一种用于肝癌诊疗的生物标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于肝癌诊疗的生物标志物，具体的涉及生物标志物LINC00511。

背景技术：

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是成人肝脏恶性肿瘤中最常见的疾病，虽然肝癌的治疗技术不断提升，如手术切除、肝移植、放化疗，但肝癌患者总体5年生存率至今仍未明显改善。肝癌病死率高、预后差的重要原因之一就是肝癌发生发展的分子机制目前仍然知之甚少。然而，随着现代细胞分子生物学的进展，现已证明肝癌的形成多伴随一系列分子及信号通路的异常。因此，从分子水平探索肝癌发生发展的机制，并将特征性分子作为抗肿瘤靶点，可为临床预防和治疗肝癌开辟新的途径。

随着微阵列技术和核酸测序技术的飞速发展，科学家发现人类基因组中仅有2％的序列编码产生蛋白质，蛋白编码基因数目不足3万个，而其余的近98％的基因组序列却转录产生了大量且种类繁多的非编码RNA，这些ncRNA是机体内错综复杂的调控网络的重要组成部分。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类能在多种生物学过程中发挥调控作用的大分子ncRNA。其分布广泛，长度一般多于200个碱基，由于缺少有效开放阅读框(ORF)而无或很少有编码蛋白的能力。作为分子生物学中的一个全新领域，lncRNA是以RNA的形式在多个层面上发挥调控基因表达的作用，主要是在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控三个层面进行调控。作为哺乳动物转录组的重要组成部分，lncRNA的功能目前还有待深入研究。最初lncRNA被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，是基因组转录的“噪音”、“暗物质”，不具有生物功能。但近年来的研究结果显示，lncRNA在细胞正常生理活性中的重要作用以及参与到多种肿瘤和其他疾病的发生发展。lncRNA不仅参与到核内运输、转录调控、蛋白降解、基因组印记及X染色体沉默等细胞生理活动中，还与乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、淋巴性白血病等疾病的发病机制有关。lncRNA可通过基因印记、染色质重构、剪切调控、mRNA降解和翻译调控等机制来实施其功能。虽然了lncRNA相关研究近年来取得了进展，但其功能及作用机制仍有待进一步探索。研究lncRNA主要方法和工具包括芯片、RNA测序、实时定量PCR,Northern blotting、原位杂交、RNAi，RIP和生物信息学预测等。研究技术的开发和利用对于生物学机制的研究是非常关键的。

lncRNA广泛存在于多种组织中，其表达具有组织特异性和时空特异性。组织特异性是指不同组织之间的lncRNA表达量不同；时空特异性是指在相同的组织或器官的不同发育阶段，其中的lncRNA表达量也会变化。有人对小鼠脑部的1,300个lncRNA的表达特异性进行研究，发现在组织发育过程中脑组织的不同部位具有不同的表达模式，进一步证明lncRNA表达的时空特异性。同时，lncRNA在肿瘤和其他疾病中也具有特异性的表达模式。目前针对lncRNA在癌症领域中的研究仍处在起步阶段，探寻lncRNA在肝癌中的作用具有重要意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断早期肝癌的产品，使患者在早期就得以治疗，进而提高生存率和生活质量。

本发明的目的之二，提供一种分子标志物，作为临床应用的检测或治疗指标。

本发明的目的之三，提供一种治疗手段和药物组合物，实现肝癌的精准分子治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种LINC00511基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。

进一步，所述LINC00511在肝癌患者中表达上调。

进一步，所述产品能够通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC00511的表达水平。

其中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增LINC00511基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增LINC00511基因的引物；所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括：与LINC00511基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肝癌的产品包括与LINC00511基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异性扩增LINC00511基因的引物，在本发明的具体实施方式中所述引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品能够通过检测样本中LINC00511的表达水平来诊断肝癌。所述“样本”包括(但不限于)细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。

进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LINC00511转录水平的针对LINC00511的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测LINC00511转录水平的引物或芯片。

固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括LINC00511基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

本发明提供了一种LINC00511基因的用途，用于制备预防或治疗肝癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括LINC00511功能性表达的抑制剂，所述抑制剂能够抑制LINC00511或涉及LINC00511上游或下游途径的物质的表达。

进一步，所述抑制剂是针对LINC00511的siRNA。

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括LINC00511功能性表达的抑制剂，所述抑制剂可以在DNA水平或RNA(即基因产物)水平上起作用。

进一步，所述药物组合物还包括与LINC00511功能性表达的抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明提供了一种LINC00511基因的用途，用于筛选预防或治疗肝癌的潜在物质。

进一步，筛选预防或治疗肝癌潜在物质的步骤包括：

候选物质处理表达或含有LINC00511基因的体系；和

检测所述体系中LINC00511基因的表达；

其中，若所述候选物质可降低LINC00511基因的表达或活性(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上，更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。

进一步，上面所述的体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，siRNA可以包括部分纯化的RNA、相当纯的RNA、合成的RNA、或重组产生的RNA、以及通过添加、删除、替换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的经改变了的RNA。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料至例如siRNA的末端(一个或多个)或至siRNA的一个或多个内部核苷酸，包括使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰。

本发明在筛选有效的siRNA序列时，通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。在本发明的具体实施方式中，本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞实验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。

本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的LINC00511过表达，通过降低LINC00511的表达，从而治疗因LINC00511表达上调导致的肝癌。

在本发明中，可将抑制LINC00511表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含抑制LINC00511表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。

本发明的药物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于本发明的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。在人类中，该基因具有17个注释转录本(或剪接变体)：长2265bp的LINC00511-018(Ensembl中的转录本ID为ENST00000581549.1)、长1716bp的LINC00511-002(Ensembl中的转录本ID为ENST00000453722.6)、长1696bp的LINC00511-009(Ensembl中的转录本ID为ENST00000457958.6)、长908bp的LINC00511-011(Ensembl中的转录本ID为ENST00000578206.1)、长757bp的LINC00511-013(Ensembl中的转录本ID为ENST00000583460.1)、长657bp的LINC00511-016(Ensembl中的转录本ID为ENST00000581183.1)、长561bp的LINC00511-005(Ensembl中的转录本ID为ENST00000580500.5)、长538bp的LINC00511-007(Ensembl中的转录本ID为ENST00000577828.5)、长536bp的LINC00511-017(Ensembl中的转录本ID为ENST00000580199.5)、长520bp的LINC00511-012(Ensembl中的转录本ID为ENST00000577773.1)、长475bp的LINC00511-010(Ensembl中的转录本ID为ENST00000580948.1)、长467bp的LINC00511-003(Ensembl中的转录本ID为ENST00000580861.1)、长436bp的LINC00511-004(Ensembl中的转录本ID为ENST00000580175.1)、长391bp的LINC00511-006(Ensembl中的转录本ID为ENST00000584749.1)、长379bp的LINC00511-014(Ensembl中的转录本ID为ENST00000581801.5)、长355bp的LINC00511-015(Ensembl中的转录本ID为ENST00000579631.1)、长141bp的LINC00511-008(Ensembl中的转录本ID为ENST00000582712.1)。在具体的实施方案中，LINC00511基因产物指长转录物。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3指定的cDNA序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少70％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

在本发明中，关于LINC00511的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像LINC00511的非蛋白编码基因，“功能性表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括LINC00511基因的启动子或调控区域的突变——如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％，但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。

第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译—例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

本发明的药物组合物可以按药剂学上有效的量进行给药，本发明的用语“药剂学上有效的量”指的是以可适用于医学治疗或预防的合理的受惠/危险比率足以治疗或预防疾病的量，可根据包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径及排出比率、治疗时间、与所使用的本发明的组合物配合或同时使用的药物的要素及其它医学领域中公知的要素来决定有效用量水平。本发明的药物组合物可作为单独的治疗剂进行给药，或是与其它治疗剂并用地进行给药，可以与以往的治疗剂依次地或同时地进行给药。此外，可单次或多次地进行给药。重要的是，需要对上述要素均加以考虑，并且以无副作用的最少的量可取得最大效果的量进行给药。

术语“治疗”是指不以治愈为目的，而是减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。如果接受治疗有效量的治疗剂之后，患者成功地被“治疗”，患者显示出可观测到的和/或可度量的一种或多种特定疾病的迹象和症状的减少或消失。例如，癌细胞数目显著减少或癌细胞消失，减少肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓，及优选地停止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；使在一定程度上减少和/或减轻与特定癌症相关联的一种或多种症状的时间增加；减少的发病率和死亡率，以及改善生活质量。疾病的迹象或症状的减轻能够为患者感知。治疗可以实现完全反应—定义为癌症的所有迹象消失，或部分反应—肿瘤尺寸减小，优选减小的比例超过50％、更优选75％。如果患者感受到疾病稳定，患者也被视为得到治疗。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了一种与肝癌发生发展相关的lncRNA，通过检测该lncRNA的表达水平即可对早期肝癌进行检测，从而对早期肝癌患者进行治疗，提高患者的生存质量。

本发明提供了一种精准医疗手段，通过抑制患者中LINC00511的表达水平，从而治疗肝癌患者。

本发明提供了一种肝癌的治疗药物，该药物可以治疗LINC00511过表达导致的肝癌。

附图说明

图1示利用QPCR检测LINC00511在肝癌患者中的表达情况图；

图2示利用QPCR检测LINC00511在肝癌细胞中的表达情况图；

图3是利用QPCR检测转染siRNA对在肝癌细胞中LINC00511的表达影响图；

图4是利用CCK8检测LINC00511对细胞增殖的影响图；

图5示LINC00511对细胞的克隆形成集落的影响图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、逆转录和标记

用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

与癌旁组织相比，LINC00511在肝癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2 QPCR测序验证LINC00511基因的差异表达

1、对LINC00511基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各60例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

引物设计：

LINC00511基因的引物序列为：

正向引物：5’-GCTCAAGTTCCTGACATAA-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-GCGTTGTGTTAGGCATTA-3’(SEQ ID NO.5)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.6)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.7)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，LINC00511基因在肝癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3 LINC00511基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取

1)当细胞达80-90％融合时终止培养，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol缓慢摇动破碎细胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每个1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，摇晃15s，室温放置10min。4℃，12000rpm离心15min。

剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，与正常肝细胞系相比，LINC00511基因在肝癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例4 LINC00511基因的沉默

1、细胞培养

人肝癌细胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

针对LINC00511基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.8)，

反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.9)；

siRNA1-LINC00511：

正义链为5’-AAAGAGAAGACUCAGAUUCAA-3’(SEQ ID NO.10)，

反义链为5’-GAAUCUGAGUCUUCUCUUUCU-3’(SEQ ID NO.11)；

siRNA2-LINC00511：

正义链为5’-AUAACUCAAAAACAAACAGUC-3’(SEQ ID NO.12)，

反义链为5’-CUGUUUGUUUUUGAGUUAUUU-3’(SEQ ID NO.13)；

siRNA3-LINC00511：

正义链为5’-AAUUAGCAAGUCAAAACCCCC-3’(SEQ ID NO.14)，

反义链为5’-GGGUUUUGACUUGCUAAUUUA-3’(SEQ ID NO.15)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h；

在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HepG2)阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-LINC00511、siRNA2-LINC00511、siRNA3-LINC00511)，其中阴性对照组siRNA与LINC00511基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测LINC00511基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

具体步骤同实施例3。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增 步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰LINC00511基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3显示，相比HepG2、转染空载siRNA-NC、siRNA1-LINC00511、siRNA3-LINC00511组，siRNA2-LINC00511组能够显著降低LINC00511的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 CCK8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染 步骤同实施例4

2、CCK8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2-LINC00511，每组设6个复孔；

3)分别在转染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测A450的吸光值。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图4所示的结果显示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染siRNA2-LINC00511组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明LINC00511的表达能够促进肝癌细胞的生长。

实施例6软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图5所示，与对照组相比，转染siRNA2-LINC00511的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 王冬国

<120> 一种用于肝癌诊疗的生物标志物

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2265

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

aaggggcgat gcgccccgga gggggaggga cgcaaggggc gactactgtt acctcgcttg 60

gagataccaa ggccggtcgg accccccgct ggccgaatgt ggggagcgag cagatccagc 120

ctgtttggac gtggtgagga cccagccgtg gggtttaagg ccaagttagc ctctcccttc 180

actgattaca agagccattg ttacaggtgc tcacatgcca ggagaaataa gctggtgatt 240

tatgtggcac agcaccatcg atcgacctac aaaggaagct tcagtgcagc cgtgttgcta 300

tacagacctc tctcaccaag gcgtcatgaa ctgaagggct gggagaggcc tcgtggagga 360

ggaagagttt cgctcagctg cttgggtgtg ggactgaatg tggttccaga actggtcgct 420

gccttcaccc gctgactctg gtctcggcga tgacaagccc atggaacaga cttacggcgt 480

atgacctcat cggagacttg tacatggggc caacccccat tttcccacag gaaacccaca 540

ctctaattaa gggctgaccc tgaacttgaa tctgagtctt ctctttcttc aacagagagc 600

catctctcca gcccagctgg caaggagaca ggtgatgtta caggaaaaaa tacacagctt 660

gtgcccttgg aattaccaga gttcaaagcc tgttcagcat ctacccacca tgtgacccgg 720

gtcgaattct tcagtttctc taagcccatt ttctcatctg taagatgggg aagtgtaatc 780

agttctgaac ccacatatac ctcactgggc ttgaacaggc ctgagcaggc atgtggggct 840

ttactagcta gccatccttt ctgccgctct ccctcattct ccttcaagcc ccccaaagtc 900

cttggtggag gaggaagtgg agacagaacg tttggtgttg ggtgaggtac gtgaggaggc 960

tgatttcaga acctccagga aacaaagctt tagtgttccg agggcagtgc ccgcctgtgc 1020

ctcctcctca cagggggtag taggagtggg gtggggccga ggcatttccc agcacagctc 1080

aatcacatct cctgcgcctg cccttgtgac ctgctcactg gaaaggaaga aatgaccgag 1140

ggagaaggga gggcatttga ggggagaaga agaggatgga gaaaaaaact ggatcatctc 1200

gtgacatgga aagaaaggtc tgagctctga cgatcccctc acgtgattat aggcatgagg 1260

actcactctt cgaattgttt gaaaattgaa tggactggct cacaccttct gaaatttctt 1320

ggaagctctg gagtaactat tccactaaag aacagcgtgt ttttggctga aatctgtgac 1380

tgtttgtttt tgagttattt taatctctgt gtcaagcatg aaaacctcag cagcctggga 1440

tttataatta gatcccactg gcatgccctc tcacctctca aacatgccac agtgctttgg 1500

ctctctcctt gtgcaaacct ccctttgata tttttggata tcgataccaa gtgtatctgc 1560

atattttaac caactgatat gcatatcctg tgatctgagg cattcgctca atgtggggca 1620

tcaggccagc tgtgaacttc ctttaaaatt tattttgtgt caaatgattc cctaatgcta 1680

tagctccctt gaactgctag atttatgaaa attctgcaca acacatagct cagagaaaaa 1740

aaaaaaagag tgttgcaaga ccagatatag gatatcattt gatttgttta aaacactctg 1800

tccagggggt tttgacttgc taatttaaaa ataattctaa aattaggtac agttgaccct 1860

tagtatccat gggggattgg ttccaggatg ccctgtggat accagaatcc aaggatgctc 1920

aagttcctga cataaatggc ttagtgtttg catataacct actcccctct tcctatatac 1980

tttaaataat ctctagatta cttataatgc ctaacacaac gcctgtgcat cacttcattc 2040

atgtggattc aatgtagtac ttggtgtgaa gaaaatttaa gtcttgcttt ttggaacttt 2100

gtggattttt ttttctggaa tgtttttgat ctgcagttgg ttgaatccac aggtgcagaa 2160

ctatggacac agggggctga ctatgtatat ttatatccac ttgcaaaatt aagaataaaa 2220

ataatgtgca tcagcaggtg cagattctga tgctcggtgg acagt 2265

<210> 2

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

agggcgcgca ggcggcgcgg gtgcgcggtg cggcgctggt atccagagga cgcggtcacc 60

gcctctggca tttgtcgttc tgcgcttctc cgcaaggacc ctctgttagg caggcgccca 120

ccgtaagcct cccgggcctt gtgaacctgc aaacccaagt ctgagagacg atccgccttc 180

agcgctttcc agcttggcag agaggctttc ccggcgggga tctttggttg gcgctggcga 240

tgcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgt ccaggctggg tgatgtccca gcacgagtag 300

gcgggatgcg ctcgcttggt cctccgggcg cccggtccct gcccgcgtcg cgcgcccacc 360

cctggggacg agaaggcggc cgcctgagga cccccgcccg cgacctccgc gagtctggag 420

cgcagaggac agggtctggc tgctctttgg ccttggatgg aaagtgggga attgggtggg 480

gggctgcgga ccccttaacg tggattactt ggtgtgtatc agctgggctc agaagaccca 540

cgacctcttc tccatccgtg gattgatttg ttctgcttaa cagctgggtc gccaagctgg 600

aggtattttt ccctctccac cctggtcttc tcctgtaacg tgtggccgcc ttttccagca 660

cggcctcctg ccttcctggt gcactttttg gagaacgtgg tggaatcaga ggtttctggc 720

tgactcggtg ggtgctttga accaggaaag gacaagaaag aggttggagt acagtggcat 780

gatctcagct cactgcagcc tcgacttcct gggctcaaga aatcctcctg tctctgcctt 840

ccgagtagct gtgatcacag ttgtatgcca tcatgcccag accagatttc gccatattgc 900

tcaggatggt cttgaactcc tgggctcaag tgatccgcct gccttggcct cccagaatgc 960

caggattaca gatgtgagcc actgtgcctg gcctgaagtc tagtaatttt taaaactttg 1020

catgttattc tgctcatgag ccaagttcgg gtgcctgtgg aacagctata ttcctcaaac 1080

tagatatgca ccccagtccc tggggattct gtcaaaaggc agattcacat tcagcaggtc 1140

tagggtgggg ggcctgacat tcggcacgtc tcacaagctc ccaggcgatg ctgatggtgc 1200

tggtccctgg acgccctctt gagtagtaag gaacaaaagg actctcccct gttcttttca 1260

gctacgtagc ccagtggttc tccacttagg cttcacactg gaatcatcca gggagtttta 1320

aactatagtg atgcctggcg gtgtcttact cgcagagctt ctggtttgat tggtctaggt 1380

tgcagcctgg gcaaggagat ttaaaaactt ctcagatggg ccaggcatgg tggctcaagc 1440

ctgtaatccc agcactttgg gaggcagagg tgggcggatc acgaggtcag gagatcgaga 1500

ccatcctggc tagcacggcg aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaaa ttagctgggt 1560

gtggtggcgt gtgcctgtgg tcccagctgc tcgggaggct gaggcagaag aatggcctga 1620

acccgggagg cggagcttgc agacagccga tcgtgccact gcactccagc ctgggcgaca 1680

gagcgagact ccgtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1716

<210> 3

<211> 1696

<212> DNA

<213> 人源

<400> 3

tggggaattg ggtggggggc tgcggacccc ttaacgtgga ttacttggtg tgtatcagct 60

gggctcagaa gacccacgac ctcttctcca tccgtggatt gatttgttct gcttaacagc 120

tgggtcgcca agctggaggt ggaatcagag gtttctggct gactcggtgg gtgctttgaa 180

ccaggaaagg acaagaaaga ggatgggaag gactgatcca cattcccacc aggaagttta 240

gcagaacccc cgcgtgccac ctggacccct tggaaggacc tggctcaggc tggaccacct 300

cttgagaggc aggagctctg gatttgatca agaattcttt gctgagcatg gtgcctcatg 360

cctataatcc caacactttg ggaggccagt gtgggaggat ctcttgagcc caggagttca 420

agactagcct gggcaacaca gagagacccc atctctaaaa taataataat aataaaataa 480

aaaattagca gggcatggtg gcatgtgcct gtagtcccag ctacccagga ggctgaggca 540

agaggatggc tggagcctgg gatgttgagg ctgcaatgaa ctgtgattac cccactgcac 600

tccagcctgg gcaaaagagc gagagaccct gtctcaaata ataataataa taataatctt 660

attttggaga ataaagagac ctctggattt gaggtgccat ttgggtagaa agaaaagacg 720

tttacaccga gaaatagtct gtgttgccct gaaggagcag agggatgcat cgctggaggt 780

gacctacagt tgaagaagac tcattatgac agaccttgtc cttcttcctt gtggaaagtg 840

tttcctctgc tgctactgct catgagactc ttccccctcc ctgtcccagg gaaccaaagg 900

gctttctacc acaccctttc ttgccccccg cctcccatgt ctgctgtgcc tttgtactca 960

gcaattcttg tttgctccat tatcttccag ccggatacag agtgaatagt taaccacact 1020

taggtcaaat aggatctaaa tttttgttcc tgctccgtgt aaagaggcca gtgtttgtgt 1080

gttgcaagca gccttggaat agtaactctt ctcatttgtt tgggatctgg ccaccaagtt 1140

ccagaatgat acacggatca gtgcagaagt tcatcaggct ctcggacctt agggctgttg 1200

gagaaggctt cagcagcaga actgatggtg aaggctcgtg ttctccatcc tcaactttct 1260

ttgcttcgat catacacaag aatacatttg gaagggcaaa aaatgaacac tgtcgttcat 1320

tgcagccgtg ttttgtgaca cagatgcaca gtctgctgtg aagaccttct ctcaagtggc 1380

atttgggagt ccatgccaga tcatggtgct tcatgagaga ctgacagcta tcaggggttg 1440

tggcacttag tgaggactct cctcccccag tgtgtgctga tgacacatac acacctgaca 1500

atagcttgag tcttctctgt tccttttact ctgtagccaa catacacatg atttaaaacc 1560

ctttctaaat atctatcatg gttcatcctt gtccaaatgc agagtcagag ctatttgtac 1620

ttcattatta tttccaaggc gaatagttgg ctttcttttt gcaaaaataa ttaaagtttt 1680

tgtatgttgc agttgc 1696

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctcaagttc ctgacataa 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgttgtgtt aggcatta 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaagagaaga cucagauuca a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaucugagu cuucucuuuc u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

auaacucaaa aacaaacagu c 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

cuguuuguuu uugaguuauu u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

aauuagcaag ucaaaacccc c 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggguuuugac uugcuaauuu a 21