本发明属于富油角毛藻的藻油提取
技术领域：
，具体来讲是涉及一种富油角毛藻的藻油高效提取方法。
背景技术：
：近年来，随着化石燃料日益减少，可再生的生物柴油备受关注。生物柴油的基本成分为脂肪酸酯，主要是通过转酯反应将甘油三酯或游离脂肪酸跟低级醇类反应而得。早期用于合成生物柴油的原料为大豆、油菜、葵花籽、玉米等油料作物但是这些可食用油成本太高。后来也有采用废弃食用油如动物油脂或烹饪后的植物油为原料的，然而受限于供应量，不能大规模应用。目前，各国普遍采用棕榈树、麻风树、可可树、棉籽、亚麻荠等非食用油料作物，我国境内富含油脂的黄连木、冠果、毛梾树等大型木本作物也广受关注。然而，木本作物生长缓慢，生物转化效率低，导致目前生物柴油的价格居高不下，难以普及应用。因此，含油量高、生物量大、易于培养且生物转化效率高的富油微藻成为研究者的新宠，也被看成是最有可能替代化石燃料的可再生油料资源，目前在藻类种质资源发掘、培养条件优化、成熟藻回收及生物柴油转化等环节均成为了研究热点。微藻为单细胞的浮游藻类，能在淡水或咸水里生长，具有良好的抗逆性，目前通常在边际土上培养，不会占用产粮耕地。微藻的生长非常迅速，每天可提升一倍的生物量，在指数生长期时的倍增时间会缩短到不到4h，单位面积下微藻年产量比目前产量最高的油料作物还要高7～23倍。早期人们关注微藻是因为多种微藻含有大量的不饱和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸(docosahex－aenoicacid，dha)和二十碳五烯酸(eicosapen－taenoicacid，epa)，均具有极高的经济价值。后来发现有些微藻所合成的长链饱和脂肪酸占据绝大比例，为合成生物柴油的绝佳原料，在生物能源方面也具有良好的应用前景。因此，对于富油微藻的高效提纯就显得意义重大，不仅在生物柴油应用方面具有良好的应用前景，分析其脂肪酸的含量和成分对其有效利用具有理论指导意义。角毛藻富含长链脂肪酸，在生物柴油等绿色能源行业具有良好的应用价值。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供了一种富油角毛藻的藻油高效提取方法，从富油角毛藻的人工快速培养再到藻油高效提取，设计流程合理，操作简单，提取率高。本发明的技术方案为：一种富油角毛藻的藻油高效提取方法，主要包括以下步骤：步骤一：角毛藻培养基制备：co(nh2)2(尿素)10-20mg，kh2po45-10mg，fec6h5o7·5h2o0.4-0.8mg，edta3-5mg，na2sio3·9h2o10-12mg，nahco3300-500mg，九二0植物生长刺激素3-5国际单位，vb10.1-0.3mg，vb60.1-0.3mg，vb120.05-0.09mg，柠檬酸铁铵1-2mg，znso4300-500mg，体积比2-4％的钼酸水溶液5-15ml，硫酸锰5-8mg，磷酸二氢钾5-15mg，氯化钾3-5mg，消毒后的海水1000ml，混合溶解后制备所述的培养基。步骤二：角毛藻的人工快速培养：选择角毛藻藻种，通过显微镜检查无其它异类杂藻、原生动物等，将角毛藻藻种接入装有培养基的培养容器中，接种密度为2-3×105cell/ml，密封培养容器并开始充气培养，培养过程中进行光照，光线照度为3000-4000lx；经过4-6天的培养，密度达4×106-5×106cell/ml即得到可用来提取藻油的角毛藻混合液，培养至生长稳定期，藻种的细胞内逐渐积累油脂。步骤三：藻油高效提取：将角毛藻混合液在转速为4000-6000r/min的作用下离心10-20min，过滤收集藻类物质，然后采用挤压膨化预处理得到膨化藻泥，将膨化物料与3-5倍量的水混合得到混合液，向混合液中加入0.02倍体积的碱性蛋白酶进行酶解，酶解后离心分离得到游离油、乳状液、水解液和残渣，将乳状液调ph值为中性，干燥后水分含量为3-5％，粉碎过筛80目，然后采用超临界co2进行破乳萃取，然后采用0.22μm超滤膜过滤后，即得到藻油。进一步的，所述的角毛藻藻种的选择标准为生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象。进一步的，所述的充气培养是指：以10-12l/min的速度充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为v空气∶v二氧化碳＝8∶1，夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行。进一步的，所述的超临界条件为挟带剂乙醇添加量为干燥后乳状液质量的16-20％，co2流量6-10l/min，萃取压力30-50mpa，萃取时间1-3h，萃取温度35-45℃。进一步的，所述的培养容器为圆柱形的塑料容器，圆柱直径为50-70cm，高度为100-120cm，可以加盖密封，盖子中间有带有开关的通气管，通气管连接通气系统，所述的通气系统分别分为空气控制系统和二氧化碳控制系统，分别对应连接空气和二氧化碳的通气管，为环形多管式结构，喷气孔向下深入容器可以减少液体在环形分布管上滞留，管内空气流速取20m/s左右，通气系统内设置有浓度传感器，从而更好的控制气体的浓度和体积，底部有过滤网连接的排液管道。进一步的，所述的培养容器消毒方式为高锰酸钾消毒。进一步的，所述的海水消毒方法为，将经过沉淀和沙滤的海水用300目的筛绢网过滤，然后给每1m3海水中加入300ml有效氯含量8-12％的次氯酸钠溶液，使海水中有效氯含量达到15-20mg/l，消毒24h后，在其中加入硫代硫酸钠30g，以中和余氯，即完成海水消毒。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：将角毛藻培养后得到的混合液离心、过滤收集，然后采用挤压膨化预处理得到膨化藻泥，进行酶解，干燥，然后采用超临界co2进行破乳萃取，超滤膜过滤得到藻油。本发明的方法对角毛藻中含有藻油的部分进行多重提取，显著提高提取效率。具体实施方式为便于对本发明的理解，下面将结合具体实施例为例做进一步的解释说明，实施例并不构成对本发明实施例的限定。实施例1：一种富油角毛藻的藻油高效提取方法，主要包括以下步骤：步骤一：角毛藻培养基制备：co(nh2)2(尿素)10mg，kh2po45mg，fec6h5o7·5h2o0.4mg，edta3mg，na2sio3·9h2o10mg，nahco3300mg，九二0植物生长刺激素3国际单位，vb10.1mg，vb60.1mg，vb120.05mg，柠檬酸铁铵1mg，znso4300mg，体积比2％的钼酸水溶液5ml，硫酸锰5mg，磷酸二氢钾5mg，氯化钾3mg，消毒后的海水1000ml，混合溶解后制备所述的培养基。步骤二：角毛藻的人工快速培养：选择角毛藻藻种，通过显微镜检查无其它异类杂藻、原生动物等，将角毛藻藻种接入装有培养基的培养容器中，接种密度为2×105cell/ml，密封培养容器并开始充气培养，培养过程中进行光照，光线照度为3000lx；经过4天的培养，密度达4×106cell/ml即得到可用来提取藻油的角毛藻混合液，培养至生长稳定期，藻种的细胞内逐渐积累油脂。步骤三：藻油高效提取：将角毛藻混合液在转速为4000r/min的作用下离心10min，过滤收集藻类物质，然后采用挤压膨化预处理得到膨化藻泥，将膨化物料与3倍量的水混合得到混合液，向混合液中加入0.02倍体积的碱性蛋白酶进行酶解，酶解后离心分离得到游离油、乳状液、水解液和残渣，将乳状液调ph值为中性，干燥后水分含量为3％，粉碎过筛80目，然后采用超临界co2进行破乳萃取，然后采用0.22μm超滤膜过滤后，即得到藻油。其中，所述的角毛藻藻种的选择标准为生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象。所述的充气培养是指：以10l/min的速度充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为v空气∶v二氧化碳＝8∶1，夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行。所述的超临界条件为挟带剂乙醇添加量为干燥后乳状液质量的16％，co2流量6l/min，萃取压力30mpa，萃取时间1h，萃取温度35℃。所述的培养容器为圆柱形的塑料容器，圆柱直径为50cm，高度为100cm，可以加盖密封，盖子中间有带有开关的通气管，通气管连接通气系统，底部有过滤网连接的排液管道。所述的培养容器消毒方式为高锰酸钾消毒。所述的海水消毒方法为，将经过沉淀和沙滤的海水用300目的筛绢网过滤，然后给每1m3海水中加入300ml有效氯含量8％的次氯酸钠溶液，使海水中有效氯含量达到15mg/l，消毒24h后，在其中加入硫代硫酸钠30g，以中和余氯，即完成海水消毒。实施例2：一种富油角毛藻的藻油高效提取方法，主要包括以下步骤：步骤一：角毛藻培养基制备：co(nh2)2(尿素)15mg，kh2po47.5mg，fec6h5o7·5h2o0.6mg，edta4mg，na2sio3·9h2o11mg，nahco3400mg，九二0植物生长刺激素4国际单位，vb10.2mg，vb60.2mg，vb120.07mg，柠檬酸铁铵1.5mg，znso4400mg，体积比3％的钼酸水溶液10ml，硫酸锰6.5mg，磷酸二氢钾10mg，氯化钾4mg，消毒后的海水1000ml，混合溶解后制备所述的培养基。步骤二：角毛藻的人工快速培养：选择角毛藻藻种，通过显微镜检查无其它异类杂藻、原生动物等，将角毛藻藻种接入装有培养基的培养容器中，接种密度为2.5×105cell/ml，密封培养容器并开始充气培养，培养过程中进行光照，光线照度为3500lx；经过5天的培养，密度达4.5×106cell/ml即得到可用来提取藻油的角毛藻混合液，培养至生长稳定期，藻种的细胞内逐渐积累油脂。步骤三：藻油高效提取：将角毛藻混合液在转速为5000r/min的作用下离心15min，过滤收集藻类物质，然后采用挤压膨化预处理得到膨化藻泥，将膨化物料与4倍量的水混合得到混合液，向混合液中加入0.02倍体积的碱性蛋白酶进行酶解，酶解后离心分离得到游离油、乳状液、水解液和残渣，将乳状液调ph值为中性，干燥后水分含量为4％，粉碎过筛80目，然后采用超临界co2进行破乳萃取，然后采用0.22μm超滤膜过滤后，即得到藻油。其中，所述的角毛藻藻种的选择标准为生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象。所述的充气培养是指：以11l/min的速度充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为v空气∶v二氧化碳＝8∶1，夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行。所述的超临界条件为挟带剂乙醇添加量为干燥后乳状液质量的18％，co2流量8l/min，萃取压力40mpa，萃取时间2h，萃取温度40℃。所述的培养容器为圆柱形的塑料容器，圆柱直径为60cm，高度为110cm，可以加盖密封，盖子中间有带有开关的通气管，通气管连接通气系统，底部有过滤网连接的排液管道。所述的培养容器消毒方式为高锰酸钾消毒。所述的海水消毒方法为，将经过沉淀和沙滤的海水用300目的筛绢网过滤，然后给每1m3海水中加入300ml有效氯含量10％的次氯酸钠溶液，使海水中有效氯含量达到17.5mg/l，消毒24h后，在其中加入硫代硫酸钠30g，以中和余氯，即完成海水消毒。实施例3：一种富油角毛藻的藻油高效提取方法，主要包括以下步骤：步骤一：角毛藻培养基制备：co(nh2)2(尿素)20mg，kh2po410mg，fec6h5o7·5h2o0.8mg，edta5mg，na2sio3·9h2o12mg，nahco3500mg，九二0植物生长刺激素5国际单位，vb10.3mg，vb60.3mg，vb120.09mg，柠檬酸铁铵2mg，znso4500mg，体积比4％的钼酸水溶液15ml，硫酸锰8mg，磷酸二氢钾15mg，氯化钾5mg，消毒后的海水1000ml，混合溶解后制备所述的培养基。步骤二：角毛藻的人工快速培养：选择角毛藻藻种，通过显微镜检查无其它异类杂藻、原生动物等，将角毛藻藻种接入装有培养基的培养容器中，接种密度为3×105cell/ml，密封培养容器并开始充气培养，培养过程中进行光照，光线照度为4000lx；经过6天的培养，密度达5×106cell/ml即得到可用来提取藻油的角毛藻混合液，培养至生长稳定期，藻种的细胞内逐渐积累油脂。步骤三：藻油高效提取：将角毛藻混合液在转速为6000r/min的作用下离心20min，过滤收集藻类物质，然后采用挤压膨化预处理得到膨化藻泥，将膨化物料与5倍量的水混合得到混合液，向混合液中加入0.02倍体积的碱性蛋白酶进行酶解，酶解后离心分离得到游离油、乳状液、水解液和残渣，将乳状液调ph值为中性，干燥后水分含量为5％，粉碎过筛80目，然后采用超临界co2进行破乳萃取，然后采用0.22μm超滤膜过滤后，即得到藻油。其中，所述的角毛藻藻种的选择标准为生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象。所述的充气培养是指：以12l/min的速度充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为v空气∶v二氧化碳＝8∶1，夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行。所述的超临界条件为挟带剂乙醇添加量为干燥后乳状液质量的20％，co2流量10l/min，萃取压力50mpa，萃取时间3h，萃取温度45℃。所述的培养容器为圆柱形的塑料容器，圆柱直径为70cm，高度为120cm，可以加盖密封，盖子中间有带有开关的通气管，通气管连接通气系统，底部有过滤网连接的排液管道。所述的培养容器消毒方式为高锰酸钾消毒。所述的海水消毒方法为，将经过沉淀和沙滤的海水用300目的筛绢网过滤，然后给每1m3海水中加入300ml有效氯含量12％的次氯酸钠溶液，使海水中有效氯含量达到20mg/l，消毒24h后，在其中加入硫代硫酸钠30g，以中和余氯，即完成海水消毒。实施例4：从深圳湾红树林海水中分离得到的富油角毛藻进行培养，然后通过实施例2的提取方法进行提取，然后通过实验对其油脂成分进行检测。1.取1ml过滤后的藻油，置于气相色谱样品管中，采用气相色谱－质谱联合分析仪(气相色谱仪为trace1300，质谱仪为traceisq，thermofisher，usa)进行分析。色谱柱为db-5ms毛细管柱(35m×250μm×0.25μm)，扫描荷质比范围为40～500。载气为he，流速1ml·min-1，进样量1μl；进样口温度280℃。升温条件为：初始温度70℃2min，然后以10℃·min-1升温到220℃，接着以3℃·min-1升温到260℃，然后以10℃·min-1升温到280℃，保持5min。以37种混合脂肪酸甲酯标准品(nu-chek-prep，inc.,usa)为参照。通过比对标准样品并计算峰面积，确定各组分的含量。2.经gc-ms分析，将质谱图跟脂肪酸甲酯标准品比较，确定藻油中所含脂肪酸的成分。气相图谱显示，富油角毛藻藻油中脂肪酸种类主要为14～18个碳原子的长链脂肪酸，出峰时间集中在第15分钟到20分钟之间，如图1所示，以37种脂肪酸甲酯混合标准品为参照，并经质谱库比对，确定图中的峰1～6分别为c14∶0、c15∶0、c16∶1、c16∶0、c18∶1和c18∶0，所得藻油脂肪酸成分分析表如下表(mg·ml-1)：c14c15c16c18合计组分11.622.1436.541.9452.243.结合以上数据可以看出，通过对该角毛藻的藻油成分分析可知，藻油中主要成分为c14∶0和c16两大类中短链脂肪酸，这种脂肪酸构成使这类藻油非常适合于生产生物柴油。因此所述的富油角毛藻的藻油高效提取方法在生物柴油生产方面具有非常重要的应用前景。最后说明：采用上述技术方案是为了便于理解本发明的实施例，本发明还可以有其他实施例，本发明的保护范围并不限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，所属
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的技术人员当可根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都属于本发明的权利要求的保护范围。当前第1页12