用于检测锌离子或焦磷酸根荧光探针、制备方法及应用与流程

本发明涉及一种荧光探针、制备方法及应用，更具体地说涉及一种用于检测锌离子或焦磷酸根离子荧光探针、制备方法及应用。

背景技术：

锌离子作为人体内含量仅次于铁离子的第二过渡金属离子，在人体内生理活动中扮演着重要角色，它参与许多生理活动，例如脑功能、病理学、DNA合成、免疫功能、酶活性和神经传递等过程。人体内一定含量的锌离子对人的身体健康是有益的，然而过量的锌离子可能引起某些神经方面病患，例如癫痫症、缺血性发作、帕金森氏病、幼儿腹泻、脑损伤的神经退行性等疾病。因此，探寻一种在生物体内有效的检测锌离子的方法显得尤为重要。焦磷酸根(PPi)在各种生理过程中发挥重要的作用，如代谢酶反应和生理能量转导等，PPi也与许多疾病如焦磷酸钙结晶脱水和软骨肉瘤病有一些关系。因此，PPi的选择性识别在各种生物过程中非常重要。尽管一些检测阴离子的常规方法已经被开发例如离子选择性电极法，但仍然迫切需要可以替代的检测方法。

目前用于检测锌离子和焦磷酸根(PPi)方法主要有：原子吸收光谱法、等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、固相微萃取-高效液相色谱法和荧光光谱法。但这些方法耗时长，响应慢，工艺复杂，而荧光光谱法能很好地克服这些缺点，所以需要研发出高选择性检测锌离子和PPi的荧光探针。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的不足，提供用于锌离子或焦磷酸根离子荧光探针，同时提供其制备方法及应用。该荧光探针可快速响应并高选择性检测锌离子，且探针和锌离子的络合物对PPi有很好的选择性，并能够监测焦磷酸化酶催化降解PPi的反应进程，而且探针也可以检测细胞体内的锌离子和PPi。

本发明的技术构思如下：探针L₁、L₂和L₃均可选择性与锌离子反应并伴随荧光由黄色到蓝色的变化，其中L₁检测效果最佳。检测过程响应时间短，且产生的比率荧光强度与锌离子浓度线性相关。而且探针L₁和锌离子结合后的络合物L₁-Zn²⁺可再次检测焦磷酸根。本发明首次制备探针L₁、L₂及L₃并首次将其用于选择性的检测锌离子，且L₁和锌离子的络合物L₁-Zn²⁺选择性的检测焦磷酸根，且可以用于监测酶催化裂解PPi。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

本发明的用于检测锌离子荧光探针，其具有如式L₁、L₂或L₃所示的结构：

本发明上述的荧光探针可以在检测锌离子中进行应用。

本发明的用于检测焦磷酸根荧光探针，其是具有如式L₁所述结构和锌离子结合后的络合物L₁-Zn²⁺；

本发明上述的荧光探针可以在检测焦磷酸根中进行应用。

本发明上述用于检测锌离子荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：

将2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛和焦亚硫酸钠溶解在DMF中反应得到化合物3，再将化合物3和乌洛托品在三氟乙酸中经过醛基化反应得到化合物2，然后化合物2分别和三(羟基甲基)氨基甲烷、2-氨基-1,3-丙二醇或乙醇胺在乙醇中反应，得到最终产物探针L₁、L₂或L₃。

本发明上述的制备方法，其进一步的技术方案是所述的反应生成化合物3时其反应条件为100℃-120℃下回流反应12小时或以上；所述的反应生成化合物2时其反应条件为90℃-110℃下回流反应5小时或以上；所述的反应得到探针L₁、L₂或L₃其反应条件均为70℃-90℃下回流5小时或以上。

本发明上述的制备方法，其更进一步的技术方案是包括以下步骤:

所述的反应生成化合物3其反应结束后先在反应产物里加入去离子水，沉淀过滤，水洗并干燥，最后经硅胶柱纯化所得产物即为化合物3；

所述的反应生成化合物2其反应结束后在反应产物里加入稀盐酸，用二氯甲烷萃取，并用饱和食盐水水洗，减压蒸干有机相，用二氯甲烷作洗脱剂，经硅胶柱纯化粗产品后，得到的产物即为化合物2；

所述的反应得到探针L₁、L₂或L₃其反应结束后冷却，过滤沉淀，然后在甲醇中重结晶，得到的产物即为探针L₁、L₂或L₃。

本发明上述的制备方法，其进一步的技术方案还可以是所述的2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛与焦亚硫酸钠的用量质量比为：1:1.1-1.2:1.3-1.5；所述的化合物3与乌洛托品的用量质量比为：1:1.1-1.2；所述的化合物2与三(羟基甲基)氨基甲烷的用量质量比为：2.2-2.3:1；所述的化合物2与2-氨基-1,3-丙二醇的用量质量比为：2.9-3:1；所述的化合物2与乙醇胺的用量质量比为：4.3-4.5:1。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明中的三种荧光探针本身均为黄色荧光，当分别与锌离子反应后，荧光由黄色变为蓝色，且焦磷酸根加入到探针L₁和锌离子络合物L₁-Zn²⁺后荧光发生由蓝色到黄色的改变。

2)采用本发明的荧光探针后，检测灵敏度高，探针L₁对锌离子的检测限可达10^-9M，且L₁-Zn²⁺对焦磷酸根的检测限可达10^-8M。

3)本发明荧光探针仅与锌离子发生荧光反应，对其他金属离子均无反应，具有很好的选择性和特异性。而且探针L₁和锌离子络合物L₁-Zn²⁺对焦磷酸根有很好的选择性，且可以用于监测焦磷酸化酶催化裂解PPi的反应进程。

4)本发明荧光探针制备工艺简单易行，易于规模化生产。

附图说明

图1为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₁纯品的¹H NMR图。

图2为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₁纯品的高分辨质谱图。

图3为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₂纯品的¹H NMR图。

图4为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₂纯品的高分辨质谱图。

图5为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₃纯品的¹H NMR图。

图6为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L₃纯品的高分辨质谱图。

图7为本发明实施例Ⅰ-2荧光探针L₁、L₂和L₃与各种金属离子反应的荧光发射光谱。

图8为本发明实施例Ⅰ-3荧光探针L₁与锌离子反应的荧光增量图。

图9为本发明实施例Ⅰ-3荧光探针L₁对锌离子浓度的荧光强度工作曲线。

图10为本发明实施例Ⅱ-1荧光探针L₁和锌离子络合物的L₁-Zn²⁺对PPi以及其他阴离子的反应的荧光发射光谱。

图11为本发明实施例Ⅱ-2荧光探针L₁和锌离子络合物的L₁-Zn²⁺与PPi反应荧光增量图。

图12为本发明实施例Ⅱ-2荧光探针L₁和锌离子的络合物L₁-Zn²⁺对PPi浓度的荧光强度工作曲线。

图13为本发明实施例Ⅱ-3荧光探针L₁和锌离子络合物的L₁-Zn²⁺监测焦磷酸化酶催化降解PPi的动态曲线图。

图14为本发明实施例Ⅱ-4荧光探针L₁在细胞内检测锌离子和PPi的共聚焦显微镜成像图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例Ⅰ，Ⅱ对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例Ⅰ-1制备检测锌离子的探针L₁、L₂和L₃

将5g(36.7mmol)5-甲基水杨醛、4.6g(36.7mmol)2-氨基苯硫酚和6g(31.6mmol)焦亚硫酸钠溶于100mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在110℃下回流一夜，通过TLC监控反应进程。反应完成后200mL去离子水加入反应液中，产生白色沉淀，粗产物用二氯甲烷作为洗脱剂，通过层析柱进一步纯化，最终得到8g化合物3；将4g(16.6mmol)化合物3和4.5g(32.14mmol)乌洛托品溶于50mL三氟乙酸中，100℃下回流五小时。反应完成后加入200mL(4M)盐酸继续搅拌2小时。之后反应混合物用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到粗产品，进一步用二氯甲烷做洗脱剂经层析柱纯化，最终得到4.5g纯净的化合物2。

将1g(3.72mmol)化合物2和0.45g(3.72mmol)三(羟基甲基)氨基甲烷溶于40mL乙醇溶液中，在80℃下回流三小时。反应完成后，冷却至室温，固体析出，过滤沉淀物，并在真空下干燥。粗产物进一步在甲醇中重结晶，真空干燥，最终得到纯化的目标产物L₁1.05g,，即为探针L₁纯品(¹HNMR图和高分辨质谱图见图1，图2)。所得荧光探针纯品实测分子量为372。

将0.2g(0.74mmol)化合物2和0.068g(0.74mmol)2-氨基-1,3-丙二醇溶于15mL乙醇中，在80℃下回流三小时。反应完成后，冷却室温，析出沉淀，过滤，真空干燥，进一步在甲醇中重结晶，最终得到0.177g纯净的L₂，即为探针L₂纯品(¹HNMR图和高分辨质谱图见图3，图4)。所得荧光探针纯品实测分子量为364。

将0.2g(0.74mmol)化合物2和0.046g(0.74mmol)乙醇胺溶解于15mL乙醇中，80℃下回流三小时。反应完成后，混合液冷却室温，析出沉淀，过滤，干燥，进一步在甲醇中重结晶，最终得到0.18g的L₃，即为探针L₂纯品(¹HNMR图和高分辨质谱图见图5，图6)。所得荧光探针纯品实测分子量为334。

本实施例工艺路线：

实施例Ⅰ-2制得锌离子荧光探针与各种金属离子的光谱性质

称取3mg实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针，配成浓度为1mM的10mL DMSO溶液，作为母液。

荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后分别加入各种金属离子：Cr³⁺，Ag⁺，Cu²⁺，Li⁺，Fe²⁺，Zn²⁺，Eu³⁺，Co²⁺，Hg²⁺，Zr⁴⁺，Cs²⁺，K⁺，Na⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Mg²⁺，Ni²⁺，Mn²⁺，Al³⁺，Ca²⁺之一，使每个金属离子的终浓度为100μM，荧光探针终浓度为10μM。在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm：5nm。所得结果如图3所示。

以上结果表明：

实施例Ⅰ-1制得荧光探针本身在543nm处有一个发生峰，表现为黄色荧光，但随锌离子的加入，该探针在475nm处出现新的发射峰，表现为蓝色荧光。

实施例Ⅰ-3制得锌离子荧光探针与锌离子反应的光谱性质

将30μL实施例Ⅰ-2中的母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入不同当量的锌离子溶液，使荧光探针的终浓度为10μM，锌离子终浓度分别为0μM,1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，10μM。锌离子加入后即刻测量其荧光发射光谱。在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm：5nm。所得荧光增量图见图5；以荧光强度比率(I_475nm/I_543nm)和锌离子的浓度关系数据制作工作曲线，结果见图6。

该实验结果表明，荧光强度比率(I_475nm/I_543nm)随锌离子浓度的增加而增加；且荧光强度比率(I_475nm/I_543nm)与0-10μM范围内的锌离子浓度呈线性关系，可以用于锌离子的定量检测。

实施例Ⅱ-1制得焦磷酸根离子荧光探针与各种阴离子的光谱性质

称取3mg实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针L₁，配成浓度为4mM的DMSO溶液，之后加入2个当量的高氯酸锌溶液使得最终的络合物L₁-Zn²⁺浓度为2mM，作为母液。

荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后分别加入各种阴离子：PPi,HPO₄^2-,H₂PO₄^-,PO₄^3-,CH₃COO^-,SO₄^2-,CO₄^2-,F^-,Cl^-,Br^-，I^-之一，使每个阴离子终浓度为40μM，荧光探针终浓度为20μM。阴离子加入后，在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。所得结果如图10所示。

以上结果表明：

(1)实施例Ⅱ-1制得络合物L₁-Zn²⁺本身在475nm处有一个发射峰表现为蓝色荧光，但随PPi的加入，该络合物L₁-Zn²⁺在543nm处产生新的发射峰，荧光变为黄色。

(2)实施例Ⅱ-1制得荧光探针对PPi具有高度的选择性和特异性。

实施例Ⅱ-2制得PPi荧光探针与PPi反应的光谱性质

将30μL实施例Ⅱ-1中的母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入不同当量的焦磷酸根离子溶液，使荧光探针的终浓度为20μM，PPi终浓度分别为0μM,2μM，4μM，6μM，8μM，10μM，12μM，14μM，16μM，18μM，20μM。阴离子加入后，在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。所得荧光增量图见图12；荧光强度比率(I_543nm/I_475nm)和锌离子的浓度关系数据制作工作曲线，结果见图6。

该实验结果表明，荧光强度比率(I_543nm/I_475nm)随PPi浓度的增加而增加；当采用终浓度20μM的荧光探针时，反应后荧光强度与0-60μM范围内的PPi浓度呈线性关系，可以用于PPi的定量检测。

实施例Ⅱ-3制得焦磷酸根荧光探针对焦磷酸化酶催化裂解PPi的监测

将30μL实施例Ⅱ-1中的母液加入到一定量的的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入10个当量的PPi，氯钯酸氨，使L₁-Zn²⁺的终浓度为20μM，PPi的终浓度为200μM。焦磷酸化酶首先在37℃下孵化5分钟，然后在如下不同的催化体系下监测反应进程：(1)只有40μM的Mg²⁺存在；(2)只有20units的焦磷酸化酶存在；(3)40μM的Mg²⁺和20units的焦磷酸化酶同时存在。417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。

该实验结果表明：实施例Ⅱ-1制得焦磷酸根荧光探针只有Mg²⁺和焦磷酸化酶同时存在下，荧光强度比率(I_475nm/I_543nm)随着时间的增加在5分钟开始增加，并在40分钟后达到稳定，说明焦磷酸化酶已经催化裂解PPi完全，L₁-Zn²⁺可用于监测焦磷酸化酶裂解PPi反应进程。因此除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

实施例Ⅱ-4制得焦磷酸根荧光探针对细胞体内锌离子和PPi的检测

海拉细胞先在含有10μM L₁中培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像，再用100μM Zn(ClO₄)₂培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像，最后在含有100μM的PPi中培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像。其中蓝色通道的激发波长为405nm,黄色通道的激发波长为480nm。

该实验结果表明：实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针培养后的细胞，在共聚焦显微镜下观察从绿色通道可看出明显的黄色荧光，而蓝色通道几乎没有蓝色荧光；在锌离子溶液中培养后，尽管从绿色通道可以看出黄色荧光依然存在，但是蓝色通道出现明显的蓝色荧光；之后在PPi中培养后，从蓝色通道观察到蓝色荧光消失。