生产低聚果糖的方法与流程

本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种生产低聚果糖的方法。

背景技术：

低聚果糖(fos)又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：g-f-fn，n＝1～3(g为葡萄糖，f为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-1-2糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体，包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较少(<1％)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶(果糖基转移酶)可得到高纯度、高产量的低聚果糖。果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖催化获得蔗果三糖等低聚糖。在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。

目前通过果糖基转移酶催化蔗糖生产获得的低聚果糖纯度只有50-60％。其中，生产的低聚果糖中葡萄糖和果糖(1-3％)占25-38％，蔗糖占9-25％，而由于糖浆内杂有葡萄糖、蔗糖和少量果糖，影响了低聚果糖生理功能。大部份低聚果糖特有的生理功能是用高纯度的低聚果糖作实验而得出的结论，而纯度不高时影响其应用。如纯度为50％的低聚果糖浆，糖尿病患者食用后血糖会很快升高，空腹食用30ml，30min后血糖很快从4.20mmol/l至5.84mmol/l，而空腹食用纯度为93％的低聚果糖糖浆，30min后血糖波动很小，从4.12mmol/l至4.18mmol/l。

果糖基转移酶催化底物蔗糖生成低聚果糖过程中，会产生葡萄糖，葡萄糖和底物蔗糖对于果糖基转移酶属于竞争性抑制的关系，这严重影响了低聚果糖的纯度。因此，开发高纯度低聚果糖的制备方法的对于高纯度低聚果糖的生产及应用具有重要意义。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种生产低聚果糖的方法，采用本发明的方法所生产的低聚果糖，其纯度可高达90％左右，对其工业化生产及应用具有重要意义。

在一方面，本发明提供了一种生产低聚果糖的方法，包括以下步骤：

(1)采用连接肽连接果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中进行融合表达，得到融合蛋白；

(2)将步骤(1)得到的所述融合蛋白和过氧化氢酶加入蔗糖水溶液中混匀，进行催化反应，得到低聚果糖，其中，低聚果糖的纯度为70-90％。

进一步地，在步骤(1)中，融合表达包括以下步骤：

(s1)通过pcr获得葡萄糖氧化酶基因，在获得的葡萄糖氧化酶基因的基础上通过含有连接肽的引物扩增获得含有连接肽基因的葡萄糖氧化酶基因；

(s2)通过pcr获得果糖基转移酶基因，在其基础上，采用含有连接肽的引物进行扩增获得含有连接肽基因的果糖基转移酶基因；

(s3)将步骤(s1)和步骤(s2)获得的基因作为混合模板，扩增获得果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶的融合基因片段god-fru基因；

(s4)用限制性内切酶双酶切质粒和god-fru基因，连接、转化后获得重组质粒；限制性内切酶为ecori和noti；质粒为ppic9k；

(s5)将重组质粒电转化宿主菌后进行发酵培养，然后在宿主菌中进行融合表达。

进一步地，在步骤(1)中，连接肽由3-30个氨基酸构成。

进一步地，氨基酸为甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、脯氨酸(pro)和谷氨酸(glu)中的一种或几种。

进一步地，连接肽的氨基酸序列gly-gly-gly、gly-gly-ala-gly、gly-gly-gly-gly-gly-gly、gly-gly-gly-gly-gly-ser、gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala、gly-gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala、gly-gly-thr-ala-gly-ala-gly-ala-ala、gly-ala-thr-gly-thr-ala-glu-gly-pro-ser、gly-ala-ala-gly-ala-thr-gly-thr-ala-glu-gly-pro-ser-gly-ala-thr或gly-gly-thr-ala-gly-ala-gly-ala-ala-gly-ala-thr-gly-thr-ala-glu-gly-pro-ser-gly-ala-thr-gly-thr-ala-glu-gly-pro-ser。

优选地，连接肽的氨基酸序列为gly-gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala。

进一步地，在步骤(1)中，宿主菌为毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或大肠杆菌(escharichiacoli)。

优选地，宿主菌为毕赤酵母(pichiapastoris)或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

进一步地，在步骤(1)中，果糖基转移酶来源于黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(a.oryzae)、甜菜或菊粉。

进一步地，在步骤(1)中，葡萄糖氧化酶来源于黑曲霉(aspergillusniger)或拟青霉属。拟青霉属为paecilomycesamagasakiense、p.funicullosum、p.canescens或p.pinophilum。

进一步地，在步骤(2)中，过氧化氢酶来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、黑曲霉(aspergillusniger)或嗜热子囊菌(thermoascusauraniacu)。

进一步地，过氧化氢酶通过野生菌表达生产或通过表达宿主异源表达生产，表达宿主为b.subtilis或p.pastoris。

进一步地，在步骤(2)中，反应体系中的过氧化氢酶的终浓度为100-2000u/ml。优选地，过氧化氢酶的终浓度为300-1000u/ml。

进一步地，在步骤(2)中，蔗糖水溶液的浓度为20-800g/l。优选地，蔗糖水溶液的浓度为50-300g/l。

进一步地，在步骤(2)中，在温度为20-65℃，ph为4.0-8.0的条件下反应1-40h。

本发明将果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达，并基于融合表达体添加过氧化氢酶的复合型酶催化生产高纯度低聚果糖。借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明提供的一种重组果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合蛋白；(2)获得的果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合蛋白可高效催化蔗糖生产高纯度低聚果糖；(3)融合蛋白与过氧化氢酶联合使用催化蔗糖生产低聚果糖，低聚果糖的纯度最高可达90％。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明融合表达重组质粒构建示意图；

图2图示了果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达对低聚果糖纯度的影响；

图3图示了添加过氧化氢酶对低聚果糖纯度的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达

图1是本发明融合表达重组质粒构建示意图，其具体构建过程如下：

将a.niger来源的葡萄糖氧化酶与果糖基转移酶基因，通过pcr方法得到含有连接肽gly-gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala的片段god-fru基因。具体方法如下：

(1)首先通过pcr获得葡萄糖氧化酶基因，在获得的葡萄糖氧化酶基因的基础上通过含有连接肽的引物扩增获得含有连接肽基因的葡萄糖氧化酶基因，其中，葡萄糖氧化酶基因扩增引物：上游引物为5’-ccggaattcatgcagactctccttgtgag-3’，下游引物为：5’-ttcatagctgcacctgcacctgcacctccctgcatggaagcataat-3’。

(2)然后通过pcr获得果糖基转移酶基因，在其基础上，采用含有连接肽的引物进行扩增获得含有连接肽基因的果糖基转移酶基因，其中，果糖基转移酶基因扩增引物为：上游引物为5’-atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt-3’，下游引物为：5’-atgcaggggaggtgcaggtgcaggtgcagctatgaagcttcaaacggctt-3’。

(3)然后采用以下引物：上游引物为5’-atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt-3’，下游引物为：5’-ttcatagctgcacctgcacctgcacctccctgcatggaagcataat-3’，将上述通过pcr获得的含有连接肽基因的葡萄糖氧化酶基因和含有连接肽基因的果糖基转移酶基因作为混合模板，扩增获得果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶的融合基因片段god-fru基因。基因pcr反应体系为：dntps(2.5mm)4μl，上下游引物各1μl，10×pfutaqbuffer5μl，模板1μl，pfutaq0.5μl，加水至50μl反应体系。pcr反应条件为：预变性94℃，4min，高温变性95℃，30s，低温退火55℃，1min，适温延伸72℃，4min，30个循环；最后延伸72℃，10min。

(4)用限制性内切酶ecori和noti双酶切质粒ppic9k和胶回收的pcr基因片段，连接、转化，获得重组质粒。电转化p.pastorisgs115感受态，获转化子，即得到果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体，摇瓶发酵分析重组酶果糖基转移酶酶活力和葡萄糖氧化酶酶活力，其酶活力分别为25.70和0.12u/ml。

实施例2果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达对提高低聚果糖纯度的影响

将实施例1表达出的重组酶果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体加入蔗糖水溶液中，蔗糖浓度为100g/l。在45℃，ph5.5(使用0.1mol·l^-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节ph)条件下保温反应18h。经检测，结果见图2，图中的曲线分别代表添加重组酶以及仅使用果糖基转移酶对低聚果糖纯度的影响。从图中可以看出，随着反应时间的延长，使用重组酶生产低聚果糖的纯度逐渐增加并高于野生酶的低聚果糖的含量。反应4h时，重组酶的低聚果糖纯度是野生酶的低聚果糖纯度的1.40倍。反应16h时，使用重组酶的低聚果糖纯度达到最高51.23％，是此时野生酶的低聚果糖含量的1.27倍。

实施例3添加过氧化氢酶对融合表达体生产低聚果糖纯度的影响

将表达出的重组酶果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体加入蔗糖水溶液中，蔗糖浓度为100g/l。同时，在反应体系中添加b.subtilis来源的过氧化氢酶，过氧化氢酶在反应体系中的终浓度为781u/ml。将上述反应体系在45℃，ph5.5(使用0.1mol·l^-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节ph)的条件下保温反应24h。检测结果见图3，图中的曲线分别代表添加上述重组酶和过氧化氢酶以及仅使用果糖基转移酶对低聚果糖纯度的影响。从图中可看出，添加后低聚果糖纯度大幅度提高，反应22h时，低聚果糖纯度最高达90％，是野生酶的低聚果糖纯度的2倍。

实施例4葡萄糖氧化酶基因的扩增方法

将实施例1中步骤(1)的葡萄糖氧化酶基因的合成引物换成以下引物，其中，上游引物：5’-atgcagactctccttgtgag-3’；下游引物：5’-tcactgcatggaagcataat-3’。

以a.nigersg610的基因组dna为模板，葡萄糖氧化酶基因pcr反应体系为：dntps(2.5mm)4μl，上下游引物各1μl，10×pfutaqbuffer5μl，模板1μl，pfutaq0.5μl，加水至50μl反应体系。pcr反应条件为：预变性94℃4min，高温变性95℃30s，低温退火55℃1min，适温延伸72℃4min，30个循环；最后延伸72℃10min，获得葡萄糖氧化酶基因。

其他方法同实施例1，得到果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体，其中，连接肽为gly-gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala。

实施例5果糖基转移酶基因的扩增方法

将实施例1中步骤(2)的果糖基转移酶基因的合成引物换成以下引物，其中，上游引物：5’-ccggaattcatgaagcttcaaacggctt-3’；下游引物：5’-ataagaatgcggccgcttagtgatgatgatgatgatgagactgacgatccggc-3’。

以a.nigersg610的果糖基转移酶cdna为模板，果糖基转移酶基因pcr反应体系为：10×extaqbuffer5μl，dntps(2.5mm)4μl，上下游引物各1μl，模板(cdna)1μl，extaqdna聚合酶0.25μl，加水至50μl反应体系。果糖基转移酶基因pcr反应条件为：预变性94℃4min；高温变性95℃30s，低温退火55℃1min，适温延伸72℃2min，循环30次；最后72℃延伸10min，获得果糖基转移酶基因。

其他方法同实施例1，得到果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体。其中，连接肽为gly-gly-ala-gly-ala-gly-ala-ala。

实施例6果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达

本实施方法同实施例1，区别在于：将实施例1第(1)步中葡萄糖氧化酶基因的上下游引物换成：上游引物为ccggaattcatgcagactctccttgtgag；下游引物为ttcattccacctccacctccaccctgcatggaagcataat，第(2)步中果糖基转移酶基因的上下游引物换成：上游引物为atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt；下游引物为ataagaatgcggccgcttagtgatgatgatgatgatgagactgacgatccggc，第(3)步中的上下游引物分别换为上游引物为atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt和下游引物为ttcattccacctccacctccaccctgcatggaagcataat。其他方法同实施例1，本实施例得到的果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体，其中连接肽为gly-gly-gly-gly-gly-gly。

实施例7果糖基转移酶与葡萄糖氧化酶融合表达

本实施方法同实施例1，区别在于：将实施例1第(1)步中葡萄糖氧化酶基因的上下游引物换成：上游引物为ccggaattcatgcagactctccttgtgag；下游引物为ttcatagctgcacctgcacctgctgtacctccctgcatggaagcataat，第(2)步中果糖基转移酶基因的上下游引物换成：上游引物为atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt；下游引物为atgcaggggaggtacagcaggtgcaggtgcagctatgaagcttcaaacggctt，第(3)步中的上下游引物分别换为上游引物为atgcagggtggaggtggaggtggaatgaagcttcaaacggctt和下游引物为ttcatagctgcacctgcacctgctgtacctccctgcatggaagcataat。其他方法同实施例1，本实施例得到的果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶融合表达体，其中连接肽为gly-gly-thr-ala-gly-ala-gly-ala-ala。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。