一种生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料、高分子化学和生物大分子自组装技术领域，具体涉及一种生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料及制备方法。

背景技术：

醋酸纤维素具有良好的生物相容性和物理性能，是常用的血液透析膜材料之一。但其与血液直接接触时，容易被血浆蛋白污染，又因其抗凝血和抗菌性能不足，与血液接触还会导致血栓的形成及细菌感染等不良反应。且醋酸纤维素膜抗氧化性能不足，在血透治疗过程中会引起病人的血液中出现氧化应激现象，易造成病人出现血管受损和动脉粥样硬化等不良症状。本发明致力于解决现有醋酸纤维素血透膜的抗凝血和抗菌方面的不足，降低血透时的氧化应激反应，提供了一种兼顾抗凝血、抗菌和抗氧化的多功能醋酸纤维素膜材料及制备方法。

对生物医用高分子材料进行表面修饰是常用的改善材料表面生物活性的有效方法。常用的表面修饰方法有表面化学接枝法、等离子表面改性法、层层自组装法等。其中，层层自组装技术是一种通过在材料表面交替吸附带相反电荷的聚电解质而实现材料表面修饰的方法，该方法具有操作简单，制备条件温和，组装材料范围广泛等优点，不仅可组装合成聚电解质，还可组装蛋白质、多糖、DNA等带电荷的生物大分子，并有利于生物大分子维持生物活性和天然构象，因此，该方法已成为生物医用高分子材料表面功能化修饰的有效手段。

生物多糖来源于生物体，与蛋白质及细胞之间存在的某些特异性识别和诱导作用，是进行材料表面修饰的重要物质之一。用生物多糖进行医用高分子材料表面的修饰，可有效改善材料的表面性能，如血液相容性、细胞相容性、亲水性等。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的一种天然阳离子多糖，具有安全无毒、良好生物相容性和生物可降解性、以及广谱抗菌等优点，因此壳聚糖已被广泛应用于人造皮肤、人造血管、可吸收手术缝合线等生物材料领域。此外，也有研究者开展了利用壳聚糖进行生物材料表面修饰的研究工作。如Liu等人在聚氨酯表面接枝固定柠檬酸和壳聚糖，经修饰的表面具有较好的抗凝血和抗菌性能 [Journal of Biomaterials Science, 2016, 27：1211-1231]。鸡枞菌作为一种天然野生的珍贵食用菌，含有较为丰富的多糖物质，且鸡枞菌多糖不仅是一种非特异性免疫增强剂，还具有降血脂、降血糖、抗凝血等多种生理活性。值得注意的是，到目前为止，还未见研究者对具有生物活性的鸡枞菌多糖衍生物作为医用高分子材料表面修饰的活性物质进行文献和专利报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料的制备方法，制备出的醋酸纤维素膜材料表面具有较好的抗凝血性、抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性及抗氧化活性，制备过程工艺简单。

本发明通过以下技术方案实现本发明目的：

1）鸡枞菌硫酸酯多糖的制备：

将4.5~10.5mL浓硫酸与10~15mL正丁醇混合，加入0.1~0.12g硫酸铵，搅拌溶解后，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下缓慢放入500~1000mg鸡枞菌多糖粉末，冰水浴中反应30~60分钟后，用已冷却至0 ℃的5 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0~8.0，得到反应液；再将反应液4000 r/min离心10 ~15分钟后，取上清液注入再生纤维素透析袋中，用去离子水透析2~3天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后冷冻干燥，得到鸡枞菌硫酸酯多糖；

所述鸡枞菌多糖参考文献（陈耀华，陈健. 现代食品科技，2012, 28（5）：541-544）制得。

2）醋酸纤维素膜材料的制备：

将12.5~17.5g醋酸纤维素粉末、22.5~45.5g丙酮、27~60g N-甲基吡咯烷酮和5~10g聚乙二醇400混合，30~80℃条件下加热搅拌5~6小时使其混合均匀，形成均相铸膜液，并抽真空脱气，随后在室温下将铸膜液倾倒在已调至水平的聚四氟乙烯模具中，在35~45℃条件下干燥24~48小时，得到醋酸纤维素膜；

将上述醋酸纤维素膜切成膜片，并用去离子水超声清洗3~5次，然后在室温条件下将膜片用浓度为2%v/v的乙酸溶液浸泡40~60分钟，再用去离子水洗涤膜片3~5次，得到表面带负电荷的醋酸纤维素膜基材；

3）鸡枞菌硫酸酯多糖溶液、壳聚糖溶液的制备：

按鸡枞菌硫酸酯多糖:去离子水=(100.0 ~ 200.0)mg:100mL的比例，将鸡枞菌硫酸酯多糖溶解于去离子水中，用0.1 M NaOH调节pH至5~6，得到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液；

按壳聚糖：乙酸：去离子水：=(100.0 ~ 200.0)mg ：2 mL: 98mL，将壳聚糖、乙酸、去离子水混合，用0.1 M NaOH调节pH至5~6，得到壳聚糖溶液；

4）在醋酸纤维素膜基材表面进行鸡枞菌硫酸酯多糖和壳聚糖的层层自组装：

将上述步骤2）制备得到的醋酸纤维素膜基材加入到壳聚糖溶液中浸泡10~20分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤3~5次，制备出表面具有壳聚糖的醋酸纤维素膜片，再将上述膜片加入到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中浸泡10~20分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤3~5次，完成基材表面第一个双分子层自组装；重复上述过程，在壳聚糖溶液和鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中分别交替自组装数次后，得到鸡枞菌硫酸酯多糖为最外层的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜片，最后将膜片在35 ~45℃条件下真空干燥24~48小时，得到生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料。

本发明的有益效果是：本发明制备的生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料不仅具有良好的血液相容性，还具有优异的抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，同时还具有较强的清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力。这种同时具备抗凝血、抗菌和抗氧化的多功能醋酸纤维素膜材料，制备工艺简单易控，特别适用于作为血液过滤、血液透析等的生物医用材料。

附图说明

图1是生物多糖层层自组装修饰前后醋酸纤维素膜材料的抗凝血时间变化图；其中M-0代表醋酸纤维素膜片，M-5代表表面组装了五个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片，M-10表面组装了十个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片；

图2 是生物多糖层层自组装修饰前后醋酸纤维素膜材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性；其中M-0代表醋酸纤维素膜片，M-5代表表面组装了五个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片，M-10表面组装了十个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片；

图3是生物多糖层层自组装修饰前后醋酸纤维素膜材料对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率；其中M-0代表醋酸纤维素膜片，M-5代表表面组装了五个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片，M-10表面组装了十个双分子层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜的醋酸纤维素膜片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1：生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料的制备方法，它包括如下步骤：

1）鸡枞菌硫酸酯多糖的制备：将4.5mL浓硫酸与10mL正丁醇混合，加入0.1g硫酸铵，搅拌溶解后，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下缓慢放入500mg鸡枞菌多糖粉末，冰水浴中反应30分钟后，用已冷却至0 ℃的5 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，得到反应液；再将反应液4000 r/min离心10分钟后，取上清液注入再生纤维素透析袋中，用去离子水透析2天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后冷冻干燥，得到鸡枞菌硫酸酯多糖；

2）醋酸纤维素膜材料的制备

将12.5g醋酸纤维素粉末、22.5g丙酮、60g N-甲基吡咯烷酮和5g聚乙二醇400混合，30℃条件下加热搅拌5小时使其混合均匀，形成均相铸膜液，并抽真空脱气，随后在室温下将铸膜液倾倒在已调至水平的聚四氟乙烯模具中，在35℃条件下干燥24小时，得到醋酸纤维素膜；

将上述醋酸纤维素膜切成尺寸为1cm×1cm的正方形膜片，并用去离子水超声清洗3次，然后在室温条件下将膜片用浓度为2%v/v的乙酸溶液浸泡40分钟，再用去离子水洗涤膜片3次，得到表面带负电荷的醋酸纤维素膜基材；

3）鸡枞菌硫酸酯多糖溶液、壳聚糖溶液的制备

按鸡枞菌硫酸酯多糖：去离子水=100.0 mg ：100mL，将鸡枞菌硫酸酯多糖溶解于去离子水中，用0.1 M NaOH调节pH至5，得到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液；

按壳聚糖:乙酸:去离子水:=100.0 mg :2 mL: 98mL，将壳聚糖、乙酸、去离子水混合，用0.1 M NaOH调节pH至5，得到壳聚糖溶液；

4）醋酸纤维素膜基材表面进行鸡枞菌硫酸酯多糖和壳聚糖的层层自组装

将上述步骤2）制备得到的醋酸纤维素膜基材加入到壳聚糖溶液中浸泡10分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤3次，制备出表面具有壳聚糖的醋酸纤维素膜片，再将上述膜片加入到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中浸泡10分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤3次，完成基材表面第一个双分子层自组装；重复上述过程，在壳聚糖溶液和鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中分别交替自组装数次后，得到鸡枞菌硫酸酯多糖为最外层的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜片，最后将膜片在35℃条件下真空干燥24小时，得到生物多糖自组装多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料。

制备得到的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料表现出较好的抗凝血性、抗菌和抗氧化活性。当组装了5层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了64.9%、27.8%和13.2%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达80.3%和98.2%，对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达26.7%和57.6%。当组装了10层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了89.8%、35.3%和47.6%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达97.5%和100%， 对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达41.2%和68.9%（图1、2、3）。

实施例2：生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料的制备方法，它包括如下步骤:

1）鸡枞菌硫酸酯多糖的制备

将10.5mL浓硫酸与15mL正丁醇混合，加入0.12g硫酸铵，搅拌溶解后，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下缓慢放入1000mg鸡枞菌多糖粉末，冰水浴中反应60分钟后，用已冷却至0 ℃的5 mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，得到反应液；再将反应液4000 r/min离心15分钟后，取上清液注入再生纤维素透析袋中，用去离子水透析3天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后冷冻干燥，得到鸡枞菌硫酸酯多糖。

2）醋酸纤维素膜材料的制备

将17.5g醋酸纤维素粉末、45.5g丙酮、27g N-甲基吡咯烷酮和10g聚乙二醇400混合，80℃条件下加热搅拌6小时使其混合均匀，形成均相铸膜液，并抽真空脱气，随后在室温下将铸膜液倾倒在已调至水平的聚四氟乙烯模具中，在45℃条件下干燥48小时，得到醋酸纤维素膜；

将上述醋酸纤维素膜切成尺寸为1cm×1cm的正方形膜片，并用去离子水超声清洗5次，然后在室温条件下将膜片用浓度为2%v/v的乙酸溶液浸泡60分钟，再用去离子水洗涤膜片5次，得到表面带负电荷的醋酸纤维素膜基材；

3）鸡枞菌硫酸酯多糖溶液、壳聚糖溶液的制备

按鸡枞菌硫酸酯多糖:去离子水=200.0mg :100mL，将鸡枞菌硫酸酯多糖溶解于去离子水中，用0.1 M NaOH调节pH至6，得到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液；

按壳聚糖:乙酸:去离子水:=200.0mg :2 mL: 98mL，将壳聚糖、乙酸、去离子水混合，用0.1 M NaOH调节pH至6，得到壳聚糖溶液；

4）醋酸纤维素膜基材表面进行鸡枞菌硫酸酯多糖和壳聚糖的层层自组装

将上述步骤2）制备得到的醋酸纤维素膜基材加入到壳聚糖溶液中浸泡20分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤5次，制备出表面具有壳聚糖的醋酸纤维素膜片，再将上述膜片加入到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中浸泡20分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤5次，完成基材表面第一个双分子层自组装；重复上述过程，在壳聚糖溶液和鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中分别交替自组装数次后，得到鸡枞菌硫酸酯多糖为最外层的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜片，最后将膜片在45℃条件下真空干燥48小时，得到生物多糖自组装多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料。

制备得到的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料表现出较好的抗凝血性、抗菌和抗氧化活性。当组装了5层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了72.3%、43.1%和33.7%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达87.9%和100%，对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达47.8%和73.9%。当组装了10层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了91.9%、54.6%和66.3%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达100%和100%， 对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达78.6%和93.4%。

实施例3：生物多糖层层自组装修饰的醋酸纤维素膜材料的制备方法，它包括如下步骤:

1）鸡枞菌硫酸酯多糖的制备

将7.5mL浓硫酸与12.5mL正丁醇混合，加入0.11g硫酸铵，搅拌溶解后，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下缓慢放入750mg鸡枞菌多糖粉末，冰水浴中反应45分钟后，用已冷却至0 ℃的5 mol/L NaOH溶液调节pH至7.5，得到反应液；再将反应液4000 r/min离心12.5分钟后，取上清液注入再生纤维素透析袋中，用去离子水透析2.5天，然后将透析液旋转蒸发浓缩，最后冷冻干燥，得到鸡枞菌硫酸酯多糖。

2）醋酸纤维素膜材料的制备

将15g醋酸纤维素粉末、34g丙酮、43.5g N-甲基吡咯烷酮和7.5g聚乙二醇400混合，55℃条件下加热搅拌5.5小时使其混合均匀，形成均相铸膜液，并抽真空脱气，随后在室温下将铸膜液倾倒在已调至水平的聚四氟乙烯模具中，在40℃条件下干燥36小时，得到醋酸纤维素膜；

将上述醋酸纤维素膜切成尺寸为1cm×1cm的正方形膜片，并用去离子水超声清洗4次，然后在室温条件下将膜片用浓度为2%v/v的乙酸溶液浸泡50分钟，再用去离子水洗涤膜片4次，得到表面带负电荷的醋酸纤维素膜基材；

3）鸡枞菌硫酸酯多糖溶液、壳聚糖溶液的制备

按鸡枞菌硫酸酯多糖:去离子水=150mg :100mL，将鸡枞菌硫酸酯多糖溶解于去离子水中，用0.1 M NaOH调节pH至5. 5，得到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液；

按壳聚糖:乙酸:去离子水:=150mg :2 mL: 98mL，将壳聚糖、乙酸、去离子水混合，用0.1 M NaOH调节pH至5.5，得到壳聚糖溶液；

4）在醋酸纤维素膜基材表面进行鸡枞菌硫酸酯多糖和壳聚糖的层层自组装

将上述步骤2）制备得到的醋酸纤维素膜基材加入到壳聚糖溶液中浸泡15分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤4次，制备出表面具有壳聚糖的醋酸纤维素膜片；再将上述膜片加入到鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中浸泡15分钟，然后取出膜片用去离子水洗涤4次，完成基材表面第一个双分子层自组装；重复上述过程，在壳聚糖溶液和鸡枞菌硫酸酯多糖溶液中分别交替自组装数次后，得到鸡枞菌硫酸酯多糖为最外层的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜片，最后将膜片在40℃条件下真空干燥36小时，得到生物多糖自组装多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料。

制备得到的生物多糖多层膜修饰的醋酸纤维素膜材料表现出较好的抗凝血性、抗菌和抗氧化活性。当组装了5层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了68.2%、33.3%和24.5%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达83.8%和99.8%， 对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达36.8%和67.8%。当组装了10层壳聚糖/鸡枞菌硫酸酯多糖多层膜时，醋酸纤维素膜材料的凝血时间（APTT、PT和TT）较未修饰的膜材料延长了90.3%、47.8%和57.2%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别达98.7%和100%， 对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别达61.7%和85.5%。