本发明属于生物技术领域，涉及具有催化dhap或d-g3p合成丙烯酸功能的酶及其应用。
背景技术：
丙烯酸(acrylicacid)，化学式为c3h4o2，是无色透明、味苦辣、带有刺激性气味的腐蚀性液体，能溶于水、乙醇及乙醚等，不耐光及热，有自聚性。丙烯酸是重要的有机化工原料,大部分用于生产丙烯酸酯(如丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯及辛酯等),少量用于生产高吸水性树脂、助洗涤剂和水处理剂等。丙烯酸及其酯系列产品可广泛应用于涂料、化纤、纺织、皮革、塑料、粘和剂、石油开采等各个领域。
丙烯酸主要采用化学方法生产。丙烯酸在20世纪30年代实现工业化生产。其生产历程经历了几个阶段：氯乙醇法、氰乙醇法、高压reppe法、烯酮法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法。前面几种工艺因技术和经济原因已经基本被淘汰。现在采用的丙烯氧化法是20世纪60年代发展起来的方法。所谓丙烯两步氧化法是在复合金属氧化物催化剂存在下,经空气氧化先生成丙烯醛,再进一步催化氧化成丙烯酸。
丙烯酸及其酯是现代有机化工中重要的基础原料和高分子单体，在精细化工的应用中占有相当重要的地位。尽管丙烯氧化法具有工艺先进、原料价格低廉、效率高等优点，发展迅速，在丙烯酸及其酯的生产中占据主导地位。然而，目前丙烯酸的生产原料归根结底还是来源于石油，其生产能耗高，污染较严重，加上石油资源日益匮乏，导致原料价格攀升，生产成本必然增加，因此可再生的生物基丙烯酸替代石油基丙烯酸是大势所趋。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)：
1)序列表中序列1所示的蛋白质；
2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在c末端或n末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。
编码上述蛋白质的dna分子也是本发明保护的范围。
上述dna分子是如下1)-3)中任一种的dna分子：
1)编码区为序列表中序列3所示的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
3)与1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
上述2)中严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，优选为在97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与序列1所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。
上述3)中限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化dhap或d-g3p缩合合成丙烯酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述1)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。
进一步地，上述核苷酸为dna或rna。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以单链的或者是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
或，扩增上述核酸分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化dhap(磷酸二羟基丙酮)或d-g3p(d-3-磷酸甘油醛)合成丙烯酸产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌催化dhap或d-g3p合成丙烯酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种催化dhap或d-g3p合成丙烯酸的产品。
本发明提供的产品，包括上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，如pet-28a等；在酵母中表达的载体，如yep系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的msxnd表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。
优选地，所述重组载体为在pet-28a载体的多克隆位点，插入序列表中序列3所示的核苷酸。可选的，克隆位点为ndei酶切位点和xhoi酶切位点。
上述重组菌包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。
上述产品中，所述产品为试剂盒；
或所述产品包括tpp和mgso4。
本发明第3个目的是提供一种催化dhap或d-g3p合成丙烯酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以dhap或d-g3p为底物，用上述蛋白催化合成丙烯酸。
上述方法中，所述催化反应的条件为25℃-37℃反应20h；
或所述催化反应的条件为30℃反应20h。
上述方法中，所述催化反应所需的ph值为7.4-8.2；
或所述催化反应的所需的ph值为8.2；
或所述催化所需的反应体系包括tpp和mgso4。
上述反应体系(200μl)如下：5mmdhap或d-g3p，2mmtpp(焦磷酸硫胺素)，6mmmgso4、1mg/ml上述纯化的ceasa蛋白和蛋白缓冲液(50mmtris-hcl，2mmedta，0.1％tritonx-100，ph8.2)混匀，得到反应体系。
本发明的实验证明，本发明发现一个新蛋白ceasa，可以用来催化dhap或d-g3p生成丙烯酸，有望实现生物法绿色生产丙烯酸。
附图说明
图1为重组质粒pet-28a-ceasa的质粒图谱示意图。
图2为ceasa纯化sds-page示意图。
图3为丙烯酸标准品lc-ms分析的色谱图。
图4为对照样品产物lc-ms分析的色谱图。
图5为ceasa催化d-g3p产物lc-ms分析的色谱图。
图6为丙烯酸标准品hplc分析的色谱图。
图7为ceasa催化dhap产物hplc分析的色谱图。
图8为ceasa催化d-g3p产物lc-ms分析的质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。
实施例1、ceasa蛋白的获得
1、ceasa基因获得
在nocardiasp.bmg51109中发现ceasa基因，其核苷酸序列为序列1，该基因编码的蛋白为ceasa蛋白，其氨基酸序列为序列2，在不改变ceasa氨基酸序列的前提下，将上述野生型ceasa基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后ceasa基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列为序列3。
2、表达载体的构建
将序列3所示的优化后ceasa基因替换pet-28a载体(novagen，kan+，见图1)酶切位点ndei和xhoi之间的dna片段，得到重组质粒，命名为pet-28a-ceasa。
3、基因的表达
为了体外检测ceasa酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。
(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pet-28a-ceasa转入e.colibl21(de3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(kan+，100mg/ml)，37℃过夜培养；
(2)挑单克隆至5mllb液体培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220r/min培养至od600为0.6-0.8。将5mllb培养基中菌液转接至800ml2yt培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220rpm培养至od600为0.6-0.8时，降温至16℃，加iptg至终浓度0.5mm，诱导表达16h；
(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；
(4)弃上清，用35ml蛋白缓冲液(50mmtris-hcl，2mmedta，0.1％tritonx-100，ph7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50ml离心管中，-80℃冰箱保存。
4、蛋白纯化
(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对于上述3得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；
(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
a：柱平衡：挂上清前，先用ddh2o洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡ni亲和层析柱1个柱体积；
b：上样：将上清按0.5ml/min流速缓慢经过ni亲和层析柱，再重复一次；
c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50ml含50mm咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
d：洗脱目的蛋白：分别用20ml含100mm，200mm，300mm咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％sds-page检测，结果如图2所示。
(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mlamicon超滤管(30kda，millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1ml。加10ml蛋白缓冲液，浓缩至1ml，重复该过程1次，得到纯化蛋白ceasa。
(4)用nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/ml。即得到纯化浓缩的ceasa蛋白，其氨基酸序列为序列2。
实施例2、ceasa蛋白在催化dhap或d-g3p合成丙烯酸中的应用
1、ceasa催化dhap或d-g3p缩合合成丙烯酸
反应方程式如下1)或2)：
2、ceasa酶活性检测
对照组：反应体系(200μl)如下：5mmdhap或d-g3p，2mmtpp(焦磷酸硫胺素)，6mmmgso4和蛋白缓冲液(50mmtris-hcl，2mmedta，0.1％tritonx-100，ph8.2)混匀，得到反应体系。
ceasa组：反应体系(200μl)如下：5mmdhap或d-g3p，2mmtpp(焦磷酸硫胺素)，6mmmgso4、1mg/ml实施例1制备纯化的ceasa蛋白和蛋白缓冲液(50mmtris-hcl，2mmedta，0.1％tritonx-100，ph8.2)混匀，得到反应体系。
将上述各组反应体系混匀后于30℃反应20h。反应结束后，12000rpm离心2min,所得上清液用0.22μm滤器过滤后，进行hplc或hplc-ms检测。
丙烯酸标准品购自sigma-aldrich公司。
上述hplc检测条件：
色谱柱：aminexhpx-87hionexclusioncolum(300mm×7.8mm)，紫外检测器，检测波长210nm。
流动相：5mm硫酸
柱温：35℃
流速：0.6ml/min
上述hplc-ms检测条件：
a)hplc：
色谱柱：waterssunfirec18(4.6×250mm)column，紫外检测器，检测波长210nm。
流动相：90％10mm乙酸铵/10％甲醇
柱温：35℃
流速：1ml/min
b)ms检测条件：
负离子模式；
ionsourcegas1:55psi
ionsourcegas2:55psi
curtaingas:35psi
ionsprayvoltagefloating:4500v
interfaceheatertemperature:550℃。
图3为丙烯酸标准品lc-ms分析的色谱图。图4为对照组产物lc-ms分析的色谱图。图5为ceasa组催化d-g3p的产物lc-ms分析的色谱图。图6为丙烯酸标准品hplc分析的色谱图。图7为ceasa组催化dhap的产物hplc分析的色谱图。图8为ceasa组催化d-g3p产物lc-ms分析的质谱图。
可以看出，ceasa催化5mmd-g3p得到28.61mg/l的丙烯酸,催化5mmdhap得到1.73mg/l的丙烯酸，因此，30℃下，1mg/ml的ceasa酶20h能够催化5mmd-g3p产生28mg/l的丙烯酸。
对照例：
ceas2(ec2.5.1.66)：n2-(2-carboxyethyl)argininesynthase是streptomycesclavuligerus棒酸生物合成中的tpp依赖性的酶。
按照实施例2的方法，将ceas2替换ceasa，催化dhap或d-g3p生成丙烯酸，结果ceas2在30℃下，1mg/ml的酶20h可以催化5mmd-g3p得到6.67mg/l的丙烯酸,催化5mmdhap得到7.06mg/l的丙烯酸。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>具有催化dhap或d-g3p合成丙烯酸功能的酶及其应用
<160>3
<170>patentinversion3.5
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