眼镜蛇毒细胞毒素‑4N的纯化制备方法及其应用与流程
本发明属于眼镜蛇毒细胞毒素领域，尤其涉及一种眼镜蛇毒细胞毒素-4n(ctx-4n)的纯化制备方法及其应用。
背景技术：
眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的毒液，其化学成分复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物活性。眼镜蛇细胞毒素(cytotoxin，ctx)又称眼镜蛇心脏毒素(cardiototxin)，是眼镜蛇毒的重要活性物质之一，约占蛇毒蛋白25％～40％，具有心脏毒、抑制骨吸收、引起可兴奋组织去极化、抗菌等生物活性，并诱导多种肿瘤细胞凋亡，不同区域不同蛇种蛇毒中含有组分的生物效应不尽相同。
从眼镜蛇中分离纯化ctx是研究其理化性质、毒性反应、药理作用、作用机制等的必要前提。在分离纯化ctx方面，国内外学者大都采用阳离子交换柱层析和凝胶过滤相结合的方法进行分离纯化，据此发现了ctx-i，ctx-ii，ctx-iii，ctx-iv(seq.id.no.2)，ctx-v等细胞毒素，然而，此种方法中，由于柱效的影响因素繁多，且很难加以控制，故重复性差，分离纯化后所得产品中往往含有其他蛋白物质，从而将影响细胞毒素生物活性的研究。
肝纤维化是慢性肝病损伤后，肝脏自我修复的一个过程`，造成肝纤维化的原因是大量的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)在肝脏内沉积，改变了肝脏的结构，破坏了肝脏的生理功能；而使ecm过多的在肝脏累积的原因是肝星状细胞hsc的激活，激活的hsc细胞会产生大量的ecm；过多的ecm会使肝脏发生纤维化，继续发展为肝硬化，肝功能衰竭等疾病。因此在肝纤维化的过程中hsc细胞有至关重要的作用，如何抑制其激活或者使其发生凋亡在抗肝纤维化过程中有着重大关联。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、可控的眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
眼镜蛇毒细胞毒素-4n在制备抗肝纤维化药物中的应用。
上述眼镜蛇毒细胞毒素-4n按以下方法制备：先采用deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱然后再利用sephadexg-50凝胶层析柱、macro-prephighs阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素-4n活性最高的峰作为下步分离的样品。
选取眼镜蛇毒细胞毒素-4n活性最高的峰采用cck-8实验方法，通过对hsc-t6细胞增殖抑制作用，用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验。
眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱洗脱分离；
(2)sephadexg-50凝胶层析柱洗脱分离；
(3)macro-prephighs阳离子交换柱洗脱分离。
步骤(1)按以下操作进行：将deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱用a液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱中，采用b液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用cck-8实验方法检测各峰对hsc-t6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用；a液为0.05m的tris-hclph8.5缓冲液；b液为0.05m的tris-hclph8.5+0.5mnacl的缓冲液。
样品的配制按以下操作进行：称眼镜蛇毒粗毒1g，加入10mla液溶解，将其放在4℃冰箱中待其全部溶解后，10000rpm，4℃离心，20min；用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。
步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml0.02mpbsph7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2阳滤器过滤，待用；sephadexg-50凝胶层析柱用0.02mpbsph7.5的缓冲液平衡12h，将前述蛋白样品上样于平衡好的sephadexg-50柱中，采用0.02mpbsph7.5按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用cck-8实验方法检测各峰对hsc-t6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。
步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1mlpb缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于pb缓冲液平衡好的macro-prephighs柱，采用缓冲液b按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用cck-8实验方法检测各峰对hsc-t6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱保存备用；平衡用的pb缓冲液为0.02m的磷酸二氢钠和0.02m的磷酸氢二钠按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液ph为6.5；缓冲液b为0.02mpbph6.5+0.5mnacl；溶解用的pb缓冲液ph4.0。
针对目前眼镜蛇毒细胞毒素-4n制备存在的问题，发明人建立了一种眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法，先采用deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱然后再利用sephadexg-50凝胶层析柱、macro-prephighs阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素-4n活性最高的峰作为下步分离的样品。其中，通过ctx-4n对hsc-t6细胞的增值抑制作用，发明人发现了眼镜蛇毒分离纯化过程中ctx-4n活性最强峰，蛋白质质谱法鉴定确认为ctx-4n。通过实验，发明人还确定了ctx-4n作用hsc-t6细胞随着浓度增加其对增殖抑制作用越强，呈剂量-效应关系，并计算出ic50为12.836±0.045μg/ml。细胞凋亡实验证明，ctx-4n对hsc-t6细胞有凋亡作用，使其发生凋亡的最小浓度为4μg/ml。研究表明，应用本发明可以获得电泳纯度的ctx-4n，其纯度高，活性高；hsc-t6增殖抑制和凋亡实验证明，ctx-4n对hsc-t6细胞有杀伤作用，提示肝纤维化发展过程ctx-4n会有抗肝纤维化的作用，具有重要的药用价值。
附图说明
图1是deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱分离纯化结果。
图2是deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱分离纯化后收集各峰蛋白对hsc-t6细胞的增殖抑制率。
图3是sephadexg-50凝胶层析柱分离纯化结果。
图4是sephadexg-50凝胶层析柱分离纯化后收集各峰蛋白对hsc-t6细胞的增殖抑制率。
图5是macro-prephighs阳离子交换柱分离纯化结果。
图6是macro-prephighs阳离子交换柱分离纯化后收集各峰蛋白对hsc-t6细胞的增殖抑制率。
图7是sds-page电泳鉴定结果。
图8是ph4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果。
图9是cck-8检测ctx-4n作用hsc-t6细胞的增殖抑制率。
图10是peannexinvapoptosisdetectionkiti检测ctx-4n作用hsc-t6细胞的凋亡率，图中：a：空白对照组，b：ctx-4n(1μg/ml)，c：ctx-4n(2μg/ml)，d：ctx-4n(4μg/ml)，e：ctx-4n(8μg/ml)，f：ctx-4n(16μg/ml)。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1仪器与试剂
电子分析天平(英国sartotius)，
1.2实验方法
1.2.1hsc-t6细胞培养
将hsc-t6细胞用含有10％的胎牛血清的dmem培养基培养，放置5％co2，37℃的培养箱中培养。取生长状态良好的hsc-t6细胞接种于96孔板中，每孔细胞量为1000个，待用。
1.2.2样品配制
称取眼镜蛇毒粗毒粉末1g，加入10ml0.05mtris-hclph8.5缓冲液溶解，放置4℃待其完全溶解后，10000rpm，4℃离心20min，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。
1.2.3分离纯化方法
(1)deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱洗脱分离
将deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱用a液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱中，采用b液按表1设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用cck-8实验方法检测hsc-t6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。a液为0.05mtris-hclph8.5的缓冲液，b液为0.05mtris-hclph8.5+0.5mnacl的缓冲液。
(2)sephadexg-50凝胶层析柱洗脱分离
将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml0.02mpbsph7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。sephadexg-50凝胶层析柱用0.02mpbs(ph7.5)的缓冲液平衡12h，将蛋白样品上样于平衡好的sephadexg-50柱中，采用0.02mpbs(ph7.5)按表2设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，做cck-8实验方法检测hsc-t6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。
(3)macro-prephighs阳离子交换柱洗脱分离
将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1ml0.02mpb缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于pb缓冲液平衡好的macro-prephighs柱，采用缓冲液b按表3设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用cck-8实验方法检测hsc-t6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱中保存备用。平衡所用pb缓冲液为0.02m的磷酸二氢钠(nah2po4)和0.02m的磷酸氢二钠(na2hpo4)按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液ph为6.5。缓冲液b为0.02mpb(ph6.5)+0.5mnacl。溶解所用pb缓冲液ph4.0。
1.2.4hsc-t6细胞增殖抑制实验
收集各蛋白峰，分别按1，5，10，20μg/ml的浓度去作用于hsc-t6细胞24h后，用cck-8试剂去检测。cck-8实验方法检测心脏毒素-4n作用hsc-t6细胞后增殖抑制，观察其对细胞的增殖抑制的影响。
1.2.5sds-page电泳
将macro-prephighs阳离子交换柱最后分离纯化后的最强活性ctx-4n峰冻干粉末，用超纯水溶解配成浓度为4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上样缓冲液(厂家：碧云天；货号：p0015l)混匀，置于沸水中水浴10min，上样于12％的sds-page胶中，其中浓缩胶部分所用电压为80v，分离胶部分所用电压为120v，当蛋白上样缓冲液的蓝色条带跑至距分离胶底1cm处时，停止电泳。考马斯亮蓝r-250染色1h后脱色。
1.2.6ph4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
将macro-prephighs阳离子交换柱最后分离纯化后的最强活性ctx-4n峰冻干粉末，用超纯水溶解配成浓度为4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上样缓冲液(取蒸馏水7.3ml，ph6.7缓冲液1.2ml，甘油1.0ml，0.5％(w/v)甲基绿溶液0.5ml，混匀，4℃保存；ph6.7缓冲液：取冰醋酸2.87ml，加水稀释，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至6.7，加水稀释至100ml，4℃保存。)上样于12％的sds-page胶中，其中浓缩胶部分所用电压为80v，分离胶部分所用电压为120v，当绿色甲基绿接近胶板底部时，停止电泳。考马斯亮蓝r-250染色1h后脱色。
1.2.7蛋白质质谱法鉴定蛋白
将电泳后的蛋白质条带切割下来，送至苏州普泰生物技术有限公司，用nano-lc-esi-ms/ms方法进行鉴定。
1.2.8ctx-4n对hsc-t6细胞的增殖抑制作用
取生长状况良好的hsc-t6细胞，向96孔板内加入100μl细胞液，每孔细胞数量为1000个，每组设置5个复孔，在37℃，5％co2的细胞培养箱内培养12h使细胞贴壁。细胞贴壁后取出96孔板，吸掉培养基，用1×pbs洗2两次后，按照实验分组设计分别加入不同浓度的ctx4n作用细胞，终浓度为0，1，2，4，8，16，32μg/ml。在培养箱中培养24h后，吸掉培养基，用1×pbs洗2两次，加入cck-8试剂，继续孵育1h，测定a450od值，根据公式算抑制率。抑制率＝[(对照组-实验组)/(对照组-空白组)]×100％(对照组：含有细胞的培养基、cck-8、没有ctx4n，实验组：含有细胞的培养基、cck-8、ctx4n，空白组：不含细胞和ctx4n的培养基、cck-8)
1.2.9ctx-4n对hsc-t6细胞的凋亡作用
取生长状态良好的hsc-t6细胞，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板，放入5％co2，37℃细胞培养箱，过夜培养待其贴壁后弃掉培养基，用1×pbs洗一次，加入含有ctx-4n的细胞培养去作用hsc-t6细胞，加入的ctx-4n的浓度为0，1，2，4，8，16μg/ml，每组设置3个复孔，在细胞培养箱中作用24h后，用peannexinvapoptosisdetectionkiti试剂盒方法用流式细胞仪去检测。具体是用0.25％的胰酶(不含edta)消化细胞，2000rpm离心5min，去除上清液，用预冷的1×pbs洗2次，2000rpm离心5min，加入1xbindingbuffer200μl轻轻吹打均匀细胞使其成为单细胞悬液，每组细胞样本浓度约为1×106个/ml，取100μl细胞悬液加入到流式管中，加入5μlannexinv-pe和5μ17-aad与细胞悬液轻轻混匀，避光孵育15min。孵育结束后每管加入400μl1xbindingbuffer混匀，并且在1h内完成流式细胞仪检测。凋亡试剂染料加入细胞设置对照：(1)只加5μlannexinv-pe，(2)只加5μ17-aad，(3)两者都不加。
2结果
2.1分离纯化结果
deae-sepharosecl-6b阴离子交换柱分离结果如图1和对hsc-t6细胞的增殖抑制实验结果如图2所示，作用hsc-t6细胞后，第i峰具有最强的抑制活性；sephadexg-50凝胶层析柱分离结果如图3和对hsc-t6细胞的增殖抑制实验结果如图4所示，作用hsc-t6细胞后，第iii峰具有最强的抑制活性；macro-prephighs阳离子交换柱分离结果如图5和对hsc-t6细胞的增殖抑制实验结果如图6所示，作用hsc-t6细胞后，第iv峰具有最强的抑制活性。
2.2电泳结果
macro-prephighs阳离子交换柱分离得到的ctx-4n活性，经sds-page电泳，从图4的结果中可以确定其纯度已达到电泳纯度，分子量大约为10kda。经ph4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从图5的结果中可以确定其纯度已达到电泳纯度。
2.3蛋白质谱鉴定
将电泳后的蛋白条带切割下来，送至苏州普泰生物技术有限公司，用nano-lc-esi-ms/ms方法进行分析鉴定。经分析比较与文献(long-senchangs-klandcc.molecularcloningandevohtionofthegenesencodingtheprecursorsoftaiwancobracardiotoxinandcardiotoxin-likebasicprotein[j].biochemicalgenetics2004，vol.42，nos.11/12)报道一致，确定蛋白质为ctx-4n(seq.id.no.1)，分子量约为9.605kd。
2.4对hsc-t6细胞增殖抑制的影响
表4结果其中1μg/ml浓度作用hsc-t6细胞的增殖抑制率与对照组相比差异无统计学意义(p＞0.05)；2，4，8，16，32μg/ml浓度作用hsc-t6细胞的增殖抑制率与对照组相比差异具有统计意义(p＜0.01)。从表4和图9的结果可以确定ctx-4n作用hsc-t6细胞随着浓度增加对其增殖抑制作用越强，呈剂量-效应关系，并计算出ic50为12.836±0.045ug/ml。
2.5对hsc-t6细胞凋亡的影响
ctx-4n作用hsc-t6细胞凋亡率检测显示，不同浓度的ctx-4n作用hsc-t6细胞24h后，细胞存在不同浓度的凋亡如图10所示，空白对照细胞的凋亡率为4.05±0.09％，当ctx-4n浓度为1，2μg/ml，细胞凋亡率为4.22±0.11％和7.16±0.18％，与空白对照组相比差异没有统计学意义(p＞0.05)；当ctx-4n为4，8，16μg/ml时，凋亡率分别为：15.23±0.29％，22.21±0.74％，40.39±1.13％，与空白对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.01)。从而得出ctx-4n使hsc-t6细胞发生凋亡的最小浓度为4μg/ml。
3结论
发明人建立一种从眼镜蛇毒分离纯化具有电泳纯度，活性高的细胞毒素-4n的方法并为其在抗肝纤维化中药理作用提供实验基础。
表1deae-sepharosecl-6b离子交换柱洗脱程序
表2spehadexg-50凝胶柱洗脱程序
表3macro-prephighs阳离子交换柱洗脱程序
表4ccn-8检测不同浓度的ctx-4n作用hsc-t6细胞的增殖抑制率
sequencelisting
<110>广西医科大学
<120>眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用
<130>眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用
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<170>patentinversion3.3
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