一个携带有NtRBSC1基因的瞬时表达载体的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一个携带有一个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因（ntrbsc1）基因的重组瞬时表达载体。

背景技术：

叶绿体是植物细胞中，由双层膜围成、含有叶绿素、能进行光合作用的细胞器。叶绿体基质中悬浮有由膜囊构成的类囊体，内含叶绿体dna，是一种质体，有圆形、卵圆形或盘形3种形态。叶绿体含有的叶绿素a、b吸收绿光最少，绿光被反射，故叶片呈绿色。叶绿体扁球状，厚约2.5微米，直径约5微米，具双层膜，内有间质，间质中含呈溶解状态的酶和片层。片层由闭合的中空盘状的类囊体垛堆而成，类囊体是形成高能化合物三磷酸腺苷(atp)所必需，是植物的“养料制造车间”和“能量转换站”。

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（ribulosebisphosphatecarboxylase/oxygenase），通常简写为rubisco，是一种酶(ec4.1.1.39)，分子量约为53kd，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，也是植物叶绿体的标志酶。它在光合作用的卡尔文循环中催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子，比如蔗糖分子。针对该酶，现有技术中仍然主要集中于该酶编码基因的克隆、分析等基础性工作，而对该酶的在细胞中的具体定位及其作用机理等情况的研究仍然相对缺乏。

技术实现要素：

本发明主要是利用烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因（ntab0062040，ntrbsc1）构建了瞬时表达载体，利用该表达载体，可更好地研究烟草ntrbsc1基因在烟草中的作用机理和作为烟草叶绿体的标志基因，从而进行叶绿体共定位研究。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个携带有ntrbsc1基因的瞬时表达载体，该载体携带有ntrbsc1（ntab0062040）和一个荧光标记蛋白gfp的基因（以荧光标记蛋白gfp基因作为报告基因），其制备方法包括如下步骤：

（1）pcr扩增，获得烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因ntrbsc1，具体为：

以红花大金元烟草品种为材料，提取其总rna，并进一步反转录得cdna，以此为模板，设计ntrbsc1-f/ntrbsc1-r引物对，进行pcr扩增，获得ntrbsc1的扩增产物，并对扩增产物进行回收；

所述ntrbsc1-f/ntrbsc1-r引物对，具体序列为：

ntrbsc1-f:cggggtaccatgtctgtctcaagtt，其中ggtacc部分序列为kpni酶切位点，

ntrbsc1-r:cgcggatccagatgctacagg，其中ggatcc部分序列为bamhi酶切位点；

所述ntrbsc1基因，其碱基序列如seqidno.1所示；

（2）酶切，并连接，具体为：

对步骤（1）中回收所获得的ntrbsc1的扩增产物，采用kpni和bamhi进行双酶切处理，并回收酶切产物；

同时对pff19-gfp载体，同样采用kpni和bamhi进行双酶切处理，并回收酶切产物；

50μl双酶切体系设计参考如下：

bufferk，2.5μl；

bamhi，2.5μl；

sphi，2.5μl；

步骤（1）中的ntrbsc1的扩增产物（或pff19-gfp载体），20μl；

灭菌水加至50μl；

采用t4dna连接酶将上述ntrbsc1的酶切产物的粘性末端与pff19-gfp载体的双酶切产物的粘性末端进行连接，10μl连接体系参考设置如下：

ntrbsc1酶切产物，1μl；

pff19-gfp载体酶切产物，1μl；

t4dna连接酶，1μl；

ddh2o加至10μl；

16℃连接过夜；

（3）转化，筛选，具体为：

将步骤（2）中的连接产物转化转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，进行抗性筛选，并挑取阳性菌落进行测序验证，对于验证正确的菌株进行扩大培养，并提取质粒备用；

此质粒即为含有烟草核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因ntrbsc1和荧光标记蛋白gfp基因的瞬时表达载体，将此质粒载体命名为ntrbsc1-pff19-gfp。

所述携带有ntrbsc1基因的瞬时表达载体在烟草中的应用，将ntrbsc1-pff19-gfp质粒载体通过基因枪介导转化法转化烟草细胞悬浮液（如by-2烟草细胞悬浮），或者通过peg介导的原生质体转化法转化烟草原生质体，转化后室温暗培养8~16h，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞或原生质体，基因表达后，该基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白定于植物的叶绿体，该载体可以作为烟草叶绿体的共定位表达载体；换言之，通过融合蛋白在细胞中的荧光显示位置即可定位烟草ntrbsc1，从而便于烟草叶绿体的定位和其作用机理的研究。

前期工作基础上，发明人克隆到了一个核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基基因（内部编号ntab0062040），将之命名为ntrbcs1。为进一步研究该基因的功能，发明人利用此ntrbsc1基因构建了一个瞬时表达载体ntrbsc1-pff19-gfp，该载体转化烟草细胞后，可使荧光标记蛋白gfp与ntrbsc1蛋白能够在悬浮细胞中共表达（即，对ntrbsc1进行了荧光标记），进而通过激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的位置而对ntrbsc1蛋白进行亚细胞定位。总体而言，这种方式是一种简便而又准确的在活细胞中进行定位的方法，可为研究烟草细胞叶绿体及相关基因提供确切参考依据，便于烟草ntrbsc1基因的进一步研究及其功能的深入开发。

附图说明

图1为所构建瞬时表达载体ntrbsc1-pff19-gfp的酶切验证图，其中m为dl2000dnamarker，1为ntrbsc1-pff19-gfp质粒酶切图；

图2为所构建瞬时表达载体ntrbsc1-pff19-gfp转化烟草细胞后激光共聚焦显微图，从图中荧光位置可对烟草ntrbsc1进行定位；图中“tag”为荧光标签通道，“chi”为叶绿素通道，“dic”为明场通道，“merge”为通道叠加。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备，简要介绍说明如下。

生物材料：

烟草红花大金元，购自于云南省烟草农业科学研究院中国烟草育种研究南方中心；实验过程中，栽培于中国烟草总公司郑州烟草研究院基因中心光照培养间内，制备rna样品时，取大十字期的烟草幼嫩叶片进行相关操作；

引物合成及测序公司均有生工生物工程（上海）股份有限公司完成；

pff19-gfp载体，均为现有生物材料或按现有技术制备即可；

实验试剂：

pcr反应试剂盒，北京全式金生物技术有限公司产品；

反转录试剂盒，smartmmlv反转录酶、kpni、bamhi酶、t4dna连接酶（solutioni连接酶）等，均为takara生物技术有限公司产品；

实验设备：

激光共聚焦显微镜，德国leicasp5stedcw。

实施例1

本申请所提供的携带有ntrbsc1基因的瞬时表达载体，该载体携带有ntrbsc1（ntab0062040））和一个荧光标记蛋白gfp的基因（以荧光标记蛋白gfp基因作为报告基因），其制备方法详述如下。

（1）pcr扩增，获得ntrbsc1基因，具体为：

以红花大金元烟草品种为材料，提取其总rna（rin≥7.5），并进一步反转录得cdna，以此为模板，设计ntrbsc1-f/ntrbsc1-r引物对，进行pcr扩增，获得ntrbsc1基因的扩增产物，并进行回收。

所述ntrbsc1-f/ntrbsc1-r引物对，利用dnaman6.0，结合ntrbsc1基因序列设计而成，所述ntrbsc1基因，其碱基序列如seqidno：1所示；所设计引物具体序列为：

ntrbsc1-f:cggggtaccatgtctgtctcaagtt，其中ggtacc部分序列为kpni酶切位点，

ntrbsc1-r:cgcggatccagatgctacagg，其中ggatcc部分序列为bamhi酶切位点。

将人工合成的引物分别使用tris-edta（ph=8.0）溶液稀释至工作浓度10μm，进行pcr扩增，pcr扩增时，50μl反应体系设计如下：

10×iibuffer，5μl；

cdna，2μl；

ntrbsc1-f，2.5μl；

ntrbsc1-r，2.5μl；

transtaqhifidna聚合酶，0.3μl；

dntp，4μl；

灭菌水加至50μl；

pcr扩增反应条件具体可设置为：94℃预变性5min；94℃、30s，62℃、30s，72℃、40s，35个循环；再72℃、10min，16℃、10min；

将pcr扩增产物进行电泳检测，并回收，所回收产物4℃保存备用或直接进行后续操作实验。

（2）酶切，并连接，具体为：

对步骤（1）中所回收ntrbsc1基因，采用kpni和bamhi进行双酶切处理，并回收酶切产物；

同时对pff19-gfp载体，同样采用kpni和bamhi进行双酶切处理，并回收酶切产物。

酶切处理时，50μl双酶切体系设计参考如下：

bufferk，2.5μl；

bamhi，2.5μl；

sphi，2.5μl；

步骤（1）中的ntrbsc1基因的扩增产物（或pff19-gfp载体），20μl；

灭菌水，加至50μl。

采用t4dna连接酶将上述基因ntrbsc1的酶切产物的粘性末端与pff19-gfp载体的双酶切产物的粘性末端进行连接，10μl连接体系参考设置如下：

ntrbsc1酶切产物，1μl；

pff19-gfp载体酶切产物，1μl；

t4dna连接酶，1μl；

ddh2o加至10μl；

16℃连接过夜（8小时以上）。

（3）转化，筛选，具体为：

将步骤（2）中的连接产物，以热激法转化转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有amp(氨苄青霉素，50μg/ml)的lb培养基上进行抗性筛选，并挑取阳性菌落提取质粒进行酶切验证，酶切验证结果如图1所示，表示质粒重组正确；进一步对酶切验证正确重组质粒进行测序验证，确保重组质粒构建无误。

对于验证正确的菌株进行扩大培养，并提取质粒备用；此质粒即为ntrbsc1基因和荧光标记蛋白gfp基因的瞬时表达载体，将此质粒载体命名为ntrbsc1-pff19-gfp。

实施例2

将实施例1中所制备ntrbsc1-pff19-gfp质粒载体通过peg介导的烟草原生质体转化法转化烟草原生质体，进一步通过激光共聚焦显微镜观察，即可较为直观的定位烟草ntrbcs1，从而为相关基因研究奠定研究基础和应用基础，相关实验简要介绍如下。

（一）制备烟草原生质体，具体操作为：

1、称取0.2gcellulaser-10（solarbio）、0.08gmacerozymer-10（solarbio），加入到20ml酶储液中，55℃水浴10min，冷却后加入200ul的1mcacl2（10mm），0.02gbsa（0.1%），0.45μm微孔过滤，制成酶解液，移入100ml小烧杯中备用；

2、取生长4周的烟草叶片（红花大金元，健康、生长状况良好的肥厚叶片），每个转化约10片，去除叶前缘和叶柄，用刀片切成1mm宽长条，置于步骤1的酶解液中，锡箔纸包裹避光，23℃、40~50rpm酶解2.5~3h；

3、将步骤2的酶解液用100~200目筛子过滤，将滤液置于50ml离心管中，4℃、60g、brake=4离心15min；

4、弃上清，沉淀用4ml冰浴的w5溶液轻轻吹散洗涤。4℃、100g、brake=4离心3min；

5、弃上清，沉淀再次用4ml冰浴的w5溶液重悬，冰上放置30min；

6、23℃、100g、brake=4离心1min，弃上清，沉淀用mmg溶液重悬，每一个转化加100μlmmg。

（二）peg介导的烟草原生质体转化，具体操作为：

7、取10~20μg质粒（实施例1所制备pff19-nttip1.1-gfp质粒）于1.5mlep管中，加入100μl步骤6中的原生质体，轻柔混匀；

8、加入110μl的peg-ca溶液，轻柔混匀，放置20~30min；

9、加入440μl的w5溶液，轻柔混匀，23℃、100g、brake=4离心1min；

10、弃上清，加入500μl的w5溶液，轻柔混匀，移入清洗干净且用w5溶液润洗过的六孔板中，用w5溶液补足1ml，稍微混匀；

23℃，锡箔纸包裹避光培养6~18h；然后进行激光共聚焦显微镜观察。

（三）激光共聚焦显微镜观察，具体操作过程为：

首先吸取适量原生质体悬浮液滴于载玻片上，轻轻盖上盖玻片；最后通过激光共聚焦显微镜进行观察；

观察时，将载玻片倒置放于载物台上，用明视野进行调焦，视野清晰后用暗视野寻找发出亮绿色荧光的细胞；设定激光共聚焦的z轴对细胞进行拍照。

结果如图2所示。对图2分析可以看出，图2中的荧光位置在细胞内特异性分布，形态大小结构与植物叶绿体的自发荧光相重叠，因此，可利用此载体作为叶绿体的基因共定位载体。

需要解释的是，上述操作过程中，部分试剂配制情况简介如下：

200mmmes（3.904g/100ml），koh调整ph=5.7；

1m甘露醇（18.218g/100ml）；

1mcacl2（11.1g/100ml）；

酶储液（200ml），包括：

a，0.4m甘露醇（80ml、1m甘露醇）；

b，20mmmes（20ml、200mmmes）；

c，20mmkcl（0.2982gkcl）；

mmg（10ml），包括：

a，0.4m甘露醇（4ml1m甘露醇）；

b，4mmmes（200ul200mmmes）；

c，15mmmgcl2（0.03049g无水mgcl2或0.065gmgcl2·6h2o）；

w5（100ml），包括：

154mmnacl（0.8999gnacl）；

125mmcacl2（12.5ml1mcacl2）；

5mmkcl（0.037275gkcl）；

2mmmes（1ml200mmmes）；

peg(40%)-ca（1ml），包括：

peg4000(sigma)，0.4g；

h2o，0.3ml；

1m甘露醇，0.2ml；

1mcacl2，0.1ml。

采用基因枪介导的烟草悬浮细胞进行相关转化操作实验时（以美国bio-rad的pds1000台式基因枪为例），具体步骤可参考如下：

（一）制备烟草悬浮细胞，并诱导愈伤组织备用；具体过程如下：

取事先培养生长的愈伤组织（如by-2培养基中培养的by-2烟草细胞），用灭菌的药匙压碎后，接入悬浮细胞液体培养基中，摇床培养数天至适合进行基因枪转化时即可（以by-2细胞为例，悬浮细胞为亮黄色时，即可进行基因枪介导转化操作）；

（二）通过基因枪介导转化法，将实施例1中所制备ntrbsc1-pff19-gfp质粒转化进入烟草悬浮细胞中，具体过程简介如下。

首先，制备金粉悬浮液，具体过程为：

首先，取60mg金粉加入到1.5ml离心管中；然后向离心管中加入1ml的70%新配制的乙醇溶液，涡旋3~5min，再静置15min，然后3000rpm离心5s，最后小心去掉上清；此步骤三次；

然后，加入1ml无菌水，振荡1min，再静置1min，最后3000rpm离心2s，去上清；

最后，加入50%甘油1ml（即，金粉浓度60μg/μl），-20℃保存备用。

其次，制备微弹（以6次量为例），具体过程为：

取步骤1中制备的金粉溶液，涡旋5min，将50μl溶液移入1.5ml灭菌后离心管中；

涡旋状态下，依次在离心管中加入实施例1中制备的ntrbsc1-pff19-gfp质粒（终浓度1μg/μl）、50μlcacl2（2.5m，高压灭菌）、20μl亚精胺（0.1m，过滤除菌），然后充分振荡3min，再静置1min，以确保质粒再金粉表面充分沉降；

3000rpm离心2s，尽可能完全地弃去上清，再加入140μl的70%乙醇洗涤金粉，但尽量不要触动金粉；

3000rpm离心2s，尽可能完全地弃去上清，再加入140μl无水乙醇洗涤金粉；

3000rpm离心2s，尽可能完全地弃去上清，再加入48μl无水乙醇，然后轻弹管壁，使金粉混合，此时，每个离心管中的微弹可供6枪使用。

基因枪转化，具体过程为：

将基因枪置于超净工作台上以便进行无菌操作，具体过程有：首先使用70%乙醇对真空室进行消毒；再将可裂圆片、阻挡网及微弹膜用70%乙醇灭菌30min，然后置于无菌滤纸上晾干备用；

取步骤2中悬匀的基因载体-金粉混合液6μl均匀点在无菌微弹载体膜的中央区域，然后于超净工作台上吹干备用；将可裂圆片装入固定盖旋紧；再将装有微弹的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置；

打开稳压电源、真空泵及氮气阀开关，将受体材料（步骤（一）中所制备悬浮细胞）放入样品室，设定射程9cm，用基因枪对受体材料进行轰击；轰击后，排气，取出样品，用封口膜封上；将轰击过的悬浮细胞28℃避光放置于植物培养箱中过夜，然后即可进行激光共聚焦显微镜观察。

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<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

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