一种运用分子信标‑熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于细菌检测
技术领域：
，具体涉及细菌快速鉴定试剂盒(分子信标法)；还涉及所述试剂盒中使用的对于细菌16s核糖体RNA具有部分特异性的分子信标探针。
背景技术：
：病原菌的鉴定一直是临床微生物室工作的难点和重点之一。目前临床上广泛采用细菌分离培养、形态特征、生化反应以及免疫学等方法对病原菌进行分类鉴定，但这些方法均存在耗时长、特异性差、操作繁琐等问题，越来越难以满足现代细菌学研究的发展要求。虽然全自动微生物分析系统(AMS)在大型医院已经普及，但其耗材昂贵，耗时仍相对较长。16s核糖体RNA，简称16srRNA，是原核生物的核糖体30s亚基的组成部分，16srRNA的3′端具有能与mRNA上游AUG起始密码子结合的Shine-Dalgarno序列，同时也可作为核糖体蛋白质结合的架构。由于不同种的细菌和古细菌间的16srRNA基因是高度保守的，因此16srRNA常备用于对各种生物进行的系统发生学方面的研究。16srRNA中同时具有保守的引物结合位点和高变区(签名序列)。近年来，随着微生物遗传信息数据库的不断完善，16srRNA已经成为临床微生物学中可用来替代细菌表型的另一种鉴定目标。将细菌分离培养与PCR及杂交探针、基因芯片等技术手段相结合,具有敏感度高、重复性好等优点,但需经过PCR扩增，PCR扩增耗时长，且其高灵敏度容易因轻微污染而产生假阳性，扩增后产物所产生的气溶胶等污染也是一个不容忽视的问题。16srRNA鉴定方法基于一种高分辨熔解曲线技术(Highresolutionmeltingcurveanalysis)的临床细菌的快速检测技术，通过分子信标对于从细菌中提取出的16srRNA模板的杂交—解链分析二者间的碱基互补程度，16srRNA上的单个碱基差异都会使熔解温度(MT)发生浮动，但是由于MT值同时会受到目标序列GC含量及碱基排列的影响。因此分子信标-熔解曲线技术尚未被用于临床细菌鉴定领域。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题是提供细菌鉴定用分子信标探针。本发明还要解决的技术问题是提供一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒。本发明最后要解决的问题是提供上述试剂盒在细菌检测中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种细菌鉴定用分子信标，包括如下分子信标探针；分子信标探针v6p1：5′-FAM-CGGCGGCTCTAGCGTTGTCAAAGGATGTCAAGCTTTGGTAAGGTTCCCGCCG-DAB-3′；分子信标探针v6p2：5′-FAM-CGCGGGCAGCAAGCTGCTGCCTGTTACCGTTCGACTTGCACCGCG-DAB-3′；分子信标探针v1p1：5′-Hex-GGCGGCGCTTCTCGACCGAGGCTCGACTTGCATGTATTAGGGCCGCC-DAB-3′；分子信标探针v1r：5′-Cy5-GCGCGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGCACGGGGAGCTTGCCCGCGC-DAB-3′。使用4种不同序列、长度及荧光标记的分子信标探针，能够一次生成一组由4个MT值构成的数据，使得即便具有较高同源性的菌种也能得以区分。分子信标探针v6p1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的39个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v6p2的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的45个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v1p1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的48个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。分子信标探针v1r的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的52个碱基是与细菌核糖体RNA16s高变区部分互补的序列。运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的分子信标探针混合液和2×杂交反应液。其中，所述2×杂交反应液包括如下组分：甜菜碱0.25～0.5M、DMSO1～2％(V/V)、Tris-HCl50～100mM、氯化钾100～500mM、氯化镁50～100mM；优选甜菜碱0.4M、DMSO1.5％(V/V)、Tris-HCl80mM、氯化钾200mM、氯化镁80mM。其中，所述分子信标探针混合液中，各分子信标探针的浓度如下：分子信标探针v6p1浓度为0.5～1.0OD，分子信标探针v6p2浓度为0.5～1.0OD，分子信标探针v1p1浓度为0.25～0.5OD，分子信标探针v1r浓度为0.25～0.5OD；优选分子信标探针v6p1浓度为0.625OD，分子信标探针v6p2浓度为0.625OD，分子信标探针v1p1浓度为0.3125OD，分子信标探针v1r浓度为0.3125OD作为优选，该试剂盒包括阳性对照和空白对照。其中，所述阳性对照为大肠杆菌CICC10421＝078:K80菌株中纯化得的核酸。其中，所述空白对照为水。本发明通过提供一组对细菌16srRNA具有部分特异性的分子信标探针及包含上述分子信标探针的试剂盒，来鉴定经培养基分纯培养后的菌落。有益效果：本发明所述的试剂盒具有以下优点：(1)无需PCR扩增，直接对提取好的核酸模板进行Tm值分析，在极短的时间内即可完成检测，同时避免了PCR产物污染的风险，不易因污染产生误判；(2)不含酶，提升了试剂盒的稳定性，并降低了检测成本；(3)覆盖范围大：本试剂盒可对18种细菌进行鉴定，覆盖了临床感染中最常见的阴性杆菌和阳性球菌；(4)实时检测：获得Tm值数据组后马上可以分析数据获得检测结果。附图说明图118种细菌在Fam荧光通道中的熔解峰。图218种细菌在Hex荧光通道中的熔解峰。图318种细菌在Cy5荧光通道中的熔解峰。图4甜菜碱浓度对熔解峰分辨率的影响。图5鲍曼不动杆菌Cy5通道TM值范围的建立。图中英文字母对应的中文名称为：Fluorescence荧光值；Temperature温度，Meltingpeaks熔解峰。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：分子信标探针的设计。(1)从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库下载本发明所述试剂盒可鉴定的18种临床感染常见细菌16s-rDNA的序列信息作为分子信标探针设计的依据；18种临床感染常见细菌包括如下细菌：鲍曼不动杆菌、嗜水汽单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单增李斯特菌、奇异变形菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌、粘质沙雷菌、噬麦芽窄食单胞菌。(2)设计分子信标探针，原则为：①使其覆盖16s-rRNA上的部分保守区序列和部分高变区序列；②使其与本发明所述试剂盒可鉴定的18种临床感染常见细菌的16s-rRNA目标序列有不同的互补程度；③每个分子信标探针的3′端和5′端各有一段可相互互补的序列，使其能够形成茎环结构；(3)提取本发明所述试剂盒可鉴定的18种目标菌的核酸；(4)对目标菌的核酸进行熔解曲线分析，记录每一种待选分子信标探针在反应中得到的TM值；(5)最后根据所得TM值的分散程度筛选得如下四个分子信标探针：分子信标探针V6p1(SEQIDNO.1)：5′-FAM-CGGCGGCTCTAGCGTTGTCAAAGGATGTCAAGCTTTGGTAAGGTTCCCGCCG-DAB-3′；上述分子信标探针v6p1在寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL；5′端和3′端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40碱基是覆盖细菌16srRNA高变区v1并与之部分互补的序列，其互补程度因菌种而异。分子信标探针V6p2(SEQIDNO.2)：5′-FAM-CGCGGGCAGCAAGCTGCTGCCTGTTACCGTTCGACTTGCACCCGCG-DAB-3′；上述分子信标探针v6p2在寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL；5′端和3′端的5个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的34碱基是覆盖细菌16srRNA高变区v1并与之部分互补的序列，其互补程度因菌种而异。分子信标探针v1p1(SEQIDNO.3)：5′-Hex-GGCGGCGCTTCTCGACCGAGGCTCGACTTGCATGTATTAGGGCCGCC-DAB-3′；上述分子信标探针v1p1在寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团HEX，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL；5′端和3′端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的35碱基是覆盖细菌16srRNA高变区v1并与之部分互补的序列，其互补程度因菌种而异。分子信标探针v1r(SEQIDNO.4)：5’-Cy5-GCGCGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGCACGGGGAGCTTGCCCGCGC-DAB-3’。上述分子信标探针v1r在寡核苷酸DNA分子的5′端标记荧光报告基团CY5，3′端标记荧光淬灭基团DABCYL；5′端和3′端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的40碱基是覆盖细菌16srRNA高变区v1并与之部分互补的序列，其互补程度因菌种而异。实施例2：菌落鉴定试剂盒检高分辨率熔解曲线鉴定体系的建立与优化。针对高分辨熔解曲线鉴定体系一些重要的影响因素进行条件的优化。1、方法(1)Mg2+浓度研究：按照表1的反应体系配制2x高分辨熔解曲线细菌鉴定反应液，固定其它参数，分别调节Mg2+浓度至0.1M、0.05M、0.03M、0.01M、0M，以大肠杆菌标准菌株中提取的核酸作为模板进行高分辨熔解曲线分析，实验结束后比较不同的Mg2+浓度对熔解曲线出峰的高度、锐度和流畅度的影响。(2)K+浓度研究：按照表1的反应体系配制2×高分辨熔解曲线细菌鉴定反应液，固定其它参数，分别调节K+浓度至1M、0.5M、0.1M、0.05M、0M，以大肠杆菌标准菌株中提取的核酸作为模板进行高分辨熔解曲线分析，实验结束后比较不同的K+浓度对熔解曲线出峰的高度、锐度、和流畅度的影响。(3)二硫苏糖醇(DTT)浓度研究：按照表1的反应体系配制2×高分辨熔解曲线细菌鉴定反应液，固定其它参数，分别调节DTT浓度至0M、0.0005M、0.001M、0.002M、0.005M、0.01M，以大肠杆菌标准菌株中提取的核酸作为模板进行高分辨熔解曲线分析，实验结束后比较不同的DTT浓度对熔解曲线出峰的高度、锐度和流畅度的影响。(4)甜菜碱浓度研究：按照表1的反应体系配制2×高分辨熔解曲线细菌鉴定反应液，固定其它参数，分别调节甜菜碱浓度至0M、0.25M、0.5M、0.7M、0.95M，以大肠杆菌标准菌株中提取的核酸作为模板进行高分辨熔解曲线分析，实验结束后比较不同的甜菜碱浓度对熔解曲线出峰的高度、锐度和流畅度的影响。(5)二甲基亚砜(DMSO)浓度研究：按照表1的反应体系配制2×高分辨熔解曲线细菌鉴定反应液，固定其它参数，分别调节DMSO浓度至0、0.5％、1％、2％、2.5％、5％(V/V)，以大肠杆菌标准菌株中提取的核酸作为模板进行高分辨熔解曲线分析，实验结束后比较不同的DMSO浓度对熔解曲线出峰的高度、锐度和流畅度的影响。2、结果：针对每个动力学优化实验，系统比较高分辨熔解曲线时获得的溶解曲线情况，结果当发现Mg2+浓度选用了0.05～0.1M、K+浓度选用了0.1～0.5M、DMSO浓度选用了1％～2％(V/V)、甜菜碱浓度选用了0.25～0.5M、不添加DTT时，对大肠杆菌标准菌株16srRNA进行高分辨熔解曲线分析时溶解曲线出峰较高、曲线更光滑、到达Tm值时峰顶更明显。因此选用上述最优条件确定为试剂盒各组分的组成。表1反应液的组分及浓度组分浓度使用浓度甜菜碱0.4M0.2DMSO1.5％(V/V)0.75％(V/V)Tris-HCl80mM40mM氯化钾200mM100mM氯化镁80mM40mM实施例3：高分辨熔解曲线细菌鉴定试剂盒的组成和检测方法1、试剂盒的组成(保存于-20℃)(1)2×高分辨溶解曲线反应液：其组分为：0.4M甜菜碱，1.5％(V/V)DMSO,80mMTris-HCl，200mM氯化钾，80mM氯化镁。2、阳性对照品的制备将大肠杆菌菌株CICC10421＝078:K80接种在哥伦比亚血平板上，37℃、70％RH培养过夜后用菌落进行核酸提取。对提取后的核酸进行浓度和纯度测定，确保1.8/1.6不低于1.8；随即用灭活纯水调整核酸浓度至50ng/ul。分装后于-20℃保存，作为试剂盒的阳性对照。3、试剂盒的检测方法如下：(1)提取样品的核酸，其中含有16srRNA：本发明试剂盒未提供核酸提取试剂，用户可选取细菌RNA提取试剂盒或总核酸提取试剂盒提取细菌核酸；(2)按照以下方法配制反应液反应体积为100μl；取50μl×(N+2)2×高分辨溶解曲线细菌鉴定反应液和3μl×(N+2)探针混合液混匀(N为待检测样本量)；将上述混合液分装至实时定量荧光PCR管中，再分别加入步骤(1)中提取的核酸，然后盖上管盖，涡旋混匀并短暂离心；(3)上机检测：将反应管放入实时定量荧光PCR仪中进行检测。反应条件是：98℃反应2分钟，55℃反应2分钟，再从55℃升温至83℃，在此过程中每升温1℃读取荧光信号4次，根据不同仪器进行相应设置，若为Roch的lightcycler480，则把荧光通道设置为465nm-510nm，533nm-580nm，618nm-660nm；(4)结果判定：根据检测样本的溶解曲线达到最高点时的温度(TM值)作为菌种判断的依据。首先是质控系统判断，即阳性对照(大肠杆菌核酸)在三个荧光波长范围内的TM值都要落在相应的参考范围内，否则系统检测无效。当系统检测是有效时，判断待测样本结果。记录待测样本在三个荧光波长(465nm～510nm；533nm～580nm；618nm～660nm)的TM值读数并以此为依据对待测菌种进行判定，如果TM值读数的组合无法在对照表上查得，则该菌种不属于本发明所覆盖的18种细菌。(5)注意事项：实验过程中应全程使用无粉手套。在加磁珠法提取得的细菌核酸时，应避免将管底的残留磁珠吸入反应体系中。实施例4：高分辨熔解曲线法菌种鉴定试剂盒参考范围的建立1、样本：随机收集临床标本中分离得的细菌菌种，用梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行分析，对照所得结果对菌株进行分类，对于本发明所覆盖的鉴定菌种，每种需至少收集40株；同时保留不在鉴定范围内的细菌作为外部参照品；从接种培养后获得的细菌菌落中提取核酸，利用紫外分光光度计测定纯化后核酸的浓度和纯度，以浓度为20ng/μl，A260/A280≥1.6的核酸作为合格模板进行高分辨熔解曲线分析；2、方法：按实施例三中的实验方法分析并记录收集的菌株各通道TM值测值并整理为一个数据集，对于相应菌种，取每个通道最高的TM值作为参考范围上限，取每个通道最低的TM值作为参考范围下限。3、实验结果：如表2。表218种菌株各通道TM值测值序号菌种名称FAMHEXCY51.鲍曼不动杆菌73.08-74.5260.8-61.9365.36-66.542嗜水汽单胞菌NA60.95-63.2769.67-70.233洋葱伯克霍尔德菌NA49.13-50.4566.52-67.084弗氏柠檬酸杆菌NANA67.1-67.775阴沟肠杆菌66.37-66.6853.27-53.777.3-77.656屎肠球菌65.72-66.5264.62-62.2564.29-64.347粪肠球菌66.07-66.7361.62-62.6573.81-74.128产气肠杆菌71.07-71.553.28-53.6677.73-78.149大肠杆菌78.82-79.7553.13-53.879.24-79.810肺炎克雷伯菌78.62-79.8561.41-62.3470.18-71.3511单增李斯特菌64.32-65.0968.41-68.9272.12-72.6912奇异变形菌NA61.39-62.9674.58-75.5513铜绿假单胞菌74.83-75.8561.17-63.2767-68.1314表皮葡萄球菌62.99-63.371.5-72.3268.18-68.4415金色葡萄球菌70.47-72.1178.42-79.8367.16-67.7216沙门氏菌74.37-75.3754.01-54.4278.9-79.8517粘质沙雷菌75.26-76.159.15-60.5971.2518噬麦芽窄食单胞菌71.6-72.5750.25-51.9075.91实施例五：高分辨熔解曲线法菌种鉴定试剂盒对临床样本的检测1、样本：随机收集临床标本中分纯得到的细菌标本，挑取独立菌落用菌种保存管进行保存。收集满100例后，将保存的菌种分别接种于哥伦比亚血平板(梅里埃)上，37℃，70～85％RH恒温培养箱培养过夜(12～24h)。2、方法：同时使用本发明所述高分辨熔解曲线法菌种鉴定试剂盒和梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对菌种进行鉴定，对比检测结果的符合率；3、检测步骤：(1)细菌核酸提取：使用细菌核酸提取试剂盒(迪安生物)抽提细菌的核酸；(2)熔解曲线分析：按照实施例三的方法进行操作；(3)比对方法：使用梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对细菌进行鉴定。4、检测结果：利用本发明提供高分辨熔解曲线法对菌种的鉴定结果与用梅里埃vitek2compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统对菌种的鉴定结果符合率为100％，当菌种为本发明试剂盒检测范围外时，则无法通过熔解曲线分析得到的TM值对菌种进行判定，而不会被误判为本试剂盒覆盖范围内的18种细菌。表3100份未知临床分离菌种的鉴定结果SEQUENCELISTING<110>杭州迪安生物技术有限公司<120>一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定细菌的试剂盒及其应用<130>SG20170221002<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子信标探针v6p1的核苷酸序列<400>1cggcggctctagcgttgtcaaaggatgtcaagctttggtaaggttcccgccg52<210>2<211>45<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子信标探针v6p2的核苷酸序列<400>2cgcgggcagcaagctgctgcctgttaccgttcgacttgcaccgcg45<210>3<211>47<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子信标探针v1p1的核苷酸序列<400>3ggcggcgcttctcgaccgaggctcgacttgcatgtattagggccgcc47<210>4<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子信标探针v1r的核苷酸序列<400>4gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacgcacggggagcttgcccgcgc52当前第1页1 2 3