本发明属于化学－酶催化技术领域，具体涉及一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，即利用葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联酶聚集体催化葡萄糖氧化和酰基供体过水解藕联反应原位产生过氧酸，进而利用过氧酸氧化环己酮生成己内酯(ε-CL)的工艺。
背景技术：
ε-己内酯是一种用途十分广泛的有机合成中间体，可用于生产合成纤维、塑料、薄膜、涂料和增塑剂等，特别是由ε-己内酯或与其他单体聚合所得到的聚己内酯(PCL)是一类完全可降解的高分子材料，具有良好的生物相容性、无毒性和良好的渗药性，在生物医学工程中获得良好的应用。
当前工业生产己内酯的主要方法是化学拜尔-维利格(Baeyer-Villiger)氧化法，即在50℃常压下利用过氧酸为氧化剂氧化环己酮来制备ε-己内酯(H.A.Wittcoff,B.G.Reubeu,J.S.Plotkin(Eds.),Industrial Organic Chemicals,John Wiley，NJ，2004,292pp)。这种方法的主要问题是过氧酸在储存和运输过程中存在爆炸的风险，通常Baeyer-Villiger氧化法制备ε-CL最常用的过氧化物是无水过氧乙酸，但市场上只有过氧乙酸的水溶液可供应。因此，寻找经济、安全、高效的己内酯合成方法具有重要意义。
中国专利CN 102408404 B公开了一种由分子氧氧化环己酮制备ε-己内酯的方法，该法以过量的氧气为氧化剂，并加入助氧化剂苯甲醛和引发剂偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰或其混合物，在30-55℃加热搅拌反应7-28h，经旋转蒸发，柱层析分离，最终得到ε-己内酯产物，产率最高为85.1％。这种方法的问题在于需要加入助氧化剂和引发剂，操作复杂且苯甲醛、偶氮二异丁腈均有毒，过氧化苯甲酰极不稳定，三者均易燃，存在操作安全性问题；CN102351836A公开了一种以环己酮为原料，H2O2为氧化剂，苯甲腈为溶剂，CaO或Al2O3为催化剂，在60-80℃反应1-7h，制备己内酯的工艺。但此工艺所用催化剂需要高温长时间活化或浸渍处理，不利于大规模制备。
酶催化的拜尔-维利格氧化法是制备己内酯的另一途径。该法利用拜尔-维利格单加氧酶(BVMOs)为催化剂，分子氧为氧化剂，催化环状酮氧化生成内酯(K.Balke,M.Kadow,H.Mallin,S.Sass,U.T.Bornscheuer,Discovery,application and protein engineering Baeyer-Villiger monooxygenases organic synthesis.Org.Biomol.Chem.2012,10,6249–6265)。然而，大多数催化拜尔-维利格反应的单加氧酶都需要以NADPH为辅酶，FAD为辅基。而NADPH的循环使用困难。而且，此类酶的稳定性较差，反应产率较低，缺乏商品化酶制剂这些问题都极大限制了拜尔-维利格单加氧酶的工业应用。Mallin等(H.Mallin,H.Wulf,U.T.Bornscheuer,A self-sufficient Baeyer–Villiger biocatalysis system for the synthesis ofε-caprolactone from cyclohexanol,Enzyme and Microbial Technology 53(2013)283-287)将一种重组表达的热稳定性多元醇脱氢酶(PDH-loopN)和来源于醋酸钙不动杆菌的环己酮单加氧酶(CHMO)用RelizymeTM HA403载体进行共固定化，制备了多元醇脱氢酶-环己酮单加氧酶共固定化酶，并用其在pH9.0条件下催化环己醇合成ε-己内酯，转化率为34％。同时，他们还用多元醇脱氢酶-环己酮单加氧酶游离酶体系催化环己醇进行了反应，ε-己内酯收率为55％。该体系以环己醇为起始底物构建了辅酶循环自满足体系，无需添加额外的辅助底物即可实现辅酶NADPH循环。但不足是，固定化过程中CHMO活力损失较大，导致所得固定化酶催化能力显著降低，转化率仅为34％。而游离酶催化时，效果虽然有所改善，但ε-己内酯收率也不高，而且游离酶稳定差，不易回收，很难反复利用，造成反应成本高，不适合工业化应用。中国专利CN104195194A公开了一种双酶法生产ε-己内酯工艺，该工艺利用醇脱氢酶和环己酮单加氧酶共固定化酶或游离酶为催化剂，以空气为氧化剂，以磷酸盐缓冲液-乙酸丁酯两相体系为反应介质，将环己醇直接氧化合成ε-己内酯。该体系也存在上述类似的问题，即使用载体固定化法进行两种酶的共固定化，其过程操作繁琐，酶活力损失大，反应成本高，游离酶催化虽然避免了固定化过程，但也存在稳定差、不易回收等问题，从而限制了其工业规模的应用。
综上所述，化学法的主要问题在于过氧酸使用和储存运输过程所带来的爆炸风险。酶催化的拜尔-维利格反应可以避免过氧酸的使用，但主要问题是缺乏商品化酶和辅酶循环问题，酶的使用成本较高。由于直接添加过氧酸存在的风险，原位生成过氧酸将有效解决这一问题。某些水解酶能够催化羧酸或羧酸酯和过氧化氢的过水解反应，从而原位生成过氧酸。因此，利用酶催化原位生成过氧酸，同时生成的过氧酸氧化环己酮生成ε-己内酯将有效解决上述问题。为了解决上述问题，本发明研究出了一条以双酶偶联-化学法制备己内酯的新方法，即将葡萄糖氧化酶(GOD)和南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)或米根霉脂肪酶(ROL)共沉淀交联，制成GOD/CALB双酶交联酶聚集体或GOD/ROL双酶交联酶聚集体，利用该交联酶聚集体氧化葡萄糖原位产生的过氧化氢为氧化剂，同时该交联酶聚集体又催化酰基供体如乙酸乙酯氧化原位产生过氧酸，进而利用过氧酸氧化环己酮生成ε-己内酯。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的方法，以解决上述技术问题。
本发明的技术方案如下：
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：向反应器中加入离子液体作为反应介质，向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体，使葡萄糖浓度为1.0-3.0mol/L，酰基供体浓度为0.5-2.0mol/L，加入双酶交联酶聚集体为催化剂进行反应制得产品，其中双酶交联酶聚集体的使用量为25-50g/L，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([EMIM][Cl])或三乙基甲基铵四氟硼酸盐([Et3MeN][BF4])。
所述双酶交联酶聚集体为GOD/CALB双酶交联酶聚集体或GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
所述环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.02-0.1mol/h·L。
本发明还进一步还包括向反应体系加入无机弱碱中和副产物乙酸步骤，其无机弱碱用量为0.2-1.0mol/L。所述的无机弱碱为KHCO3。
所述酰基供体为乙酸乙酯、乙酸酐或乙酸2-氯乙酯。
所述反应于25-40℃，150-250rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下反应8-15h。
如无特殊说明，本发明中所通气为无菌空气。
本发明还进一步包括后处理步骤，所述后处理为反应结束后用乙酸乙酯溶解反应混合液，滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用甲苯萃取产物。
所述萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。
所述的GOD/CALB双酶交联酶聚集体的制备方法如下：将GOD酶粉和CALB酶粉混合物，用缓冲液溶解，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-7.0，于4℃搅拌下加入硫酸铵,使其浓度为0.4-0.6kg/L,再向此溶液中加入交联剂戊二醛，使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，将得到的混合溶液离心，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，既得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
所述的GOD/CALB双酶交联酶聚集体更具体的制备方法如下：
将0.75-3.0KgGOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物，用5-20L的pH 6.0-7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.4-0.6kg/L，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
所述的GOD/CALB双酶交联酶聚集体的制备所加入的GOD酶粉和CALB酶粉的酶活力之比为5:1-10:1。
所述的GOD/ROL双酶交联酶聚集体的制备方法如下：将GOD酶粉和ROL酶粉混合物，用pH 6.5-8.0缓冲液溶解，于4℃条件下搅拌下加入丙酮,其加入量为2-5L/L,再向此溶液中加入交联剂戊二醛，使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，得到的混合溶液离心，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，既得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
所述的GOD/ROL双酶交联酶聚集体更具体的制备方法如下：
将0.75-3.0KgGOD酶粉(≥500U/g)和ROL酶粉(≥500U/g)混合物，用5-20L的pH 6.5-8.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入丙酮，其加入量为2-5L/L,继续搅拌1.5h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
所述的GOD/ROL双酶交联酶聚集体的制备所加入的GOD酶粉和ROL酶粉的酶活力之比为8:1-12:1。
本发明采用的更具体的技术方案如下：
(1)制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联酶聚集体。
将0.75-3.0KgGOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为5:1-10:1)，用5-20L的pH 6.0-7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.4-0.6kg/L，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
(2)以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为25-50g/L。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([EMIM][Cl])或三乙基甲基铵四氟硼酸盐[Et3MeN][BF4])，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯、乙酸酐或乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为1.0-3.0mol/L，酰基供体浓度为0.5-2mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.02-0.1mol/h·L，并向反应体系加入KHCO3其用量为0.2-1.0mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于25-40℃，150-250rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下反应8-15h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解，滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为96-99％，ε-己内酯产率为97-99％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用10-15次。萃余液离子液体也可循环使用。
本发明采用的更具体的另一技术方案如下：
(1)制备葡萄糖氧化酶(GOD)/米根霉脂肪酶(ROL)双酶交联酶聚集体。
将0.75-3.0KgGOD酶粉(≥500U/g)和ROL酶粉(≥500U/g)混合物(酶活力之比为8:1-12:1)，用5-20L的pH 6.5-8.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入丙酮，其加入量为2-5L/L,继续搅拌1.5h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.5％，交联2-3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
(2)以上述GOD/ROL双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为25-50g/L。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])、1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([EMIM][Cl])或三乙基甲基铵四氟硼酸盐[Et3MeN][BF4])，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯、乙酸酐或乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为1.0-3.0mol/L，酰基供体浓度为0.5-2mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.02-0.1mol/h·L，并向反应体系加入KHCO3其用量为0.2-1.0mol/L,加入GOD/ROL双酶交联酶聚集体开始反应。反应于25-40℃，150-250rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下反应8-10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解，滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98-99％，ε-己内酯产率为98-99％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用15-20次。萃余液离子液体也可循环使用。
本发明提供的方法能够利用GOD/CALB或GOD/ROL体系持续、稳定的原位产生过氧化氢和过氧酸，有效避免了传统化学法中过氧酸的直接加入使用所带来的爆炸风险，原位过氧化氢供应可减少H2O2浓度过高对酶活力的损失。反应还加入KHCO3以中和反应中副产物乙酸，以减少乙酸导致的酶微环境pH的下降，从而使酶保持较高的活性和选择性。
本发明制备GOD/CALB或GOD/ROL双酶交联酶聚集体所用的酶分别为葡萄糖氧化酶(GOD)、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和米根霉脂肪酶(ROL)，均有商品化酶供应，可方便的用于本发明的GOD/CALB或GOD/ROL双酶交联酶聚集体的制备。
本发明的优点如下：
(1)原位生成过氧化氢，减少了过氧化氢浓度过高引起的酶失活；
(2)原位生成过氧酸，避免了直接添加过氧酸可能导致易爆的风险；
(3)加入KHCO3中和副产物乙酸减少了酶微环境pH的下降对酶活性的影响。
(4)采用连续滴加的方式加入环己酮，减少底物对酶的抑制。
(5)本发明环己酮转化率为96-99％，ε-己内酯产率为97-99％，ε-己内酯选择性为100％。远超传统制备方法的转化率和收率。
(6)本发明的方法较传统的化学法更安全易操作同时反应条件更加温和，以GOD/CALB或GOD/ROL双酶交联酶聚集体为催化剂，无需加入强酸等催化剂，酶催化剂和反应介质离子液体均可多次重复使用，是一种绿色友好的ε-己内酯合成方法。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将0.75Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为5:1)，用5L的pH 6.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入3kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为50g/L。向100L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])60L,再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯，使葡萄糖浓度为1mol/L，乙酸乙酯浓度为0.5mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.02mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.2mol/L，加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于25℃，150rpm，通气量5.0vvm条件下反应8h。应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，并用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为96.6％，ε-己内酯产率为98.1％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用10次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例2
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将1.0Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为6:1)，用10L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入5kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.2％，交联2.5h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为25g/L。向500L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])300L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸酐，使葡萄糖浓度为1.5mol/L，乙酸酐浓度为0.75mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.03mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.6mol/L，加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，200rpm，通气量4.0vvm条件下反应10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.0％，ε-己内酯产率为98.7％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用12次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例3
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将1.5Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为8:1)，用15L的pH 6.5磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入6kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.3％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为30g/L。向1000L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([EMIM][Cl])600L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为2.5mol/L，乙酸2-氯乙酯浓度为1mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.05mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.5mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，200rpm，通气量1.0vvm条件下反应12h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.3％，ε-己内酯产率为98.5％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用11次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例4
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将2.0Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为7:1)，用20L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入8kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.5％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为35g/L。向500L带夹套搅拌反应器中加入离子液体三乙基甲基铵四氟硼酸盐[Et3MeN][BF4])350L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯，使葡萄糖浓度为2.5mol/L，酰基供体浓度为1mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.05mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.5mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，200rpm，通气量2.0vvm条件下反应10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.7％，ε-己内酯产率为97.5％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用13次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例5
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将2.5Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为9:1)，用20L的pH 6.8磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入12kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.4％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为25g/L。向1000L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])700L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为2.0mol/L，酰基供体浓度为1.5mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.08mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.8mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于30℃，150rpm，通气量3.0vvm条件下反应15h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为97.7％，ε-己内酯产率为98.4％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用10次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例6
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将3.0Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为10:1)，用20L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入12kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.2％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为30g/L。向1000L带夹套搅拌反应器中加入离子液体三乙基甲基铵四氟硼酸盐[Et3MeN][BF4]700L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为2.5mol/L，酰基供体浓度为1.0mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.08mol/h·L，并加入KHCO3其用量为1.0mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，150rpm，通气量4.0vvm条件下反应10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.1％，ε-己内酯产率为98.5％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用15次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例7
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将1.75Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为8:1)，用20L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入10kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.3％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为30g/L。向500L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])350L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯，使葡萄糖浓度为2.5mol/L，酰基供体浓度为1.0mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.1mol/h·L，并加入KHCO3其用量为1.0mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，180rpm，通气量2.0vvm条件下反应12h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.0％，ε-己内酯产率为98.6％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用10次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例8
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联聚集体，其过程如下：将2.0Kg GOD酶粉(≥500U/g)和CALB酶粉(≥200U/g)混合物(酶活力之比为10:1)，用20L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入10kg硫酸铵，继续搅拌1h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.2％，交联2.5h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/CALB双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/CALB双酶交联酶聚集体为催化剂，双酶交联酶聚集体的使用量为30g/L。向1000L带夹套搅拌反应器中加入离子液体三乙基甲基铵四氟硼酸盐([Et3MeN][BF4])600L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为2.5mol/L，酰基供体浓度为1mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.05mol/h·L，并加入KHCO3其用量为0.5mol/L,加入GOD/CALB双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，180rpm，通气量3.0vvm条件下反应10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.5％，ε-己内酯产率为98.5％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/CALB双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用10次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例9
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/米根霉脂肪酶(ROL)双酶交联酶聚集体，其过程如下：将0.75KgGOD酶粉(≥500U/g)和ROL酶粉(≥500U/g)混合物(酶活力之比为12:1)，用5L的pH 6.5磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入丙酮，其加入量为2L/L,继续搅拌1.5h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.2％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/ROL双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为25g/L。向500L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM][BF4])350L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸乙酯，使葡萄糖浓度为1.0mol/L，酰基供体浓度为0.5mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.02mol/h·L，并向反应体系加入KHCO3其用量为0.2mol/L,加入GOD/ROL双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，150rpm，通气量1.0vvm条件下反应8h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解，滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为98.5％，ε-己内酯产率为99.3％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用18次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例10
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/米根霉脂肪酶(ROL)双酶交联酶聚集体，其过程如下：将1.5KgGOD酶粉(≥500U/g)和ROL酶粉(≥500U/g)混合物(酶活力之比为10:1)，用10L的pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入丙酮，其加入量为3L/L,继续搅拌1.5h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.25％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/ROL双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为30g/L。向1000L带夹套搅拌反应器中加入离子液体三乙基甲基铵四氟硼酸盐([Et3MeN][BF4])600L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸酐，使葡萄糖浓度为2.0mol/L，酰基供体浓度为1.0mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.05mol/h·L，并向反应体系加入KHCO3其用量为0.5mol/L,加入GOD/ROL双酶交联酶聚集体开始反应。反应于40℃，200rpm，通气量2.0vvm条件下反应9h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解，滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为99.2％，ε-己内酯产率为98.9％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用20次。萃余液离子液体也可循环使用。
实施例11
一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，具体步骤如下：
首先制备葡萄糖氧化酶(GOD)/米根霉脂肪酶(ROL)双酶交联酶聚集体,其过程如下：将3.0KgGOD酶粉(≥500U/g)和ROL酶粉(≥500U/g)混合物(酶活力之比为12:1)，用20L的pH 7.5磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下120rpm慢速搅拌下加入丙酮，其加入量为5L/L,继续搅拌1.5h，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.5％，交联3h，混合溶液于4℃,5000×g离心5min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得GOD/ROL双酶交联酶聚集体。
以上述GOD/ROL双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为50g/L。向500L带夹套搅拌反应器中加入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯盐([EMIM][Cl])300L，再向其中加入葡萄糖、环己酮和酰基供体乙酸2-氯乙酯，使葡萄糖浓度为3.0mol/L，酰基供体浓度为2mol/L，环己酮采用连续滴加的方式加入，加入速度为0.1mol/h·L，并向反应体系加入KHCO3其用量为1.0mol/L,加入GOD/ROL双酶交联酶聚集体开始反应。反应于35℃，250rpm，通气量5.0vvm条件下反应10h。反应结束后反应混合液用等体积乙酸乙酯溶解，滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，滤液真空减压浓缩，用等体积甲苯萃取产物，萃取物用10％NaHCO3洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得产品。用气相色谱仪分析产物组成。结果，环己酮转化率为99.4％，ε-己内酯产率为99.2％，ε-己内酯选择性为100％。反应结束后滤出GOD/ROL双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯洗涤后，可以重复使用17次。萃余液离子液体也可循环使用。