用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法与流程

本发明属于水产生物技术领域，涉及一种用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法，涉及用于鉴定鲑鳟鱼卵和鱼苗是否携带传染性造血器官坏死病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)的检测技术。

背景技术：

鲑鳟鱼是鲑科(salmonidae)鱼类的统称，作为重要的冷水性名优水产物种，在我国26个省市区都有人工养殖，养殖规模逐年稳步扩大，2015年总产量已达到41，607万吨。传染性造血器官坏死病(infectioushematopoieticnecrosis，ihn)是一种严重威胁鲑鳟鱼养殖业发展的暴发性疾病，能够感染大多数鲑鳟鱼养殖种，其中虹鳟(oncorhynchusmykiss)、大西洋鲑(salmosalar)等感染后死亡率高达90％以上，且缺乏有效的治疗药物。目前在鲑鳟鱼养殖业中，防控病害较为有效的方式是倡导“生物安保(biosecurity)”风险管理理念，从切断病原传播途径入手，通过对特定病原的监测，防范疫病传入，实现水产健康养殖管理。

ihnv属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，诺拉弹状病毒属(novirhabdovirus)，是一种单链负义rna病毒，20世纪50年代发现于美国，早期主要在北美传播，1968年在日本北海道被报道，1987年传入法国和意大利，随后在欧洲暴发性流行。流行病学调查发现该病毒主要通过病鱼或被污染的鱼卵在不同地域传播，世界动物卫生组织(法语officeinternationaldesépizooties，oie)将其列入《水生动物卫生法典》。

1985年我国首例虹鳟ihn疫情在黑龙江省爆发，事后调查其传染源可能为自美国引种的银鲑(oncorhynchuskisutch)，银鲑能感染并携带ihnv，但不表现出严重症状，由于鲑鳟鱼通常为流水养殖模式，病毒在同一水域养殖的鲑鳟鱼间极易扩散传播，形成暴发性流行。此后三十余年间，ihnv曾在黑龙江、辽宁、青海、山西、北京、甘肃等多地出现，中国农业部和国家质量监督检验检疫总局均将其列为二类动物疫病。

oie《水生动物疾病诊断手册》推荐的ihnv诊断方法包括临床症状诊断、病毒分离、组织病理切片、电子显微镜、逆转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpcr，rt-pcr)、间接免疫荧光、酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)、中和实验等，其中病毒分离结合rt-pcr为检测的“金标准”。但是，上述方法检测周期较长，病毒分离还需要在特定细胞系中进行病毒培养，对检测设备和操作人员的要求较高，不易在苗种场、养殖场等生产经营场所推广。

因此，亟待开发简便快速的ihnv检测技术，在苗种场、养殖场购进外来鲑鳟鱼卵、鱼苗时，用于鉴定苗种是否携带ihnv，降低疫病传入的风险。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法，包括：

步骤一、提取到待测鲑鳟鱼样品的rna；

步骤二、以所述rna为模板，以如seqidno：1、2、3和4所示的核苷酸序列作为引物，且该引物中的至少一种引物上携带有电化学活性标记分子，构建逆转录环介导等温扩增体系，向该体系中添加部分带有锚定标记分子的dntp，对待测鲑鳟鱼样品的rna进行扩增，得到扩增反应液；

步骤三、首先将所述扩增反应液加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，之后检测所述电极表面是否存在所述电化学活性标记分子的电化学信号，若能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测鲑鳟鱼样品携带有ihnv。若检测不到电化学电子标记分子的电化学信号，则表明所述待测鲑鳟鱼样品不携带有ihnv。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤二中，还以如seqidno5和6所示的核苷酸序列作为引物。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤二中，seqidno：3所示的核苷酸序列带有所述电化学活性标记分子。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤二中，seqidno：4所示的核苷酸序列带有所述电化学活性标记分子。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤二中，所述部分带有锚定标记分子标定的的dntp的用量为总dntp用量的5％～8％。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤二中，所述逆转录环介导等温扩增体系的反应温度为60-65℃，反应时间15-30min。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤三中，所述锚定反应条件为温度37℃，反应时间15-30min。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述的电化学活性标记分子为二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、硫堇、邻苯二酚、对苯二酚、稀土单酞菁、铱氯水配合物、血红蛋白和肌红蛋白中的任意一种。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述锚定分子为生物素、亲和素、抗原、抗体、抗抗体、细胞因子、受体和核酸适配体中的任意一种。

优选的是，所述的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法中，所述步骤三中，将所述扩增反应液加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应之后，洗脱掉电极表面未结合的扩增反应液，然后在进行电化学信号的检测，其中，洗脱的方法为：使用ph7.0的tris-edta缓冲液洗脱3次，每次洗脱2min。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供了一种简便易行的ihnv检测技术，dna扩增在恒温下进行，且无须精准控温和计时，可使用简易水浴锅和普通计时器完成扩增和锚定反应，不涉及复杂操作和精密仪器，适用于苗种场、养殖场等生产经营性场所的现场检测。

本发明将rna逆转录与dna扩增整合在同一体系中完成，并提供6条引物同时进行环式扩增，所需反应时间短，包括rna提取在内的全部检测操作能够在90min内完成，适合快速检测。

本发明中核酸扩增靶标为基质蛋白(matrixprotein，m)编码基因，通过对ncbi数据库中不同株系来源的357条ihnv基因序列进行比对分析，证实m基因在ihnv基因组内的6个编码基因中保守性最高，基于该基因序列设计扩增引物，能够有效避免由于病毒变异过快而造成的假阳性结果，保证检测准确率。

本发明基于电化学生物传感检测原理，不使用任何有毒有害试剂，检测操作全程不存在人身健康或环境污染隐患。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中ihnv特异性引物的基因组位置比对图，所示为ihnv中国株ch20101008的m基因编码区完整序列(ncbi序列号kj421216.1)，序列下方数字表示该碱基在m基因上的位置，序列下方星号显示序列中的保守性碱基，序列下方下划线显示序列中的可变碱基，阴影区所示碱基为ihnv特异性引物片段；

图2为本发明其中一个实施例中检测感染ihnv的虹鳟鱼苗的循环伏安信号，线型ⅰ表示感染ihnv的虹鳟鱼苗样品的扩增产物检测信号，线型ⅱ表示未携带ihnv病毒的虹鳟鱼苗样品的扩增产物检测信号，线型ⅲ表示ihnv-m基因标准质粒扩增产物检测信号(正对照)；

图3为本发明其中一个实施例中检测携带ihnv的金鳟鱼卵的循环伏安信号，线型ⅰ表示携带ihnv的金鳟鱼卵样品的扩增产物检测信号，线型ⅱ表示未携带ihnv病毒的金鳟鱼卵样品的扩增产物检测信号，线型ⅲ表示ihnv-m基因标准质粒扩增产物检测信号(正对照)；

图4为本发明其中一个实施例中检测ihnv传感器工作曲线，右下插图显示线性范围内(每μl扩增模板ihnv拷贝数为10²至10¹¹)的拟合直线y＝92.983+49.14823x(r²＝0.99653)，误差棒显示5次重复实验标准差。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明公开了一种用于鉴定鲑鳟鱼苗种是否携带传染性造血器官坏死病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)的生物传感检测方法。该方法基于公共数据库中不同株系来源的ihnv基因序列保守性分析结果，设计了以ihnv病毒基质蛋白(matrixprotein，m)编码基因为扩增靶点的6条特异性引物，对待测鱼卵或鱼苗样品总rna模板进行快速的恒温逆转录扩增，扩增时间仅需15-30min。扩增反应中全部或部分引物带有电化学活性标记，核酸链延伸的底物dntp中部分带有锚定标记，因此成功扩增的病毒m基因序列同时带有电化学活性标记和锚定标记，能够利用锚定标记将扩增产物捕获在电极表面，通过检测电极表面的电化学信号，准确判定样品是否携带ihnv病毒。本发明操作简单，反应迅速，对设备精密度要求较低，适用于苗种场、养殖场等生产经营性场所的现场快速检测。

如图1～4所示，本发明提供一种用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法，包括：

步骤一、提取到待测鲑鳟鱼样品的rna；采集新鲜的待测鱼卵或鱼苗内脏，直接提取rna，或于液氮、rna贮存液等保护剂中保存运输，3个月内提取rna。

步骤二、以所述rna为模板，以如seqidno：1、2、3和4所示的核苷酸序列作为引物，且该引物中的至少一种引物上携带有电化学活性标记分子，包括一种、两种、三种、四种、五种或者全部引物都携带有电化学活性标记分子，构建逆转录环介导等温扩增体系，向该体系中添加部分带有锚定标记分子的dntp，及rna逆转录酶、bstdna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dntp)、可溶性镁盐、bstdna聚合酶缓冲液和无菌去离子水等，对待测鲑鳟鱼样品的rna进行扩增，得到扩增反应液；

步骤三、首先将所述扩增反应液加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应，之后检测所述电极表面是否存在到所述电化学活性标记分子的电化学信号，若能够检测到所述电化学标记分子的电化学信号，表明所述待测鲑鳟鱼样品携带有ihnv。若检测不到电化学电子标记分子的电化学信号，则表明所述待测鲑鳟鱼样品不携带有ihnv。

本发明基于生物传感原理的检测技术，使用ihnv病毒特异性引物对待测样品核酸进行扩增，其中引物带有电化学活性标记，而核酸链延伸的底物dntp中部分带有锚定标记，使得成功扩增的病毒m基因序列同时带有电化学活性标记和锚定标记，然后利用锚定标记将扩增产物捕获在电极表面，检测电极表面的电化学活性，从而准确判定样品是否携带ihnv病毒。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，还以如seqidno：5和6所示的核苷酸序列作为引物。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，seqidno：3所示的核苷酸序列带有所述电化学活性标记分子。

在上述方案中，作为优选，所述步骤二中，seqidno：4所示的核苷酸序列带有所述电化学活性标记分子。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述部分带有锚定标记分子标定的的dntp的用量为datp用量的20％～30％，占dntp用量的5％-8％。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述逆转录环介导等温扩增体系的反应温度为60-65℃，反应时间15-30min。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，所述锚定反应条件为温度37℃，反应时间15-30min。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的电化学活性标记分子为能够发生可逆或准可逆氧化还原反应的分子，为二茂铁及其衍生物、铁氰化钾、硫堇、邻苯二酚、对苯二酚、稀土单酞菁、铱氯水配合物、血红蛋白、肌红蛋白等，其中优选的是，所述的电化学活性标记分子为二茂铁，对应的电化学信号为循环伏安信号或交流阻抗信号。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的锚定分子为能够与其受体发生特异性稳定结合，且亲和常数在10⁶m^-1以上的分子，为生物素、亲和素、抗原、抗体、抗抗体、细胞因子、受体、核酸适配体等，其中优选的是，所述的锚定标记分子为生物素，对应的锚定受体为亲和素或链霉亲和素。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，将所述扩增反应液加于修饰有锚定受体的电极表面进行锚定反应之后，洗脱掉电极表面未结合的扩增反应液，然后在进行电化学信号的检测，其中，洗脱的方法为：使用ph7.0的tris-edta缓冲液洗脱3次，每次洗脱2min。

为使本领域技术人员更好地理解本发明，还提供如下说明及实施例1至4。

本发明中，样品前处理过程包括组织采集和rna提取。若待测样品为鱼卵或小规格苗种，直接收集并置于适量组织裂解液(或rna保护剂)中即可；若待测样品为大规格苗种，需解剖采集内脏并置于适量组织裂解液(或rna保护剂)中。rna提取可使用常规市售试剂盒完成。

本发明中，检测对象ihnv为rna病毒，需将其逆转录为dna进行扩增。通过反应体系调整和优化，逆转录和dna扩增可在同一反应体系中完成，且无须添加额外的随机引物。反应体系的必需组分包括4条ihnv特异性引物、待测样本rna、rna逆转录酶、bstdna聚合酶、dntp、带有锚定标记分子的一种dntp(通常为dutp)、可溶性镁盐(提供镁离子)、bstdna聚合酶缓冲液和无核酸酶灭菌去离子水，可添加组分为2条环引物和甜菜碱。

本发明中，各引物序列如下：

seqidno:1：acgaggagagggtgacaat

seqidno:2：tctgaggtgcgggtttcc

seqidno:3：gcagccgccagattcatagagtcagagggggagatcaaggt

seqidno:4：tcgtagggggagatctacaccctcttgggtgcttccgaact

seqidno:5：cctcaagtgtggttggtcttc

seqidno:6：aatccatgacctttctgttcca

其中，seqidno:1-4为必需引物，seqidno:5和seqidno:6为可选引物。

本发明中，全部或部分引物带有电化学活性标记，标记位于引物5’端，不影响扩增反应的进行，底物中一定比例的dntp带有锚定标记，携带有ihnv的样本将成功扩增，扩增产物末端带有电化学活性标记，中段带有锚定标记，能够被偶联有锚定受体的电极表面所捕获，并产生电化学信号。而未携带ihnv的样本无法扩增，模板、引物及反应液中的多数组分将被洗脱，无法留在电极表面，带有锚定标记的dntp虽然也能竞争性结合在电极表面，但不带有电化学活性标记，因而无法产生电化学信号。

在本发明的实施例中，使用一个携带ihnv-m基因序列的质粒充当正对照，指示所有反应流程正常进行，若通用对照质粒检测电极无信号，提示应排查试剂和仪器等检测条件问题。

实施例1鉴定虹鳟鱼苗是否感染ihnv

1.溶液配制

定制合成碱基序列如seqidno：1-6所示引物(上海生工)，各引物5’端均带有二茂铁修饰，溶于无核酸酶的灭菌去离子水，配制成含有引物seqidno：1和seqidno：2各1μm，引物seqidno：3和seqidno：4各8μm，引物seqidno：5和seqidno：6各2μm的引物使用液，其中引物seqidno：3和seqidno：4上游带有二茂铁标记。

使用无核酸酶的灭菌去离子水配制dntp使用液，该溶液含有datp、dctp、dgtp各10mm，dttp8mm，biotin-16-dutp2mm。

2.总rna提取

待测虹鳟鱼苗体长约2-3cm，解剖5尾取内脏混合，液氮研磨，使用rnasimple总rna提取试剂盒(天根dp419)，按照说明书步骤提取待测样品总rna，溶于50μl无核酸酶灭菌去离子水，紫外分光光度计测定浓度，调整至rna浓度为100ng/μl左右。

3.核酸扩增

待测样品扩增反应体系如下：

ihnv-m质粒正对照扩增反应体系如下：

将各反应管置于60℃水浴中反应30min。

4.电极表面修饰

使用al2o3粉末对金电极进行抛光，超声波清洗5min，浸入纳米金溶液(sigma，柠檬酸钠还原氯金酸法制备，粒径30nm)，+1.55v电位下沉积15min，静置5min，无核酸酶灭菌去离子水清洗。

电极表面浸入含10mmα-硫辛酸的乙醇溶液活化20min，移入浓度为100g/l的edc/nhs混合液活化羧基，向电极表面滴加0.2g/l的亲和素50μl，偶联30min，去离子水洗脱未结合亲和素。超净台风干后可4℃长期保存，12个月内均可用于检测。短期保存可置于室温ph7.0磷酸缓冲液中。

将各管扩增反应产物，分别滴加在不同的修饰电极表面，37℃温育20min。

将dna修饰电极浸入ph7.0tris-edta缓冲液，洗脱2min，换新的缓冲液重复2次。

5.电化学信号检测

采用三电极测试系统，以dna修饰电极为工作电极，铂丝(直径1mm)为对电极，ag/agcl为参比电极，20mlph7.0磷酸缓冲溶液为支持电解质，分别测定各电极的循环伏安曲线，初始电位设为0mv，折回电位设为+600mv，扫描速度设为50mv/s，记录3个循环中的第3个。

6.检测结果

虹鳟鱼苗样品检测结果如图2所示，细实线表示感染ihnv的虹鳟鱼苗样品的扩增产物检测信号，点线表示未携带ihnv病毒的虹鳟鱼苗样品的扩增产物检测信号，粗虚线表示ihnv-m基因标准质粒扩增产物检测信号(正对照)，图中可见感染ihnv的虹鳟鱼苗样品曲线与正对照相似，呈现明显的氧化还原峰，氧化峰电位位于+476mv，氧化峰电流值为+564na，还原峰电位位于+266mv，还原峰电流值为-594na，氧化还原峰电位差约为210mv；而未感染ihnv的虹鳟鱼苗样品曲线平缓，无明显的氧化还原峰。

实施例2鉴定金鳟鱼卵是否携带ihnv

1.溶液配制

定制合成碱基序列如seqidno：1-6所示引物(上海生工)，引物seqidno：1-4的5’端均带有二茂铁修饰，溶于无核酸酶的灭菌去离子水，配制成含有引物seqidno：1和seqidno：2各1μm，引物seqidno：3和seqidno：4各8μm，引物seqidno：5和seqidno：6各2μm的引物使用液，其中引物seqidno：3和seqidno：4上游带有二茂铁标记。

使用无核酸酶的灭菌去离子水配制dntp使用液，该溶液含有datp、dctp、dgtp各10mm，dttp8mm，biotin-16-dutp2mm。

2.总rna提取

取待测金鳟鱼卵约20粒混合，液氮研磨，使用rnasimple总rna提取试剂盒(天根dp419)，按照说明书步骤提取待测样品总rna，溶于50μl无核酸酶灭菌去离子水，紫外分光光度计测定浓度，调整至rna浓度为100ng/μl左右。

3.核酸扩增

待测样品扩增反应体系如下：

ihnv-m质粒正对照扩增反应体系如下：

将各反应管置于60℃水浴中反应30min。

4.电极表面修饰

同实施例1。

5.电化学信号检测

同实施例1。

6.检测结果

金鳟鱼卵样品检测结果如图3所示，细实线表示携带ihnv的金鳟鱼卵样品的扩增产物检测信号，点线表示未携带ihnv病毒的金鳟鱼卵样品的扩增产物检测信号，粗虚线表示ihnv-m基因标准质粒扩增产物检测信号(正对照)，图中可见携带ihnv的金鳟鱼卵样品曲线与正对照相似，呈现明显的氧化还原峰，氧化峰电位位于+480mv，氧化峰电流值为+368.5na，还原峰电位位于+276mv，还原峰电流值为-303na，氧化还原峰电位差约为204mv，其氧化还原峰电流值显著低于正对照，表明样品中ihnv拷贝数较低；而未携带ihnv病毒的金鳟鱼卵样品曲线平缓，无明显的氧化还原峰。

实施例3ihnv的定量检测

1.溶液配制

同实施例1。

2.ihnv对照质粒提取

依据ncbi数据库ihnv中国株ch20101008全基因组序列(kj421216.1)，人工合成基质(matrix，m)基因及其两端侧翼各10bp序列(2245-2852)，共计608bp，连接至pgm-t载体中，构建成分子量为3639bp的ihnv对照质粒，转化dh5α大肠杆菌，扩大培养。使用无内毒素质粒中量提取试剂盒(天根dp108)提取质粒，10倍浓度梯度稀释，配制成每1μl体积分别含有1-10¹³个质粒拷贝的溶液。

3.核酸扩增

扩增反应体系如下：

将各反应管置于60℃水浴中反应30min。

4.电极表面修饰

同实施例1。

5.电化学信号检测

同实施例1。

6.检测结果

使用梯度稀释的ihnv对照质粒作为模板进行扩增反应，检测cv信号，以氧化峰电流值构建传感器工作曲线，结果如图4所示。在每μl模板ihnv拷贝数为10²至10¹¹的区间内，模板拷贝数对数值与氧化峰电流值呈线性关系，拟合方程为y＝92.983+49.14823x(r²＝0.99653)，线性范围之外工作曲线斜率降低。根据工作曲线，在信噪比为3的时，ihnv传感器最低检测限为6.2拷贝/μl。

实施例4ihnv诊断灵敏性和诊断特异性评估

1.真阳性样本采集

将按照oie《水生动物疾病诊断手册》(2015版)病毒分离结合rt-pcr方法，检测呈ihnv阳性的样本视为真阳性样本，收集真阳性虹鳟鱼苗样本50例。

2.真阴性样本采集

将ihnv不易感鱼类鲤鱼视为真阴性样本，收集真阴性鲤鱼鱼苗样本50例。

3.样本ihnv检测

应用本发明对真阳性和真阴性样品各50例进行ihnv检测，具体步骤同实施例1。

本发明方法对所有真阳性样本检测结果均为阳性。对所有真阴性样本检测结果均为阴性。

4.诊断灵敏性和诊断特异性评估

依据oie《水生动物疾病诊断手册》(2015版)第1.1.2章所规定，

诊断灵敏性＝真阳性检出数/(真阳性检出数+假阳性检出数)

诊断特异性＝真阴性检出数/(真阴性检出数+假阴性检出数)

计算获得本方法诊断灵敏度为100％，诊断特异性为100％。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的用于鲑鳟鱼苗种鉴定的生物传感检测方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，本发明基于电化学生物传感检测原理，不使用任何有毒有害试剂，检测操作全程不存在人身健康或环境污染隐患，不涉及复杂操作和精密仪器，适用于苗种场、养殖场等生产经营性场所的现场检测。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

sequencelisting

<110>中国水产科学研究院

<120>鲑鳟鱼中hinv的生物传感检测方法

<130>2016

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