一种基于微流控芯片的单细胞自动操控分选装置及方法与流程

本发明涉及细胞操控技术领域，具体说是涉及一种基于微流控芯片的单细胞自动操控分选装置及方法。

背景技术：

在生命科学、医学以及生物学等诸多领域，经常需要从较为复杂的样品中，分选出单个目标细胞，以进行后续的科学研究。例如在癌症研究中，分选获得单个癌细胞是进行后续细胞测序的关键技术。

目前，最为常用的单细胞分选技术是借助显微镜，采用手动的方法从样品中隔离出单个细胞。该方法费时，操控难度大并且容易对细胞造成伤害。以流式细胞仪为代表的细胞计数和筛选仪器，虽已实现集成化和自动化，但无法实现单个细胞的分选。

微流控芯片是通过构建网络式通道，从而将样品制备、生物与化学反应、分选和检测等过程，缩微或基本缩微到一块几平方厘米的芯片上，并对其结果进行检测与分析，扩展了在细胞和亚细胞水平上进行生命科学研究的能力。在微流控芯片上，通过对微流体施加不同的作用，比如介电电泳、磁场力、声动力、光镊技术等，使微流控通道内这些作用与流体动力相结合，从而实现对细胞或者颗粒的分选以便使单细胞计数、筛选以及胞内组分分析等操作大大简化。目前，有多种方法应用在微流控芯片上进行细胞操控：

1)立柱结构分选：该方法是根据细胞粒径和变形等特点，通过改变芯片内立柱之间的距离，实现对不同粒径的细胞或粒子的分选。其优点是能够精确控制分选的细胞或者颗粒尺寸，但是具有芯片体积较大，通量较小，容易形成通道堵塞等缺点，并且捕获的细胞很难回收进行后续研究。

2)惯性力分选：惯性分选的原理主要是基于细胞在微流道中所受的惯性升力、离心力等惯性力作用，使得不同尺寸的细胞受力之后的平衡位置不同，从而实现分选。其优点是通量高，能够实现连续分选。但是无法实现单个细胞的捕获。

3)磁力分选：磁力分选主要利用特异性磁珠来捕获细胞，并继而利用外加磁场来操控。该方法的主要缺点是某些细胞很难有特异性的磁珠，并且后续脱附磁珠的步骤会影响细胞的活性。

4)电分选：电分选主要分两种，一是电泳分离：利用外加电场和粒子表面电荷的相互作用来驱动细胞运动；二是介电泳分离，利用细胞在非均匀电场中受到的极化作用使细胞运动。该两种方法具有分选通量高和分选效率高等优点，但是受流道内电导率影响较大。

5)光学分选：光学分选利用激光光束作用在细胞或颗粒上的不同位置，能够实现对细胞的精确控制，但是通量低，对光源的波长及功率有特定要求。

6)声波分选：声波分选利用微流道中被压电材料感应到超声波共振时，产生的辐射能使细胞运动。其优点是能够对单个细胞进行操控，但是对分选设备要求高，操作较复杂。

7)水动力分选：利用外界提供的力对溶液中的流体施加作用，从而分选溶液中的细胞。其优点是施加的力可以控制大小，能对细胞进行精确操控，缺点就是外界设备比较多，集成困难。

综上所述，使用上述任意单一方法均不能实现有效地单细胞全自动快速操控，且其所用装置大多结构复杂，操作不便。

技术实现要素：

鉴于已有技术存在的不足，本发明的目的是要提供一种结合水动力分选技术与电分选技术，同时能够实现单细胞自动操控分选的装置及方法。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种基于微流控芯片的单细胞自动操控分选装置，其特征在于，装置包括细胞分选基片、压力控制元件、信号处理元件、通道分选元件及信号采集控制装置；

所述细胞分选基片由玻璃底片及凹刻有微流道的pdms微流控芯片封装构成，所述pdms微流控芯片与玻璃底片键合一侧中间位置凹刻有首尾两端分别设置进样储液孔和废液储液孔的主通道；

所述主通道中间位置对应的两侧侧壁向通道中心方向渐缩，以形成用以检测通过细胞的细胞检测区域；所述主通道位于细胞检测区域后一定位置处呈放射性均匀连接有n条末端设置有目标细胞储液孔的细胞分选通道，其中n≧2；

所述主通道与所述细胞分选通道连通处为细胞分选区域，所述细胞检测区域前的部分主通道为上游主通道，所述细胞分选区域后的部分主通道为下游主通道；

同时，任意所述目标细胞储液孔均与压力控制元件一端连接；所有压力控制元件另一端均与信号采集控制装置连接；所述进样储液孔和废液储液孔内均插有铂电极，所述进样通道储液孔内的铂电极与一直流电源的正极连接，且废液储液孔内的铂电极通过一参考电阻与上述直流电源的负极连接；所述参考电阻的两端均通过导线与所述信号处理元件的输入端连接，所述信号放大元件的输出端与所述信号采集控制装置连接。

进一步的，所述目标细胞储液孔为封闭式储液孔，且所述进样储液孔、废液储液孔及目标细胞储液孔三者深度一致。

进一步的，作为本发明的优选，所述信号采集控制装置采用单片机处理器，所述单片机处理器通过通道分选元件控制各所述压力控制元件的动作。

进一步的，作为本发明的优选，所述通道分选元件采用继电器开关。

进一步的，作为本发明的优选，所述压力控制元件采用两位三通电磁阀，所述两位三通电磁阀具有一个常开通道和两个常闭通道；其中一常闭通道通过毛细软管与对应的目标细胞储液孔相连通，另一常闭通道接负压管，同时常开通道与大气连通。

进一步的，作为本发明的优选，所述负压管选用一段长为15mm，直径为2mm的塑料软管，排空空气后与所述两位三通电磁阀常闭通道连接。

本发明的另一目的是要提供一种基于上述装置进行单细胞自动操控分选的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

s01单片机设置：对单片机预先设置一动作电压值为u，延时值t；

s02缓冲液滴加：首先在所述进样储液孔、废液储液孔以及各目标细胞储液孔中滴加相同体积的磷酸盐缓冲液；

s03装置连接：在目标细胞储液孔中接入软管，并用处理好的pdms薄片盖住储液孔，形成密封空间，排空毛细软管中的空气并将其连接于相应两位三通电磁阀的一个常闭通道之间，再将一定量的细胞样品滴加到进样孔中；

s04样品运输：接通所述直流电源，细胞样品溶液在电渗流及压力的作用下，由进样储液孔经主通道流向废液储液孔；

s05样品检测：当有细胞流经细胞检测区域时，相应的参考电阻两端电压发生变化，该电压变化信号由与参考电阻连接的信号处理元件放大后发送至信号采集控制装置进行分析处理；

s06细胞分选：当信号采集控制装置检测到有样品细胞经过检测区域时，信号采集控制装置通过通道分选元件选择细胞分选通道；与其相对应的压力控制元件电源接通，在压力控制元件的负压作用下，细胞进入相应的细胞分选通道，一定时间t后，细胞流入目标细胞储液孔，该细胞分选通道的分选过程结束，信号采集控制装置切断相应压力控制元件电源；

当其他细胞经过检测区时，重复上述细胞分选过程，信号采集控制装置按照预先设定的接通逻辑依次接通其余压力控制元件，直至完成细胞的分选工作。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明采用负压管来操控细胞，分选速度快；并且负压管接通细胞分选通道的同时与大气相通，使得负压效应存在的时间极短，能够避免多个细胞进入同一个分选通道的情况发生；

2、本发明可以通过调整负压管的尺寸来改变负压的大小，从而控制分离速度以满足不同的使用需求；

3、本发明采用外接电阻差分检测方式，不需要在芯片细胞检测区域两端设置检测通道，从而简化了芯片的结构；

4、本发明利用单片机、电磁阀及继电器等完成细胞分选通道的选择动作，具有全自动操控的突出特点，同时装置体积小，造价低，能够高效便捷地完成样品细胞分选工作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明结构示意图；

图2为本发明细胞分选基片结构示意图。

图3为本发明细胞分选方法流程图。

附图标号说明：

图中：1、上游主通道，2、下游主通道，3、4、5、6均为目标细胞分选通道，a、进样储液孔，b、废液储液孔，c、d、e、f均为目标细胞储液孔，7、8、11、12均为两位三通电磁阀，9、10、13、14均为负压管，15、电磁继电器，16、单片机，17、差分放大器，18、定值电阻。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明设计了一种基于微流控芯片的单细胞自动操控分选装置及方法，下面结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的技术方案：

一种基于微流控芯片的单细胞自动操控分选装置，其特征在于，装置包括：

用于实现细胞分选操控的细胞分选基片，所述细胞分选基片由玻璃底片及凹刻有微流道的pdms微流控芯片封装构成，所述pdms微流控芯片与玻璃底片接合一侧中间位置凹刻有首尾两端分别设置进样储液孔a和废液储液孔b的主通道，所述主通道中间位置对应的两侧侧壁向通道中心方向收紧以形成细胞检测区域；所述主通道位于细胞检测区域后一定位置处部分呈放射性均匀连接有n条末端设置有目标细胞储液孔的细胞分选通道，本实施例中n＝4；所述主通道与所述细胞分选通道连通处为细胞分选区域，所述细胞检测区域前的部分主通道为上游主通道1，所述细胞分选区域后的部分主通道为下游主通道2；

在有细胞通过所述微流控芯片细胞检测区域时，将其对应的电阻信号转换为电压信号并对所得电压信号进行放大的信号处理元件17；

两者配合使用以实现通道选择与细胞操控的压力控制元件9、10、13、14和通道分选元件15；

以及根据信号处理元件的输出信号控制所述压力控制元件和通道分选元件动作的信号采集控制装置16。

任意所述目标细胞储液孔均通过软管与压力控制元件连接；所有压力控制元件均与信号采集控制装置连接；所述进样储液孔和废液储液孔内均插有铂电极，所述进样通道储液孔内的铂电极与一直流电源的正极连接，且废液储液孔内的铂电极通过一参考电阻与上述直流电源的负连接；所述参考电阻的两端均通过导线与所述信号处理元件的输入端连接，所述信号放大元件的输出端与所述信号采集控制装置连接。

所述目标细胞储液孔为封闭式储液孔，且所述进样储液孔、废液储液孔及目标细胞储液孔三者深度一致。

作为本发明的优选，所述信号采集控制装置采用单片机处理器，所述单片机处理器通过通道分选元件控制各所述压力控制元件的通断。

作为本发明的优选，所述通道分选元件采用继电器开关。

作为本发明的优选，所述压力控制元件采用两位三通电磁阀，所述两位三通电磁阀具有一个常开通道和两个常闭通道；其中一常闭通道通过毛细软管与对应的目标细胞储液孔相连通，另一常闭通道接负压管，同时常开通道与大气连通。

作为本发明的优选，所述负压管选用一段长为15mm，直径为2mm的塑料软管，排空空气后与所述两位三通电磁阀常闭通道连接。

所述pdms微流控芯片上的主通道部分包括依次连通设置的上游主通道、细胞检测区域、细胞分选区域和下游主通道。

上游主通道作为微流控芯片的进样区域，其一端连接插有铂电极的进样储液孔，另一端连接细胞检测区域，且进样储液孔内的铂电极与直流电源的正极连接。

细胞检测区域分别与上游主通道和细胞分选区域连接，用以检测是否有细胞通过。

细胞通过细胞检测区域后进入细胞分选区域，所述细胞分选区域连接下游主通道以及若干条细胞分选通道。

下游主通道连接插有铂电极的废液储液孔，且所述铂电极连接直流电源的正极，这样与目标进样储液孔形成电渗流，构成本装置的检测通路。

各所述细胞分选通道一端均与细胞检测区域相连通，另一端分别连通各自对应的目标细胞储液孔。微通道数量以实际分选需求为准；优选的，各所述细胞分选通道呈放射形分布于pdms微流控芯片上，即分别以与检测区连通处为起点，沿远离该连通处方向延伸一定长度，并连接通过外置软管连通电磁阀的目标细胞储液孔。

同时本发明利用差分原理对信号进行放大，即在电路系统中串联一个参考电阻即定值电阻r，从参考电阻两端引出检测信号，达到差分放大的目的，以提高本单细胞分选装置的信噪比和实验精度。各所述目标细胞储液孔连接的电磁阀通过通道分选元件—继电器控制动作，所述继电器受信号采集控制装置；所述参考电阻的两端均通过导线与相应的信号放大元件的输入端连接，所述信号放大元件优选使用差分放大单元，且其输出端与信号采集控制装置连接，所述信号采集控制装置优选为单片机。所述单片机装置通过控制继电器开关的动作控制各分选通道的电磁阀开闭情况，电磁阀常闭端连接有负压管，当电磁阀处于打开状态，用以在各个分选通道内产生负压实现将当前待分选的细胞分选至该通道。

下面结合具体实例1对本发明做进一步说明：

如图1-2所示，该装置设置有若干微流道的pdms微流控芯片；

主通道进样储液孔a位于所述pdms微流控芯片上的左端，主通道废液储液孔b、目标细胞储液孔c～f以及和目标细胞储液孔相配套的第3～6号细胞分选通道均位于细胞检测区域1的右端；主通道进样储液孔a通过细胞检测区域1与第3～6号细胞分选通道连通；对应的目标细胞储液孔c～f通过软管连接于各自匹配使用的两位三通电磁阀；主通道进样孔a中的铂电极的另一端与直流电源的负极相连；主通道废液孔b与直流电源正极相连。所述电磁阀常开通道通大气，使目标细胞储液孔的气压与大气压相等，常闭管通负压管；电磁阀电源端连接继电器，继电器另一端连接单片机并受单片机控制；定值电阻r两端通过导线连接至差分放大器17的两个输入端；差分放大器17的输出端连接至单片机处理器的输入端；单片机处理器接收的信号可以直接在显示屏上显示；单片机处理器通过控制继电器来控制各分选通道的电磁阀与主电路的通断，使负压管的负压作用与分选通道，进而实现细胞分选。

一种基于上述装置进行单细胞自动操控分选的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

s01单片机处理器设置：对单片机处理器预先设置一动作电压值为u，延时值t；

s02缓冲液滴加：首先在所述进样储液孔、废液储液孔以及各目标细胞储液孔中滴加相同体积的磷酸盐缓冲液；

s03装置连接：在目标细胞储液孔中接入软管，并用处理好的pdms薄片盖住储液孔，形成密封空间，排空毛细软管中的空气并将其连接于目标细胞储液孔与相应两位三通电磁阀的一个常闭通道之间，再将一定量的细胞样品滴加到进样孔中；

s04样品运输：接通所述直流电源，细胞样品溶液在电渗流及压力的作用下，由进样储液孔经主通道流向废液储液孔；

s05样品检测：当有细胞流经细胞检测区域时，相应的参考电阻两端电压发生变化，该电压变化信号由与参考电阻连接的信号处理元件放大后发送至信号采集控制装置进行分析处理；

s06细胞分选：当信号采集控制装置检测到有样品细胞经过检测区域时，信号采集控制装置通过通道分选元件选择细胞分选通道；与其相对应的压力控制元件电源接通，在压力控制元件的负压作用下，细胞进入相应的细胞分选通道，一定时间t后，细胞流入目标细胞储液孔，该细胞分选通道的分选过程结束，信号采集控制装置切断相应压力控制元件电源；

当其他细胞经过检测区时，重复上述细胞分选过程，信号采集控制装置按照预先设定的接通逻辑依次接通其余压力控制元件，直至完成细胞的分选工作。

对应的实例1的操作步骤:

样品滴加：首先在主通道进样孔a，主通道废液孔b以及各个目标细胞储液孔c～f中滴加相同体积的磷酸盐(pbs)缓冲液，取出主通道进样孔a中的磷酸盐(pbs)缓冲液，然后将等量的待分选单细胞样品滴加到主通道进样孔a中；

在目标细胞储液孔c～f中接入针管，并用处理好的pdms薄片盖住储液孔，形成密封空间；然后将一定量的待分选单细胞样品滴加到进样孔中；

样品运输：接通直流电源，将主通道进样孔a中的样品电渗运输至主通道废液孔b内。当样品单细胞经过检测区时，检测区电阻值发生变化，进一步导致与该电路串联的电阻r两端的电压发生变化，产生电压变化信号，电压变化信号经过差分放大器元件(如ad621差分放大器)差分信号放大后输入至单片机，由单片机处理器对该信号采集、分析以及控制继电器动作，打开细胞分选通道电磁铁，使负压管中的负压作用与分选通道中；所述单片机处理器预先设置一动作电压值为u，延时值t，当有样品单细胞通过检测区在单片机处理器上产生的检测信号大于u时，单片机处理器控制继电器动作，按照单片机预设的逻辑顺序，将目标细胞储液孔c的外接电磁阀接通电源，使负压管的负压作用与分选通道c中，将单细胞分选至细胞分选通道3中，经过时间t后完成细胞在c储液孔的分选；当再有单细胞通过检测通道时，单片机按照此逻辑顺序依次动作，从而完成对单细胞的分选操控。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。