本发明涉及植物病害研究的农业技术领域，具体涉及到一种玉米穗腐、茎基腐等病害接种用带菌牙签的高效繁殖方法。
背景技术：
植物病害病原物、抗病性等鉴定是病害研究的重要内容，而接种菌的繁殖又是其不可缺少的重要环节，简便快速地获得优质、足量的接种菌是人们探索重要方面。用带菌牙签接种是现有植物病害病原物接种技术常用的方法之一。现有的带菌牙签繁殖方法就是先把牙签、培养基、培养皿或广口瓶灭菌，然后在无菌条件下将培养基倒入培养皿或广口瓶中，待培养基凝固后把牙签插入其中，然后接种培养。这种带菌牙签繁殖方法存在一些局限：①种菌与牙签结合不紧密，接种菌只是附着在牙签上，菌种容易因摩擦而脱落；②牙签上没有营养，不利于菌种在牙签上持续生长繁殖和不断地提供菌源；③由于用的是一些培养皿、广口瓶等器皿，不便于大量繁殖；④菌种往往先从培养基上某一接种点开始生长，然后再慢慢扩展至周围的培养基和牙签上，菌种长满器皿中所有牙签的速度较慢。
技术实现要素：
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种易于大量高效地繁殖接种用带菌牙签的新方法。
本发明的植物病害接种用带菌牙签的繁殖方法，包括如下步骤：
(1)准备菌种 无菌条件下将植物病原菌接种在PDA平板培养基上，25℃恒温培养7~8d，菌种长满平板后冷藏待用；
(2)浸泡麦粒 将麦粒放三角瓶中，用清水冲洗干净后，浸泡12~24 h，中间冲洗一次，待麦粒吸足水后，再用清水冲洗2~3次，然后篦去三角瓶中的水，盖上棉塞，待用；
(3)清洗牙签 将牙签在清水中浸泡12~24 h，用清水冲洗后在锅中用清水煮10~15min，倒掉煮水再用清水冲洗2~3次，待用；
(4)牙签渗入营养 将（3）处理后的牙签放在容器中，加足量清水淹过牙签，根据水量，按(1)中培养基制作的原料成份配比加入相应量的营养成份即去皮马铃薯小块和葡萄糖，一起煮20~30 min，待用；
(5)粘拌面粉 将小麦面粉加1%的琼脂粉放在干燥的容器中拌匀，然后将（4）处理后表面湿润的牙签放入面粉中搅拌，使牙签表面均匀地粘满面粉，待用；
(6)装袋灭菌 将（5）准备的牙签轻放在菌袋中，使牙签之间保持一定的空隙，装满后扎住菌袋口，与（2）准备的麦粒一起高压灭菌20 min，待用；
(7)麦粒拌菌 无菌条件下，先用接种针或接种环将（1）准备的菌种连同培养基一起划碎，再将其放入（6）处理后的装麦粒的三角瓶中，搅拌麦粒，摇动三角瓶，使菌种混匀并粘附在麦粒上，待用；
(8) 牙签接种 无菌条件下，将经（7）处理的带菌麦粒倒入经（6）灭菌的牙签袋中，轻轻扎住袋口，缓缓地转动并左右上下翻动袋子，以便使麦粒上的菌种充分粘着到牙签上，使麦粒均匀地分散在牙签之间的缝隙中，待用；
(9) 培养与保存 将（8）准备的接种后牙签袋放20~30℃温度下培养7~10d，待牙签表面长满了菌，即完成带菌牙签的培养，对暂时不用的带菌牙签先将菌袋放4℃条件下冷藏保存，使用时，将带菌牙签从菌袋取出，把连成一团的牙签轻轻分开即可。
所述PDA培养基制作的原料成份配比是：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，自来水1000ml。
与现有技术相比，本发明的优点在于：（1）可以进行大量繁殖；（2）多点接种，菌种在塑料袋的牙签和麦粒上多点同时生长，繁殖速度快；（3）由于牙签上粘着和渗入营养物质，菌种直接在其上生长，因而菌种不仅生长茂密，而且与牙签结合紧密，操作时菌种不易从牙签上因磨蹭而脱落；（4）接种后牙签上菌种可持续生长繁殖，能不断地为接种部位提供菌源，保证接种效果；（5）操作方便、高效，易于推广。
实施例1
采用本发明方法繁殖1000根带菌接种牙签，包括如下步骤：
(1)准备菌种 无菌条件下将禾谷镰刀菌接种在直径9cm培养皿内制作的PDA平板培养基上，25℃恒温培养7d，菌种长满平板后冷藏待用；
(2)浸泡麦粒 称取麦粒50g放在300ml三角瓶中，用清水冲洗干净后，浸泡12 h，中间换一次水，麦粒吸足水后，再用清水冲洗2次，然后篦去三角瓶中的水，盖上棉塞，待用；
(3)清洗牙签 取1000根一端尖、另一端钝圆带槽、木质疏松、表面粗糙的牙签在清水中浸泡24 h，然后放在锅中用清水煮10 min，倒掉煮水再用清水冲洗2次，待用；
(4)牙签渗入营养 将1000根清洗干净的牙签放在容器中，加1000ml清水淹过牙签，再在水中加入200g去皮马铃薯小块和20g葡萄糖，一起煮30 min，待用；
(5)粘拌面粉 称取小麦面粉50g和琼脂粉0.5g放在干燥的容器中拌匀，然后将用营养水煮过的牙签趁表面湿润时放入面粉中搅拌，使牙签表面均匀地粘满面粉，待用；
(6)装袋灭菌 将粘满面粉的牙签轻放在1个长36 cm、宽10cm的耐高压菌袋中，使牙签之间保持一定的空隙，装完后轻轻扎住菌袋口，与（2）浸泡好的麦粒一起高压灭菌20 min，待用；
(7)麦粒拌菌 无菌条件下，先用接种针或接种环将（1）准备的禾谷镰刀菌菌种和培养基一起划碎，再将其放入灭菌后的麦粒三角瓶中，搅拌麦粒，摇动三角瓶，使菌种混匀并粘附在麦粒上，待用；
(8)牙签接种 无菌条件下，将三角瓶中粘附有禾谷镰刀菌菌种的带菌麦粒倒入灭菌后的牙签袋中，轻轻扎住袋口，轻轻地转动并左右上下翻动袋子，以便使麦粒上的菌种充分粘着到牙签上，使麦粒均匀地分散在牙签之间的缝隙中，待用；
(9)培养与保存 将接种后牙签袋放20℃恒温下培养10d，待牙签表面长满了菌，即完成带菌牙签的培养。对完成培养但暂时不用的带菌牙签先将菌袋放4℃条件下冷藏保存，使用时，将带菌牙签从菌袋取出，把连成一团的牙签轻轻分开即可。
PDA培养基制作的原料成份配比是：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，自来水1000ml。
实施例2
采用本发明方法繁殖1000根带菌接种牙签，包括如下步骤：
(1)准备菌种 无菌条件下将禾谷镰刀菌接种在直径9cm培养皿内放置PDA平板培养基上，25℃恒温培养8d，菌种长满平板后冷藏待用；
(2)浸泡麦粒 称取麦粒30g放在300ml三角瓶中，用清水冲洗干净后，浸泡24 h，中间换一次水，麦粒吸足水后，再用清水冲洗3次，然后篦去三角瓶中的水，盖上棉塞，待用；
(3)清洗牙签 取1000根一端尖、另一端钝圆带槽、木质疏松、表面粗糙的牙签在清水中浸泡12 h，然后放在锅中用清水煮15 min，倒掉煮水再用清水冲洗3次，待用；
(4)牙签渗入营养 将1000根清洗干净的牙签放在容器中，加1000ml清水淹过牙签，再在水中加入200g去皮马铃薯小块和20g葡萄糖，一起煮20 min，待用；
(5)粘拌面粉 称取小麦面粉50g和琼脂粉0.5g放在干燥的容器中拌匀，然后将用营养水煮过的牙签、趁表面湿润时将牙签放入面粉中搅拌，使牙签表面均匀地粘满面粉，待用；
(6)装袋灭菌 将粘满面粉的牙签轻放在1个长36 cm、宽10cm的耐高压菌袋中，使牙签之间保持一定的空隙，装满后扎住菌袋口，与（2）浸泡好的麦粒一起高压灭菌20 min，待用；
(7) 麦粒拌菌 无菌条件下，先用接种针或接种环将（1）准备的直径为9cm的培养皿平板培养基菌种1/2的禾谷镰刀菌菌种和培养基一起划碎，再将其放入灭菌后的麦粒三角瓶中，搅拌麦粒，摇动三角瓶，使菌种混匀并粘附在麦粒上，待用；
(8) 牙签接种 无菌条件下，将三角瓶中粘附有禾谷镰刀菌菌种的带菌麦粒倒入灭菌后的牙签袋中，轻轻扎住袋口，轻轻地转动并左右上下翻动袋子，以便使麦粒上的菌种充分粘着到牙签上，使麦粒均匀地分散在牙签之间的缝隙中，待用；
(9) 培养与保存 将接种后牙签袋放30℃恒温下培养7d，待牙签表面长满了菌，即完成带菌牙签的培养。对完成培养但暂时不用的带菌牙签先将菌袋放4℃条件下冷藏保存，使用时，将带菌牙签从菌袋取出，把连成一团的牙签轻轻分开即可。
PDA培养基制作的成份配比实施例1。