专利名称：EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及EBFl基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用。
背景技术：
植物激素乙烯信号转导中两个关键的转录因子EIN3/EIL1在蛋白水平上受到由两个F-Box类蛋白EBF1/EBF2所介导的泛素化降解调控。目前关于EBF1/EBF2基因功能的研究主要进展是被受体感知到的乙烯信号能够负调EBF1/EBF2蛋白积累(Plant Cell.2010Jul ；22(7) :2384-401.)，从而使其蛋白量减少。但是对于这两个基因的mRNA的研究还没有人进行深入的研究，只是2004年曾有人报道(Mol Cell. 2004 Jul 23 ； 15 (2) 173-83.)这两个基因的mRNA受到外切核酸酶EIN5的负调。EBFLEBF2基因成熟mRNA的3，UTR分别为695nt和590nt，至今为止还不清楚这么长的序列在生物体内是否具有某种特定的生物学功能。
发明内容
本发明的目的是提供EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表达中的应用。为了实现本发明目的，本发明的EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表达中的应用，其是将编码EBFl 3’ UTR的核苷酸序列与报告基因GFP编码序列重组得到一个结构为 GFP-3'UTR的重组基因然后整合至宿主基因组中，并随宿主基因组进行表达。其中，所述宿主为植物，优选为拟南芥等。前述编码EBFl 3，UTR的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有EBFl 3’ UTR同等功能的核苷酸序列。本发明还提供EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制植物生长发育中的应用。本发明还提供EBFl基因mRNA的3’UTR在获得乙烯不敏感型转基因植物中的应用以及EBFl基因mRNA的3’ UTR在抑制转基因植物中EIN3蛋白表达水平中的应用。过量表达EBFl基因3’ UTR的拟南芥植物体内EIN3蛋白水平显著下调，具有明显的乙烯不敏感表型。本发明首次发现了 EBFl基因的3，UTR具有负调植物基因表达的功能，将3，UTR 用于负调植物基因表达，具有以下优点3’ UTR为非编码序列其序列较短易于克隆，且植物过量表达3’ UTR后可产生与过量表达EBFl基因编码序列相同的生物学效应。
图1为载体pEGAD的结构示意图。图2为将EBFl 3，UTR与载体pEGAD连接后的重组基因结构。图3分别显示了转基因35S :GFP-EBF1U/Col-0以及转基因35S :GFP/Col_0拟南芥幼苗的三个部位，子叶、下胚轴、根尖的荧光强度。
图4为转基因植物mRNA及蛋白水平的检测结果。图5为转基因植物的三重反应。图6为转基因竹中EIN3蛋白水平的检测结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。实施例1 EBFl mRNA 3，UTR的功能研究构建一个新的重组基因。按照5，一 3，方向从EBFl终止密码子TGA开始选取了长度为643nt的一段序列，以拟南芥基因组DNA为模板扩增目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID No=I所示，扩增过程所使用的PCR反应体系为
权利要求
1.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制基因表达中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其是将编码EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因组中，随宿主基因组进行表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其是将编码EBF13’UTR的核苷酸序列整合至宿主基因组中目的基因的3’端。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述编码EBF13’UTR的核苷酸序列如 SEQ ID No 1 所示。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述宿主为植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主为拟南芥。
7.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制植物生长发育中的应用。
8.EBFl基因mRNA的3，UTR在获得乙烯不敏感型转基因植物中的应用。
9.EBFl基因mRNA的3，UTR在抑制转基因植物中EIN3蛋白表达水平中的应用。
全文摘要
本发明提供了EBF1基因mRNA的3’UTR在抑制基因表达中的应用，其是将编码EBF1 3’UTR的核苷酸序列与报告基因GFP重组后通过转基因整合至宿主基因组中，随宿主基因组进行表达，带有3’UTR的GFP与单独的GFP相比起蛋白产物明显减少。本发明还提供EBF1基因mRNA的3’UTR在调节植物生长发育中的应用。本发明首次发现了EBF1基因的3’UTR具有负调植物基因表达的作用。
文档编号A01H5/00GK102286482SQ20111011010
公开日2011年12月21日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者安丰英, 李文阳, 李红姜, 江志强, 郁晖, 郭红卫 申请人:北京大学