser Leu Pro(ERTISLP)(SEQ ID NO：8)

上述5条多肽序列与HeLa耐药细胞的亲和力更强。

本发明提供的上述多肽，对肿瘤细胞的亲和力强，可作为靶向特定肿瘤细胞的靶向头基；而且，该多条多肽与肿瘤细胞结合会抑制细胞膜的某些功能，可能会抑制肿瘤细胞的生长或者与化疗药物有协同作用，具有治疗效果，可用于肿瘤的靶向治疗。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆军区总医院

<120> 与耐药宫颈癌癌细胞系Hela表面分子结合的多肽及其应用

<130> 2016

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 1

Val Gln Arg Pro Met Pro Glu

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 2

Ser Leu Ala Ser Leu Tyr Ala

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 3

Ser Tyr Val Thr Arg Ala His

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 4

Thr Gln Tyr Ala His Asp Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 5

Ser Leu Ala Ala Pro Pro Ala

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 6

Lys Leu Ser Pro Gly Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 7

Met Ser Pro Pro Pro Phe Arg

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 8

Glu Arg Thr Ile Ser Leu Pro

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 9

Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 10

Leu Gly Gly Gly Pro Thr

1 5

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 11

gttcagcgtc ctatgcctga g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 12

tctttggcgt ctttgtatgc t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 13

tcttatgtga cgcgggcgca t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 14

acgcagtatg ctcatgattc g 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 15

agtcttgcgg ctcctccggc t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 16

aagctttcgc cggggcctac g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 17

atgtcgccgc ctccgtttcg g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

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<400> 18

gagcgtacga tttcgcttcc t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 噬菌体(bacteriophage, phage)

<400> 19

gctttgaatt cgggtgcgca g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

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<400> 20

ctgggtggtg ggccgacgta g 21