一个棉花产量性状关联的乙烯信号转导途径调节因子的制作方法

本发明属于生物技术应用领域，涉及一个棉花产量性状关联的乙烯信号转导途径调控因子。

背景技术：

作为世界纺织品生产基地，我国是世界最大的棉花消费国。随着我国人民生活水平的飞速提高和纺织品配额的取消，纺织品消费和出口保持着高速增长。进而每年对棉花的需求巨大，然后棉花种植面积不断减少，因此对棉花产量和品质的要求也越来越高。

由于棉花基因组的复杂性，先前对棉花产量性状的研究则是利用不同的群体组合进行qtl(quantitativetraitlocus)定位。jiang等(1998)利用一个海陆杂交的f2群体检测到影响单铃重的2个qtls。ulloa等(2000)在陆陆组合f2群体中筛选到了2个影响皮棉产量的qtls，3个衣分的qtls，2个籽指的qtls。shen等(2007)利用陆陆组合的重组自交系群体检测到了6个影响衣分的qtls。zhu等(2010)利用海岛棉染色体片段导入系il-15-5和il-15-5-1建立了f2和f2:3群体，检测到1个籽指和2个衣分qtls。lacape等(2013)通过海陆间ril群体，检测到61个与铃重、铃数、衣分等产量相关的qtls。

全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy；gwas)是以基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(singlenucleotideploymorphism，snp)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的相关性分析。利用全基因组关联分析挖掘和克隆农艺性状相关基因，已成为分子育种研究的热点。从2005年开始，该技术就被用于拟南芥开花和抗逆性方面的研究，并获得了拟南芥开花期(fri)和抗病性相关基因(rpm和rps)(aranzanaetal.2005)。在玉米方面，belo等(2008)对553份优良自交系的8,950的snp进行了gwas分析，鉴定出于油酸含量相关的位点。wang等(2016)利用玉米自交系的自然变异群体进行gwas分析，找到83个与玉米苗期抗旱性显著相关的遗传变异位点。在水稻方面，huang等(2011)利用illumina高通量测序技术对517份水稻地方种进行了重测序，利用全基因组关联分析方法对水稻的14个农艺性状进行研究，成功鉴定了80个性状关联的位点。同时，他们还对多达950份水稻群体的开花期和10个产量相关性状进行全基因组关联分析，获得了很多已知功能基因(huangetal.2012)。在大豆方面，zhou等(2015)对302份大豆野生、地方品种以及改良品种进行重测序和全基因组关联分析，找到了96个与之前报道的qtl有关联，同时还鉴别出含油量、株高和茸毛生成相关的新的关联位点。以上研究成果充分说明了全基因组关联分析鉴定农艺性状相关变异的有效性和准确性。

乙烯是一种无色、无味的气体植物激素，也是最早确立为植物生长调节物质之一(kepinskietal.2003)。随着研究的不断深入，人们发现乙烯对植物生长发育的很多过程都有影响，包括种子萌发、根毛和侧根的生长、开花、果实成熟以及叶片脱落、衰老等很多阶段(guoetal.2004)。同时，乙烯还可以在植物非生物胁迫和病原菌侵害的防御反应中起了重要作用。近年来，研究人员以拟南芥为模式植物来研究乙烯信号转导途径已经取得迅速发展。乙烯转导途径，是从内质网膜上的受体蛋白(etr1、etr2、ers1、ers和ein4)与乙烯分子结合开始的，接着抑制负调控组分ctr1(constitutivetripleresponse1)激酶的活性，然后正调控因子ein2(ethyleneinsensitive2)释放出乙烯信号通路，将信号传递到核心转录调控因子ein3/eil1，再传递到乙烯响应转录因子erf(ethyleneresponsefactor)，最后再由erf激活下游的靶基因从而调控植物的生长发育和防御反应(bissonetal.2011；lietal.2013)。此外，ein3/eil1蛋白的稳定性受到ebf1(ein3-bandingf-boxprotein1)和ebp2的泛素化降解。ein2可以促进ebf1和ebf2的降解，进一步稳定ein3的蛋白活性(anetal.2010)。

乙烯信号转导途径的下游事件主要由核蛋白ein3/eil1介导，调控了绝大部分的乙烯反应(chaoetal.1997；alonsoetal.2003)。乙烯的组成型“三重反应”(tripleresponse)作为乙烯反应强弱的形态学标准，主要表现为根和下胚轴伸长受到抑制、下胚轴加粗变成横向生长和顶端子叶弯曲生长。chao等(1997)利用拟南芥ein2和ein3功能缺失突变体证明了ein3在乙烯传导途径中位于ein2的下游，且ein3是一个乙烯传导的正调控因子。他们还在拟南芥中鉴定了5个eils蛋白家族，命名为eil1、eil2、eil3、eil4和eil5。其中eil1与ein3在序列上最为相似，且过量表达突变体表现出组成型乙烯反应(chaoetal.1997)。科研人员相继在烟草、番茄和水稻中也分别鉴定出5、4和6个ein3/eils转录因子(kosugiandohashi，2000；tiemanetal.2001；maoetal.2006)。在不同植物的组织中，几乎都能检测到ein3/eils转录因子的表达，但表达水平表现出些许差异。kosugi等(2000)在烟草检测nteils的表达水平，发现其在根、茎、叶和花器官中均有表达，且在根和茎中表达水平最高。tieman等(2001)检测在番茄果实发育期间，leeil1-3在根、茎、叶、花瓣和果实中表现为组成性表达，而leeil4随着发育持续上调表达，并且在果实诚实时表达最高。以上结果说明ein3/eils在表达模式上具有时空特异性，这也决定了该类基因在植物生长发育和抗逆性中起到不同的作用。另外，不同信号途径之间的相互作用也是植物生产发育和对抗外源刺激的重要调控机制。achard等(2007)发现乙烯通过调节ein3/eil1抑制赤霉素的积累，进而推迟植物的开花。在棉花研究中，研究人员发现乙烯和赤霉素等激素都会调控棉纤维的伸长(shietal.2006；xiaoetal.2010)。超长脂肪酸(vlcfa)位于乙烯合成途径上游，乙烯和vlcfa又能诱导果胶合成前体基因的表达而激活果胶合成途径，促进纤维及拟南芥根毛伸长(qinandzhu,2011)。

以上结果表明，乙烯信号转导途径中的核心转录因子ein3/eils基因在植物生长发育的过程中起了非常重要的作用。我们推测棉花中这类转录因子参与调控棉花胚珠和纤维的生产发育，从而影响棉花产量相关的农艺性状，这方面相关研究未见详细报道。

技术方案

本发明的目的是涉及一个棉花产量性状关联的乙烯信号转导途经调控因子。

本发明的另一目的是提供该乙烯信号转导途经调控因子的应用。

全基因组关联分析结果表明转录因子与棉花产量性状铃数、衣分和籽指密切关联。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

乙烯信号转导途径调节因子gheil，所述的乙烯信号转导途径调节因子gheil在四倍体陆地棉tm-1中的cdna序列为：seqidno.1，基因组序列为：seqidno.2，所述的乙烯信号转导途径调节因子gheil在基因组序列的184bp位置上存在一个snp突变，该snp突变与棉花产量性状之间的存在显著的相关性，snp位点的碱基从a变为c，对应的氨基酸从asn变为his；该位点碱基为c的型产量显著高于该位点碱基为a的基因型。

本发明所述的乙烯信号转导途径调节因子ghei在鉴定高产量陆地棉品种中的应用。

本发明所述的乙烯信号转导途径调节因子gheil在改良棉花产量性状中的应用。

本发明所述的乙烯信号转导途径调节因子gheil在通过基因工程手段培育棉花高产新品种中的应用。

一种用于检测本发明所述的snp位点的引物对，上游引物为：seqidno.5，下游引物为：seqidno.6。

本发明所述的引物对在筛选高产棉花品种中的应用。

一种筛选高产棉花品种的方法，检测所述的snp位点，选择该位点碱基为c的基因型的棉花即为高产棉花品种。

有益效果

本发明的优点表现在：

本发明通过棉花品种群体重测序和全基因组关联分析挖掘了一个与棉花产量性状铃数、衣分和籽指同时关联的基因。该基因是乙烯信号转导途径中核心的调控因子，ein3-like(eil)转录因子家族。该基因为乙烯信号转导途经中核心的调控因子gheil，属于ein3/eil类转录因子。该类基因通过调控乙烯信号转导途径来调节植物生产发育和对外界胁迫的抗性。本发明的乙烯信号转导途径调控因子gheil在全基因组关联分析中与棉花产量性状密切相关，推测其可能通过调控棉花种子发育或者纤维发育从而影响棉花产量。

本发明提供的gheil的cdna和基因组序列是通过pcr扩增所得(表1)，试验步骤简单易行。

gheil在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析由高通量测序所得。该基因在棉花根、茎、叶、胚珠和纤维组织均表达，是组成型表达的基因。

gheil中非同义突变的snp在品种群体中的基因型通过pcr方法进行了检测(表1)，较易操作、灵敏度高和准确性好。

根据gheil的不同snp基因型可以将品种群体分为两大类，结合群体之间的铃数、衣分和籽指性状数据进行统计学分析(表2)，证明该snp突变与棉花产量性状之间的存在显著的相关性。

附图说明

图1棉花不同产量性状gwas关联分析结果。

lp、bn和si分别代表产量性状衣分、铃数和籽指。红色箭头表示性状关联基因gheil上的snp位点。横坐标表示染色体上的位置(mb)，纵坐标表示snp位点关联的显著性，用-log10(pvalue)表示。

图2gheil在棉花不同组织和发育时期的表达水平。

横坐标代表不同组织，包括根(r)、茎(s)、叶(l)、胚珠(ovule)和纤维(fiber)。胚珠材料包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维材料包括开花后5到25天。

图3gheil的序列信息和两种单倍型的鉴定。

在品种群体中检测到gheil序列存在1个非同义突变的snp位点，在基因组序列的184bp位置上。snp位点的碱基从a变为c，对应的氨基酸从asn变为his。品种群体根据snp位点碱基a或者c基因型分为不同单倍型，标记为gheil^llb和gheil^hlb。llb表示低衣分和低铃数。hlb代表高衣分和高铃数。

图4gheil的不同单倍型之间产量性状的比较分析。

箱图代表品种群体的产量性状的分布情况。含有gheil^llb和gheil^hlb两种单倍型的品种分别是210和34个。蓝色代表单倍型gheil^llb的产量性状分布，橙色代表gheil^hlb的产量性状分布。方框内的横线代表性状分布的中值。**表示在0.05和0.01水平有差异。

具体实施方式

实施例1棉花产量性状关联的乙烯信号转导途经调控因子gheil的挖掘：

从2007到2009年，我们分别在河南安阳、江苏南京和新疆库车调查了258份现代品种或者品系的产量性状(铃数、衣分和籽指)。针对这258份棉花品种进行了全基因组重测序，获得2.54tb测序数据，平均测序深度2.5×。我们将这些序列比对到棉花陆地棉基因组序列，利用samtools软件进行全基因组snp的鉴定，共挖掘了1,871,401个高质量的snp(最小基因频率>0.05)用于后续分析。利用emmax软件，我们进一步进行全基因组关联分析，再根据p<1×10^-6筛选snp关联信号位点，并最终获得71个棉花产量性状关联位点。在这些关联位点中，我们发现了d08染色体上的一个snp信号关联位点(d08:3040023)可以同时关联铃数、衣分和籽指三个性状(图1)。这个snp位点正好处于基因外显子区，并造成了非同义氨基酸突变。该基因为乙烯信号转导途经调控因子gheil(gh_d08g0312)，属于乙烯信号转导途经调控因子。

实施例2乙烯信号转导调控因子gheil序列信息的获得：

从陆地棉基因组序列中获取了gheil(gh_d08g0312)的cdna序列和基因组序列。该基因只有一个外显子，不含有内含子。根据cdna两端设计基因全长引物，进行pcr扩增,上游引物为f1:seqidno.3,下游引物为r1:seqidno.4。pcr反应程序设定如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。然后将pcr扩增产物进行测序，测序结果与cdna进一步比对确定序列的准确性。

实施例3乙烯信号转导调控因子gheil在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析：

本实验采取了棉花不同组织和不同发育时期的rna样本进行转录组测序。样本材料包括了根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维组织包括开花后5到25天。利用illuminahiseq2500平台进行转录组测序，每个样本平均测序深度达到6gb。基因表达水平的计算是利用tophat软件(verson2.0.8)将测序得到的reads与陆地棉基因组进行比对，计算出的表达水平以每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数(fpkm)表示。结果见图2。结果表明该基因在棉花根、茎、叶、胚珠和纤维组织均表达，是组成型表达的基因。

实施例4乙烯信号转导调控因子gheil在鉴定高产量棉花品种和改良棉花产量性状中的应用：

根据snp位点在染色体上位置d08:3040023，在其两端250bp左右设计基因组扩增引物，上游引物为f2:seqidno.5,下游引物为r2:seqidno.6。利用该引物在258个品种的dna中进行pcr扩增并测序。pcr反应程序设定如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸7min。根据测序结果分析该snp位点上每个品种群体的基因型(图3)。snp位点的碱基从a变为c，对应的氨基酸从asn变为his。根据该snp位点碱基信息，将该位点为a的品种为低衣分和低铃数品种材料，标记为gheil^llb；将该位点为c的品种为高衣分和高铃数品种材料，标记为gheil^hlb。

经统计，我们鉴定出单倍型gheil^llb材料210个，单倍型gheil^hlb材料34个(表1)。利用t-test检测方法，我们计算了两组单倍型之间产量性状的相关性(图4)。结果显出，相比gheil^llb，单倍型gheil^hlb的铃数增产了11.77％，与铃数性状呈极显著正相关(p＝0.0027)；单倍型gheil^hlb的衣分增产了4.92％，与衣分性状呈极显著正相关(p＝0.0034)；单倍型gheil^hlb的籽指减产了4.83％，与籽指性状呈极显著负相关(p＝0.024)。这与棉花产量性状衣分和籽指之间呈负相关相符合。

通过以上结果可以看出，基因gheil在改良棉花产量性状和培育棉花高产新品种中具有重要的研究价值和应用前景。一方面可以根据基因gheil的两种单倍型设计分子标记，可以快速有效地鉴定棉花产量性状，在高产棉花品种选育研究中有很好的应用价值。另一方面，可以通过基因工程的手段将含有高产单倍型gheil^hlb的基因转入棉花品种中提高棉花产量，也可以将低产单倍型gheil^llb中的snp位点进行定点突变改造成高产单倍型从而培育出高产棉花新品种。

表1高产和低产单倍型在群体品种材料中的鉴定

<110>南京农业大学

<120>一个棉花产量性状关联的乙烯信号转导途径调节因子

<160>6

<210>1

<211>363

<212>dna

<213>四倍体陆地棉tm-1

<220>

<223>乙烯信号转导途径调节因子gheilcdna序列

<400>1

atgggaatttgtggggataagggtttcttcagtgctccacttggggaaaaagatgtggca60

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<210>2

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<213>四倍体陆地棉tm-1

<220>

<223>乙烯信号转导途径调节因子gheil基因组序列

<400>2

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<213>人工序列

<220>

<223>引物f1

<400>3

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<213>人工序列

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<223>引物f2

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<213>人工序列

<220>

<223>引物r2

<400>6

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